JP2009219439A - 一塩基多型の検出方法及びプライマーセット。 - Google Patents
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Abstract
【課題】臓器移植患者に移植後に投与される免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤の薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動を予測に関する関連する一塩基多型として、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1のExon12に含まれるSNPs(C1236T)、Exon21に含まれるSNPs(G2677TA)、Exon26に含まれるSNPs(C3435T)の6種の一塩基多型の検出において、迅速かつ簡便な検出手段を提供する。
【解決手段】6種の一塩基多型を含む核酸領域を一度の操作で同時に増幅するために特定塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを用い、さらに6種の一塩基多型検出において一塩基伸長反応を行うために、特定の塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを用いる。
【選択図】なし
【解決手段】6種の一塩基多型を含む核酸領域を一度の操作で同時に増幅するために特定塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを用い、さらに6種の一塩基多型検出において一塩基伸長反応を行うために、特定の塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを用いる。
【選択図】なし
Description
本発明は、一塩基多型の検出方法、並びに前記方法で用いられる核酸増幅用プライマーのセット及び一塩基伸長用プライマーのセットに関する。
近年、遺伝子多型はある個人の特性全体を表すのみならず、様々な疾患や病態の原因や臨床経過に関わるという点で注目を集めている。一塩基多型(以下、SNPとも言う)は、ヒトには1420万以上も認められている遺伝子多型であり、その中には疾患や病態の重症化予測因子として有用であるものがあると考えられている。また近年、一塩基多型を用いて、ある遺伝子の連鎖不均衡のブロック様構造が判明したり、ある一塩基多型と近傍の一塩基多型が連鎖関係をもつことでハプロタイプの多様性が限定されるということが明らかになった。すなわちある個人の多数の一塩基多型を同時に検出することで、その個人の遺伝的背景が判明するようになってきた。
特に、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1のExon12に含まれるSNP、MDR1のExon21に含まれるSNP、MDR1のExon26に含まれるSNPの6種の一塩基多型は、免疫抑制剤の薬物動態(薬物血中濃度)との関連性が示唆されており、臓器移植領域においては、患者におけるこれらの一塩基多型を事前に検出して個人に応じた適切な投与量を決定するなど、これらの一塩基多型を解析することは非常に有用であると考えられている(非特許文献1〜3)。
従って免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤が併用投与された臓器移植患者における薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動の予測は、前記の一塩基多型の全てを検出することが必要であると考えられている。
一塩基多型の解析を行うために、様々な種類の解析方法が考案されてきた。これらには、PCR−SSCP(single-strand conformation polymorphism)法(非特許文献4)、インベーダー法、TaqMan法(非特許文献5)、一塩基伸長法等の解析方法がある。これらの解析方法は、単一の一塩基多型を複数の患者において解析する際には有用であるが、ある個人における複数の一塩基多型を解析するためには、目的の一塩基多型それぞれについて一連の煩雑な操作を繰り返して行う必要があるため、検出に要する時間が長くなるといった問題を抱えている。臨床応用を踏まえてリアルタイムでこのような一塩基多型解析を行うためには、多種の一塩基多型を迅速かつ簡便に検出可能な一塩基多型解析方法の考案が必要である。
細畑ら、日本薬学会第127年会要旨集3、95、2007 佐藤ら、第24回日本TDM学会学術大会、O2−02 Masuda S,Pharmacol Ther. 2006;112:184−198 Hayashi K,PCR Methods Appl 1991; 1:34―38 Germer S,Genome Res 2000; 10:258―266
細畑ら、日本薬学会第127年会要旨集3、95、2007 佐藤ら、第24回日本TDM学会学術大会、O2−02 Masuda S,Pharmacol Ther. 2006;112:184−198 Hayashi K,PCR Methods Appl 1991; 1:34―38 Germer S,Genome Res 2000; 10:258―266
本発明の目的は、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1のExon12に含まれるSNP、MDR1のExon21に含まれるSNP、MDR1のExon26に含まれるSNPの6種の一塩基多型の検出において、迅速かつ簡便な検出手段を提供することである。
本発明者らは鋭意検討の結果、特定のプライマーセットを使用することで、前記6種の一塩基多型を迅速かつ簡便に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、(1)CYP3A5*3、(2)CYP2C19*2、(3)CYP2C19*3、(4)MDR1のExon12に含まれる一塩基多型、(5)MDR1のExon21に含まれる一塩基多型、(6)MDR1のExon26に含まれる一塩基多型の検出方法であって、配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の(1)〜(6)の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してDNA産物を得る第1の工程、第1の工程で得られたDNA産物を鋳型として、配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第2の工程、を含む一塩基多型の検出方法を提供する。
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、6種の該一塩基多型を含む核酸領域を同時に増幅するための、配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを提供する。
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、6種の該一塩基多型を検出するための、配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを提供する。
本発明により、前記(1)〜(6)の6種の一塩基多型を、迅速かつ簡便に検出することが可能となる。また、本発明により、前記の6種の一塩基多型を、高精度に検出することが可能となる。
本発明は、臓器移植患者に移植後に投与される免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤の薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動を予測に関する関連する一塩基多型である、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1のExon12に含まれるSNP、MDR1のExon21に含まれるSNP、MDR1のExon26に含まれるSNPの6種の一塩基多型を一度に同時検出する方法である。
ここでCYP3A5*3は、ヒトチトクロームP450 3A5遺伝子(CYP3A5)の一塩基多型の一種で、Intron3に含まれるAからGの変異(ref SNPID:rs776746)であり、CYP2C19*2またはCYP2C19*3は、ヒトチトクロームP450 2C19遺伝子(CYP2C19)の一塩基多型の一種で、*2はExon5に含まれるGからAの変異(ref SNPID:rs4244285)、*3はExon4に含まれるGからAの変異(ref SNPID:rs4986893)である。また、MDR1は細胞膜P糖タンパク質をコードする遺伝子で、MDR1のExon12に含まれる一塩基多型(以下、MDR1Ex12とも言う)、MDR1のExon21に含まれる一塩基多型(以下、MDR1Ex21とも言う)、MDR1のExon26に含まれる一塩基多型(以下、MDR1Ex26とも言う)は、それぞれmRNAにおける開始コドンの最初の塩基を1としたときの1236番目の塩基に該当する部分のCからTの変異、2677番目の塩基に該当する部分のGからTまたはAの変異、3435番目の塩基に該当する部分のCからTの変異である。
