JP6506793B2 - Ｓｔｒ遺伝子座の迅速な多重増幅のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に、核酸サンプル内のショート・タンデム・リピート（Short Tandem Repeat）遺伝子座の迅速増幅のための組成物および方法に関する。
（参照による援用）
本願は、次の出願全体を参照により援用している：「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号；「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号；「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号；「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第12/080,751号；および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号。
本願は、次の出願全体を参照により援用している：「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号；「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号；「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号；「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第12/080,751号；および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号。
（政府支援）
本発明は、米国国土安全保障省（Department of Homeland Security）からのSBIR助成金、番号N10PC2010S、のもと政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明にある種の権利を有し得る。
本発明は、米国国土安全保障省（Department of Homeland Security）からのSBIR助成金、番号N10PC2010S、のもと政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明にある種の権利を有し得る。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、in vitroでの核酸配列の迅速な指数関数的増幅を促進する酵素的反応である。科学捜査では、PCRを利用して、ショート・タンデム・リピート（STR）として公知のあるクラスの反復DNAを含有するヒトゲノムの小領域の増幅に基づき個体を同定することができる。所与のSTRリピートの単位長は、2〜10塩基対の間の範囲であり、STRは、一般的に、非コーディングおよび隣接配列に分類されるが、時としてコード領域に分類される（Edwardsら, Am. J. Hum. Genet. 1991, 49, 746-756）。ヒトゲノムには平均6〜10kbごとに現れる数十万のSTR遺伝子座が存在し（Beckman and Weber, Genomics 1992, 12, 627-631）、これらの多くは高多型性である（Edwardsら, Trans. Assoc. Am. Physicians 1989, 102, 185-194）。STR分析は、科学捜査用具の中で主要ツールになってきており、法の執行、親子鑑定、集団災害の際の人物同定および子供のルーチン的分類を含めて、一連の用途は増え続けている。
1つの態様において、本発明は、STR遺伝子座の多重増幅方法であって、（a）サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および得られたSTR多重は、3.20以上の多重密度を有する；（b）前記少なくとも6つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって同時に増幅して、増幅された核酸生成物を生成し；次いで（c）前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出することを含む前記方法を提供する。関連態様において、前記多重STRアッセイは、3.0以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、3.5以上、3.6以上、3.7以上、3.8以上、3.9以上、4.0以上、4.2以上、4.4以上、4.6以上、4.8以上、5.0以上、5.5以上、6.0以上、6.5以上、7.0以上、7.5以上、8.0以上、8.5以上、9.0以上、9.5以上、または10.0以上の多重密度を有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。蛍光色素の数を増加させることで、より大きい多重密度が可能になる。
もう1つの態様において、本発明は、STR遺伝子座の多重増幅方法であって、（a）サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い、および得られたSTR多重は、1044より大きいSTR遺伝子座サイズ範囲合計（STR Locus Size Range Sum）を有し；（b）前記少なくとも6つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバー中でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって同時に増幅して、増幅された核酸生成物を生成し；次いで（c）前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出することを含む前記方法を提供する。関連態様において、前記多重STRアッセイは、1050塩基以上、1075塩基以上、1100塩基以上、1125塩基以上、1150塩基以上、1175塩基以上、1200塩基以上、1225塩基以上、1250塩基以上、1275塩基以上、1300塩基以上、1325塩基以上、1350塩基以上、1375塩基以上、1400塩基以上、1425塩基以上、1450塩基以上、1475塩基以上、1500塩基以上、1600塩基以上、1700塩基以上、1800塩基以上、1900塩基以上、2000塩基以上、2500塩基以上、3000塩基以上、4000塩基以上、または5000塩基以上のSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。蛍光色素の数を増加させることで、より大きいSTR遺伝子座サイズ範囲合計が可能になる。
本明細書に提供するある態様は、多型遺伝子座の多重増幅方法であって、（a）1以上の源から得たもう1つの核酸テンプレートのサンプルと、1以上の核酸テンプレート内の少なくとも6つのSTR遺伝子座のうちの1つに各対がハイブリダイズする少なくとも6つの異なるプライマー対とを1つの溶液中で接触させ、ここに、前記プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、ならびに少なくとも6つ（およびいくらかの態様では5つ、およびさらに他の態様では6つより多く）の異なる標識を用い；（b）前記1以上の核酸中の少なくとも6つのSTR多型遺伝子座を1つの反応チャンバーにおいてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅して、少なくとも6つの核酸生成物を生成することを含む前記方法に関する。いくらかの実施形態では、6以上の遺伝子座を増幅する。いくらかの実施形態では、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、26以上、27以上、28以上、29以上、30以上、31以上、32以上、34以上、36以上、38以上、または40以上のSTR遺伝子座を増幅する。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、STR遺伝子座SE33、Penta C、Penta D、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、DYS391およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、STR遺伝子座SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043のためのプライマー対と、STR遺伝子座SE33、D10S1248、D2S441、Penta C、D22S1045およびDYS391のセットから選択されるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのさらなるプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、STR遺伝子座SE33、Penta C、Penta D、TPOX、Penta E、D22S1045およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのさらなるプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、少なくとも2つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と少なくとも1つのさらなるプライマー対とを含有し、該少なくとも1つのさらなるプライマー対は、それぞれ、STR遺伝子座Penta C、Penta D、Penta E、SE33およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のためのものである。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、STR遺伝子座Penta C、Penta D、Penta EおよびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのさらなるプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、FGA、D8S1179のためのプライマー対と少なくとも6つのさらなるプライマー対とを含有し、該少なくとも6つのさらなるプライマー対は、各々が、それぞれ、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座を増幅するものである。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、FGA、D8S1179のためのプライマー対と、STR遺伝子座D19S433、D2S1338、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045およびDYS391のセットから選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12のさらなるSTR遺伝子座のための少なくとも1つのプライマー対を含有する少なくとも6つのさらなるプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S6156、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179のためのプライマー対と少なくとも2つのさらなるプライマー対とを含有し、該少なくとも2つのさらなるプライマー対は、各々が、それぞれ、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座を増幅するものである。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433m D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179のためのプライマー対と少なくとも2つのさらなるプライマー対とを含有し、該少なくとも2つのさらなるプライマー対は、各々が、それぞれ、STR遺伝子座SE33、Penta C、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、DYS391およびD6S1043の群から選択される少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座を増幅するものである。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、FGA、D8S1179およびD6S1043のためのプライマー対と、少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座のためのプライマー対とを含有する。いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、FGA、D8S1179およびD6S1043のためのプライマー対と少なくとも1つのさらなるプライマー対とを含有し、該少なくとも1つのさらなるプライマー対は、それぞれ、STR遺伝子座SE33、TH01、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、vWA、Penta D、D22S1045、Penta E、SE33およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のためのものである。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、D22S1045、FGAおよびD8S1179のためのプライマー対を、少なくとも1つのさらなるプライマー対と共にまたは少なくとも1つのさらなるプライマー対なしに含有し、該少なくとも1つのさらなるプライマー対は、それぞれ、STR遺伝子座SE33、Penta C、Penta D、TPOX、Penta E、DYS391およびD6S1043のセットから選択されるSTR遺伝子座のためのものである。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。いくらかの実施形態では、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合により前記多重に含めることがある。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、3.0以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、3.5以上、3.6以上、3.7以上、3.8以上、3.9以上、4.0以上、4.2以上、4.4以上、4.6以上、4.8以上、5.0以上、5.5以上、6.0以上、6.5以上、7.0以上、7.5以上、8.0以上、8.5以上、9.0以上、9.5以上、または10.0以上の多重密度を有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。蛍光色素の数を増加させることで、より大きい多重密度が可能になる。
いくらかの実施形態において、前記多重STRアッセイは、1044塩基以上、1050塩基以上、1075塩基以上、1100塩基以上、1125塩基以上、1150塩基以上、1175塩基以上、1200塩基以上、1225塩基以上、1250塩基以上、1275塩基以上、1300塩基以上、1325塩基以上、1350塩基以上、1375塩基以上、1400塩基以上、1425塩基以上、1450塩基以上、1475塩基以上、1500塩基以上、1600塩基以上、1700塩基以上、1800塩基以上、1900塩基以上、2000塩基以上、2500塩基以上、3000塩基以上、4000塩基以上、または5000塩基以上のSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有する。いくらかの実施形態では、合計4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（各プライマー対の一方のメンバーを標識し）、色素標識された断片をレーザー励起および検出に基づいて検出する。蛍光色素の数を増加させることで、より大きいSTR遺伝子座サイズ範囲合計が可能になる。
6以上の蛍光標識（例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超える標識）の使用は多くの利点を提供する。例えば、分解したDNAサンプルを用いて作業する場合、所望の増幅生成物すべてを生成する尤度は、多重STR評価の際に小さなアンプリコンを使用すると増加される。6以上の標識色素の使用は、プライマーおよびプライマーダイマーのアーティファクトより大きい最小可能範囲でのさらなる遺伝子座の設計を可能にすることにより遺伝子座の平均アンプリコンサイズを低減させることによって分解したDNAサンプルでの成功の機会を増加させる。いくらかの実施形態では、6以上の遺伝子座を多重セットで増幅し、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を使用する。いくらかの実施形態では、12以上の遺伝子座を多重セットで増幅し、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を使用する。いくらかの実施形態では、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、45、50またはそれを超える遺伝子座を多重セットで増幅し、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を使用する。米国政府は時が経てばさらなる遺伝子座を承認することとなることが具体的に予見され、また27より多くの遺伝子座を可能にするための多重セットでの6色以上の使用が予見される。1以上の遺伝子座を置換してもよい。例えば、FBIは、米国CODISデータベースに入るためのサンプルプロフィールについてもTPOX遺伝子座をその現行要求ステータスから推奨ステータスにダウングレードすることを目下、検討中である。
問い合わせることができるSTR遺伝子座の色および数のこの増加は、偶発的マッチの発生率も低減させることとなり（http://www.enfsi.org/で利用できるENFSI document on DNA-database management 2010）、多くの他のSTRベースアプリケーションの実行に信頼を加えることとなる。例えば、DNAプロファイリングの役割も拡大されて、データベースの近親者検索を含むようになってきており（Bieberら Finding criminals through DNA of their relatives. Science. 2006;312(5778):1315-6；Nothnagelら Potentials and limits of pairwise kinship analysis using autosomal short tandem repeat loci. Int J Legal Med. 2010;124(3):205-15）、血縁関係分析が難民、政治的亡命者および移民申請の際に用いられている（Bakerら Reuniting Families: An Online Database to Aid in the Identification of Undocumented Immigrant Remains*. J Forensic Sci. 2008;53(1):50-3；Preston. US set to begin a vast expansion of DNA sampling; big effect on immigrants; law to cover most people detained or arrested by federal agents. The New York times. 2007:A1, A15）。
6以上の標識の使用のもう1つの利点は、数ヵ国が、様々な犯罪の犯人の同定を補助するために利用する国家データベースの作成に使用するためのSTR遺伝子座の標準セットを明確に定めているという事実に基づく（Budowleら Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci. 1999;44:1277-86；Butler. Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing. J Forensic Sci. 2006 Mar;51(2):253-65；Gillら New multiplexes for Europe--Amendments and clarification of strategic development. Forensic Sci Int. 2006; 163(1-2):155-7）。これらの標準セットは、国によって様々である。国境を越えてSTRプロフィールデータを共有したいという要求に応じて、時とともに地域、国家および国際データベースのサイズは増大してきた。データベース検索の互換性は、同時に分析することができるSTR遺伝子座の数を増加させることの利益を受けるであろう。6以上の標識の使用は、個々の国で使用されるSTR遺伝子座の本質的にすべてを組み込む新たな国際STR標準の作成を可能にする。
多重STRアッセイに組み込むことができるSTR遺伝子座の幾つかのカテゴリーがある。これらには、常染色体STR(上で開示したものの大部分）、X STR、Y STR、およびミニSTR（常染色体、Y-およびX-STRのより低分子量バージョン）が挙げられる。STRアッセイは、所与のアッセイにおける1タイプのSTR遺伝子座よりなることができ、またはSTR遺伝子座の組み合わせよりなることができる（例えば、常染色体、XおよびY-STRを一緒に問い合わせることができる）。
直系の男性から男性への遺伝を評価すべき場合、血縁関係分析、および地理的祖先の調査は、Y染色体STRマーカー使用から有意な利益を受ける。いくらかの実施形態では、6以上のY染色体STR遺伝子座（いくらかの適用には6、8、10、12、14、15、18、21、24、27、30またはそれを超えるY染色体STR遺伝子座が好ましい）を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。いくらかの実施形態では、18以上の遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。いくらかの実施形態において、少なくとも1つがDYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641またはDYS643から選択される18以上の遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。いくらかの実施形態において、少なくとも1つがDYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641またはDYS643から選択される24以上の遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。
いくらかの実施形態において、少なくとも1つがDYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641またはDYS643から選択される30以上の遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。