本発明の検出方法における第1の工程、及び第2の工程の概略を図1の模式図に示す。第1の工程は、前記(1)〜(6)の6種の一塩基多型を含む核酸領域を増幅するプライマーのセットを用いて、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域を一度に同時増幅してDNA産物を得る工程である。ここでは、配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを使用する。
本発明の第1の工程について具体的に説明する。
第1の工程は、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)による核酸増幅法により増幅する工程である。増幅用プライマーとして配列番号1〜12に示す塩基配列からなる増幅用プライマーのセットを用い、患者血液または臓器から得られた標的核酸を鋳型としてPCRを行うことにより、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1Ex12、MDREx21、MDREx26を含む核酸領域を一度に同時増幅することが可能となる。
ここで用いる核酸増幅用プライマーとして、配列番号1に示す塩基配列からなるプライマーはCYP3A5*3を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号2に示す塩基配列からなるプライマーはCYP3A5*3を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号3に示す塩基配列からなるプライマーはCYP2C19*2を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号4に示す塩基配列からなるプライマーはCYP2C19*2を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号5に示す塩基配列からなるプライマーはCYP2C19*3を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号6に示す塩基配列からなるプライマーはCYP2C19*3を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号7に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex12を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号8に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex12を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号9に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex21を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号10に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex21を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号11に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex26を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号12に示す塩基配列からなるプライマーはMDR1Ex26を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。
配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーは、一般に知られているポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
第1の工程で行うPCR反応の条件は、一般に行われるPCR反応の条件で良く、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
・最初の熱変性(94℃・2分)×1サイクル
・増幅(変性94℃・30秒、アニーリング58℃・30秒、伸長反応68℃・1分)×30サイクル。
・増幅(変性94℃・30秒、アニーリング58℃・30秒、伸長反応68℃・1分)×30サイクル。
次に第2の工程は、第1の工程で得られたDNA産物を鋳型として、一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに一塩基多型の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る工程である。ここで本発明者らは、前記6種のSNPsの検出において一塩基伸長反応の効率をそれぞれのSNP間でほぼ同等にするためには、標識ヌクレオチドの標識の種類と標的核酸としていずれを選択するか、すなわち、mRNAと同じ配列をもつプラス鎖またはそれに相補的なマイナス鎖のいずれを鋳型とするかが大きく影響することを新規に見出した。すなわち本発明においては、CYP3A5*3の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、CYP2C19*2の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、CYP2C19*3の検出においてはプラス鎖を鋳型とするプライマー、MDR1Ex12の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、MDREx21の検出においてはプラス鎖を鋳型とするプライマー、MDREx26の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー(好ましくは配列番号18)が適しており、具体的には、CYP3A5*3の検出においては配列番号13に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、CYP2C19*2の検出においては配列番号14に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、CYP2C19*3の検出においては配列番号15に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、MDR1Ex12の検出においては配列番号16に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、MDREx21の検出においては配列番号17に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、MDREx26の検出においては配列番号18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマーが使用される。
また、本発明の一塩基多型の検出方法の第2の工程において用いる一塩基伸長用プライマーは、標的核酸中の特定位置の塩基配列の3’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列であることを特徴とする。例えば、CYP3A5*3おいては、特定位置の塩基がTまたはCであるため、これに相補的な標識ヌクレオチド、例えば標識ddATPまたは標識ddGTPが取り込まれたことにより得られる標識シグナルを判別することにより、特定位置の塩基配列を検出することが可能となる。
第2の工程において、一塩基伸長用プライマーとして配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを用い、第1の工程で得られたDNA産物を鋳型として一塩基伸長反応を行うことにより、CYP3A5*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、MDR1Ex12、MDR1Ex21、MDR1Ex26の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを取り込んだ標識産物を得ることができる。
配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーは、一般に行われるポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
第2の工程での一塩基伸長反応条件は、一般に行われる一塩基伸長反応の条件であれば特に限定されず、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
・最初の熱変性(95℃・2分)×1サイクル
・一塩基伸長反応(変性95℃・20秒、一塩基伸長反応60℃・15秒)×30サイクル。
・一塩基伸長反応(変性95℃・20秒、一塩基伸長反応60℃・15秒)×30サイクル。
第2の工程において付加する標識ヌクレオチドとしては、標識ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)、即ちddATP、ddTTP若しくはddUTP、ddGTP、ddCTP、を用いることができる。ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのデオキシリボースの3’位の水酸基が水素基になっている物質で、dNTPの代わりにddNTPが取り込まれるとそれ以上相補鎖が合成されなくなり、特異的なターミネーターの役割を果たす。
標的核酸中の特定位置の塩基配列を検出する場合には、図2に一例を示すように、4種類のddNTPを用い、これらのうち少なくとも1種類には識別可能な標識を付加したddNTPを用いる。一塩基伸長用プライマーから一塩基伸長反応が進行し、特定位置の塩基に相補的なddNTPが取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する。この際に取り込まれたddNTPの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を決定することができる。一塩基伸長反応時に、相互に識別可能な複数の標識をそれぞれddNTPに付加してあれば、取り込まれたそれぞれの標識の存在を測定することにより、1種類から4種類の同時塩基配列分析も可能である。
第2の工程で用いるddNTPに付加する識別可能な標識としては、公知の標識物が使用可能であり、識別可能な標識物としては、例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、シアニン系蛍光色素のほか、FITC、6−FAM、HEX、R6G、ROX、R110、TET、TAMRA、テキサスレッド等の蛍光物質が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、32P、35Sなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。これらの中でも、酵素への取り込み効率を標識間で一定にするために、シアニン系蛍光色素または半導体微粒子を用いることが好ましい。
シアニン蛍光色素は、酵素の取り込み効率のばらつきを抑えることができることから好ましく用いることができる。シアニン系蛍光色素の好ましい例としては、一般式1〜3で表される化学構造を有しているものが挙げられる。なお一般式1〜3において、nは1から3の整数、XはOまたはC(CH3)2、R及びR’はヌクレオチドと結合する際に適宜選択されて用いられる官能基を表す。前記官能基としては、カルボン酸基、アルデヒド基、水酸基、アミノ基またはチオール基などが挙げられ、これらが前記一般式1〜3に示す窒素原子に直接結合されてもよいが、アルキル基を介して結合していれば、ヌクレオチドとの結合反応において上記官能基の立体障害を低減できることから好ましい。また、前記官能基がカルボン酸である場合、ヌクレオチドのアミノ基とアミド化反応により結合できることからより好ましく、カルボン酸がカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸アジドまたはカルボン酸活性エステル化物であれば、ヌクレオチドとの結合反応性が向上することから、さらに好ましい。
前記一般式1〜3の化学構造を有するシアニン系蛍光色素の具体例としては、異なる励起、蛍光波長をもつCy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7などが市販されている(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))。Cy2は一般式1において、X=O、n=1で表され、Cy3は一般式1において、X=C(CH3)2、n=1で表され、Cy5は一般式1において、X=C(CH3)2、n=2で表され、Cy7は一般式1において、X=C(CH3)2、n=3で表され、Cy3.5は一般式2おいて、n=1で表され、Cy5.5は一般式2おいて、n=2で表され、Cy3Bは一般式3で表される化学構造を有している。本発明の一塩基多型の検出方法においては、励起、蛍光波長や蛍光シグナルの減衰を考慮すると、特にCy2、Cy3またはCy5を用いることが好適である。
半導体微粒子とは、III−V族原子やII−IV族原子から構成される半導体であって、量子ドットとも呼ばれる。量子サイズによって光学特性が変わることが知られており、多色蛍光標識物として用いられている。例えばZnSe、CdS、CdSe、CdTe、InAs、InP、PbS、Si等が挙げられるが、これに限定されるものではない。CdSeは、結晶径を変えるだけで青から赤まで任意の可視光の波長を作り出すことができるので、好ましく用いられる。また、ZnSe、CdS、CdSe、CdTe、InAs、InP、PbS、Si等は、ZnS、CdSによりコーティングすると蛍光消光が抑えられることから好ましい。
前記標識物は、プライマーの一塩基伸長反応に影響を与えることがなければ、ddNTPのどの位置に結合させてもよい。例えば、アデニン、グアニンの場合はプリン骨格の7位または8位、シトシンはピリミジン骨格の5位または6位、チミンはピリミジン骨格の6位、ウラシルのピリミジン骨格の5位または6位に結合させることができる。標識物の結合方法としては特に制限はなく、例えばGEヘルスケアバイオサイエンス(株)の「CyDyeカタログ」(22頁)に記載されているような一般的な方法で標識体を結合することができる。また、市販されているCy3標識ddNTP、Cy5標識ddNTP((株)パーキンエルマージャパン)など、入手可能又は既知の標識物が結合されているddNTPを用いることもできる。
一塩基伸長反応にはポリメラーゼを用いるが、好ましくは耐熱性のDNAポリメラーゼを用いる。耐熱性のDNAポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、取り込み効率の向上を図ることができる。より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の高いことから、Thermo Sequenase DNA Polymerase(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))またはSequenase Version 2.0 T7 DNA Polymerase(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))が用いられる。
本発明における一塩基伸長反応後の標識産物を検出する方法としては様々な方法が適用可能であるが、以下のような支持体による検出法を用いることが可能である。この検出法は、第2の工程で得られた該標識産物中に含まれる一塩基伸長用プライマーと選択的な結合が可能な核酸配列を有する捕捉プローブを用いることにより実施できる。なお、本検出方法においては、一塩基伸長用プライマーは前記配列番号13〜18に示す塩基配列からなる伸長プライマー配列部分とともに、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分を有していることが好ましい。捕捉プローブとしては、前記タグ配列に相補的な配列を用いることができる。図3に、伸長プライマー配列部分とともにタグ配列を有する一塩基伸長用プライマーを説明するための模式図を示す。ここでいうタグ配列とは、任意に設計した配列で、タグ配列同士がほぼ同じ長さを持ちかつほぼ同じ解離温度を有しさらに標的核酸中に結合しない配列であれば特に限定されない。前記タグ配列を付加したプライマーを利用して得られる標識産物を捕捉する方法は既に開示されており(J−B.ファン(J-B. Fan)、ゲノム・リサーチ(Genome Res.)、10、853−860、2000)、図4に一例を示すように、支持体上にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップにより、一塩基伸長反応用プライマーを、タグ捕捉プローブと特異的に結合する塩基配列を有するタグ配列を介して特異的に支持体上に捕捉することができる。
ここで、バイオチップとは、生物の遺伝情報を解析するツールの総称であり、マイクロウェル、マイクロアレイ、DNAチップ等があげられるがこれに限らない。
本発明において用いることができるバイオチップとしては、特に構造に限定はないが、ノイズが低減し、ハイブリダイゼーション効率をあげる効果があることから、例えば、図5に示すようなカバーと支持体を有し、図6に示すような固定化領域に微細な凹凸構造を有する支持体を用いて、該凹凸構造の凸部上面にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップが好ましい。