血縁関係、科学捜査および人類学における複合欠損ケースでは、X染色体マーカーが分析に特に有用である。男性のX染色体プロフィールは、ハプロタイプとして子孫に伝えられ、それ故、このプロフィールは近親者同定（familial identification）のための高多型併用システムである。いくらかの実施形態では、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30またはそれを超えるX染色体STR遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。いくらかの実施形態では、少なくとも1つがDXS6807、DXS9895、DXS10135、DXS8378、DXS9902、DXS10076、DXS10077、DXS10078、DXS7132、DXS10074、DXS981、DXS6800、DXS9898、DXS6801、DXS6809、DXS6789、DXS7424、DXS101、DXS6797、DXS7133、GATA172D05、HPRTB、DXS10101、DXS9908、DXS8377、DXS10134、DXS7423、DXS10011、DXS10102、DXS10103、DXS10104、DXS10105、DXS10106またはDXS10107から選択される13以上の遺伝子座を、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、かつ少なくとも6つの異なる標識を用いて、多重セットで増幅する。
いくらかの実施形態では、13のCODIS遺伝子座（すなわち、CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA）のうちの少なくとも5つのためのプライマー対と少なくとも1つのYマーカーとを前記多重に組み込む。さらにもう1つの実施形態では、13のCODIS遺伝子座のうちの少なくとも5つのためのプライマー対と、少なくとも1つのYマーカーと、D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045およびSE33を含む群からの2以上のマーカーとを、前記多重に組み込む。これらの実施形態では、合計5、6、7、8、9、10、11、12またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（1プライマー対につき1標識）、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合によりその多重に組み入れることがある（この任意選択マーカーは、上述の少なくとも1つのYマーカーとは異なる）。
いくらかの実施形態では、13のCODIS遺伝子座（すなわち、CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA）のうちの少なくとも5つのためのプライマー対と、少なくとも1つのXマーカーとを前記多重に組み込む。さらにもう1つの実施形態では、13のCODIS遺伝子座のうちの少なくとも5つのためのプライマー対と、少なくとも1つのXマーカーと、D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045およびSE33を含む群からの2以上のマーカーとを、前記多重に組み込む。これらの実施形態では、合計5、6、7、8、9、10、11、12またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識し（1プライマー対につき1標識）、アメロゲニンまたはもう1つの性別識別用マーカーを場合によりその多重に含めることがある（この任意選択マーカーは、上述の少なくとも1つのXマーカーとは異なる）。
いくらかの実施形態では、順方向もしくは逆方向プライマーまたは双方のプライマー対を（例えば、蛍光色素で）ユニークに標識する。いくらかの実施形態において、前記標識は、蛍光色素である。いくらかの実施形態では、レーザー（例えば、サファイア488nmレーザー）を用いて前記蛍光標識アンプリコンを検出する。レーザーを使用する利点は、アッセイの感度および検出限界が例えばプレートリーダーと比較して劇的に向上される点である。
いくらかの実施形態では、核酸生成物を約180分未満、約120分未満、約90分未満、約80分未満、約70分未満、約60分未満、約55分未満、約50分未満、約45分未満、約40分未満、約35分未満、約30分未満、約25分未満、約20分未満、約18分未満、約17分未満、約16分未満、約15分未満、約14分未満、約13分未満、約12分未満、約11分未満、約10分未満、約9分未満、約8分未満、約7分未満、約5分未満、または約4分未満の間、増幅する。
本明細書に提供する実施形態のいずれかに記載する方法について、その反応チャンバーは、マイクロ流体バイオチップ上にある場合がある（例えば、Gieseら (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96を参照されたし）。さらに、前記反応チャンバーは、オペレーター操作を必要としない、サンプル・イン・トゥー・リザルツ・アウト・システム（sample-in to results out system）の設定で1以上のサンプルについて複雑な一連の処理工程を並行して行うことができる完全集積型マイクロ流体チップ上にあり得る。いくらかの実施形態において、前記方法は、核酸生成物の電気泳動分離および検出を含む。いくらかの実施形態では、前記マイクロ流体バイオチップを用いて前記核酸生成物の分離および／または検出を行う。
本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、前記サンプルは、約1pgから10μgより多くの1以上の核酸（テンプレート）を含むことができる。いくらかの実施形態において、前記サンプルは、1ng未満の1以上の核酸（テンプレート）を含む。ある態様において、前記核酸生成物の各々についてのヘテロ接合体のピーク高比（PHR）は、0.05ngから4.0ngの範囲の核酸テンプレートレベルについては0.6と1.0の間である。
本発明のさらなる態様は、多型遺伝子座の迅速な多重増幅のためのキットであって、（a）塩、バッファー、dNTP、およびポリメラーゼと；（b）前記のものから選択されるSTRプライマー対のセットと、ここに、各プライマー対は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを有し、および1以上の核酸または核酸の混合物における少なくとも6つの遺伝子座のうちの1つにハイブリダイズし、ならびに各プライマー対の前記順方向または逆方向プライマーのいずれかまたは双方が、蛍光色素で標識されている；（c）STR遺伝子座の迅速な多重増幅のための構成要素（例えば、塩、バッファー、マグネシウム、dNTPS、およびポリメラーゼ）とを含み；構成要素（a）、（b）および（c）が単一反応容器内に配置されているものであるキットを提供する。
本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、任意のDNAポリメラーゼを利用することができる。例としては、サームス・エクアティカス（Thermus aquaticus）（Taq）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrccoccus furiosus）（Pfu）、パイロコッカス・ヴェッセイ（Pyrococcus woesei）（Pwo）、サームス・フラバス（Thermas flavus）（Tfl）、サームス・サーモフィラス（Themus thermophilus）（Tth）、サームス・リトリス（Thermus litoris）（Tli）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）（Tma）が挙げられる。これらの酵素、これらの酵素の修飾バージョン、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StrategeneおよびApplied Biosystemsを含めた供給メーカーから市販されている。代表的な酵素としては、PHUSION（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Hot MasterTaq（商標）（Eppendorf）、PHUSION Mpx（Finnzymes）、PyroStart（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（タカラバイオ株式会社（TAKARA））、およびCS3AC/LA（KlenTaq、ミズーリ州ユニバーシティ・シティー）が挙げられる。
限定されるものではないが、多重エンドポイントPCR、リアルタイムPCR、逆転写PCR、非対称PCR、ネステッドPCR、LATE PCR、タッチダウンPCR、デジタルPCR、等温PCR、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅および多置換増幅を含めた任意の核酸増幅アプローチに、本発明の教示を適用することができる。
所与の遺伝子座におけるアレルサイズを変更することにより特徴付けられる任意の多重遺伝子座の分析に本発明の教示を適用することができる。非ヒト哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類および両生類種を含めた多種多様な生物に多重STR分析を適用することができる。加えて、複数遺伝子座可変数タンデムリピート分析（Multiple Loci Variable Number Tandem Repeats Analysis ：MLVA）および増幅断片長多型（Amplified Fragment Length Polymorphism：AFLP）分析による（病原体を含む）細菌の同定および特徴付けに本発明を適用することができる。これらのアプローチはSTR分析に類似しており、これらのアプローチを植物、真菌および動物における株の分類および特徴付けに広く適用することができる。多型性でない遺伝子座の分析または多型性でない遺伝子座の組み合わせの分析に、本発明の教示を適用することができる。最後に、本発明を一塩基多型（SNP）の多重分析に直接適用することができる。
遺伝子分析に有用な方法を本明細書に記載する。前記方法のいくらかの実施形態を、1以上の核酸テンプレートの高特異的遺伝子プロフィール、例えば、ショート・タンデム・リピート（STR）プロフィールを提供するために設計する。各プロフィールが所与の核酸テンプレート内の多数の多型ゲノム遺伝子座のDNA「指紋」を提供し、次いで、いくらかの実施形態では、それを用いて、その核酸テンプレートを得た個体（またはその個体についての情報もしくはその個体の血縁者）を同定することができる。
本発明の目的は、様々な適用に有用な人物同定情報を生成する多重STRアッセイを提供することである。例えば、法医学研究室は、近親者検索、すなわち、可能性のある疑わしい者のリストをデータベース内にプロフィールがある個体の家族に狭めることによって調査を助けるための犯罪現場サンプルから誘導されたプロフィールと州、国家または国際データベース内に存在するプロフィールとの関係性についての検索、の益々大きくなる価値を最近確認した。本発明のアッセイは、近親者検索に対する実質的により大きな信頼をもたらし、大型化するデータベースの検索で得られる偶発的マッチの数をかなり減少させる。
本発明のアッセイのより大きな識別能はまた、移民および難民申請の分析の際のDNAプロファイリングの使用を強化する。こうした中で、米国国民または特定の難民に関する個人の権利に関する米国国務省の政策実施を、正しい結果をより大きく確信して行うことができる。13のCODIS STR遺伝子座は、親子関係および同胞−同胞関係の試験を十分に保証するが、より拡大した関係、例えば祖父母−孫またはおば／おじ−甥／姪、の血縁関係分析は、限られた信頼レベルを有する多くの結果をもたらす。試験に使用するSTR遺伝子座数の増加および／またはより多くの多型遺伝子座の選択は、血縁関係分析に使用する尤度比の強度を増加させて、結果に対する信頼を増大させ、潜在的不正リスクを低減させる。本発明のアッセイは、法医学サンプルから得られることがある分解DNAサンプルの評価にも有利である。
STR分析は、証拠の判断基準となってきているが、STR遺伝子座セットは、国際標準化されていない。米国では、連邦捜査局が、統合DNAインデックスシステム（Combined DNA Index System：CODIS）との併用に13のSTR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座（性別判定用）を選択した。この米国セットは、多くの場合、「CODISコア遺伝子座」と呼ばれ、STR遺伝子座CSF1PO、FGA、THO1、TPOX、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51およびD21S11よりなる。一般的に、各STR遺伝子座は、それが見出される染色体に因んで命名され（例えば、D3S1358は、ヒト染色体3上に位置する）、または近くの遺伝子に因んで命名される（例えば、CSF1POは、コロニー刺激因子-1受容体遺伝子についてのヒトc-fms癌原遺伝子受容体をコードする遺伝子のイントロン内に位置する）。英国コア遺伝子座は、FGA、TH01、VWA、D2S1338、D3S1358、D8S1179、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11およびアメロゲニンである。欧州コア遺伝子座は、FGA、ThO1、VWA、D1S1656、D2S441、D3S1358、D8S1179、D10S1248、D12S391、D18S51、D21S11、D22S1045およびアメロゲニンである。オーストリア政府は、欧州コア遺伝子座にD2S1338、D16S539およびD19S433を加えており、ドイツ政府は、遺伝子座SE33を加えている。中国では、多くの場合、遺伝子座D6S1043が、STR遺伝子座CSF1PO、FGA、vWA、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11およびアメロゲニンと併用される。インターポール標準セット遺伝子座は、FGA、TH01、VWA、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、および場合によりアメロゲニンである。
本発明は、世界中の国家データベースに組み入れるために選択されたすべてのSTR遺伝子座およびこれらの遺伝子座を含有するサブセットを同時に問い合わせるSTRアッセイを提供する。かかる国際STR標準セットは、社会の安全を向上させるための国家間の有効な協力を劇的に向上させることとなる。多重STRアッセイを設計および構築する際に多くの因子のバランスをとらなければならないことは、当業者には理解されるであろう。特に、アッセイにおけるSTR遺伝子座数が18を超えて増加すると、これらの因子のバランスをとることがより困難になる。バランスをとらなければならない因子としては、STRアーティファクト（例えば、iNTA、および2以上のプライマーとサンプル核酸の意図されない相互作用）の防止または除去、絶対および相対シグナル強度、反応効率および時間、STR遺伝子座オーバーラップ、STRアンプリコン分解能、STR遺伝子座サイズ範囲およびオーバーラップ許容可能度、STR遺伝子座ヘテロ接合性、反応に利用する蛍光色素標識の数、多重サイズ範囲、ならびに反応を行う計器（単数または複数）の仕様および性能が挙げられる。これらの因子が、STRアッセイがおよそ3.15より大きい多重密度および1022のSTR遺伝子座サイズ範囲合計での単回同時反応で18より多くのフォーマル遺伝子座を移動させることを妨げてきた。所望の成果に依存して、これらのツールおよび技術を適用して、はるかに多くの数のフォーマル遺伝子座のSTR多重への組み込みを可能にすること、ならびにはるかに大きな多重密度およびSTR遺伝子座サイズ範囲合計の実現を可能にすることができる。
本明細書に用いた用語「STR遺伝子座」（単数および複数）は、標的核酸の所与の遺伝子座における2以上のヌクレオチドの反復パターンよりなるヌクレオチド配列を意味する。前記反復パターンは、長さが約2〜約10塩基対（bp）の範囲であり得、典型的には非コーディングイントロン領域内にある。前記反復パターンは、リピート単位に対応しない介在配列を含有することがあり、または1より多くの反復パターンを含有することがある。
本明細書に用いた用語「STRアレル」または「アレル」は、個体のゲノム内で見出されるSTR遺伝子座の1形態をいう。所与のSTR遺伝子座は、ヘテロ接合性であることがあり、これは、2つのアレル（各々の生物学的親から遺伝されるもの）が異なる長さおよび塩基組成であることを意味し、またはホモ接合性であることがあり、これは、双方のアレルが同一の長さ（および常にではないが通常は同一の塩基対組成）であることを意味する。個体が所与のSTR遺伝子座に3以上のアレルを有することはめったにない。まれに、所与のSTR遺伝子座における個体のアレルが、1以上の突然変異のため、彼または彼女の親と異なることがある。
本明細書に用いた用語「アレリックラダー」は、各STR遺伝子座について観察された共通アレルに対応する長さのDNAのセットをいう。異なる市販用STRキットは、アレリックラダー内に各遺伝子座を代表する異なるアレルを有する。
本明細書に用いた用語「STR遺伝子座サイズ範囲」または「遺伝子座サイズ範囲」は、その集団内で観察された共通アレルのサイズ範囲をいう。試験される数千万人のうちの一人または数人に関して試験または観察された任意の特定数のDNAサンプルということからして、珍しいアレルは観察されないことがあった。市販用キットは、異なるサイズ範囲を有する（会社は、時が経つにつれて彼らのアレリックラダーに稀なアレルを加える傾向がある）ので、対象となるすべてのSTR遺伝子座についてのSTR遺伝子座サイズ範囲を定義することが重要である。かかる定義は、様々なSTRアッセイの互いの比較を可能にする。珍しいアレルは、任意の特定のアレリックラダーへの組み入れに利用可能でなかったことがあり、または便宜上、組み入れられなかったこともある。さらなるアレルを既存のアレリックラダー成分とのサイズ比較により同定することができるので、アレリックラダーがすべて公知のアレルを含有する必要はない。市販アレリックラダーのセット内の各遺伝子座についての最大アレルと最小アレル間のサイズ差を用いて、標準STR遺伝子座サイズ範囲を定義し、表1に提示する。後続の比較に含めるSTR遺伝子座サイズ範囲を、Applied Biosystems製品AmpFlSTR Identifiler、AmpFlSTR Identifiler Plus、AmpFlSTR Identifiler Direct、AmpFlSTR NGM Select、AmpFlSTR Sinofiler、ならびにPromega Corporation製品PowerPlex 16 HS、PowerPlex ESX 17およびPowerPlex 18Dについてオンラインで入手できる商業出版技術資料の比較によって決定した。各遺伝子座について、前述の技術資料に記載されている市販アレリックラダーの複合セットの中の最大および最小アレルを決定した。その後、最大アレルと最小アレル間の塩基でのサイズ差を、リピート数、および4リピート長が遺伝子座に存在するのか、または5リピート長が遺伝子座に存在するのかに基づいて決定した。その遺伝子座についての「遺伝子座標準サイズ範囲」と呼ばれる1つの値を遺伝子座ごとに割り当てた。これらの個々の値を使用して、「マルチ遺伝子座サイズ範囲合計」（すなわち、各多重内に含有されている個々の遺伝子座についてのすべての標準サイズ範囲の合計）を決定した。
表1のSTR遺伝子座は、次の4つのカテゴリーに分類することができる：1）1以上の国によって公認されている遺伝子座：CSF1PO、FGA、THO1、TPOX、VWA、D1S1656、D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D22S1045、SE33およびアメロゲニン；2）中国において広く使用されている遺伝子座：D6S1043；3）米国において使用が提案されている遺伝子座：DYS391；および4）市販用STRキットにおいて使用されている3つの遺伝子座：Penta B、C、DおよびE。まとめて、これら4つのカテゴリーの中に含まれる任意のSTR遺伝子座を「フォーマルSTR遺伝子座」と呼ぶ。一般的に、これらのカテゴリー内に現在ある遺伝子座は、厳格な検証および試験に付された。時が経てば、新たな遺伝子座が上記カテゴリーに加えられるであろう：1）1以上の国によって公認されている新たな遺伝子座；2）公認されてはいないが1以上の国で広く用いられている新たな遺伝子座；3）米国での使用が提案されている新たな遺伝子座；および4）市販用キットにおいて見つけられる新たな遺伝子座。後にこれらのカテゴリーのうちの1つのメンバーとなる新たな遺伝子座に関して、その遺伝子座の最大および最小アレルについて発表されている制限を用いて、各STR遺伝子座についてのサイズ範囲を定義することができる。これらの4つのカテゴリーのうちの1つに入らない「インフォーマル」STR遺伝子座に関しては、その遺伝子座の最大および最小アレルについて発表されている制限を用いて、各STR遺伝子座に関するサイズ範囲を定義することができる。
本明細書に用いた用語「実質的非オーバーラッピングSTRアッセイ」は、極めてまれであるアレルおよびSTR遺伝子座サイズ範囲外であるアレルを除き、STR遺伝子座サイズ範囲のアレルが、同じ色素（または適用可能である場合には他の検出方法）で標識された遺伝子座の任意の他のSTR遺伝子座サイズ範囲とオーバーラップしないSTR多重アッセイをいう。
本明細書に用いた「STR遺伝子座サイズ範囲合計」は、多重STRセットに組み入れられた遺伝子座についての個々のSTR遺伝子座サイズ範囲の合計をいう。例えば、実施例Iの26遺伝子座STRセットは、1487塩基のSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有し、Identifiler遺伝子座（Life Technologies）の16遺伝子座STRセットは、809塩基のSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有する。
本明細書に用いた「多重サイズ範囲」は、所与のSTR多重の任意の遺伝子座における最大アレルと該多重の任意の遺伝子座における最小アレルのサイズの差をいう。これら2つの遺伝子座および多重サイズ範囲が、特定の多重の特徴である。多重サイズ範囲を算出するために：1）最小共通アレルを含有する多重におけるSTR遺伝子座を同定すること；2）前記遺伝子座における最小共通アレルのサイズを（「STR遺伝子座サイズ範囲」について説明したのと同じアプローチを用いて）決定すること；3）最大標準アレルを含有する多重におけるSTR遺伝子座を同定すること；4）前記遺伝子座における最大標準アレルのサイズを（「STR遺伝子座サイズ範囲」について説明したのと同じアプローチを用いて）決定すること；5）前記2つの標準アレル間の差を算出すること。例えば、実施例Iの26遺伝子座STRセットは、411塩基のマルチ遺伝子座サイズ範囲を有し、Identifilerセット（Life Technologies）の16遺伝子座STRセットは、257塩基の多重サイズ範囲を有する。
所与のアッセイにおいて使用する多重サイズ範囲に幾つかの因子が影響を及ぼす。電気泳動および質量分析を含めた様々なアプローチを用いてSTRアレルを特徴付けることができる。電気泳動分離に関して、サイズ下限は、例えば、短いアンプリコンとSTRプライマー、プライマーダイマーまたは他の増幅アーティファクトとの区別が難しくなるサイズによる影響を受け得る。サイズ上限は、1つまたは少数の塩基が異なる大きいアレルを分解する能力低下を有するシステムの分解能による影響を受け得る。類似して、所与のアッセイにおけるアレルが大きいほど、該大きいアレルの増幅を可能にするのに十分な平均断片長を分解DNAサンプルが有さない可能性は高い。
MALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化・飛行時間型）質量分析について、STR断片のサイズは、該断片を含有するサンプルをレーザでパルスすること、および質量標準物質と比較して検出器への飛行時間を測定することに基づく。サイズ上限は、質量分光光度計がSTRアレルを検出または分解できないことによる影響を受け得る。MALDI-TOFがSTR断片の正確な分子量を生じさせること、したがって、アレリックラダーを必要としないことに留意されたし。電気泳動に基づく方法との直接比較を可能にするために、STR遺伝子座サイズ範囲合計、多重サイズ範囲、および多重密度を上で説明したように算出する。質量分析に関する精度増加のため、アレリックラダーと比較することなくSTRアレルを容易に型別することができる。電気泳動分析の場合にように（DNAサイズ測定標準との比較での）相対移動度測定ではなく質量分析で絶対質量が測定される。そのとき、GeneTrace設計の遺伝子型判定ソフトウェアは、基準配列、PCRプライマー位置、およびリピート単位質量から得た予想アレル質量に基づく遺伝子型に戻って実測ピーク質量を相関させる。標準デスクトップ・パーソナル・コンピュータを使用して、各サンプルをおよそ1秒で処理して遺伝子型判定することができる。
本明細書に用いた「多重密度」は、「多重サイズ範囲」で割った「STR遺伝子座サイズ範囲合計」と定義される。この値は、所与の多重から得ることができるSTR情報の密度の尺度である。より高い値は、多重が、検出が可能な制限サイズ範囲内でより大きいアレル範囲を提示することを示す。例えば、表2は、幾つかのSTRセットについてのSTR遺伝子座の総数、フォーマルSTR遺伝子座の数、色素数、多重サイズ範囲、多重サイズ範囲合計、および多重密度を表示する。この表は、これらの値の決定を可能にする遺伝子座標準サイズ範囲および基礎データも含む。本発明のSTRセットは、少なくとも2以上、2.25以上、2.5以上、2.75以上、2.93以上、3.00以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、3.5以上、3.6以上、3.7以上、3.8以上、3.9以上、4.0以上、4.1以上、4.2以上、4.3以上、4.4以上、4.5以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上の多重密度を有する。
本明細書に用いた用語「核酸テンプレート」（単数または複数）は、STRプロフィールの合成のための出発原料として機能する核酸（単数または複数）をいう。核酸テンプレート（単数または複数）は、二本鎖であることもあり、または一本鎖であることもある。前記テンプレートは、個体の1以上の全ゲノムからのDNA、個体の部分ゲノムからのDNA、または前記個体のDNAから以前に増幅された生成物を含む場合があり、ならびに2以上の個体からの全および部分ゲノムの混合物を含む場合がある。分析すべきゲノムは、ヒトから採取されることもあり、他の哺乳動物種から採取されることもあり、または混合物であることもある。
本明細書に用いた用語「遺伝子座」（単数および複数）は、本明細書中で定義するとおりの所与の種の全または部分ゲノム内の1カ所以上の特定の位置を意味する。
本明細書に用いた用語「高多型遺伝子座」（単数または複数）は、少なくとも0.5の多型情報含有値を有する遺伝子座（単数）（複数の遺伝子座、それらの各々）をいう。多型情報含有値（polymorphic information content：PIC）［Botstein D, White RL, Skolnick M, and Davis RW, 1980. Am J Hum Genet 32:314-331、この開示は本明細書に援用されている］、その各々が当業者には公知である。次の方程式を用いて特定の遺伝子座のPICを算出することができる：
（式中、piは、第i番目のアレルの頻度であり、およびnは、アレルの数である）。いくらかの実施形態において、高多型遺伝子座は、約0.5以上のPIC値を有する。いくらかの実施形態において、高多型遺伝子座は、約0.5〜約0.7のPIC値を有する。いくらかの実施形態では、本明細書に記載する方法を用いて2以上の高多型遺伝子座を増幅するが、他の実施形態では、本方法を用いて、多型（PIC＜0.4）遺伝子座と高多型（PIC≧0.5）遺伝子座の混合物を増幅する。
本明細書に記載するいくらかの実施形態における方法は、6以上の多型遺伝子座の迅速な実質的に同時のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を提供し、前記多型遺伝子座の一部は、高多型性であることがあり、核酸サンプルの場合は、前記多型のすべてをレーザー励起蛍光法によって検出することとなる。いくらかの実施形態では、35以上までの多型遺伝子座を増幅する。本発明の多重における遺伝子座の一部は、高多型でないことがある。例えば、身体的特徴についての遺伝子座、疾患について遺伝子座、地理的民族性（geoethnicity）に関連した遺伝子座、またはその共用のために組み入れられる遺伝子座が最小限の多型性で存在することもある。実施例の多重では、アメロゲニン遺伝子座が高多型性でない。本明細書に用いた用語「実質的に同時の」は、時間的に直ぐにまたはほぼ直ぐに続くことをいう。
記載した方法は、STR遺伝子座の迅速な増幅を提供する。いくらかの実施形態において、本明細書に記載した方法は、少なくとも0.006ngのヒトゲノムDNAよりなるサンプルからの約45分以下または約20分以下での迅速なPCR増幅多型遺伝子座を提供する。他の実施形態では、多数の多型遺伝子座を約100分以下で増幅する。さらに他の実施形態では、多数の多型遺伝子座を約80分以下、約70分以下、約60分以下、約50分以下、約40分以下、約30分以下、または約20分以下で増幅する。さらに他の実施形態では、多数のSTR遺伝子座を約1分〜約10分で増幅する。
いくらかの実施形態では、標的核酸遺伝子座の少なくとも1つのコピーから出発して、多数の多型遺伝子座を増幅することができる。例えば、分析すべきサンプル（または核酸テンプレート）は、多重増幅反応前に、標的核酸の10,000未満のコピー、1000未満のコピー、400未満のコピー、200未満のコピー、100未満のコピー、50未満のコピー、30未満のコピー、10未満のコピー、6未満のコピー、または少なくとも1コピーを含む場合がある。加えて、標的核酸遺伝子座の1つが、ゲノム内に1コピーで存在する場合、または標的核酸遺伝子座が、ゲノム内に1つより多くのコピーで存在する場合、単一ゲノム当量未満のDNAを増幅に利用することができる。いくらかの実施形態では、本明細書に記載する方法のいくらかの実施形態によるサンプル中の各標的核酸内の少なくとも2つの遺伝子座、かつおよそ250以下の遺伝子座を同時に増幅することができる。いくらかの実施形態では、およそ26または27の多型（または高多型）遺伝子座を同時に増幅する。他の実施形態では、1つまたは多数の標的核酸であって、異なる源または同じ源から各々得たものである標的核酸から、少なくとも2つの遺伝子座、かつおよそ250以下の遺伝子座を同時に増幅することができる。
本明細書に用いる標的核酸は、任意の核酸、例えば、ヒト核酸、細菌核酸、またはウイルス核酸であり得る。前記標的核酸は、例えば、1以上の細胞、組織または体液、例えば、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液もしくは羊水、または他の生体サンプル、例えば組織培養細胞、口内スワブ、マウスウォッシュ、糞便、組織切片、吸引生検材料、および考古学サンプル、例えば、骨またはミイラ組織からの核酸であり得る。標的核酸は、例えば、DNA、RNA、または逆転写に付されたRNAのDNA生成物であり得る。標的サンプルを任意の源から採取することができ、該源としては、限定されるものではないが、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚類、哺乳類、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針穿刺吸引生検、癌、腫瘍、組織、細胞、細胞溶解産物、粗細胞溶解産物、組織溶解産物、組織培養細胞、口内スワブ、マウスウォッシュ、糞便、ミイラ組織、法医学源、剖検、考古学源、感染、院内感染、生産源、薬物調製、生体分子生産、タンパク質調製、脂質調製、炭水化物調製、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、発掘物、ならびに／または他の地上もしくは地球外材料もしくは源が挙げられる。前記サンプルは、1つの源または異なる源からの材料の混合物を含有することもある。例えば、感染性細菌またはウイルスの核酸は、本開示方法を用いてかかる感染細胞または組織からの核酸を増幅するときにヒト核酸と一緒に増幅することができる。有用な標的サンプルのタイプとしては、真核生物サンプル、植物サンプル、動物サンプル、脊椎動物サンプル、魚類サンプル、哺乳動物サンプル、ヒトサンプル、非ヒトサンプル、細菌サンプル、微生物サンプル、ウイルスサンプル、生体サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、血液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、リンパ液サンプル、脳脊髄液サンプル、羊水サンプル、生検サンプル、針穿刺吸引生検サンプル、癌サンプル、腫瘍サンプル、組織サンプル、細胞サンプル、細胞溶解産物サンプル、粗細胞溶解産物サンプル、組織溶解産物サンプル、組織培養細胞サンプル、口内スワブサンプル、マウスウォッシュサンプル、糞便サンプル、ミイラ組織サンプル、剖検サンプル、考古学サンプル、感染サンプル、院内感染サンプル、生産サンプル、薬物調製サンプル、生体分子生産サンプル、タンパク質調製サンプル、脂質調製サンプル、炭水化物調製サンプル、無生物サンプル、空気サンプル、土壌サンプル、樹液サンプル、金属サンプル、化石サンプル、発掘物サンプル、および／または他の地上もしくは地球外サンプルが挙げられる。法医学サンプルのタイプとしては、血液、乾燥血液、血痕、口内スワブ、指紋、接触サンプル（例えば、飲用グラスの縁に残った上皮細胞、野球帽の内縁部、またはタバコの吸い殻）、レーザー切開細胞、チューインガム、胃内容物、唾液、爪の切り屑、土壌、性的暴行サンプル（精液および膣上皮細胞を含む）、毛髪、骨、皮膚および固形組織が挙げられる。環境サンプルのタイプとしては、濾過されていないおよび濾過された空気および水、土壌、表面からのスワブサンプル、エンベロープ、ならびに紛体が挙げられる。
例えば、いくらかの実施形態において、本明細書に記載する方法は、分析により法医学的解釈に適するデータが得られる増幅核酸サンプル、および特に、法医学的解釈のガイドラインを満たすデータを提供することができる。かかるガイドラインには、シグナル強度、遺伝子座間ピーク高バランス、ヘテロ接合体のピーク高比（PHR）、不完全非テンプレートヌクレオチド添加（iNTA）、およびスタッターが含まれる（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods, Short Tandem Repeat (STR) Interpretation Guidelines. Forensic Science Communications, 2000, 2(3)）。
本明細書に用いた用語「核酸」は、一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAならびに、修飾された塩基、糖および主鎖を含有する代替核酸の任意のおよびすべての形態を包含することを意図される。したがって、用語「核酸」を、限定されるものではないが、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNA（および部分的に一本鎖または部分的に二本鎖であり得るそれらの形態）、cDNA、アプタマー、ペプチド核酸（「PNA」）、2'-5' DNA（DNAのA立体配座とマッチする塩基間隔を有する短縮主鎖を有する合成材料；2'-5' DNAは、通常、B形態ではDNAとハイブリダイズせず、RNAと容易にハイブリダイズするであろう）、およびロックド核酸（「LNA」）を含むと理解される。核酸類似体は、類似したまたは向上した結合、塩基対合のハイブリダイゼーション特性を有する天然ヌクレオチドの公知類似体を含む。プリンおよびピリミジンの「類似体」形態は当該技術分野において周知であり、それらとしては、限定されるものではないが、アジリジニルシトシン、4-アセチルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、ケオシン（queosine）、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、および2,6-ジアミノプリンが挙げられる。本発明によって提供されるDNA主鎖類似体としては、ホスホジエステル、ホスホロチオリン酸塩、ホスホロジチオリン酸塩、メチルリン酸塩、ホスホルアミド酸塩、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸塩、3'-チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、3'-N-カルバミン酸塩、モルホリノカルバミン酸塩、およびペプチド核酸（PNA）、メチルリン酸塩架橋またはメチルリン酸塩・ホスホジエステル交互架橋（Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698）、および米国特許第6,664,057号明細書において言及されるようなベンジルリン酸塩結合が挙げられる；OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, F. Eckstein編, IRL Press at Oxford University Press (1991)；Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, BasergaおよびDenhardt編 (NYAS 1992); Milligan, 1993, J. Med. Chem. 36:1923-1937；Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)も参照されたし。本明細書における核酸は、抽出形態である場合もあり、または当業者に公知の任意の手段に従って合成により調製される場合もある；例えば、前記核酸を化学合成することができ、または、数ある源の中でも、cDNAもしくはmRNAから転写もしくは逆転写することができる。
ある態様では、1以上の標的核酸内の多数の核酸遺伝子座を高速ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって実質的に同時に増幅するための方法を本明細書に記載する。いくらかの実施形態において、かかる方法は、（a）1以上の源から得たもう1つの核酸テンプレートのサンプルと、1以上の核酸テンプレート内の少なくとも6つの遺伝子座のうちの1つに各対がハイブリダイズしている少なくとも6つの異なるプライマー対とを1つの溶液中で接触させ、ここに、前記プライマー対の少なくとも一方のプライマーを標識し、および少なくとも6つの異なる標識を用い；（b）前記1以上の核酸内の少なくとも6つの多型遺伝子座を1つの反応チャンバーにおいてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅して、少なくとも6つの核酸生成物を生成することを含む。サンプルは、単一の個体からまたは1より多くの個体から得た（単離したまたは採取した）1以上の核酸を有する場合がある。前記1以上の核酸を多数の源から、例えば、2以上の個体から、または同じ個体からの2以上の異なる組織サンプル（例えば、器官、細胞タイプ）から得ることもできる。前記反応チャンバーは、1以上の核酸の1つのサンプルを有する場合もあり、または1以上の核酸の1つより多くのサンプルを有する場合もある。例えば、本明細書に記載する方法を用いて、同じ核酸サンプルに関するまたは多数の核酸サンプルに関する多数の実質的同時分析（増幅）を実行することができる。
PCR増幅用のプライマーは、標的DNAの遺伝子座にハイブリダイズするように特異的に設計されているオリゴヌクレオチド配列である。これらのプライマーは、ポリメラーゼ伸長のための出発点としての役割を果たす。増幅された（核酸）断片の分析を促進するために、標識プライマーをPCR反応において使用することもできる。標識プライマーは、検出可能部分にカップリング（またはコンジュゲート）されているオリゴヌクレオチドであり、該検出可能部分の非限定的な例としては、蛍光色素、放射性標識、ならびに識別可能な金属、核酸、配列およびタンパク質が挙げられる。蛍光標識プライマーを用いてPCRを行うと、蛍光標識を有するアンプリコン（核酸増幅生成物）が生成される。いくらかの実施形態では少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8以上の蛍光色素を単回増幅反応において（1つの反応チャンバーにおいて）使用する。1以上の色素を使用して、対照配列、例えば、サイズ測定基準またはアレリックラダーを生成することができる。
プライマーセットは、前記のような標的核酸内の多数の個々の遺伝子座の増幅について当業者に公知のいずれのものであってもよい。例えば、ヒト核酸サンプル中の1以上の遺伝子座の増幅に有用なプライマーは、米国特許第5,843,660号、同第6,221,598号、同第6,479,235号、同第6,531,282号および同第7,008,771号明細書、ならびに米国特許出願公開第2003/0180724号、同第2003/0186272号および同第2004/0137504号明細書に記載されており、前記特許文献の各々が参照により本明細書に援用されている。
さらに、ウイルス核酸サンプル中の1以上の遺伝子座の増幅に有用なプライマーは、例えば、米国特許第7,312,036号、同第6,958,210号、同第6,849,407号、同第6,790,952号、および同第6,472,155号明細書に記載されており、前記特許文献の各々が、参照により本明細書に援用されている。
細菌核酸サンプル中の1以上の遺伝子座の増幅に有用なプライマーの例は、米国特許第7,326,779号、同第7,205,111号、同第7,074,599号、同第7,074,598号、同第6,664,080号、および同第5,994,066号明細書に記載されており、前記特許文献の各々が、参照により本明細書に援用されている。
塩およびバッファーとしては、MgCl2、およびTris-HClおよびKClをそれぞれ含むものを含めた当業者によく知られているものが挙げられる。バッファーは、添加剤、例えば、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（BSA）およびポリエチレングリコール（PEG）、ならびに当業者によく知られている他のものを含有し得る。ヌクレオチドは、一般的に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）およびデオキシチミジン三リン酸（dTTP）であり、これらもまた標的核酸の増幅のために適当な量で反応チャンバーに添加される。
場合によっては、前記溶液を核酸ポリメラーゼのホットスタート活性化に適する第一の期間、第一の温度に加熱し、保持してもよい。一般的に、前記第一の期間は、約90秒未満である。前記第一の温度は、約90〜98℃であり得る。60秒以下で活性化され得るホットスタート機序を備えているポリメラーゼとしては、抗体媒介ホットスタートおよびアプタマー媒介ホットスタート機序を用いるものが挙げられる。別法として、本明細書に記載する方法にホットスタートポリメラーゼを用いる必要はない。
続いて、その後、反応溶液の温度を、変性状態、アニーリング状態および伸長状態の間で所定のサイクル数の間サイクルさせることができる。いくらかの実施形態では、前記1つまたは複数の反応溶液を、変性状態からアニーリング状態に、約1〜約150℃／秒、または約1〜約100℃／秒；または約1〜約80℃／秒；または約1〜約60℃／秒；または約1〜約40℃／秒；または約1〜約30℃／秒；または約1〜約20℃／秒；約4〜約150℃／秒、または約4〜約100℃／秒；または約4〜約80℃／秒；または約4〜約60℃／秒；または約4〜約40℃／秒；または約4〜約30℃／秒；または約4〜約20℃／秒；または約10〜約150℃／秒；または約10〜約100℃／秒；または約10〜約80℃／秒；または約10〜約60℃／秒；約10〜約40℃／秒；または約10〜約30℃／秒；または約10〜約20℃／秒の第一の冷却速度で冷却する。前記1つもしくは複数の反応溶液を、アニーリング状態から伸長状態に、約1〜約150℃／秒、もしくは約1〜約100℃／秒；もしくは約1〜約80℃／秒；もしくは約1〜約60℃／秒；もしくは約1〜約40℃／秒；約1〜約30℃／秒；約1〜約20℃／秒；4〜約150℃／秒、もしくは約4〜約100℃／秒；もしくは約4〜約80℃／秒；もしくは約4〜約60℃／秒；もしくは約4〜約40℃／秒；約4〜約30℃／秒；約4〜約20℃／秒；もしくは約10〜約150℃／秒；もしくは約10〜約100℃／秒；もしくは約10〜約80℃／秒；もしくは約10〜約60℃／秒の；約10〜約40℃／秒；もしくは約10〜約30℃／秒；もしくは約10〜約20℃／秒の第一の加熱速度で加熱することができ、および／または前記1つもしくは複数の反応溶液を、伸長状態から変性状態に、約1〜約150℃／秒、もしくは約1〜約100℃／秒；もしくは約1〜約80℃／秒；もしくは約1〜約60℃／秒；もしくは約1〜約40℃／秒；約1〜約30℃／秒；約1〜約20℃／秒；約4〜約150℃／秒、もしくは約4〜約100℃／秒；もしくは約4〜約80℃／秒；もしくは約4〜約60℃／秒；もしくは約4〜約40℃／秒；約4〜約30℃／秒；約4〜約20℃／秒；もしくは約10〜約150℃／秒；もしくは約10〜約100℃／秒；もしくは約10〜約80℃／秒；もしくは約10〜約60℃／秒の；約10〜約40℃／秒；もしくは約10〜約30℃／秒；もしくは約10〜約20℃／秒の第二の加熱速度で加熱する。最後に、それらの反応溶液を最終状態で保持して、1つまたは複数の増幅核酸生成物を得る。
アニーリング温度および時間は、標的核酸内の特定の遺伝子座へのプライマーの結合の特異性および効率に影響を及ぼす場合があり、多重PCR反応にとって重要であり得る。前記アニーリング工程中のプライマー対の完全セットの正確な結合が、複数の遺伝子座の多重増幅の生産、例えば、許容され得るPHRおよび遺伝子座間シグナル強度バランスを有する1つまたは複数のフルSTRプロフィールを可能にし得る。所与のプライマー対についてのアニーリング状態は、いくらかの実施形態では、約50℃から70℃、および約1秒未満から約30秒より長い時間にわたり得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的依存性である。
伸長温度および時間は、アレル生成物収量に影響を及ぼすことがあり、および利用する酵素の固有の特性であることは理解される。所与のプライマー対についての伸長状態は、いくらかの実施形態では、約45℃から80℃、および約1秒未満から約30秒より長い時間にわたり得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的依存性である。所定のサイクル数を継続するために、反応溶液を、伸長状態から変性状態に、約1〜約150℃／秒、または約1〜約100℃／秒；または約1〜約80℃／秒；または約1〜約60℃／秒；または約1〜約40℃／秒；または約1〜約30℃／秒；または約1〜約20℃／秒；4〜約150℃／秒、または約4〜約100℃／秒；または約4〜約80℃／秒；または約4〜約60℃／秒；または約4〜約40℃／秒；または約4〜約30℃／秒；または約4〜約20℃／秒；または約10〜約150℃／秒；または約10〜約100℃／秒；または約10〜約80℃／秒；または約10〜約60℃／秒；約10〜約40℃／秒；または約10〜約30℃／秒；または約10〜約20℃／秒の第三の速度で加熱することができる。いくらかの実施形態において、前記所定のサイクル数は、約10〜約50サイクルであるように選択されるが、必要に応じてより少ないまたはより多いサイクル数を使用してもよい。
STR反応についての最終伸長時間を、不完全NTAが増加し始めるまで、かなり短縮することができる。所与の酵素についての最終伸長温度は、いくらかの実施形態では、約60から75℃の範囲であり得、時間は約0から5400秒の範囲であり得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的依存性である。
上に示した3段階サーマルサイクリングアプローチに加えて、本発明のこの方法および組成物を2段階サーマルサイクリングアプローチにも適用できる。いくらかの実施形態でのこのアプローチでは、その後、前記反応溶液を変性状態とアニーリング／伸長状態間で所定のサイクル数の間サイクルさせる。このアプローチは、伸長温度でアニールするように設計されたプライマーを利用し、それによりアニーリング工程と伸長工程に同じ温度を共有させることができる。温度転移数低減は、サイクル時間をさらに短縮させる結果となり得る。