前記支持体の材質としては特に制限はないが、例えば、金、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ゲルなどの合成ポリマー、ビーズ、繊維、中空糸などを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマーであり、PMMAが、図6に示す微細な凹凸構造と組み合わせて好適に用いられる。
支持体の成形としては、ポリマー製の場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法を用いることができる。また、シリコンの場合は、半導体プロセスで使用される公知の方法が挙げられる。
支持体の凸部の上面への捕捉プローブの固定化は、支持体がポリマー製である場合、凸部上面を化学処理し、捕捉プローブと結合可能な官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを生成させ、これとプローブDNAとを化学結合させることによって行うことができる。例えば支持体がPMMA製である場合は、図7に例示するように、アルカリ性溶液及び/又は酸性溶液によって表面処理することにより支持体表面にカルボキシ基を生成させ、図8に例示するように、3’末端をアミノ化した捕捉プローブをこれと化学反応により縮合させることにより、固定化することができる。また、このような官能基の導入は、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理(例えばγ線、電子線など)するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン(例えばポリーL−リシン、シランカップリング剤など)をコートしたりすることによって行うことができる。
本発明において用いることができるバイオチップにおいては、支持体とカバーの間の凹部にはビーズ6を含むことができる(図6)。ビーズ6が存在することによって、液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、反応促進効果がもたらされる。ビーズのサイズは、支持体の凹部に複数個のビーズが自由に動きうるようなサイズであれば該凹部の形状に合わせて適宜選択できるが、例えば直径数十〜数百μmである。ビーズの材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック(例えばイットリア安定化ジルコニア)、ステンレス等の金属、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックのビーズが好ましい。
本発明において用いることができる前記バイオチップは、通常、固定化領域(スポット)毎に捕捉プローブをそれぞれ一種類ずつ固定化して作製することができる。
本発明において用いるバイオチップ上で、捕捉プローブと一標識を付加された一塩基伸長用プライマーとをハイブリダイゼーションし、余剰物を洗浄することにより、標識産物をバイオチップ上に特異的に捕捉することができる。この場合のハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば30〜50℃で、3〜4×SSC、0.1〜0.5%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、その後の2×SSC及び0.1%SDSを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む溶液(pH7.2)である。
前記方法で捕捉した標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定することにより、標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析することができる。
分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基である場合には、ddNTPの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を分析することができる。つまり、特定位置の塩基に相補的なddNTPの標識の存在、即ち相補的なddNTPの標識シグナルが測定されれば、該特定位置に該塩基が存在すると判断することができる。
標的核酸の試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解させればよい。
前記の他にも、本発明の方法を適用する標的核酸の試料は、随意に変更することができる。例えば、細胞を株化して大量培養したり、末梢血を多めに取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムDNAを大量に調製することにより、直接ゲノムDNA試料とすることができる。また、少量のゲノムDNAを取得し、例えばGEヘルスケアバイオサイエンス(株)の試薬キットGenomiPhiのようなWGA法(Whole Genome Amplification)で、非特異的にゲノムDNAを増幅した試料を用いてもよい。また、PCR法や、マルチプレックスPCR法、アシンメトリックPCR法のようなプライマーを用いて特定の塩基配列を増幅したものを試料としてもよい。特に、ゲノムDNAなどを用いる場合は、予め分析したい特定位置の塩基配列を含む領域をPCRなどで増幅しておいてもよい。例えば、酵素的に増幅する方法により得られた二本鎖試料の場合は、95℃まで加熱してから4℃に急冷して1本鎖化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で95℃まで加熱し断片化したり、超音波で断片化したり、制限酵素で切断したりして、1本鎖化及び/又は断片化操作を加えたものを試料としてもよい。
本発明において一塩基伸長用プライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドから得られるシグナルから一塩基多型を判定する場合、標識シグナルを普遍的な数値に変換、補正することが好ましい。シグナルの普遍性を失わせる要因としては、標識ddNTPの退色、チューブごとの反応性のばらつき、スキャナーのレーザーパワーなどのばらつき、各実験間に一般的に含まれるばらつきが考えられ、これを補正する方法としては、例えば、各反応溶液中にコントロールシグナルを設定し、コントロールシグナルを1とした各シグナルを使用することができる。より具体的には、標識ヌクレオチドとして標識1(野生型用)及び標識2(変異型用)を使用した場合には、コントロールを1としたときの標識1と標識2のシグナル強度比(R=標識1/標識2)を計算し、その比から遺伝子多型(野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモ)を判定することができる。このとき、得られるシグナルは標識1のみ、標識1と2、標識2のみの3パターンが検出されることが想定されており、例数を増やすことによりこれらは3群を形成することになる。ここで、R値の桁を合わせて比較しやすくする目的でRの代わりに、log2(R)を用いても良い。予め3群の平均、分散を得ることにより、新たなサンプルに対してもRまたはlog2(R)を計算し、どの群に含まれるかをマハラノビス距離などで検定することにより、統計的に一塩基多型の判定を行うことができる。
以下の実施例によって本発明について更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されないものとする。
以下の実施例、比較例に用いた該一塩基多型の存在する遺伝子領域を増幅する増幅用プライマー、及び該一塩基多型を検出するための一塩基伸長用プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼し合成した。
(参考例1)
肝移植患者(ドナー、レシピエント)75人の患者から得られたDNAを用いて、通常の塩基配列決定方法(direct−sequence)により、SNPsの配列を確認し、本方法による遺伝子多型検出結果と比較した。
肝移植患者(ドナー、レシピエント)75人の患者から得られたDNAを用いて、通常の塩基配列決定方法(direct−sequence)により、SNPsの配列を確認し、本方法による遺伝子多型検出結果と比較した。
手順(1)オリゴヌクレオチドの準備