いくらかの実施形態では、多数の増幅核酸生成物を約5〜約20分で得る。ある種の他の実施形態では、多数の増幅核酸生成物を約5〜10分、約1〜5分、または5分未満で得る。いくらかの実施形態では、約10ng未満の標的核酸から出発して各増幅核酸生成物を得ることができる。いくらかの実施形態では、約5ng未満または約2ng未満の核酸、または約1ng未満の核酸、または約0.5ng未満の核酸、または約0.2ng未満の核酸、または約0.1ng未満の核酸、または約0.05ng未満の核酸、または約0.006ng未満の核酸から出発して、増幅核酸生成物を生成する。
他の実施形態、例えば臨床もしくは環境サンプル中の生物兵器剤の同定、またはヒト、植物および動物における細菌、ウイルスもしくは真菌感染の診断では、標的核酸の少なくとも1つのコピーから出発して増幅核酸生成物を生成することができる。例えば、分析すべきサンプルは、多重増幅反応前に、標的核酸の1000未満のコピー（例えば、1〜1000コピー）、400未満のコピー、200未満のコピー、100未満のコピー、50未満のコピー、30未満のコピー、10未満のコピーまたは1つのコピーを含む場合がある。
上述の方法のいずれにおいても、サーマルサイクリングを所定のサイクル数にわたって行って、当業者が容易に判定できるような標的核酸内の遺伝子座の十分な増幅を達成することができる。例えば、前記所定のサイクル数は、約10サイクルと約50サイクルの間、およびいくらかの実施形態では約20サイクルと50サイクルの間の範囲であり得る。さらに、上述の方法の少なくともいくらかの実施形態では、1つまたは複数の核酸の少なくとも2つの遺伝子座を実質的に同時に増幅することができる。所望の用途に依存して、4より多くの、5〜10、10〜20、20〜30または約10〜250の遺伝子座を同時に増幅することができる。例えば、STR遺伝子座の増幅については、10〜20の遺伝子座を増幅することができる。
本明細書に記載する方法を用いる高速PCR適用での使用に多くの市販ポリメラーゼを適用させることができる。いくらかの実施形態において、前記核酸ポリメラーゼは、少なくとも100塩基/秒の伸長速度を有する。サームス・エクアティカス（Taq）、パイロコッカス・フリオサス（Pfu）、パイロコッカス・ヴェッセイ（Pwo）、サームス・フラバス（Tfl）、サームス・サーモフィラス（Tth）、サームス・リトリス（Tli）およびサーモトガ・マリティマ（Tma）を含む、PCR増幅に利用可能な多数のポリメラーゼ。これらの酵素、これらの酵素の修飾バージョン、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StrategeneおよびApplied Biosystemsを含めた供給メーカーから市販されている。代表的な酵素としては、PHUSION（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Hot MasterTaq（商標）（Eppendorf）、PHUSION Mpx（Finnzymes）、PyroStart（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（タカラバイオ株式会社（TAKARA））、およびCS3AC/LA（KlenTaq、ミズーリ州ユニバーシティ・シティー）が挙げられる。STR型判定のためのPCR増幅用に広範に用いられている酵素は、Taq DNAポリメラーゼである。
多数の（100より多くの）色素を蛍光励起および検出への適用に利用することができる。利用可能な色素のこの広い範囲により、検出範囲全域にわたる発光波長を有する、したがって最少の発光極大値間オーバーラップしか有さない色素セットの選択が可能になる。オリゴヌクレオチドおよびプライマーへの共有結合が化学修飾されている色素を利用することができ、それらとしては、フルオレセイン、ローダミン、AlexaFluor、Bodipy、クマリン、Cascade Dyes、およびシアニン色素ファミリーからのものが挙げられる。蛍光色素は、Invitrogen/Molecular Probes（カリフォルニア州カールズバッド）、Anaspec（カリフォルニア州フリーモント）、GE Healthcare（ニュージャージー州ピスカタウェイ）およびPierce/Thermo Fisher（マサチューセッツ州ウォルサム）を含めた多数の商業的供給業者から商業的に入手することができ、かかる色素を、オリゴヌクレオチドに付けるために化学修飾された誘導体（例えば、アミダイト、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルエステル、イソチオシアナート）として得ることができる。多数の会社（例えば、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド；Operon Biotechnologies、アラバマ州ハンツヴィル；IDT、アイオワ州コラールヴィル；Gene Link、ニューヨーク州ホーソーン；AnaSpec Inc.、カリフォルニア州フリーモント；BioSynthesis、テキサス州ルイスヴィル）が、かかる蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび化学修飾オリゴヌクレオチドの合成を提供している。
化学的に活性化された（修飾された）蛍光色素をオリゴヌクレオチドプローブ／プライマーに、オリゴヌクレオチド合成中に付けることができ（アミダイトケミストリー、PhAmケミストリー）、または合成後に付けることができる（NHSエステル、スクシンイミジルエステルもしくはイソチオシアナートで修飾された色素）。第一の方法（成長オリゴ鎖へのホスホロアミダイト結合色素基の組み込み）の方が適便であるが、5'アミノリンカー基を含有するオリゴヌクレオチドへの活性化色素（例えば、NHSエステル）の合成後カップリングも十分に確立されている。それにより、アミノ基は活性化色素と反応して、PCR、ハイブリダイゼーションおよび他の操作中に安定な共有結合を形成する。ホスホロアミダイト結合色素の例は、FAM、JOE、およびいくらかのCy色素である。
蛍光色素は、それらのピーク発光波長から典型的に20〜50nm青色シフトされるピーク励起波長を有する（ストークスシフト）。結果として、広範な発光波長にわたる色素の使用は、その発光波長範囲にわたってそれらの色素の効率的励起を達成するための励起波長に伴って、多数の励起源の使用を必要とし得る。例えば、FAMは、従来の青色アルゴンレーザー（488nmで励起極大）を使用して488nmで非常に効率的に励起されるが、Cy5.5は、同じレーザーによってあまり効率的に励起されない（Cy5.5励起極大は、673nmである）。かかる赤方シフト色素を効率的に励起させるための1つの方法は、蛍光エネルギー移動による方法であり、この方法は、例えば、FAMおよびCy5.5の効率的な単一レーザー励起を可能にする。これは、選択した光源によって効率的に励起される色素（吸収体）を、同じ光源によって励起されないが赤方シフト波長で発光する色素（発光体）の極近傍に付けることにより達成される。発光体の極近傍への吸収体の配置により、吸収したエネルギーの吸収体から発光体への移動が可能になり、その結果、長波長色素のより効率的な励起が可能になる。吸収体と発光体の最適な空間距離はフォルスター距離と呼ばれ、吸収体色素と発光体色素の間に適するスペーサー部分を配置することによって実験的に決定される。かかる部分は、単純な炭素スペーサー（例えば、C3、C6、C18リンカー）、オリゴヌクレオチドスペーサー、または修飾ヌクレオチドであり得、それらの2つの色素を化学的に連結させて最適な距離を維持することができる。吸収体色素と発光体色素の間の最適な間隔は、吸収体の励起、発光体へのエネルギー移動、および発光体色素のみの蛍光発光を生じさせる結果となる。色素間の間隔を離し過ぎると、蛍光エネルギー移動が非効率的になり、発光体は、その蛍光極大波長で発光し得る。対照的に、吸収体と発光体の間隔を近づけ過ぎると、蛍光消光（無蛍光／発光）が観察され得る。
最後に、色素は、増幅断片の電気泳動移動度を改変することがある。一般的に、これは、改変された移動度が異なる遺伝子座からのアンプリコンとのオーバーラップの原因とならない限り、重要な問題ではない。かかる改変移動度がオーバーラップの原因となる比較的珍しい事象では、（例えば、オーバーラップする遺伝子座の大きい方のアンプリコンを生じさせる遺伝子座の標識プライマーの5’末端に塩基を付加させることにより）そのオーバーラップをなくすようなプライマー設計が必要とされる。
当業者に公知の幾つかのパラメータを用いて、本明細書に記載するPCR増幅を最適化することができる。前記プロトコルの最適化の基準としては、フルプロフィールの生成、シグナル長、ダイナミックレンジ、遺伝子座間シグナル強度バランス、PHR、不完全NTA、スタッター、および総サイクル時間が挙げられる（Hill, CR, Butler, JM, Vallone, PM. A 26plex Autosomal STR Assay to Aid Human Identity Testing. J Forensic Sci 54:1008-1015. 2009. Brownstein, MJ, Carpten, JD, Smith, JR. Modulation of Non-Template Nucleotide Addition by Taq DNA Polymerase: Primer Modifications that Facilitate Genotyping. BioTechniques 30:1004-1010. 1996. SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories. 2010. http://www.fbi.gov/about-us/lab/codis/swgdam-interpretation-guidelines）。
いくらかの実施形態において、少なくとも10、20または30多重PCRサイクルについての総サイクリング時間は、約1分〜約90分の範囲であり得る。いくらかの実施形態において、少なくとも10、20または30多重PCRサイクルについての総サイクリング時間は、約1分〜約90分；または約1分〜約85分；または約1分〜約80分；または約1分〜約75分；または約1分〜約70分；または約1分〜約65分；または約1分〜約60分；または約1分〜約55分；または約1分〜約50分；または約1分〜約45分；または約1分〜約40分；または約1分〜約35分；または約1分〜約30分；または約1分〜約25分；または約1分〜約20分；または約1分〜約15分；または約1分〜約10分または約1分〜約5分の範囲である。他の実施形態において、少なくとも10、20または30多重PCRサイクルについての総サイクリング時間は、約90分未満である。さらに他の実施形態において、少なくとも10、20または30多重PCRサイクルについての総サイクリング時間は、約89、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2または1分未満である。
本明細書に記載する方法を、従来のPCRサーマルサイクラー、例えば、GeneAmp（登録商標）PCR Systems 9700（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して行うことができると考えられる。各反応チャンバーを薄壁反応チューブの中に収容することができる。薄壁反応チューブは、約200μm未満の壁厚を好ましくは有する。好ましくは、薄壁反応チューブは、約100μm未満の壁厚を好ましくは有する。
本明細書におけるPCR増幅方法を、マイクロ流体バイオチップ、例えば、「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号明細書、および「Unitary Biochips」と題する米国特許第13/044,485号明細書に記載されているものを使用して行うことも考えられ、前記特許文献の双方が参照により本明細書に援用されている。各反応チャンバーをバイオチップ（例えば、マイクロ流体バイオチップ）の中に収容することができる。
いくらかの実施形態では、バイオチップを使用して本発明の方法を行うことができる。あるバイオチップ設計は、マイクロ流体分野の基本目的、すなわち、オペレーターなしでのサンプルの挿入から結果の生成までの複雑なプロセスにおけるいくらかの工程またはいくらかの実施形態ではすべての工程の集積化、を達成することができる。いくらかの実施形態において、前記バイオチップを完全集積化することができ；ならびに法医学サンプルからショート・タンデム・リピート（STR）プロフィールを生成するための、細胞溶解、DNA精製、多重増幅、ならびに電気泳動分離および検出を含む、複雑なサンプル・イン・トゥー・リザルツ・アウト分析（sample in to results out analysis）；臨床サンプルからDNA配列を生成するための、細胞溶解、DNA精製、多重増幅、サンガーシークエンシング、限外濾過ならびに電気泳動分離および検出を含む、複雑なサンプル・イン・トゥー・リザルツ・アウト分析；バイオ脅威（biothreat）サンプルからDNA配列を生成するための、核酸精製、逆転写、多重増幅、サンガーシークエンシング、限外濾過ならびに電気泳動分離および検出を含む、複雑なサンプル・イン・トゥー・リザルツ・アウト分析；ならびにヒト、細菌およびウイルス臨床および研究サンプルからゲノムDNA配列を生成するための、核酸精製、ライブラリー構築および単一分子シークエンシングを含む、複雑なサンプル・イン・トゥー・リザルツ・アウト分析を行うことができる。
いくらかの実施形態では、サンプル操作をバイオチップで行い、該サンプル操作は、核酸抽出と；細胞溶解と；細胞分離と；差次的細胞溶解（differential cell lysis）と；分別濾過と；全核酸精製と；DNA精製と；RNA精製と；mRNA精製と；タンパク質精製と；核酸増幅前清浄化と；核酸増幅（例えば、シンプレックスおよび多重双方のエンドポイントPCR、リアルタイムPCR、逆転写PCR、非対称PCR、ネステッドPCR、LATE PCR、タッチダウンPCR、デジタルPCR、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅、ならびに多置換増幅)と；Y-STR増幅と；ミニSTR増幅と；一塩基多型分析と；VNTR分析と；RFLP分析と；核酸増幅後清浄化と；核酸シークエンシング前清浄化と；核酸シークエンシング（例えば、サンガーシークエンシング、パイロシークエンシング、および1分子シークエンシング)と；核酸シークエンシング後清浄化と；逆転写と；逆転写前清浄化と；逆転写後清浄化と；核酸ライゲーションと；SNP分析と；核酸ハイブリダイゼーションと；電気泳動分離および検出と；イムノアッセイと；結合アッセイと；タンパク質アッセイと；酵素的アッセイと；質量分光分析と；核酸およびタンパク質定量との組み合わせを含む。
いくらかの実施形態では、バイオチップにより、未処理生体サンプルからの核酸および他の生体成分を精製、操作および分析することができる。未処理生体サンプルは、個体により採取され、その後、中間処理工程なしで（処理前にサンプル採取デバイスが標識および／または保管されることはあるが）、バイオチップのサンプル受け入れチャンバーに挿入されるサンプルである。オペレーターは、サンプルを採取しまたは別様に得、そのサンプルを装置に挿入し、その装置に計器を挿入し（その装置に予めその計器が配置されていれば必要ない）、そしてスタートボタンを押すだけですむ。装置への挿入前にサンプルを処理、操作または修飾する必要はない−オペレーターは、スワブを切断する必要がなく、血液チューブを開ける必要がなく、組織および生体液を採取する必要がなく、サンプルを別のホルダーに移す必要がなく、ならびにサンプルを試薬および条件（例えば、加熱、冷却、振動）に付す必要がない。したがって、オペレーターは、生物科学および検査室技術の広範な訓練を受ける必要がない。場合により、バイオチップは、処理済み生体サンプル（例えば、その後の精製のための細胞溶解産物）を受け入れることがあるが、かかる用途には、技術的訓練を受けたオペレーターが必要とされ得る。
実際、生体サンプルは、無数の採取デバイスを使用して採取され、それらのデバイスのすべてを、本明細書に記載する方法で使用することができる。前記採取デバイスは、一般的に市販されているが、所与の用途のために特異的に設計および製造することもできる。臨床サンプルには、鼻、鼻咽頭、口内、口腔液、糞便、扁桃、膣、子宮頚および創傷スワブを含めた、様々な市販用スワブタイプを利用することができる。サンプル採取デバイスの寸法および材料は様々であり、該デバイスは、専用ハンドル、キャップ、切断を促進および指示するためのスコア、ならびに採取マトリックスを含有することがある。血液サンプルは、多種多様な市販チューブに様々な体積で採取され、それらのチューブの一部は、添加剤（抗凝血剤、例えば、ヘパリン、クエン酸塩、およびEDTA）、サンプル進入を促進するためのバキューム、針挿入を促進するためのストッパ、およびオペレーターをサンプルへの曝露から防護するためのカバーを含有する。血液チューブとは一般的に異なるチューブに、組織および体液（例えば、痰、膿状物質、吸引物）も採取される。これらの臨床サンプル採取デバイスは、（迅速連鎖球菌テストのための咽頭／扁桃スワブの評価などのある種の試験は、ポイント・オブ・ケアで行われる場合があるが）、一般的に、試験のために最新技術の病院または商業臨床研究所に送られる。環境サンプルは、フィルターもしくはフィルター・カートリッジ（例えば、エア・ブリーザ、エアロゾルまたは水濾過デバイスからのもの）、スワブ、紛体または流体であり得る。
法医学的証拠についての一般採取法は、スワブを使用して行われる。スワブは、Bode（バージニア州ロートン）、Puritan（メイン州ギルフォード）、Fitzco（ミネソタ州スプリングパーク）、Boca（フロリダ州コーラルスプリングズ）、Copan（カリフォルニア州ムリエタ）およびStarplex（カナダ国オンタリオ州エトビコー）から市販されている。ガーゼ様材料、使い捨てブラシ、または市販の生体サンプル採取キットを使用してスワッビングを行うこともできる。法医学サンプルは、血液、精液、上皮細胞、尿、唾液、糞便、様々な組織、および骨を含有し得る。人に存在する個体からの生物学的証拠は、多くの場合、口内スワブを使用して採取される。広範に使用されている市販用口内スワブは、SecurSwab（The Bode Technology Group、バージニア州ロートン）である。口内サンプルは、スワブを頬の内面に置いてそのスワブを1回以上、上下に動かすように被験者またはオペレーターに指示することによって採取される。
いくらかの実施形態では、本明細書に記載する方法においてバイオチップを用いて、多数のサンプルに関する複雑なプロセスを並行して行う。いくらかの実施形態では、同一の操作セットを用いて多数のサンプルを処理し、または場合に応じた操作セットを使用して各サンプル（もしくはサンプルのサブセット）を処理する。いくらかの実施形態では、幾つかの独立した分析を所与のサンプルについて行う。例えば、法医学サンプルは、DNAを単離し、その後、その精製された材料に関するSTR分析、SNP分析およびミトコンドリアシークエンシングを行うことによって分析することができる。同様に、臨床サンプルは、核酸およびタンパク質を精製し、PCR、逆転写PCR、DNAシークエンシングおよびイムノアッセイを行うことによって分析することができ、（例えば）単一のバイオチップを用いて所与のサンプルを多数の病原体および細胞プロセスについて同時に問い合わせることが可能になる。
バイオチップ動作およびデータ分析のために一連のソフトウェアおよびファームウェアを提供することができる。成分機能を命令し、計器の自己テストを行うソフトウェアおよびファームウェアによって計器ハードウェアを制御する。すべてのスクリプトプロセス工程の適用を含む、計器とバイオチップのすべての相互作用を自動スクリプトが制御する。分析用ソフトウェアは、生データ（例えば、電気泳動図の色補正）の処理と、アッセイ結果の場合は分析（例えば、断片サイズ測定、STRアレルコーリング、DNA配列分析）の双方を行う。前記計器は、ユーザーにプロセスを開始させ、ユーザーにプロセスステータスの情報を伝える、グラフィカル・ユーザー・インターフェースを含有することがある。最後に、前記システムは、関連分析コンパレータ（例えば、対象となる個体からのSTRプロフィール、もしくは病原体のDNA配列）を記憶することができ、または前記システムは、外部データベースマッチングおよびさらなる分析のために結果をポートアウトすることができる。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびそれらの様々な使用を例示するものである。単に説明を目的として示すものであり、本発明を制限するものと解釈してはならない。
実施例１
STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、ならびにSE33およびアメロゲニン遺伝子座の5色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この多重設計の第一の工程は、遺伝子座選択を必要とする。幾つかの基準を用いて何十万もの利用可能な多型遺伝子座から選択したが、主要識別因子は、各遺伝子座の多型度であった。より類似した頻度を呈示するより多くのアレルを有する遺伝子座は、より高いヘテロ接合性
STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、ならびにSE33およびアメロゲニン遺伝子座の5色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この多重設計の第一の工程は、遺伝子座選択を必要とする。幾つかの基準を用いて何十万もの利用可能な多型遺伝子座から選択したが、主要識別因子は、各遺伝子座の多型度であった。より類似した頻度を呈示するより多くのアレルを有する遺伝子座は、より高いヘテロ接合性
（Weir, BS. Genetic Data Analysis II, Chapter 4, p.141. Sinaeur Associates Inc, Publishers 1996）およびより高い多型情報含有値（
、Botstein, D, White, RL, Skolnick, M, Davis, RW. Construction of a genetic Linkage Map in Manu Using Restriction Fragment Length Polymorphisms, Am J Hum Genet 32:314-331, 1980）を提示する。この特徴は、DNAサンプル源の互いのマッチングにかなり有利である。個体の遺伝子座の高い多型情報含有値は、類縁個体を含む親子および血縁関係分析において特に重要である。ゲノムが、これらの分析に好ましい非連鎖遺伝子座を限られた数しか収容できないからである。それ故、他の因子が選択に影響を及ぼさない限り、多くのアレルを有する高多型遺伝子座を一般的に選択した。
もう1つの重要な因子は、米国および世界中で法の執行のために利用されている遺伝子座を含めることであった。すべての国が同定に同じSTR遺伝子座セットを使用するとは限らない。異なる国が異なる遺伝子座セットを使用するという事実は、ある国のデータベースを別の国で収集されたプロフィールに関して検索することの有用性を低減させる。すべての米国標準STR遺伝子座ならびに世界中の司法管轄区で常例的に利用されているすべての遺伝子座を含むプライマーセットを開発することにより、データベース検索および個体同定は、はるかに情報価値の高いものなるであろう。前記多重は、世界中からのデータベース検索に適する遺伝子座を含有するので、このアプローチは、移民検査および国際犯罪に関係したサンプルの検査での使用についてさらなる利点を提供する。