CYP3A5*3を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号1及び2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*2を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号3及び4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*3を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号5及び6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex12を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号7及び8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex21を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号9及び10に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex26を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号11及び12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
CYP3A5*3を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号1及び2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*2を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号3及び4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*3を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号5及び6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex12を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号7及び8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex21を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号9及び10に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex26を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号11及び12に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
また、ここでは、特異的なタグ配列が付加されている一塩基伸長用プライマーを用いた。すなわち、CYP3A5*3を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号19に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*2を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号20に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、CYP2C19*3を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号21に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex12を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号22に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex21を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号23及び24に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、MDR1Ex26を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号25に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
シグナル補正用コントロールとして、コントロール1(cont1A、cont1G、primer1)、コントロール2(cont2T、cont2C、primer2)を合成した。cont1Aとして配列番号26に示す塩基配列からなるヌクレオチド、cont2Cとして配列番号27に示す塩基配列からなるヌクレオチド、primer1として配列番号28に示す塩基配列からなるヌクレオチド、cont2Tとして配列番号29に示す塩基配列からなるヌクレオチド、cont2Cとして配列番号30に示す塩基配列からなるヌクレオチド、primer2として配列番号31に示す塩基配列からなるヌクレオチドを合成した。cont1Aとcont1Gは、100merの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基(AまたはG)以外完全に同じ配列である。primer1は、cont1A及びcont1Gの中央の一塩基の3’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。cont2Tとcont2Cは、100merの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基(TまたはC)以外完全に同じ配列である。primer2は、cont2T及びcont2Cの中央の一塩基の3’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。
手順(2)タグ補足プローブ固定化用支持体の作製
タグ補足プローブを固定化する支持体を以下のようにして作製した。公知の方法であるLIGA(LIthographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するPMMA製のタグ捕捉プローブ固定化用の支持体を得た。なお、この実施例で用いたPMMAの平均分子量は5万であり、PMMA中には1重量%の割合で、カーボンブラック(三菱化学製 #3050B)を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域(波長が400nmから800nm)のいずれの波長でも5%以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は0.5%以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン(ピークなど)はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、JIS Z 8722の条件Cに適合した照明・受光光学系を搭載した装置(ミノルタカメラ製、CM−2002)を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
タグ補足プローブを固定化する支持体を以下のようにして作製した。公知の方法であるLIGA(LIthographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するPMMA製のタグ捕捉プローブ固定化用の支持体を得た。なお、この実施例で用いたPMMAの平均分子量は5万であり、PMMA中には1重量%の割合で、カーボンブラック(三菱化学製 #3050B)を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域(波長が400nmから800nm)のいずれの波長でも5%以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は0.5%以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン(ピークなど)はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、JIS Z 8722の条件Cに適合した照明・受光光学系を搭載した装置(ミノルタカメラ製、CM−2002)を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
支持体(図5及び図6の符号1)の形状は、大きさが縦75mm、横26mm、厚み1mmであり、支持体の中央部分を除き表面は平坦であった。支持体の中央に、縦10.0mm、横12.5mm、深さ0.15mmの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径0.15mm、高さ0.15mmの凸部を256(16×16)箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ(256箇所の凸部の高さの平均値)と平坦部分との高さの差を測定したところ、3μm以下であった。また、256個の凸部上面の高さのばらつき(最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差)、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ3μm以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ(凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離)は0.56mmであった。
手順(3)タグ捕捉プローブの固定化
手順(2)で得たPMMA支持体を10Nの水酸化ナトリウム水溶液に70℃で12時間浸漬した。これを、純水、0.1NのHCl水溶液、純水の順で洗浄し、支持体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図7に示す。
手順(2)で得たPMMA支持体を10Nの水酸化ナトリウム水溶液に70℃で12時間浸漬した。これを、純水、0.1NのHCl水溶液、純水の順で洗浄し、支持体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図7に示す。
配列番号19〜25、配列番号28及び31を特異的に捕捉するために、9種類のタグ捕捉プローブ(3’末端アミノ化)を、それぞれ純水に0.3nmoL/μLの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。支持体に点着する際は、PBS(NaClを8g、Na2HPO4・12H2Oを2.9g、KClを0.2g、KH2PO4を0.2g純水に溶かし1LにメスアップしたものにpH調整用の塩酸を加えたもの、pH5.5)でプローブDNAの終濃度を0.03nmoL/μLとし、かつ、支持体表面のカルボン酸とプローブDNAの末端のアミノ基とを縮合させるため、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を加え、この終濃度を50mG/mLとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー(日本レーザー電子製;Gene Stamp―II)で支持体凸部上面の全てにスポットした。次いで、支持体を密閉したプラスチック容器入れて、37℃、湿度100%の条件で20時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図7に示す。
手順(4)カバーの作製、及び装着、ビーズの充填
射出成型法により貫通孔(図5及び図6の符号)を4つ有するカバー(図5及び図6の符号;外周部にオーバーハング構造有り)を作製した。手順(3)で得られたタグ捕捉プローブ(図5及び図6の符号5)を固定化した支持体にPDMSを塗布し(図5及び図6の符号)、その上に作製したカバー2を装着して42℃で2時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した(図5)。このバイオチップに、カバーの貫通孔4から直径180μmのジルコニアビーズ(図5の符号6;東レ(株)製)を20mg装填した(図6)。
射出成型法により貫通孔(図5及び図6の符号)を4つ有するカバー(図5及び図6の符号;外周部にオーバーハング構造有り)を作製した。手順(3)で得られたタグ捕捉プローブ(図5及び図6の符号5)を固定化した支持体にPDMSを塗布し(図5及び図6の符号)、その上に作製したカバー2を装着して42℃で2時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した(図5)。このバイオチップに、カバーの貫通孔4から直径180μmのジルコニアビーズ(図5の符号6;東レ(株)製)を20mg装填した(図6)。
手順(5)特定すべき一塩基多型を含む領域のPCRによる増幅
各肝移植患者の血液からWizard(R) Genomic DNA Purification Kit(プロメガ株式会社)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAは、20ng/μLになるように純水で希釈し、使用するまで−30℃で凍結保存した。得られた各肝移植患者のゲノムDNAを鋳型として、手順(1)の配列番号1〜12のプライマーセットを用いて特定すべき一塩基多型を含む領域をPCRにより増幅した。
各肝移植患者の血液からWizard(R) Genomic DNA Purification Kit(プロメガ株式会社)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAは、20ng/μLになるように純水で希釈し、使用するまで−30℃で凍結保存した。得られた各肝移植患者のゲノムDNAを鋳型として、手順(1)の配列番号1〜12のプライマーセットを用いて特定すべき一塩基多型を含む領域をPCRにより増幅した。
PCRにはKOD−Plus−DNA Polymerase(東洋紡績)を用い、メーカー指定の条件で35サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このPCRは単に標的核酸中の特定領域を増幅することが目的であるため、PCRの方法や酵素の種類に特段の制限はない。
ここで、PCRには常法に従い、以下の試薬を含む50μL水溶液を調製した。各SNPsを含む領域を増幅するフォワードプライマー(配列番号1,3,5,7,9,11):各15pmoL、リバースプライマー(配列番号2,4,6,8,10,12):各15pmoL、10xBuffer for KOD―Plus―Vers.2:5 μL、2mM each dNTP:8μL、25mMMgSO4:5μL、KOD―Plus―:1U、ゲノムDNA:100 ng
また、PCRは、94℃・2分、94℃・30秒/58℃・30秒/68℃・1分を30サイクル行い、反応後は4℃で保存した。その後、GFX PCR DNA and GelBand Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))により精製し、余剰のdNTPsを除いた。
また、PCRは、94℃・2分、94℃・30秒/58℃・30秒/68℃・1分を30サイクル行い、反応後は4℃で保存した。その後、GFX PCR DNA and GelBand Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))により精製し、余剰のdNTPsを除いた。
手順(6)特異的なddNTPの取り込み反応
PCR産物を一塩基伸長反応の鋳型とし、配列番号19〜25の一塩基伸長用プライマーを用いて一塩基伸長反応を行った。
PCR産物を一塩基伸長反応の鋳型とし、配列番号19〜25の一塩基伸長用プライマーを用いて一塩基伸長反応を行った。
手順(5)で得られたPCR産物に、配列番号19〜25に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、Cy3またはCy5で標識されたddNTP(Cy3−ddNTPまたはCy5−ddNTP)、非標識ddNTP、DNA Polymeraseなどを加え、ddNTPの取り込みを行った。検出したい塩基種がCまたはTである場合、Cy5−ddUTP、Cy3−ddCTP、ddGTP、ddATPを、検出したい塩基種がGまたはAである場合、Cy5−ddGTP、Cy3−ddATP、ddTTP、ddCTPを使用した。DNA Polymeraseにはサンガー法に広く使用されている改変型T7 DNA Polymerase Thermo Sequenase DNA Polymerase」(GEヘルスケアバイオサイエンス)を使用した。
一塩基伸長反応は、2つの系に分けて行った。チューブ1にはMDR1Ex12、MDR1Ex21、MDR1Ex26に含まれるSNPsとCYP2C19*3のSNPsを検出する系(C/T判別系)を、チューブ2にはMDR1Ex21とCYP3A5*3、CYP2C19*2のSNPsを検出する系(G/A判別系)を構築している。それぞれのチューブには、蛍光シグナル補正用コントロールを含む。