25STR遺伝子座に加えてアメロゲニン遺伝子座を含有する多重を表3に示すように設計した。この多重は、米国CODISデータベースにおいて是認されている13のSTR遺伝子座すべて（表3、米国CODIS列）ならびにEuropean DNA Profiling（EDNAP）GroupおよびEuropean Network of Forensic Science Institutes（ENFSI）により欧州諸国において標準化に推奨されているもの［Schneider, PM. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci-The Current Situation. Profiles in DNA, Promega Corporation, March 2009. http://www.promega.com/resources/articles/profiles-in-dna/2009/expansion-of-the-european-standard-set/］（表3、欧州EDNAP／ENFSI列）を含む。3つの異なる遺伝子座がオーストリア国家データベースに組み入れられており、ドイツデータベースには1の異なる遺伝子座、SE33、が組み入れられている。最後に、増幅アレル間で観察される分離増加のため価値があるペンタヌクレオチド遺伝子座も含める。
多重内のSTR遺伝子座の配置は、分離システムで検出することができる断片の範囲、分離システムの分解能（識別すべき2つの断片の分子量に基づき変化し得る）および、電気泳動分離の場合、分離中に検出することができる蛍光色素の数を含む、幾つかの考慮事項に基づく。25STR／アメロゲニン多重は、比較的少数の稀なミクロ変異アレル（すなわち、整数のリピート長が他のものと異ならないアレル）を有する4および5塩基リピート遺伝子座をより大きいアンプリコン位置に配置する。このアプローチには、（所与の分離プラットホームおよび所与の分離時間に関して）より高い分子量範囲のアレルの分析を、最低分解能を概して有する領域内にこれらのアレルを配置することによって最適化するという利点がある。 高分子量範囲の前記比較的少数の稀なミクロ変異アレルを有するさらなる4および5塩基リピート遺伝子座の配置と同時に、より低い分子量範囲の3つの塩基リピートを含有する高多型遺伝子座（すなわち、D22S1045）およびより高頻度のミクロ変異遺伝子座を配置することが、この多重設計の重要な態様である。高分子量範囲の5塩基分離でのアレルは、より一般的に用いられている4または3塩基STRリピートより容易に分離するので、組み入れられた遺伝子座のフルスペクトルにわたってのアレルのより迅速な分離がこの同じ設計特徴によて可能になる。このアプローチは、多重設計の高分子量範囲の使用向上を可能にし、各色素で標識された高多型特性を有するより多くの遺伝子座の組み入れとを可能にし、最終的には、より多くのこれらの遺伝子座の多重への組み入れを可能にする。25STR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座を合計4色で標識し（第5の色を使用してサイズマーカーを標識し）、74塩基から485塩基の総分子量範囲にわたって配置した。本発明者らはまた、分解サンプルが何らかの高分子量情報を消去する事象での情報の喪失を制限するために、より大きいアンプリコン箇所の複数の位置に最小共通使用遺伝子座を配置した。
図1は、単一反応での26の遺伝子座の共増幅を可能にする設計を示す。第一のパネルは、遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta Bについてのものを含む、FAMで標識した遺伝子座を示し、第二のパネルは、遺伝子座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta Cについてのものを含む、JOEで標識した遺伝子座を表示し、第三のパネルは、遺伝子座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta Dについてのものを含む、カルボキシ−テトラメチルローダミン（TMR）で標識した遺伝子座を表示し、第四および五のパネルは、遺伝子座D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGAおよびSE33についての5,6-カルボキシローダミン6G（CXR）で標識した遺伝子座を表示する。第六のパネルは、分析に含めたサイズマーカーを構成するCC5標識断片を表示する。
多重STRセットの構築は、該ミックスにおいて計画外のプライマー相互作用によって生じるアーティファクトの削除を必要とすることがある。例えば、ある遺伝子座の標識プライマーが別の遺伝子座の未標識プライマーと協調して作用して、意図されない配列をポリメラーゼ連鎖反応中に増幅することがある。これは、ゲノム標的DNAに関して起こるが、設計したアンプリコンの濃度が反応中に増加するにつれて起こる可能性が高くなる；この増加は、偶発的増幅事象が発生する（その結果、アーティファクト産物が生ずる）より高いテンプレート濃度をもたらす。一旦生成されると、かかるアーティファクトは、問題のあるプライマー対との完全マッチをもたらし、そして後続の増幅ラウンドにおいて効率的に増幅する。
かかるアーティファクトを解消するには、多重の中のどの2つのプライマーが、問題の特異的アーティファクト（単数または複数）を生じさせるのかを特定することが有用である。これは、それらの存在および不在がアーティファクト（単数または複数）の存在および不在とそれぞれ一致する2つの特定のプライマーが同定されるまで、個々のプライマーまたはプライマー群をそのミックスから系統的に削除することによって達成される。原因となるプライマーが同定されたら、それらのアーティファクトを様々な方法で削除することができる。これらには、（1）問題のあるプライマーを含有するプライマー対の一方をより少なく使用すること、（2）3’末端への塩基の付加により、もしくは新たな結合部位に完全に設計し直すことにより、一方もしくは双方の問題のあるプライマーの配列を変更すること、（3）標識プライマーを未標識に変更し、未標識プライマーをプライマー対で標識する（したがって、アーティファクト（単数もしくは複数）を検出不能にする）こと、または（4）意図されない生成物の生成を減少させるように一方もしくは双方の対の中の未標識プライマーに対する標識の比を修飾すること、が挙げられる。経験的分析を用いて、各々のアーティファクトまたはアーティファクトのセットに関してアーティファクト低減を達成するために最も有効な手段を決定する。
遺伝子座対遺伝子座バランスも法医学的に有用な多重セットの作成に重要である。このことに関して、初期プライマー設計は、それらのそれぞれの融解温度が互いに類似しているプライマーの設計を含む。増幅プロセスで用いるアニーリング温度をこの融解温度より低く設定して、すべてのプライマー標的が、主として、変性状態ではなく相補的プライマーを有するデュプレックス状態であることを確実にする。そうであっても、サイクルあたりの相対増幅効率は、遺伝子座によって異なり、その結果、ある遺伝子座を他の遺伝子座より多く提示する最終多重増幅生成物が生ずることがある。このインバランスを克服する1つの方法は、いくらかのプライマーの濃度を増加させる一方で、他のものの濃度を低下させて、増幅プロセスに影響を及ぼす他の因子の一部を補償する方法である。1増幅ラウンドにつき2倍より大きい増加に増幅効率を向上させることは決してできないので、このアプローチには限界がある。
26のSTR遺伝子座の各々についてのプライマー配列を、表4にリストするプライマー配列を含む単一溶液に併せた。
この26プレックス25-STR溶液を用いて、ヒトゲノムDNAテンプレート（株9947）を単一反応容器において個々の遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGAおよびSE33で同時に増幅した。前記PCR増幅をマイクロ流体バイオチップにおいて7μL反応で行った。前記PCRバイオチップ（図2A）をスライド形式で射出成形し、図2Bの高速サーマルサイクラーを使用して迅速な多重PCRについて順次試験した。このバイオチップは、25mm×75mm×1.1mm厚である。このシステムは、単一ゲノム当量のヒトDNA（6pgのDNA、本質的に単一コピー検出限界）からのSTR断片に関する多重増幅を可能にする。反応は、本質的にGiese, H.,ら (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96に記載されているように行った。31サイクルプロトコルを適用して、サーマル・サイクリング・チャンバー内で反応をサイクリングして標識アンプリコンを生成した。サイクリング条件は、次のとおりであった：ホットスタート93℃×20秒、続いて31サイクルの（93℃×4秒、56℃×15秒、そして70℃×7秒）、続いて70℃×90秒の最終伸長。「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号明細書、および「Unitary Biochips」題する米国特許出願第13/044,485号明細書も参照されたし（これら特許文献の双方が参照により本明細書に援用されている）。下の実施例6において説明するようにNetBioのGenebench-FXを使用して、増幅生成物を分離し、検出した。
図3は、得られた26プレックス反応の各遺伝子座についての増幅生成物の色補正スキャンを示す。26遺伝子座プライマーセットを使用して、NetBio GeneBench FX（商標）計器で分離および検出された各遺伝子座について断片を増幅した。第一のパネルは、遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta Bについてのものを含む、FAMで標識したピークを表示し、第二のパネルは、遺伝子座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta Cについてのものを含む、JOEで標識したピークを表示し、第三のパネルは、遺伝子座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta Dについてのものを含む、カルボキシ−テトラメチルローダミン（TMR）で標識したピークを表示し、第四および五のパネルは、遺伝子座D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGAおよびSE33についての5,6-カルボキシローダミン6G（CXR）で標識したピークを表示する。第六のパネルは、サイズマーカーを構成するCC5標識断片を表示する。
実施例1は、25の異なるSTR遺伝子座とアメロゲニン遺伝子座で有効な共増幅が達成されたこと、およびこれらの生成物が分離および検出されたことを実証するものである。これは、用いたプライマー配列が、増幅材料において観察される局所バックグラウンドノイズとは異なる断片に関する26遺伝子座の各々についての増幅生成物を生じさせるように十分よく設計されており、バランスがとられていることを示す。増幅材料は、ヒト株9947からの公知の標準DNAであったので、予想断片は既知であり、確認された。しかし、CXR標識D8S1179、FGAおよびSE33アレル範囲が、各々、他の6つのCXR標識遺伝子座のうちの1以上とかなりオーバーラップするため、5色素に制限したことが、いくらかのサンプルでの解釈を困難にするであろう。この制限を実施例2において克服し、実施例2は、6つの蛍光標識を利用して個々の色素各々の中の一意的サイズ範囲への各遺伝子座のアレルの完全分離を可能にする。
実施例２
25-STR遺伝子座多重。
実施例2は、25の異なるヒトSTR遺伝子座に加えてアメロゲニン遺伝子座の共増幅、ならびに同じ色素で標識した隣接アレルとのオーバーラップのない異なるアレルサイズ範囲へのそれらの共増幅生成物の分離および検出を表示するものである。この遺伝子座セットは、完全13 CODIS遺伝子座、8つのさらなる欧州、オーストリアおよびドイツ標準または提案標準遺伝子座、4つのPenta遺伝子座、および性別識別を可能にするためのアメロゲニンを含んだ。このアプローチは、法医学的型判定方法の統一、ならびに米国と世界中の多くの国々および機構との間でのより多くの有用なデータの共有を可能にする。この多重を使用してDNAサンプルを分析することができ、すると欧州における、米国における、および世界中のデータベースでの検索を支援することができ、その結果、これらの行為地のすべてにおいて法の執行、テロ対策および自国防衛努力を支援することができる。
25-STR遺伝子座多重。
実施例2は、25の異なるヒトSTR遺伝子座に加えてアメロゲニン遺伝子座の共増幅、ならびに同じ色素で標識した隣接アレルとのオーバーラップのない異なるアレルサイズ範囲へのそれらの共増幅生成物の分離および検出を表示するものである。この遺伝子座セットは、完全13 CODIS遺伝子座、8つのさらなる欧州、オーストリアおよびドイツ標準または提案標準遺伝子座、4つのPenta遺伝子座、および性別識別を可能にするためのアメロゲニンを含んだ。このアプローチは、法医学的型判定方法の統一、ならびに米国と世界中の多くの国々および機構との間でのより多くの有用なデータの共有を可能にする。この多重を使用してDNAサンプルを分析することができ、すると欧州における、米国における、および世界中のデータベースでの検索を支援することができ、その結果、これらの行為地のすべてにおいて法の執行、テロ対策および自国防衛努力を支援することができる。
遺伝子座アメロゲニン、D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGAおよびSE33の6色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。この多重設計例は、実施例1において説明したのと同じ遺伝子座を共増幅するプライマーよりなる。これは、遺伝子座D8S1179、FGAおよびSE33を、実施例1の場合のようなROX標識プライマーではなくこれら3つの遺伝子座のための第六の色素で標識したプライマーを含有するプライマー対を用いて増幅した点で異なる。前記第六の色素はDyLight 633であるが、多数の他の色素を必要に応じて用いることができる。この第六の色素に加えて、この多重における他の色素は、FAM、JOE、TMR、CXRおよびCC5である。
図4は、本発明の多重システムの開発に取り入れたアプローチの利点を例示する。各行の特定の遺伝子座を標識するために使用した色素を左の列にリストする（A488は、ATTO448色素を表す）。各遺伝子座についての近似アレルサイズを、この図の上部に示す縮尺から判定することができる。個体の集団における多くのアレル各々が表示する幾つかの高多型遺伝子座の多重への配置が非常に望ましい。しかし、分離中のDNA断片のより高分子量範囲の分解能の喪失は、作業可能なアンプリコンサイズ範囲に上限を作り、したがって、各蛍光色素で標識された遺伝子座の明確に分離および分析することができる数を制限する。色素の数を増加させることがこの制限を克服する1つの方法である（代替アプローチは、電気泳動システムによって分離される有効MW範囲を増加させることである）。D8S1179、FGAおよびSE33遺伝子座のための特異的プライマーにコンジュゲートさせた第六の蛍光色素の組み入れにより、オーバーラッピングアレルのアンプリコンを生じさせることなく、すなわち、同じ色素で標識されたプライマーを有する別の遺伝子座のアレルのサイズ範囲に出現する1つの遺伝子座を生成することなく、共増幅および独立した可視化を行うことが可能になる。
換言すれば、この25遺伝子座アッセイは、実質的非オーバーラッピングSTRアッセイである。実質的非オーバーラッピングアッセイの価値は、それらが、同じ様式で標識された隣接遺伝子座からのオーバーラッピングアレルから生ずる混乱の可能性を本質的になくすことである。STR遺伝子座サイズ範囲外に分類される稀なアレルのみがかかる混乱を引き起こし得る。実施例5の本発明者らの27プレックスアッセイの設計は、4つのかかる稀なオーバーラッピングアレルを有し、16プレックスABI Identifilerアッセイは、少なくとも6つの稀なオーバーラッピングアレルを有し、およびPowerplex 16プレックスアッセイは、8つのかかる稀なオーバーラッピングアレルを有する。これらの稀なアレルの大部分が、1回または数回の出現に基づき文献に報告されている。然るが故に、多数のSTR遺伝子座の評価を可能にし、その上、それらを実質的非オーバーラッピングアッセイとして維持することを可能にするような多重の設計が、本発明の主要な利点である。
実施例Iのアッセイを除いて、本実施例に提供するSTRアッセイのすべてが実質的非オーバーラッピングである。したがって、アレルを代表する断片をサイズもしくは色または双方による可視化および分析のために自信をもって分離する。これは、多くの集団に関する実質的集団データを多重に組み入れられた遺伝子座に利用できるため可能なのである。これらのデータを用いなければ、より少数の高多型遺伝子座の各々の色での表示を可能にするためにアレル範囲を実質的に互いに分離する必要があり、またはそれらを互いに近くに配置する場合には、同じ色の隣接遺伝子座のアレルサイズ範囲の実質的オーバーラップのリスクを処理する必要がある。
この実施例では、DNAテンプレート（株9947）を、個々の遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、FAM標識したPenta B遺伝子座、JOEで標識した遺伝子座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441およびPenta C、TMRで標識した遺伝子座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニンおよびPenta Dで同時に増幅し、遺伝子座D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1POおよびPenta EをCXRで標識し、ならびに遺伝子座D8S1179、FGAおよびSE33を単一の反応容器で第六の色素で標識する。実施例1において説明したようにPCR増幅を行う。増幅された生成物をCC5標識サイズマーカーと混合し、その後、実施例1において説明したようにNetBioのGenebench-FX（商標）を使用して分離し、検出する。
実施例３
35-STR遺伝子座多重設計
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D6S1043、D1SGATA113、D10S1435およびD11S4463の8色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。この35プレックス設計は、実施例1および2の25のSTR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座とさらなる9つのSTR遺伝子座を含む。
35-STR遺伝子座多重設計
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D6S1043、D1SGATA113、D10S1435およびD11S4463の8色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。この35プレックス設計は、実施例1および2の25のSTR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座とさらなる9つのSTR遺伝子座を含む。
図5は、増幅された遺伝子座セットの標識生成物に8つの色素を用いる設計を表示する（参照により本明細書に援用されている、「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号明細書を参照されたし）。遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045およびPenta Bを色素1で標識し、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441およびPenta Cを色素2で標識し、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニンおよびPenta Dを色素3で標識し、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1POおよびPenta Eを色素4で標識し、D8S1179、FGAおよびSE33を色素6で標識し、D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157およびD20S1082を色素7で標識し、ならびにD6S1043、D1SGATA113、D10S1435およびD11S4463を色素8で標識する。サイズ標準を色素5で標識する。
D6S1043遺伝子座は、染色体6上のSE33遺伝子座と物理的に近く、したがって、それと遺伝的に連鎖している。この多重システムに組み入れたD6S1043遺伝子座は、中国で使用されている。D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D1SGATA113、D10S1435およびD11S4463遺伝子座は、Hillら（2009、同誌）によって報告されている。これらの遺伝子座は、すべて、この多重セットに組み入れた他のすべての遺伝子座から実質的な物理的（染色体）距離を隔てて位置し、それが、この多重内での他の遺伝子座との遺伝連鎖の可能性を低くさせる。
多重システムへの34のSTR遺伝子座とアメロゲニン遺伝子座の組み入れは、以前に開発されたSTR多重セットに対して有意な複雑性を加える。少なくとも70のプライマーをこのミックスに組み入れ、それにより、アーティファクト発生の有害な帰結を伴うことなく同時共増幅が生ずる結果となる。8つの別個の色素標識を、各々に関してより少ない遺伝子座が増幅されるように組み込み、かくして高分子量アンプリコンのサイズ制限を可能にする。そしてまた、これが、増幅生成物のより迅速で正確な分離を可能にする。
実施例４
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437およびDYS438の8色増幅、分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この38-プレックス設計は、実施例1および2の25STR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座、実施例3のD6S1043遺伝子座、ならびにさらなる11のY染色体STR遺伝子座を含む。
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437およびDYS438の8色増幅、分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この38-プレックス設計は、実施例1および2の25STR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座、実施例3のD6S1043遺伝子座、ならびにさらなる11のY染色体STR遺伝子座を含む。
前記Y染色体遺伝子座は、血縁関係の判定において男性から男性への遺伝を調査しているときに有効である。常染色体STRとY STRの複合多重は、この多次元分析に別途有用性をもたらす。これらのY STR遺伝子座を使用して、数ある関係の中でも、おじ関係、祖父孫関係、男性同士の連鎖により関係づけられる男性のいとこ、および同じ父親からの男性半同胞関係を確立することができる。Y STRは、数世代の期間にわたって血縁関係を確立するために使用されている。それらは、2名の人を分析する際、介在する親族の男性が分析から抜けている場合（例えば、姪の父親であるおじの兄弟からのサンプルがない、おじと姪）に特に役立つ。それらはまた、父系の地理的祖先の決定に使用することができる点で付加価値をもたらす。したがって、これらの遺伝子座は、調査分析および血縁関係判定に極めて有用である。
この実施例は、増幅された遺伝子座セットの生成物を標識するための8つの色素の使用を含む。これは、各々の色素標識で生成された増幅生成物を個別的に分離および検出する能力を提供する。