蛍光シグナル補正用コントロールは、primer1(配列番号28)とcont1A(配列番号26)、cont1G(配列番号27)の組み合わせ(チューブ1)と、primer2(配列番号31)とcont2T(配列番号29)、cont2C(配列番号30)の組み合わせ(チューブ2)である。チューブ1を例に詳しく説明する。cont1Aとcont1Gは、100merの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基(AまたはG)以外完全に同じ配列である。primer1は、cont1A及びcont1Gの中央の一塩基の3’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。そのため、primer1はcont1Aを鋳型に一塩基伸長した場合はCy5―ddUTPを、cont1Gを鋳型にした場合はCy3―ddCTPを結合するので、コントロール1のスポットはCy3とCy5の両方のシグナルを与えることになる。蛍光シグナル補正コントロールは全てのサンプルにおいて同量加えているので、理論上は常に同じ蛍光シグナル強度を与えるものであり、チューブ1中の反応を反映する蛍光シグナル強度を与えると考えられる。チューブ2についても同様で、cont2Tとcont2Cは、100merの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基(TまたはC)以外完全に同じ配列であり、コントロール2のシグナルがチューブ2中の反応を反映するシグナル値を与える。
ここで、ddNTPs取り込み反応には、C/T判別系(チューブ1)として、一塩基伸長反応用プライマー:{MDR1Ex12プライマー(Ex12、配列番号22)、MDR1Ex21プライマー(Ex21−1、配列番号23)、MDR1Ex26(Ex26、配列番号25)、CYP2C19*3プライマー(配列番号19)}各0.3pmoL、10μM Cy3標識ddCTP:1μL、10μM Cy5標識ddUTP:1μL、10μM ddGTP:1μL、10μM ddATP:1μL、ReactionBuffer:2μL、Thermo sequenase polymerase:5U、精製後PCR産物2μL、cont1A(配列番号26):5ng、cont1G(配列番号27):5ng、primer1(配列番号28):0.15pmoLを、純粋で20μLにメスアップしたものを用いた。
ddNTPs取り込み反応がG/A判別系(チューブ2)としては、一塩基伸長反応用プライマー:{MDR1Ex21プライマー(Ex21−2、配列番号24)、CYP3A5*3プライマー(配列番号19)、CYP2C19*2プライマー(配列番号20)}各0.3pmoL、10μM Cy3標識ddATP:1μL、10μM Cy5標識ddGTP:1μL、10μM ddCTP:1μL、10μM ddTTP:1μL、ReactionBuffer:2μL、Thermo sequenase polymerase:5U、精製後PCR産物2μL、cont2T(配列番号29):5ng、cont2C(配列番号30):5ng、primer2(配列番号31):0.15pmoLを、純水で20μLにメスアップしたものを用いた。
また、ddNTPs取り込み反応は、95℃・2分、95℃・20秒/60℃・15秒を30サイクル行い、反応後は4℃で保存した。
手順(7)ハイブリダイゼーション
手順(6)の取り込み反応液9.6μL(C/T判別系(チューブ1)反応溶液4.8μL、及びG/A判別系(チューブ2)反応溶液4.8μLの混合溶液)を95℃で5分間熱変性し、氷中で急冷した。これにハイブリダイゼーション用反応溶液を30.4μL加え、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液40μLを貫通孔より注入した。その後、封止材としてPETテープで貫通孔を塞ぎ、チャンバー(TaKaRa製、TaKaRa Hybridization Chamber 5 No.TX711)にセットした。シェイカー(EYELA製、Multi Shaker MMS)にチャンバーを固定化し、42℃、3時間インキュベートした。シェイカーの回転数は250rpmとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。
手順(6)の取り込み反応液9.6μL(C/T判別系(チューブ1)反応溶液4.8μL、及びG/A判別系(チューブ2)反応溶液4.8μLの混合溶液)を95℃で5分間熱変性し、氷中で急冷した。これにハイブリダイゼーション用反応溶液を30.4μL加え、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液40μLを貫通孔より注入した。その後、封止材としてPETテープで貫通孔を塞ぎ、チャンバー(TaKaRa製、TaKaRa Hybridization Chamber 5 No.TX711)にセットした。シェイカー(EYELA製、Multi Shaker MMS)にチャンバーを固定化し、42℃、3時間インキュベートした。シェイカーの回転数は250rpmとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。
インキュベート後、支持体からカバーとPDMSを脱離後に支持体を洗浄、乾燥した。
手順(8)蛍光シグナル強度の測定
DNAチップ用のスキャナー(ScanArray Lite, PerkinElmer, Boston, MA)に手順(7)の処理後の支持体をセットし、蛍光シグナル強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力70%、フォトマルチプレイヤーを適度に調整した。ここでの蛍光シグナル強度とはスポット内の蛍光シグナル強度の平均値である。
DNAチップ用のスキャナー(ScanArray Lite, PerkinElmer, Boston, MA)に手順(7)の処理後の支持体をセットし、蛍光シグナル強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力70%、フォトマルチプレイヤーを適度に調整した。ここでの蛍光シグナル強度とはスポット内の蛍光シグナル強度の平均値である。
本方法では以下のように各SNPに対応する蛍光シグナルの色(取り込まれた蛍光標識ddNTPs)及び強度から特定位置の塩基配列の分析を行った。まず各反応チューブに一定量加えたコントロールの蛍光シグナル(コントロール1または2)による補正を行った。チューブ1では、CYP2C19*3とMDR1Ex12、21、26に含まれる各SNPsを検出するために、配列番号19、22、23、25を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化したスポットから得られる各蛍光シグナル強度から、コントロール1のCy3及びCy5の蛍光シグナル強度を1と補正した場合のR=Cy3の蛍光シグナル強度/Cy5の蛍光シグナル強度を得た。
また、同様にチューブ2は、CYP3A5*3、CYP2C19*2及びMDR1Ex21に含まれるSNPsを検出するために、配列番号19、20、24を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化した各スポットから得られる蛍光強度から、コントロール2のCy3及びCy5の蛍光強度を1と補正した場合のR=Cy3の蛍光シグナル強度/Cy5の蛍光シグナル強度を得た。
ここで、蛍光シグナル強度の値としてはブランクスポット(スポット溶液のみをスポットした部分)のCy3及びCy5の蛍光シグナル強度を引いた値を用いている。この補正は、遺伝子多型を診断するCy3及びCy5の蛍光シグナル強度を普遍的な数値に変換することを目的としている。Cy3及びCy5の蛍光シグナル強度の普遍性を失わせる要因としては、Cy3,Cy5標識ddNTPの退色、チューブごとの反応性のばらつき、スキャナーのレーザーパワーなどのばらつき、各実験間に一般的に含まれるばらつきが考えられる。この補正によりこれらの要因を加味した数値に変換することができる。
手順(9)各肝移植患者の塩基配列との比較
手順(8)で求めたR値については、底2をとったlog値に変換し、通常の塩基配列決定方法で得られたデータと比較したところ、各肝移植患者のSNPsの遺伝子多型のlog2(R)値は、野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの3群を形成した。各群の平均と分散は表1に示す。DUNNET法による多重比較検定の結果、p値が0.05より小さく、各群間に有意差があることが確認できた。なお、MDR1Ex21のGからAまたはTの変異をチューブ2のG/A判定系で検出しようとする場合、GからTの変異の場合のみCy3標識ddATPの蛍光が検出されるため、Ex21−2のプライマーではCy3蛍光シグナル強度検出群の1群のみが形成された(図9)。
手順(8)で求めたR値については、底2をとったlog値に変換し、通常の塩基配列決定方法で得られたデータと比較したところ、各肝移植患者のSNPsの遺伝子多型のlog2(R)値は、野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの3群を形成した。各群の平均と分散は表1に示す。DUNNET法による多重比較検定の結果、p値が0.05より小さく、各群間に有意差があることが確認できた。なお、MDR1Ex21のGからAまたはTの変異をチューブ2のG/A判定系で検出しようとする場合、GからTの変異の場合のみCy3標識ddATPの蛍光が検出されるため、Ex21−2のプライマーではCy3蛍光シグナル強度検出群の1群のみが形成された(図9)。
(実施例1)
参考例1で得られたデータをもとに、新規の肝移植患者1名のSNPsの検出、解析した。
参考例1で得られたデータをもとに、新規の肝移植患者1名のSNPsの検出、解析した。
まず、参考例1の手順(5)のPCR増幅後に得られたDNA試料は一部を電気泳動したところ目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた(図10レーン1)ほか、通常の塩基配列決定方法(direct−sequence)により、CYP3A5*3はGAへテロ、CYP2C19*2はGAへテロ、CYP2C19*3はGGホモ、MDR1Ex12はCCホモ、MDR1Ex21はGTへテロ、MDR1Ex26はCCホモであることを確認した。
次に、参考例1の手順(1)〜(8)に従って求めたR値について、底2をとったlog値に変換した。得られた各SNPのlog2(R)(xとする)と、参考例1で得られた各群の平均(mとする)と分散(sとする)を以下の計算式に当てはめて参考例1で得られたそれぞれのグループに対するマハラノビス距離(Dとする)を求めた。log2(R)値はマハラノビス距離の最も小さいグループに帰属するとし、これによりSNPs判定を行った。
計算式:D=(x−m)2/s2。
計算式:D=(x−m)2/s2。
但し、Ex21−2によるMDR1Ex21のSNP検出においては、SNPがTに変異している場合のみCy3のシグナルを検出するため、Cy3のシグナルがコントロールのCy3シグナルを1としたときに0.5以上である場合にのみ、GからTへの変異を検出するシグナルとみなし、Rを求めることとした。
各測定値log2(R)とマハラノビス距離を表2に示す。CYP3A5*3のlog2(R)は0.6であり、GAヘテロ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、GAへテロと判定した。CYP2C19*2のlog2(R)は−0.5であり、GAヘテロ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、GAへテロと判定した。CYP2C19*3のlog2(R)は9.0であり、GGホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、GGホモと判定した。MDR1Ex12のlog2(R)は8.9であり、CCホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、CCホモと判定した。MDR1Ex21のC/T判定系におけるEx21−1(配列番号23)プライマー由来のlog2(R)は8.7であり、GGホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、GGホモと判定した。さらに、MDR1Ex21のG/A判定系におけるEx21−2(配列番号24)プライマー由来のシグナルは、コントロール2のCy3シグナルを1としたときに、1.2であることから、シグナルであると判定し、一塩基多型はTであると判定した。即ち、MDR1Ex21は、GTへテロと判定した。MDR1Ex26のlog2(R)は6.2であり、CCホモとのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、CCホモと判定した。以上の結果を表2に示す。
以上の結果より、蛍光シグナル強度による検出結果と通常の塩基配列決定法による結果が一致した。
(比較例1)
一塩基伸長用プライマーを、MDR1Ex21を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、Ex21−1をEx21−3(配列番号32)、Ex21−2をEx21−4(配列番号33)に変更した以外は実施例1と同様に行った。なお、Ex21−3はEx21−1が鋳型とするDNA鎖の相補鎖を鋳型とする設計であり、Ex21−4はEx21−2が鋳型とするDNA鎖の相補鎖を鋳型にする設計となっている。
一塩基伸長用プライマーを、MDR1Ex21を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、Ex21−1をEx21−3(配列番号32)、Ex21−2をEx21−4(配列番号33)に変更した以外は実施例1と同様に行った。なお、Ex21−3はEx21−1が鋳型とするDNA鎖の相補鎖を鋳型とする設計であり、Ex21−4はEx21−2が鋳型とするDNA鎖の相補鎖を鋳型にする設計となっている。
まず、参考例1の手順(5)のPCR増幅後に得られたDNA試料は一部を電気泳動したところ目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた(図10レーン2)。
次に、各SNPsのlog2(R)について、参考例1で得られた群とのマハラノビス距離を調べた結果は表2に示す通り、実施例1と同様の判定結果であったが、MDR1Ex21のC/T判定系におけるEx21−3プライマー由来のシグナルは、コントロール2のCy5シグナルを1としたときに、0.1であることから、シグナルは検出されなかったものとし、一塩基多型はGGホモであると判定したため、MDR1Ex21において通常の塩基配列決定法による判定と相違することが判明した。
以上の結果から、一塩基伸長反応時に使用する標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマー設計、即ち鋳型とするDNA鎖の選択が必要であることが明らかとなった。
(比較例2)
CYP3A5*3を増幅するプライマーとして配列番号2から配列番号34に変更して実施した以外は実施例1と同様に行った。
CYP3A5*3を増幅するプライマーとして配列番号2から配列番号34に変更して実施した以外は実施例1と同様に行った。
PCR増幅後に得られたDNA試料は一部を電気泳動したところ、目的とする領域のうち、CYP3A5*3を含む領域のバンドが見られなかった(図10レーン3)。
次に各SNPsのlog2(R)について、参考例1で得られた群とのマハラノビス距離を調べた結果を表2に示す。その結果、CYP3A5*3については蛍光シグナルを検出することができず、CYP3A5*3を含む領域がPCRによって増幅されなかったためであると判断された。
以上の結果から、同時に複数の一塩基多型を含む領域を増幅するためには、一塩基多型を含む領域を増幅するためのプライマーの配列が重要であることが明らかとなった。
1 支持体
2 カバー
3 接着層(PDMS)
4 貫通孔
5 支持体に固定化されたタグ捕捉プローブ
6 ビーズ
2 カバー
3 接着層(PDMS)
4 貫通孔
5 支持体に固定化されたタグ捕捉プローブ
6 ビーズ
Claims (3)
- (1)CYP3A5*3、(2)CYP2C19*2、(3)CYP2C19*3、(4)MDR1のExon12に含まれる一塩基多型、(5)MDR1のExon21に含まれる一塩基多型、(6)MDR1のExon26に含まれる一塩基多型の検出方法であって、
配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の(1)〜(6)の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してDNA産物を得る第1の工程、
第1の工程で得られたDNA産物を鋳型として、配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第2の工程、
を含む一塩基多型の検出方法。 - 請求項1に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号1〜12に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセット。
- 請求項1に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号13〜18に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセット。
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CN110885884A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-17 | 昆明和合医学检验所有限公司 | 用于同步检测cyp2c19基因*2、*3、*17位点基因多态性的方法 |
JP2020114240A (ja) * | 2011-05-12 | 2020-07-30 | アンディ・コーポレイションANDE Corporation | Str遺伝子座の迅速な多重増幅のための方法および組成物 |
-
2008
- 2008-03-17 JP JP2008067938A patent/JP2009219439A/ja active Pending
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