図6は、増幅された遺伝子座セットの生成物を標識するために8つの色素を用いる設計を表示する。遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045およびPenta Bを色素1で標識し、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441およびPenta Cを色素2で標識し、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニンおよびPenta Dを色素3で標識し、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1POおよびPenta Eを色素4で標識し、D8S1179、FGAおよびSE33を色素6で標識し、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19およびDYS392を色素7で標識し、ならびにDYS393、DYS389I、DYS390、DYS385、DYS437およびDYS438を色素8で標識する。サイズ標準を色素5で標識する。
多重システムへの38のSTR遺伝子座とアメロゲニン遺伝子座の組み入れは、以前に開発されたSTR多重セットに対して有意な複雑性を加える。少なくとも76のプライマーをこのミックスに組み入れ、それにより、アーティファクト発生の有害な帰結を伴うことなく同時に共増幅が生ずる結果となる。8つの別個の色素標識を、各々に関してより少ない遺伝子座が増幅されるように組み込み、かくして高分子量アンプリコンのサイズ制限を可能にする。そしてまた、これが、増幅生成物のより迅速で正確な分離を可能にする。
実施例５
遺伝子座選択および多重設計。
STR遺伝子座を、米国および欧州データベースでのそれらの使用是認に主として基づき、27遺伝子座多重アッセイへの組み入れに選択した。これらの遺伝子座は、表5に収載されており、13 CODISコアSTR遺伝子座（Budowleら Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci. 1999;44:1277-86）、欧州標準12 STR遺伝子座（これらのうちの7つは、CODIS遺伝子座と重複している）、オーストリアデータベースで使用されているアメロゲニン遺伝子座、D2S1138およびD19S433遺伝子座、ならびにドイツデータベースで使用されているSE33遺伝子座（Parsonら Efficient DNA database laboratory strategy for high through-put STR typing of reference samples. Forensic Sci Int. 2001;122(1):1-6；Schneider. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci−the Current Situation. Profiles in DNA. 2009;12(1):6-7）を含む。加えて、拡張CODISコアSTRセットへの組み入れが最近提案されたPenta D、Penta EおよびDYS391遺伝子座（Hares. Expanding the CODIS core loci in the United States. Forensic Sci Int Genet. 2012;6(1):e52-4）、中国で一般的に使用されているD6S1043遺伝子座を組み入れ、およびその大きいリピート長のためさらなるペンタヌクレオチド遺伝子座、Penta Cも組み入れた。
遺伝子座選択および多重設計。
STR遺伝子座を、米国および欧州データベースでのそれらの使用是認に主として基づき、27遺伝子座多重アッセイへの組み入れに選択した。これらの遺伝子座は、表5に収載されており、13 CODISコアSTR遺伝子座（Budowleら Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci. 1999;44:1277-86）、欧州標準12 STR遺伝子座（これらのうちの7つは、CODIS遺伝子座と重複している）、オーストリアデータベースで使用されているアメロゲニン遺伝子座、D2S1138およびD19S433遺伝子座、ならびにドイツデータベースで使用されているSE33遺伝子座（Parsonら Efficient DNA database laboratory strategy for high through-put STR typing of reference samples. Forensic Sci Int. 2001;122(1):1-6；Schneider. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci−the Current Situation. Profiles in DNA. 2009;12(1):6-7）を含む。加えて、拡張CODISコアSTRセットへの組み入れが最近提案されたPenta D、Penta EおよびDYS391遺伝子座（Hares. Expanding the CODIS core loci in the United States. Forensic Sci Int Genet. 2012;6(1):e52-4）、中国で一般的に使用されているD6S1043遺伝子座を組み入れ、およびその大きいリピート長のためさらなるペンタヌクレオチド遺伝子座、Penta Cも組み入れた。
27遺伝子座の共増幅を可能にするための多重設計の作成には反復的プライマー設計および試験が必要であった。増幅生成物は、500塩基未満であった。なぜなら法医学サンプル抽出物が、時にはこの長さ以下の長さのDNAサンプルを含有するからである。各遺伝子座についての必要最小および最大アンプリコン長は、各遺伝子座について入手できるNIST STRbaseデータおよびNCBI DNA配列の再調査から決定した（米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）ホームページ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists/；米国国立標準技術研究所（National Institute for Standards and Technology）ホームページ：http://www.cstl.nist.gov/strbase/）。幾つかのケースでは、新たなアレルが市販用キットの導入後に発見されたので、この多重におけるアンプリコン範囲を、市販のアレリックラダーによって代表される範囲と比較して拡張した。この実施例に記載する多重におけるさらなる11の遺伝子座の組み入れおよび個々の遺伝子座の指定アンプリコン範囲の拡大にもかかわらず、この27プレックスアッセイは、隣接遺伝子座にわたってアレルがオーバーラップする可能性のあるケースを4ケースしか有さず、これらは非常に稀なアレルでしか起こらないであろう。これは、6対の隣接遺伝子座がオーバーラップする可能性のあるIdentifiler Kit、および8対の隣接遺伝子座がオーバーラップする可能性のあるPowerplex 16 Systemに好適に比較される − 双方のキットは、27遺伝子座アッセイと比較して遺伝子座同士のオーバーラップに関してはるかに低いSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有する。
前記選択遺伝子座についての大きな遺伝子座数および拡大されたアンプリコンサイズ範囲に対応するために、6つの蛍光色素を使用してPCRプライマーを標識した。この多重設計を図7に模式的形式で表示する。図7は、27遺伝子座多重設計を示す。27遺伝子座すべてについてのアレルを代表する増幅生成物の近似サイズ範囲をサイズマーカーの上に表示する。各サイズマーカー断片をその対応する塩基サイズと共に示す。各アンプリコンを標識するために使用した蛍光色素をそれぞれの遺伝子座名各々の左に示す。次の遺伝子座略号を用いる：A=アメロゲニン、D10＝D10S1248、D22＝D22S1045、Y＝DYS391
実施例６
5、6および8色光学検出および電気泳動器具。
NetBioのGenebench-FX（商標）を使用して、実施例1の増幅生成物を分離し、検出した。この計器は、STR分析、DNAシークエンシングおよびSNP型判定のために開発および最適化されたものであり、研究室および先行予測型医療利用のために堅牢化されている。それは、Gieseら (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96、ならびに「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acids and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号、「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号、「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第 12/080,751号、および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号に記載されており、前記文献のすべてが参照により本明細書に援用されている。2.7μLの各増幅生成物に、9.87μLのホルムアミドおよび1.02μLのCC5-ILS（内部レーン標準、Promega Corporation、カタログ#DG1521）を添加した。サンプルを分離バイオチップに負荷し、350V/cmの電場を90秒間印加することによって分離チャネルに電気泳動で移動させた。この後、150V/cmの電場をその分離チャネルに沿って印加して、DNA断片を分離した。すべての分離を50℃で行った。分離された生成物に付いている色素を固体（488nm）レーザーで励起させ、蛍光をダイクロイックフィルターおよびバンドパスフィルターによって波長分離し、1セット5本の光電子倍増管によって検出した。得られたプロフィールをデータ処理および色分離ソフトウェアに付して、それらの個々の色素中の代表される断片を表示した。
5、6および8色光学検出および電気泳動器具。
NetBioのGenebench-FX（商標）を使用して、実施例1の増幅生成物を分離し、検出した。この計器は、STR分析、DNAシークエンシングおよびSNP型判定のために開発および最適化されたものであり、研究室および先行予測型医療利用のために堅牢化されている。それは、Gieseら (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96、ならびに「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acids and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号、「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号、「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第 12/080,751号、および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号に記載されており、前記文献のすべてが参照により本明細書に援用されている。2.7μLの各増幅生成物に、9.87μLのホルムアミドおよび1.02μLのCC5-ILS（内部レーン標準、Promega Corporation、カタログ#DG1521）を添加した。サンプルを分離バイオチップに負荷し、350V/cmの電場を90秒間印加することによって分離チャネルに電気泳動で移動させた。この後、150V/cmの電場をその分離チャネルに沿って印加して、DNA断片を分離した。すべての分離を50℃で行った。分離された生成物に付いている色素を固体（488nm）レーザーで励起させ、蛍光をダイクロイックフィルターおよびバンドパスフィルターによって波長分離し、1セット5本の光電子倍増管によって検出した。得られたプロフィールをデータ処理および色分離ソフトウェアに付して、それらの個々の色素中の代表される断片を表示した。
前記Genebench FX計器は、先行予測型医療用途用に堅牢化されており、低い電力消費量を有し、Low Voltage Directive 73/23/EECで市販されているCEである。分離および検出を行うために、マイクロ流体バイオチップをこの計器のバイオチップチャンバーに配置する。そのバイオチップチャンバーが高電圧、励起および検出、ならびにサーマルサブシステムの連結をバイオチップにもたらす。1セットの電極板によってバイオチップに高電圧を印加する。この計器とバイオチップ間の接触は、チップチャンバーのカバー上のポゴピン接続部によって果たされる。高電圧サブシステムが分離チャネルへの10KVまでの印加を可能にし、および場合により、サンプル負荷チャネルへの1.5KVまでの印加を可能にする。空気圧を用いて分離チャネルにサンプルを負荷することもできる。予めプログラムされたスクリプトが、切換え構成、電圧レベル、および電力供給のタイミングを制御することにより自動動作を可能にする。バイオチップを正確かつ一貫して加熱するために、抵抗フォイルヒーターをバイオチップチャンバー内のヒータープレートに取り付ける。
レーザー、検出器および光路よりなる前記光学システムは、分離チャネルに沿ってバイオチップの励起および検出窓へと電気泳動により進む色素標識DNA分子をレーザーで励起させ、蛍光を検出する。光励起は、200mW、488nmレーザー（Coherent、カリフォルニア州サンタクララ）によって遂行する。ダイクロイックミラーとバンドパスフィルター（Omega Optical、バーモント州ブラトルバラ）と5本の光電子倍増管（PMT）（Hamamatsu、ニュージャージー州ブリッジウォーター）のセットによって多色検出を遂行する。レンズと検流計と10倍対物レンズのセットが、バイオチップをレーザーおよび検出器につなぐ。検出は、ステップ・ステア・アプローチを用いて遂行し、このアプローチでは、第一のチャネルを励起させるおよびこのチャネルからの蛍光を一定の積分時間にわたって収集する位置に検流計を配置する。その後、隣接チャネルからの蛍光を励起させ、収集する位置に検流計を配置し、バイオチップ内のすべてのチャネルに問い合わせるまでこのプロセスを繰り返す。単色または多色定量に加えて、この光学構成は、4色DNA配列分析、1〜5色SNP分析、ならびに4色および5色多重DNA断片サイズ測定アッセイを行うことができる。
6色および8色反応の増幅生成物を、Genebench FX光路の改良に基づく計器で分離した。このアプローチは、「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許第8,018,593号明細書に記載されている。この改良計器は、Genebench FX計器のダイクロイックミラー、バンドパスフィルターおよび個別の光電子倍増管検出器の代わりに分散回折格子およびリニアアレイ検出器を備えた分光器よりなる検出システムの開発に基づく。
以下の仕様を有する分光器（図8A）を選択した：
−収差補正凹面ホログラフィック回折格子。この回折格子設計が、単一光学素子を備えた分光器を可能にする。
−固定回折格子マウント。この回折格子を分光器内にしっかりと取り付け、適所にロックする。波長較正のために、回折格子マウント上の止めねじをはずし、回折格子を回転させることによって回折格子配向の調整を行う。回折格子をしっかりと取り付けることが分光器の丈夫さを増す。
−焦点距離。必要分解能（1〜5nm）と同時に最小フットプリントの維持、双方を満たすために100mm焦点距離を選択する。
−ピンホール。分光器の入口の1.0mmピンホールが、最大集光および背景光低減を可能にする。
−出力窓。32mm×10mmの出力窓が、波長分離光によるリニアアレイ検出器への画像形成を可能にする。
−検出器取り付け。リニアアレイ検出器を取り付けるための四条ねじ穴が分光器の出力窓辺りにある。
−収差補正凹面ホログラフィック回折格子。この回折格子設計が、単一光学素子を備えた分光器を可能にする。
−固定回折格子マウント。この回折格子を分光器内にしっかりと取り付け、適所にロックする。波長較正のために、回折格子マウント上の止めねじをはずし、回折格子を回転させることによって回折格子配向の調整を行う。回折格子をしっかりと取り付けることが分光器の丈夫さを増す。
−焦点距離。必要分解能（1〜5nm）と同時に最小フットプリントの維持、双方を満たすために100mm焦点距離を選択する。
−ピンホール。分光器の入口の1.0mmピンホールが、最大集光および背景光低減を可能にする。
−出力窓。32mm×10mmの出力窓が、波長分離光によるリニアアレイ検出器への画像形成を可能にする。
−検出器取り付け。リニアアレイ検出器を取り付けるための四条ねじ穴が分光器の出力窓辺りにある。
収差補正凹面ホログラフィック回折格子をこの分光器での使用に選択する。前記回折格子仕様は、次のとおりである：
−結像面の平坦領域。これらの回折格子は、リニアアレイ検出器への直接画像形成のために、平面上の入口スリットからの光を平行にし、再集束させる（図8B）。
−サイズ。42.4×42.4mmの回折格子は、最大集光を可能にする。
−溝密度。1200溝／mmの回折格子により、必要波長範囲および必要分解能を満たすことができる。
−ブレーズ波長。ほぼ可視範囲に中心があるピーク回折格子効率を達成するために、450nmのブレーズ角を選択する。
−分散。溝密度によって規定される、7nm/mmの分散を達成する。これは、出力時に32mmの結像面全域での224nmの波長範囲の画像形成を可能にする。
−波長範囲 − 350〜850nmの波長範囲は、可視色素の発光スペクトル（520〜700nmの範囲）の分離、および波長較正のためのレーザー発光（488および514nm）の検出を可能にする。
−結像面の平坦領域。これらの回折格子は、リニアアレイ検出器への直接画像形成のために、平面上の入口スリットからの光を平行にし、再集束させる（図8B）。
−サイズ。42.4×42.4mmの回折格子は、最大集光を可能にする。
−溝密度。1200溝／mmの回折格子により、必要波長範囲および必要分解能を満たすことができる。
−ブレーズ波長。ほぼ可視範囲に中心があるピーク回折格子効率を達成するために、450nmのブレーズ角を選択する。
−分散。溝密度によって規定される、7nm/mmの分散を達成する。これは、出力時に32mmの結像面全域での224nmの波長範囲の画像形成を可能にする。
−波長範囲 − 350〜850nmの波長範囲は、可視色素の発光スペクトル（520〜700nmの範囲）の分離、および波長較正のためのレーザー発光（488および514nm）の検出を可能にする。
Genebench FXの光学ベースプレートを集積型波長分離および検出モジュールに適用するように改良した。前記集積型検出モジュールを前記ベースプレートに取り付けるための取り付けブラケットを設計し、製造した。入力ポートの位置選定がGenebenchの検出路長を保つように、前記集積型検出モジュールを前記ベースプレート上に配置する。注文設計・製造のマウント上の鏡を前記ベースプレート上に据え付る。前記鏡により、集積型波長モジュールまたは既存のフィルターおよび別個のPMTを動作させるための計器の容易な構成が可能になる（図8C）。光路のこれらの改良により、図8Dに示すビーム経路が生じる結果となる。
いくらかの実施形態では、合計9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40またはそれを超える蛍光色素を利用してプライマーを標識する。分光器、回折格子、検出器およびレーザーの様々な構成および組み合わせを適用して、これらの数の蛍光色素から蛍光を生じさせ、収集することができる。回折格子パラメータの指定によって波長範囲が割り当てられ、その中心波長によって波長範囲および主要波長が規定される。回折格子の波長範囲を拡張することによって、最大数の色素を検出することができる。波長範囲の圧縮は、より高い波長分解能を可能にする。波長範囲をより低波長にシフトさせることによって紫外色素の検出が可能になるであろうし、その一方で、波長範囲をより長波長にシフトさせることによって近赤外および赤外色素の検出が可能になる。中心波長と波長範囲の双方を回折格子で調整できることにより、UV、可視、近赤外および赤外色素の検出が可能になる。多数の分光器、回折格子および検出器モジュールを並行して実行して、広い波長範囲および高い波長分解能を実現して、多数の色素の検出に適用させることができる。この構成では、入射蛍光をダイクロイックミラーで分割し、その後、この光の各部分が、分光器、回折格子および検出モジュールのうちの1つに入射する。PMT、アバランシェフォトダイオード、CCDを含めた、リニア検出モジュールの適切な選択が、蛍光の効率的検出を可能にする。
一般的に、短波長レーザー励起ほど、UVおよび可視色素からの蛍光生成が効率的であり、その一方で、長波長励起ほど、近赤外および赤外色素からの蛍光生成が効率的である。多数の色素からの同時検出ができるように、多数のレーザー源からの多数のレーザー励起を並行して用いることができる。広い波長範囲および可視外の波長範囲を利用する場合には、広範な色素、例えば、Cy7およびCy7.5（それぞれ773および808nm）ならびに800〜900nmの最大波長を有する赤外色素、に合う光学システムによって、蛍光色素の大きなセットの利用してプライマーを標識することができる。
実施例７
色素選択。
6色素多重開発に蛍光色素を選択する場合、作業用5色素セットを作り、新たな色素候補をこのコレクションとの互換性について評価した。表6の上方部分にFAM、JOE、TMR、CXRおよびCC5の5色素セットと共に、各色素についての励起および発光波長最大値をリストする。
色素選択。
6色素多重開発に蛍光色素を選択する場合、作業用5色素セットを作り、新たな色素候補をこのコレクションとの互換性について評価した。表6の上方部分にFAM、JOE、TMR、CXRおよびCC5の5色素セットと共に、各色素についての励起および発光波長最大値をリストする。
図9は、5つのコア色素とDyLight 633の各々に関して観察された発光スペクトルを表示する。これらの6つの色素に関して、各隣接色素対間の4以上の分光器チャネル分離を用いて各色素を明確に検出することができた。この分離量により、本発明者らは、6色すべての完全分離を生じさせる結果となる色補正マトリックスを生成することができた。ATTO 488標識生成物は、同じ生成物のFAM標識バージョンより強い出力発光を発生させたので、また双方の色素が類似した波長で発光したので、この多重セットではFAM色素の代わりにATTO 488を用いた。
実施例８
8色色素検出および分離。
8つの蛍光色素で標識したSTR生成物を同時に検出するための前記改良光学システムの有用性を評価した。選択した8つの色素は、実施例7で言及したものと、590nmの発光波長最大値を有するリサミン−ローダミン色素および627nmの発光波長最大値を有するATTO 594であった。この形式を試験するために、各プライマー対が、それぞれ、1つの未標識プライマーと8つの異なる蛍光式のうちの1つから選択される標識を有する1つの標識プライマーとよりなる8つの独立したプライマー対ごとに明確なサイズの増幅生成物を生成した。顕色させ、色補正行列を適用してオーバーラッピング・スペクトル・シグナルを分解した後、利用した色素の各々についてのクリーンシグナルを得た（図10）。
8色色素検出および分離。
8つの蛍光色素で標識したSTR生成物を同時に検出するための前記改良光学システムの有用性を評価した。選択した8つの色素は、実施例7で言及したものと、590nmの発光波長最大値を有するリサミン−ローダミン色素および627nmの発光波長最大値を有するATTO 594であった。この形式を試験するために、各プライマー対が、それぞれ、1つの未標識プライマーと8つの異なる蛍光式のうちの1つから選択される標識を有する1つの標識プライマーとよりなる8つの独立したプライマー対ごとに明確なサイズの増幅生成物を生成した。顕色させ、色補正行列を適用してオーバーラッピング・スペクトル・シグナルを分解した後、利用した色素の各々についてのクリーンシグナルを得た（図10）。
実施例９
モノプレックスおよびミニプレックス試験
多重構築を多数の段階で行い、一般的には、モノプレックスから遺伝子座の幾つかのコアセットを作る戦略、すなわち、本発明者らの以前の研究（Krenkeら Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci. 2002;47(4):773-85；Linsら Development and population study of an eight-locus short tandem repeat (STR) multiplex system. J Forensic Sci. 1998;43(6):1168-80；Linsら Multiplex Sets for the Amplification of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci--Silver Stain and Fluorescence Detection. BioTechniques. 1996;20(5):882-9）において説明したようなセットに基づく戦略に従った。先ず最初に、個々の遺伝子座各々のモノプレックス増幅のためのプライマー対を「材料および方法」に記載されているように設計した。各対の一方のプライマーがFAM、JOE、CXRおよびROXの色素セットから選択された蛍光色素で標識されている、0.5μMの順方向プライマーおよび0.5μMの逆方向プライマーを使用して、モノプレックス性能を試験した。
モノプレックスおよびミニプレックス試験
多重構築を多数の段階で行い、一般的には、モノプレックスから遺伝子座の幾つかのコアセットを作る戦略、すなわち、本発明者らの以前の研究（Krenkeら Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci. 2002;47(4):773-85；Linsら Development and population study of an eight-locus short tandem repeat (STR) multiplex system. J Forensic Sci. 1998;43(6):1168-80；Linsら Multiplex Sets for the Amplification of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci--Silver Stain and Fluorescence Detection. BioTechniques. 1996;20(5):882-9）において説明したようなセットに基づく戦略に従った。先ず最初に、個々の遺伝子座各々のモノプレックス増幅のためのプライマー対を「材料および方法」に記載されているように設計した。各対の一方のプライマーがFAM、JOE、CXRおよびROXの色素セットから選択された蛍光色素で標識されている、0.5μMの順方向プライマーおよび0.5μMの逆方向プライマーを使用して、モノプレックス性能を試験した。
有意なアーティファクト（STR遺伝子座によって呈示される典型的なスタッターおよび不完全非テンプレート付加（iNTA）を除く）を生じさせることなく強い増幅生成物を生成するプライマー対の群を組み合わせて、4〜6遺伝子座のためのプライマー対の小セット（すなわち、ミニプレックス（単数または複数））を同時に試験した（データを示さない）。殆どのケースで、共増幅によって予期せぬ増幅ゲノム配列（すなわち、アーティファクト）は生成されなかった。いくらかのセットは、アーティファクトを示し、かかる結果にはプライマー再設計およびモノプレックス試験やり直しが必要であった。プライマーの個々の二つ一組での組み合わせについての増幅生成物の分析により、どのプライマーがアーティファクトの発生に関与するかが明らかになった。モノプレックス評価に合格した再設計プライマーを小多重形式で再試験して、後の段階でフル多重で使用するためのより強い組み合わせ候補を同定した。アーティファクトモノプレックスを発生させる組み合わせを含めて、この開発の任意の段階で不成功に終わった試みには、モノプレックス遺伝子座段階での再設計と、モノプレックスおよび多重段階双方での試験が必要であった。
実施例１０
アーティファクト削減または除去：iNTA。
STR遺伝子座増幅は、スタッターアーティファクトを示することが多い。これらのアーティファクトは、常にではないが一般的に、真正のアレルより1リピート長短い（Klintscharら Polymerase slippage in relation to the uniformity of tetrameric repeat stretches. Forensic Sci Int. 2003;135(2):163-6；Shindeら Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi‐likelihood analysis:(CA/GT) n and (A/T) n microsatellites. Nucleic Acids Res. 2003;31(3):974-80）。国家および国際データベースに選択されている、およびしたがって本研究のための選択した遺伝子座が、標準コピー数評価のもとでの単一源サンプルのDNAプロファイリングにおいて真のアレルと区別することができるスタッター量を有することは公知である。
アーティファクト削減または除去：iNTA。
STR遺伝子座増幅は、スタッターアーティファクトを示することが多い。これらのアーティファクトは、常にではないが一般的に、真正のアレルより1リピート長短い（Klintscharら Polymerase slippage in relation to the uniformity of tetrameric repeat stretches. Forensic Sci Int. 2003;135(2):163-6；Shindeら Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi‐likelihood analysis:(CA/GT) n and (A/T) n microsatellites. Nucleic Acids Res. 2003;31(3):974-80）。国家および国際データベースに選択されている、およびしたがって本研究のための選択した遺伝子座が、標準コピー数評価のもとでの単一源サンプルのDNAプロファイリングにおいて真のアレルと区別することができるスタッター量を有することは公知である。
テンプレート依存性重合完了後の不完全非テンプレートヌクレオチド付加は、STR増幅生成物において一般的に観察される二次的なアーティファクトである（Clark . Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1988 Oct 25;16(20):9677-86；H. DNA Polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' of a DNA fragment. DNA and Cell Biology. 1993;12(8):763-70；Magnusonら Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning. BioTechniques. 1996 Oct;21(4):700-9）。このアーティファクトは、真正のアレルより1塩基小さい二次的断片として観察される。その存在は、一般的に真のアレルのピーク高を低下させ、および1つのアレルを表す2つの断片の出現により混乱を生じさせることがある。最初のプライマー設計が完全テンプレート付加を果たさなかった場合、Brownstein（Brownsteinら Modulation of non-templated nucleotide addition by Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. BioTechniques. 1996 Jun;20(6):1004-6, 8-10）によって推奨されているDNA配列5’-GTTTCTT-3’をプライマー対における未標識プライマーの5'末端に付加させて、より完全非テンプレート型付加を刺激した。幾つかのケースでは、5’末端‐Gだけの付加を試験して、同じ効果を果たした。いくらかのケースでの代替アプローチは、プライマー対における標識および未標識プライマーを逆にして、未標識プライマーの代替5’末端を生成するアプローチであった。iNTA低減の一例を図11に表示する。
図11Aは、iNTAを低減させるためのGTTTCTTテール付加を例示する。上方パネルは、未標識プライマーの5’末端への5’-GTTTCTT-3’配列テールの付加のないD18S51プライマー対増幅生成物を表示する。下方パネルは、修飾したプライマー対を使用する生成物を示す。この変更は、上方パネルにおけるおよそ150％から下方パネルにおける10％未満へとiNTAを低減させた。この変更はまた、断片長を増加させた。図11Bは、iNTAを低減させるための未標識プライマーの5’末端へのG-テール付加を例示する。上方パネルは、未標識プライマーの5’末端への5’-G-3’配列テールの付加のないD2S441プライマー対増幅生成物を表示する。下方パネルは、修飾したプライマー対を使用する生成物を示す。この変更は、上方パネルにおけるおよそ90％から下方パネルにおける10％未満へとiNTAを低減させた。この変更はまた、断片長を増加させた。図11Cは、iNTAを低減させるためのプライマー対における標識プライマーを逆にする生成物を示す。上方パネルは、オリジナルROX色素標識スキームでのD8S1179プライマー対増幅生成物を表示する。下方パネルは、そのプライマー対における反対のプライマーをROX標識して使用する生成物を示す。この変更は、上方パネルにおけるおよそ80％から下方パネルにおける10％未満へと可視iNTAを低減させた。この変更は、見かけの断片長を改変しないが、見かけの断片におけるかかる改変は、増幅生成物中の配列変異に依存して起こることがある。
限定されるものではないが、iNTA、スタッター、およびプライマーと核酸の意図されない相互作用に起因するアンプリコンを含めた、STRアーティファクトは、プライマー配列に関係付けられるが、PCR反応条件にも関係付けられる。酵素、バッファー、ならびにサイクル時間および温度（ならびに計器駆動温度勾配率）は、アーティファクト生成および削減に有意な影響を及ぼし得る。個々のアンプリコンの相対シグナル強度もこれらの因子による影響を受け得る。したがって、STR多重を開発する際、所与の増幅条件セットに基づいてプライマーを最適化することを考えることが重要である。例えば、90分PCR反応に最適な多重が、20分PCR反応での同様の性能のために修飾を必要とすることは十分にある。
実施例１１
多重増幅生成物からのアーティファクトの除去。
増幅アーティファクトは、少なくとも一方が標識されている2つのプライマーと、関与するプライマーの少なくとも一方についてそのプライマー設計における意図されたハイブリダイゼーション標的ではないゲノム配列との意図されない相互作用から生ずる。アーティファクト発生に関与するプライマーを最初に同定することにより、かかるアーティファクトを除去することができる。これは、1つのプライマーまたはプライマー対を同時にフル多重から除去して、特定のプライマーの除去と特定のアーティファクトの除去とを関連づけることによって果たすことができる。アーティファクト発生についての候補プライマーを同定したら、2つの候補プライマーを使用して、他のプライマーの不在下でサンプルを増幅して、アーティファクト発生におけるそれらの役割を確認する。一方または双方のプライマーの再設計、その後の再試験により、多くの場合、すべての多重遺伝子座の増幅を確保しつつアーティファクト（単数または複数）が除去される。多重プライマーセットへの再設計プライマーの組み入れ後に多重内の多数の遺伝子座の表象のバランスをとり直す努力が、多くの場合、必要とされる。
多重増幅生成物からのアーティファクトの除去。
増幅アーティファクトは、少なくとも一方が標識されている2つのプライマーと、関与するプライマーの少なくとも一方についてそのプライマー設計における意図されたハイブリダイゼーション標的ではないゲノム配列との意図されない相互作用から生ずる。アーティファクト発生に関与するプライマーを最初に同定することにより、かかるアーティファクトを除去することができる。これは、1つのプライマーまたはプライマー対を同時にフル多重から除去して、特定のプライマーの除去と特定のアーティファクトの除去とを関連づけることによって果たすことができる。アーティファクト発生についての候補プライマーを同定したら、2つの候補プライマーを使用して、他のプライマーの不在下でサンプルを増幅して、アーティファクト発生におけるそれらの役割を確認する。一方または双方のプライマーの再設計、その後の再試験により、多くの場合、すべての多重遺伝子座の増幅を確保しつつアーティファクト（単数または複数）が除去される。多重プライマーセットへの再設計プライマーの組み入れ後に多重内の多数の遺伝子座の表象のバランスをとり直す努力が、多くの場合、必要とされる。
図12A、12Bおよび12Cは、5色GeneBench FX検出計器での6色増幅生成物の検出を表示する。DL633標識サンプル増幅断片およびCC5標識サイズ断片を同じPMTチャネルで検出する。図12Aは、アーティファクト発生の2つのケースを示す。ATTO488で標識されたおよび107塩基（B107）に位置する比較的弱い断片、および193塩基（B193）の位置周辺の一連のATTO488標識断片に注目されたし。図12Bの左パネルに、これらの同じアーティファクトを拡大した様式で示す。図12Bの右パネルは、2つの個々のプライマーを修飾配列のプライマーで置換した後の増幅を表示する。図12Cは、プライマー置換後のサンプル増幅生成物のバランス保持を例示する。
実施例１２
増幅生成物強度を向上させるための色素選択
幾つかの異なる方法を用いて、多重増幅に関連して個々の遺伝子座からの増幅生成物の強度を増加させることを試みることができる。例えば、新たなゲノム配列に結合するようなまたはより安定したハイブリダイゼーションをもたらすようなプライマー再設計を用いることができる。あるいは、ある遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度を増加または減少させることで、他の遺伝子座に相対して生成物の強度を変化させることができる。時として、他の遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度または全混合プライマー濃度の修飾は、増幅生成物強度を改変し得る。より低いアニーリング温度またはより多くの増幅サイクルを含めたプロトコルの修正もまた、相対増幅生成物表象を変化させる。材料およびプロセスのこれらの変更は、実施例1において説明したおよび図1に表示した26遺伝子座多重セットでのSE33増幅生成物の量を向上させなかった。実施例7における色素調査は、ATTO488色素の使用が、FAM色素の使用より増幅生成物の相対的に強い表象を生じさせることを本発明者らに示した。本発明者らは、標識SE33プライマーをFAMの代わりにATTO488で標識し直し、その多重において他の遺伝子座に相対して望ましい強い増幅生成物表象を観察した。
増幅生成物強度を向上させるための色素選択
幾つかの異なる方法を用いて、多重増幅に関連して個々の遺伝子座からの増幅生成物の強度を増加させることを試みることができる。例えば、新たなゲノム配列に結合するようなまたはより安定したハイブリダイゼーションをもたらすようなプライマー再設計を用いることができる。あるいは、ある遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度を増加または減少させることで、他の遺伝子座に相対して生成物の強度を変化させることができる。時として、他の遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度または全混合プライマー濃度の修飾は、増幅生成物強度を改変し得る。より低いアニーリング温度またはより多くの増幅サイクルを含めたプロトコルの修正もまた、相対増幅生成物表象を変化させる。材料およびプロセスのこれらの変更は、実施例1において説明したおよび図1に表示した26遺伝子座多重セットでのSE33増幅生成物の量を向上させなかった。実施例7における色素調査は、ATTO488色素の使用が、FAM色素の使用より増幅生成物の相対的に強い表象を生じさせることを本発明者らに示した。本発明者らは、標識SE33プライマーをFAMの代わりにATTO488で標識し直し、その多重において他の遺伝子座に相対して望ましい強い増幅生成物表象を観察した。
図13では、各パネルに表示した増幅生成物を生じさせるために用いた色素をそれぞれのパネルの左端に示す。この図は、強いSE33増幅生成物を明示する26遺伝子座増幅を表示する。FAM標識SE33生成物に関して図1で観察されたものに対するこの増幅のATTO488標識SE33増幅生成物の相対強度を比較されたし。より強い表象は、ATTO488色素から検出されたより強い光出射に由来する。本発明者らはまた、D3S1358、D19S433およびD2S1338のための標識プライマーをFAM標識からATTO488標識に変えて、これらの4つの遺伝子座についてのスペクトル検出が、その多重色素セットの状況で確実に一致したままであるようにした。
実施例１３
多重開発戦略としてのミニプレックスの構築および併用
各々が個々の遺伝子座各々についての増幅生成物を首尾よく表示し、かつ非特異的生成物または他のプライマー配列関連アーティファクトのない幾つかのミニプレックスセットを併用して、19遺伝子座多重を生成した。3つのさらなる遺伝子座を別のミニプレックスから付加させて22遺伝子座バージョンを生成し、その後、残りのプライマー対を個々に付加させた。各中間多重を試験してプライマー関連アーティファクトを同定し、遺伝子座間のバランスを評価し、隣接遺伝子座の増幅生成物がオーバーラップしていないことを確認した。特定のアーティファクトの存在および不在と完全プライマーセットからの一方のプライマーの存在または不在と相関させることにより、多くのプライマー関連アーティファクトの各々へのプライマーの寄与を同定した。問題のあるプライマーを再設計し、再試験して、これらの後期開発段階での殆どの問題点を解決した。再試験は、同じ色の隣接遺伝子座のアレルがオーバーラップしなかったことを保証するための、理論的結果ではなく経験的結果の注意深いアンプリコン範囲サイズ分析を含んだ。一方または双方のプライマーの5’末端への配列付加でのサイズ変更を一般的に用いて、遺伝子座・オーバーラップ・ケースを解決した。次の3つの異なるアプローチを用いて遺伝子座間のバランスを調整した：a）入力プライマー濃度の調整、b）PCR増幅反応のアニーリング温度の調整、およびc）プライマー再設計。これらの調整に従って、図14Aは、遺伝子座のバランスをとった27遺伝子座多重セットを用いる2.8ngの男性DNAサンプルの19.5分増幅を表示する。図14Bは、女性DNAサンプルの6色27遺伝子座増幅を示す。8色光学システムを使用して、これらの増幅生成物を分離し、検出した。
多重開発戦略としてのミニプレックスの構築および併用
各々が個々の遺伝子座各々についての増幅生成物を首尾よく表示し、かつ非特異的生成物または他のプライマー配列関連アーティファクトのない幾つかのミニプレックスセットを併用して、19遺伝子座多重を生成した。3つのさらなる遺伝子座を別のミニプレックスから付加させて22遺伝子座バージョンを生成し、その後、残りのプライマー対を個々に付加させた。各中間多重を試験してプライマー関連アーティファクトを同定し、遺伝子座間のバランスを評価し、隣接遺伝子座の増幅生成物がオーバーラップしていないことを確認した。特定のアーティファクトの存在および不在と完全プライマーセットからの一方のプライマーの存在または不在と相関させることにより、多くのプライマー関連アーティファクトの各々へのプライマーの寄与を同定した。問題のあるプライマーを再設計し、再試験して、これらの後期開発段階での殆どの問題点を解決した。再試験は、同じ色の隣接遺伝子座のアレルがオーバーラップしなかったことを保証するための、理論的結果ではなく経験的結果の注意深いアンプリコン範囲サイズ分析を含んだ。一方または双方のプライマーの5’末端への配列付加でのサイズ変更を一般的に用いて、遺伝子座・オーバーラップ・ケースを解決した。次の3つの異なるアプローチを用いて遺伝子座間のバランスを調整した：a）入力プライマー濃度の調整、b）PCR増幅反応のアニーリング温度の調整、およびc）プライマー再設計。これらの調整に従って、図14Aは、遺伝子座のバランスをとった27遺伝子座多重セットを用いる2.8ngの男性DNAサンプルの19.5分増幅を表示する。図14Bは、女性DNAサンプルの6色27遺伝子座増幅を示す。8色光学システムを使用して、これらの増幅生成物を分離し、検出した。
実施例１４
より多くの色素を組み込むことで、より小さい増幅生成物が可能になる。
5色検出に対する改善案としての6色検出または8色検出は、人物同定のための多重システムの改善された設計を可能にする。ヒトに関する作業の難しさの1つは残存し、例えば、いくらかのサンプルが分解DNAを含有することである。ここに、より大きいアンプリコンの増幅がより困難になる、または不可能になることさえある。6、7、8、9、10、11、12、14、16以上の色素の存在は、より小さい増幅生成物を生じさせるための多重STR増幅セットの再設計を可能にする。そしてまた、これは、より高いサンプル増幅成功率を可能にする。
より多くの色素を組み込むことで、より小さい増幅生成物が可能になる。
5色検出に対する改善案としての6色検出または8色検出は、人物同定のための多重システムの改善された設計を可能にする。ヒトに関する作業の難しさの1つは残存し、例えば、いくらかのサンプルが分解DNAを含有することである。ここに、より大きいアンプリコンの増幅がより困難になる、または不可能になることさえある。6、7、8、9、10、11、12、14、16以上の色素の存在は、より小さい増幅生成物を生じさせるための多重STR増幅セットの再設計を可能にする。そしてまた、これは、より高いサンプル増幅成功率を可能にする。
図15Aは、多重セットにおける13 CODIS STRコア遺伝子座を含有する5色設計を表示する。実質的非オーバーラッピングSTRアッセイを可能にするために70塩基未満の増幅生成物がないという制約および隣接遺伝子座間に5〜10塩基の必要が想定される。CODIS 13STR遺伝子座は、689塩基のSTR遺伝子座サイズ範囲合計を構成する。選択される遺伝子座の遺伝子座サイズ範囲の制約、およびサイズマーカーのために1色を確保する必要を考えて、3.25遺伝子座／色の範囲を、235塩基の多重サイズ範囲および2.93の多重密度を残す各色に再設計することができる。
図15Bは、図15Aにおける5色設計と同じ制約で同じ遺伝子座を含有する6色設計を表示する。第6の色素の組み入れで、多重セットのサイズ上限は、およそ275塩基になる。加えて、平均遺伝子座／色は、2.6であり、各色の遺伝子座の数が少ないほど、実質的非オーバーラッピングSTRアッセイを可能にするためのアレルの遺伝子座間オーバーラップの可能性の回避が容易になる。多重サイズ範囲は、205塩基であり、多重密度は、3.36である。
図15Cは、図15Aにおける5色設計および図15Bにおける6色設計と同じ制約を有する同じ遺伝子座を含有する8色設計を表示する。8つの色素の組み入れで、多重セットのサイズ上限は、およそ230塩基になる。さらに、FGA遺伝子座の大きいアレルは極めて珍しく、そのためより多くの共通アレルが155塩基を超えない。アレルサイズのこの実質的な削減は、分解サンプルでフルプロフィールを得る能力を実質的に増加させる。加えて、1.86がこの平均遺伝子座／色であり、各色の遺伝子座の数が少ないほど、実質的非オーバーラッピングSTRアッセイを可能にするためのアレルの遺伝子座間オーバーラップの可能性の回避が容易になる。実際、この多重では各色のたった2つ以下の遺伝子座およびたった6つの隣接遺伝子座間対を用いて、同じ色の遺伝子座対間の間隔増加により、図15Cに示すようにこのリスクを完全に回避が可能になる。極めて稀な高分子量FGAアレルを含むこの形式での多重サイズ範囲は、160塩基であり、多重密度は、4.31である。
13‐STR CODISコア・多重・セットの3つのバージョンについての多重内容、STR遺伝子座サイズ範囲合計、STR遺伝子座サイズ範囲、および多重密度を表7において比較する。
実施例１５
24遺伝子座23-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
24遺伝子座23-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
図16は、アメロゲニンに加えて次の23のSTR遺伝子座の同時共増幅のための手段を表示する：D3S1358、SE33、D6S1043、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179およびD10S1248。この多重設計のSTR遺伝子座サイズ範囲合計は1286であり、多重サイズ範囲は340塩基であり、および多重密度は3.78である。
実施例１６
23遺伝子座22-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
23遺伝子座22-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
図17は、アメロゲニンに加えて次の23のSTR遺伝子座の同時共増幅のための手段を表示する：D3S1358、D6S1043、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179およびD10S1248。この多重設計のSTR遺伝子座サイズ範囲合計は1136であり、多重サイズ範囲は300塩基であり、および多重密度は3.79である。
実施例１７
22遺伝子座21-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
22遺伝子座21-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
図18は、アメロゲニンに加えて次の23のSTR遺伝子座の同時共増幅のための手段を表示する：D3S1358、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179およびD10S1248。この多重設計のSTR遺伝子座サイズ範囲合計は1072であり、多重サイズ範囲は292塩基であり、および多重密度は3.67である。
実施例１８
21遺伝子座20-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
21遺伝子座20-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
図19は、アメロゲニン遺伝子座に加えて次の23のSTR遺伝子座の同時共増幅のための手段を表示する：D3S1358、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、FGA、D8S1179およびD10S1248。この多重設計のSTR遺伝子座サイズ範囲合計は1044であり、多重サイズ範囲は278塩基であり、および多重密度は3.76である。
実施例１９
6色SNPアッセイ
6、7、8、9、10、11、12、14、16または24より多くの色の検出に関する検出は、とりわけ、人物同定および獣医学的同定、臨床および獣医学的診断、生物脅威検出、食品安全性、ならびに工業的試験目的での多重システムの向上された設計を可能にすることにより、SNP試験などの非STR評価も向上させる。詳細には、STR多重アッセイについて上で論証したように、より小さい生成物をより多くの色素で区別する。あるいは、より多くの色素を使用することで、同じサイズ範囲制約内でより多くの遺伝子座を試験することができる。一般的に、色素の数が多いほど、多くの情報を単一サンプルおよび単一検出レーンから得ることができる。
6色SNPアッセイ
6、7、8、9、10、11、12、14、16または24より多くの色の検出に関する検出は、とりわけ、人物同定および獣医学的同定、臨床および獣医学的診断、生物脅威検出、食品安全性、ならびに工業的試験目的での多重システムの向上された設計を可能にすることにより、SNP試験などの非STR評価も向上させる。詳細には、STR多重アッセイについて上で論証したように、より小さい生成物をより多くの色素で区別する。あるいは、より多くの色素を使用することで、同じサイズ範囲制約内でより多くの遺伝子座を試験することができる。一般的に、色素の数が多いほど、多くの情報を単一サンプルおよび単一検出レーンから得ることができる。
この実施例において、本発明者らは、人間の虹彩色を判定するための6SNPをアッセイする6色素の能力の使用を説明する。以前、Walshによって発表されたアッセイ（Walshら (2011, Iris IrisPlex: A sensitive DNA tool for accurate prediction of blue and brown eye color in the absence of ancestry information. Forensic Science International: Genetics 5: 170-180）は、ヒトサンプルDNAの6領域の増幅、続いての、増幅されたPCR生成物の各々の中の1個の塩基の存在を問い合わせるための、一塩基伸長アッセイ（Chenら 3003, Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost, and throughput, The Pharmacogenomics Journal 3: 77-96）に基づく。5色のうちの1色をサイズマーカー用に確保して5色素アッセイとしてその試験を行った。対象となる6ヵ所の各々について2つの可能性のある代替SNP生成物、すなわち12の可能性のある生成物を、24〜54塩基の範囲の生成物サイズに関して4色ですべて検出する。本発明の6色素アプローチを用いて、一塩基伸長生成物範囲を例えば48塩基に低減させることができる。一塩基伸長でより長い生成物を検出するために必要なより長いオリゴヌクレオチドの調製および精製の難しさが、ここで提案するようなより短いオリゴヌクレオチドに依存するアッセイを作成する利点を実証する。
このアプローチの伸長では、多くのSNPアッセイが、単一反応および検出レーンで問い合わせられる10より多くの、20より多くの、30より多くの、50より多くの、100より多くの、200より多くの、300より多くの、400より多くの、500より多くの、1000より多くの、2000より多くの、300より多くの、または5000より多くの個々のSNPを必要とする。このアッセイへの6色システム、8色システム、またはより多くの色のシステムの組み入れにより、さらに多くのSNPアッセイを現行の5色アッセイと同じサイズ範囲で行うことが可能になる。
SNP分析において使用するサンプルは、PCRによって増幅された生成物を含めて、サンプル中に増幅核酸を含む場合もあり、または未増幅核酸を含む場合もある。前記分析には、電気泳動分離および検出、ならびにマイクロアレイベースのアッセイが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも3つのSNP多型への曝露前または後のオリゴヌクレオチドに6以上の蛍光標識を付けることができる。例えば、前記オリゴヌクレオチドを前記方法でのそれらの使用前に標識することができ、または標識をヌクレオチドと混ぜるプライマー伸長アッセイの過程で標識することができる。
幾つかの代替SNP分析方法を本発明の適用によって向上させることができる。1つの方法は、核酸サンプルを増幅し、その後、差次標識されたジデオキシ−dNTPの存在下で未標識プライマー（オリゴヌクレオチド）でのプライマー伸長を行う方法である（Syvanen,A-Cら1990. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotypin of apolipoprotein E, Genomics 8: 684-692）。種々の長さの未標識プライマーを使用してプライマー伸長を行うと、種々の長さの生成物が生成される。検出のための種々の色素の使用は、増幅STR生成物でそれを行うのと同じ方法での検出プロセスに寸法を追加する。前記方法の変形では、例えば、デオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドの混合物を組み込むことができる。
さらにもう1つの方法は、6以上、好ましくは8以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを利用するアレル特異的ハイブリダイゼーションを含む。（Wallace 1979. Hybriciation of syntheit oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch, Nucleic Acides Research 10:3543-3557）。
本発明のもう1つの実施は、1つの未標識プライマー、および分析する各SNPについて同一の（またはほぼ同一の）配列を有する2つの差次標識プライマーの存在下でのPCRの使用を含む（Choiら, 2012. Integrated allele-specific polymerase chain reaction-capillary electrophoresis microdevice for single nucleotide polymorphism genotyping. Biosens. Bioelectron. 35: 327-334）。稀なケースではSNP位置ごとに4つ以下の差次標識プライマーを使用することができる。STR遺伝子座生成物と同じ様式での、すなわちサイズ分離および色選別による、これらの増幅生成物の分離および検出、
SNP分析に適用される本発明のさらにもう1つの実施は、核酸標的の存在下でのポリメラーゼ、バッファー、デオキシヌクレオチド三リン酸とジてオキシヌクレオチド三リン酸の混合物の組み合わせを使用する配列プライマー伸長を含む。このプロセスの間に、1つの核酸標的からの増幅生成物を、dNTPまたはジデオキシNTPのいずれかに付けた4つの異なる蛍光色素で標識する（Sanger, Niclen, and Coulson, 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467）。別の箇所の第二の核酸標的を、dNTPまたはジデオキシNTPのいずれかに付けたさらに4つの異なる色素で標識する。それらのサンプルを別々に実行することができ、または本発明のバージョンでは、混合し、その後、分析のために分離および検出することができる。
少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50またはそれを超える蛍光色素の使用を、多種多様なSNP検出アプローチ（Chen and Sullivan, 2003, Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost, and throughput. The Pharmacogenomics Journal 3: 77-96; Syvanen, 2001, Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms, Nature Reviews 2: 930-942；Kwok, 2000. High-throughput genotyping assay approaches, Pharmacogenetics 1:1-5；Kwok, 2003 Detection of single nucleotide polymorphisms, Current Issues in Molecular Biology 5:43-60; Kimら SNP Genotyping: Technologies and Biomedical Applications Annual Review of Biomedical Engineering, Vol. 9: 289-320, 2007；Nassirら An ancestry informative marker set for determining continental origin: validation and extension using human genome diversity panels, BMC Genetics 2009, 10:39）に適用することができる。
本発明に記載する電気泳動分離および光学検出能力と併用して、とりわけ、法医学サンプル、臨床サンプル、獣医学サンプル、食品安全性サンプルおよび工業微生物学サンプルを多数のSNPについて問い合わせることができる。本発明のシークエンシングならびに多重および他のアッセイと併用すると、SNPアッセイ（高多重SNPアッセイを含む）によって、とてつもない量の重要情報を得ることができる。説明したように、単独でのまたは併用でのこれらのSNPアッセイを、完全集積型マイクロ流体バイオチップシステムを含めたマイクロ流体バイオチップに適用させることができる。
実施例２０
STR分析と併用されるSNP分析のための6色アッセイ
実施例2、実施例3、実施例5、実施例15、実施例16、実施例17および実施例18は、漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析、より大きい遺伝子座サイズ範囲合計分析、ならびに増加した多重を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例4は、Y STR遺伝子座と組み合わせた漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例19は、漸増数のSNP遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするためのまたはSNP遺伝子座分析における多重サイズ範囲要求に対する6以上の色素の使用を説明するものである。
STR分析と併用されるSNP分析のための6色アッセイ
実施例2、実施例3、実施例5、実施例15、実施例16、実施例17および実施例18は、漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析、より大きい遺伝子座サイズ範囲合計分析、ならびに増加した多重を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例4は、Y STR遺伝子座と組み合わせた漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例19は、漸増数のSNP遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするためのまたはSNP遺伝子座分析における多重サイズ範囲要求に対する6以上の色素の使用を説明するものである。
6、7、8、10、12、14、24またはそれを超える色素の組み入れ、検出および色分離によって可能になる増加されたサイズ範囲の分析を用いて、異なるマーカータイプを同時に分析することもできる。詳細には、実施例19において説明したSNPベースの虹彩検出分析、ならびに実施例5および幾つかの他の実施例において説明した常染色体STRベースの同定分析の増幅生成物を、分離増幅生成物の同一単一チャネルまたはレーンで検出することができる。したがって、前記方法を用いて、身元および身体的特徴分析を同時に判定することができる。
異なる多型マーカータイプ（例えば、STR、SNP、配列変異体）および異なる染色体タイプ源（例えば、常染色体、X染色体、Y染色体、ミトコンドリア、細菌、真菌、植物）を併用した、ならびに異なる目的（例えば、身元、血縁関係判定、科学捜査、身体的特徴、感染症原因、遺伝的特徴）のための多重増幅セットを、多数のマーカータイプについて、多数のDNA源について、および多数の機能的目的のために同時に分析することができる。これらのタイプの多重増幅を、生物または他の核酸含有サンプル材料の存在、不在、同定または状態についての診断情報を提供する非多型核酸マーカーと併用することもできる。
実施例２１
二重配列分析
DNA配列分析を行って、ヒトゲノムを構成する染色体中の4つの異なるヌクレオチドの順序を決定する。多数の配列分析方法を利用できるが、旧来の評判のよい方法は、サンガーらによって開発された方法（1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74: 5463-5467）であり、この方法は、未標識デオキシ−ヌクレオチド三リン酸と蛍光標識ジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸の混合物の存在下でのプライマー伸長を用いる。4つの差次的に蛍光標識されたジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸が、それぞれの塩基各々について、および位置またはそれぞれの塩基を示す様々な長さで、鎖延長を停止させる。
二重配列分析
DNA配列分析を行って、ヒトゲノムを構成する染色体中の4つの異なるヌクレオチドの順序を決定する。多数の配列分析方法を利用できるが、旧来の評判のよい方法は、サンガーらによって開発された方法（1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74: 5463-5467）であり、この方法は、未標識デオキシ−ヌクレオチド三リン酸と蛍光標識ジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸の混合物の存在下でのプライマー伸長を用いる。4つの差次的に蛍光標識されたジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸が、それぞれの塩基各々について、および位置またはそれぞれの塩基を示す様々な長さで、鎖延長を停止させる。
8色検出の使用は、分離生成物の単一レーンからの検出および独立した解釈のためにサンガーシークエンス生成物の2つの異なる非オーバーラッピング色素色セットの組み入れを可能にする。かくして、本発明者らは、2つのシークエンシング反応からのシークエンシング生成物を単一分離試験で同時に検出する。さらに、本発明者らは、後続の別個の配列の分離、検出および分析のために単一反応体積でジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸の非オーバーラッピング色素色セットを同時に使用して2つの異なるDNA領域をシークエンシングすることができる。
4の倍数で色の数を増加させると、単一検出レーンで分析できるDNA配列の数が比例して増加される（例えば、16色は、4セットの配列を可能にする）。色素数およびアッセイ要件の賢明な選択により、単一のサンプルを使用して莫大な量の情報を集めることができる。例えば、単一のヒトサンプルにより、（例えば、6色およびSTRアッセイを用いて）身元および血縁関係情報、（例えば、6色の追加色およびSNPアッセイを用いて）表現型情報、ならびに（例えば、4色およびシークエンシングアッセイを用いて）ミトコンドリア遺伝情報を得ることができるであろう。類似して、このアプローチを用いて、（例えば、8色およびSTRアッセイを用いて）人物同定および血縁関係分析ならびに（例えば、8色および2つの多重シークエンシングアッセイを用いて）病原体の正体および治療レジメンの判定を行うことができる；この組み合わせは、救急救命室に運ばれた身元不明の個体の血液サンプルを敗血症の徴候に関してアッセイするのに有用であろう。第三のケースでは、アッセイを用いて、（例えば、6色およびSTRアッセイを用いて）身元情報、（例えば、4色の追加色およびシークエンシングアッセイを用いて）組織型判定または癌病期分類に関係した臨床診断情報を提供することができる；この組み合わせは、組織を手術中に評価すると同時に組織ドナーの身元について保証するのに有用であろう。
しかし、これらの適用は、本発明の教示によって可能になるアッセイの莫大な組み合わせのうちの3つである。これらの教示に基づいて行うことができるアッセイには、限定されるものではないが、核酸増幅（例えば、シングルプレックスおよび多重双方のエンドポイントPCR、リアルタイムPCR、逆転写PCR、非対称PCR、ネステッドPCR、LATE PCR、タッチダウンPCR、デジタルPCR、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅、および多置換増幅）；Y-STR増幅；ミニSTR増幅；一塩基多型分析；VNTR分析；RFLP分析；核酸シークエンシング（例えば、サンガーシークエンシング、パイロシークエンシング、および1分子シークエンシング）；逆転写；核酸ライゲーション；核酸ハイブリダイゼーション；イムノアッセイ；結合アッセイ；タンパク質アッセイ；酵素的アッセイ；質量分光分析；ならびに核酸およびタンパク質定量を含めた、個々のアッセイおよび併用アッセイが含まれる。
Claims (6)
- 核酸を含有するサンプルからSTRプロフィールを生成するSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
（a）前記サンプルと、アメロゲニン、D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、D16S539、D5S818、D18S51、D13S317、D7S820、D1S1656、TPOX、D10S1248、CSF1PO、D2S441、Penta D、Penta E、THO1、vWA、D21S11、D12S391、Penta C、D8S1179、FGAおよびSE33よりなる群から選択される少なくとも7つのSTR遺伝子座についての少なくとも7つの異なるプライマー対とを溶液中で接触させ、
ここに、前記少なくとも7つの異なるプライマー対の少なくとも一方は、相互に異なる少なくとも7つの蛍光色素で標識し、これにより、前記の各プライマー対を相互に異なる前記蛍光色素の1つで標識し；
（b）前記少なくとも7つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって同時に増幅して、少なくとも7つの増幅された核酸生成物を生成し；次いで
（c）前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出することを含むことを特徴とする前記方法。 - 各プライマー対の少なくとも１つのプライマーが、アメロゲニンについての配列番号1および2; CSF1POについての配列番号3および4; D1S1656についての配列番号5および6; D2S1338についての配列番号7および8; D2S441についての配列番号9および10; D3S1358についての配列番号11および12; D5S818についての配列番号13および14; D7S820についての配列番号15および16; D8S1179についての配列番号17および18; D10S1248についての配列番号19および20; D12S391についての配列番号21および22; D13S317についての配列番号23および24; D16S539についての配列番号25および26; D18S51についての配列番号27および28; D19S33についての配列番号29および30; D21S11についての配列番号31および32; D22S1045についての配列番号33および34; FGAについての配列番号35および36; Penta Bについての配列番号37および38; Penta Cについての配列番号39および40; Penta Dについての配列番号41および42; Penta Eについての配列番号43および44; SE33についての配列番号45および46; THO1についての配列番号47および48; TPOXについての配列番号49および50;およびvWAについての配列番号51および52よりなるプライマー配列の群の１つから選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
- アメロゲニンが、選択された少なくとも７つのＳＴＲ遺伝子座のうちの１つでない場合に性別識別のためのSTR遺伝子座、またはアメロゲニンが、選択された７つのＳＴＲ遺伝子座のうちの１つである場合に性別識別のためのさらなるSTR遺伝子座をさらに含むことを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、90分未満で生成されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、45分未満で生成されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、20分未満で生成されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
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