EA036754B1 - Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных - Google Patents
Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных Download PDFInfo
- Publication number
- EA036754B1 EA036754B1 EA201600045A EA201600045A EA036754B1 EA 036754 B1 EA036754 B1 EA 036754B1 EA 201600045 A EA201600045 A EA 201600045A EA 201600045 A EA201600045 A EA 201600045A EA 036754 B1 EA036754 B1 EA 036754B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- deer
- species
- dna
- seq
- primers
- Prior art date
Links
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 116
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241001493546 Suina Species 0.000 title claims abstract description 22
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 40
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 37
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000282988 Capreolus Species 0.000 claims abstract description 28
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 19
- 241000283014 Dama Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 244000309464 bull Species 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 241000283026 Cervus elaphus Species 0.000 claims description 13
- 241000282983 Capreolus capreolus Species 0.000 claims description 12
- 241001416182 Dama dama Species 0.000 claims description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 claims description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 claims 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 claims 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims 2
- 241000283726 Bison Species 0.000 abstract description 13
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011840 criminal investigation Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 81
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 29
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 21
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 19
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 4
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 3
- 241000283705 Capra hircus Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 241000282996 Alces Species 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282985 Cervus Species 0.000 description 2
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 2
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 210000001565 alc Anatomy 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241001237623 Capreolus capreolus bedfordi Species 0.000 description 1
- 241000283021 Cervus canadensis canadensis Species 0.000 description 1
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241001016073 Sus scrofa scrofa Species 0.000 description 1
- 241000269849 Thunnus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 231100000640 hair analysis Toxicity 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000020991 processed meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
- B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биодиагностики и может быть использовано для установления видового происхождения биологических образцов диких животных в криминалистике при экспертном исследовании вещественных доказательств по делам о незаконной охоте, краже домашнего скота. Предложен способ видовой ПЦР-идентификации биологических образцов диких животных семейства Оленевые (лось, олень, косуля, лань) и их дифференциации от домашних представителей отряда Парнокопытные (бык, овца, коза, свинья) и диких зубра и кабана, при котором ДНК определяемых видов генотипируют с использованием мультиплексного набора праймеров, специфичных к ДНК других генетически родственных видов семейства Оленевые и Полорогие. Предложена тест-система для осуществления способа, состоящая из набора 1 (локусы T108, T501, BM1824, CSSM036, RT24, RT9, DYS392) и набора 2 (локусы T108, BM1824, RT9, BL4, McM505, SO766).
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биодиагностики и может быть использовано для установления видового происхождения биологических образцов (волосы, слюна, пятно крови, фрагмент мышцы и др.) европейских видов диких животных семейства Оленевые - Лось (Alces alces), Олень благородный (Cervus elaphus), Косуля (Capreolus capreolus), Лань (Dama dama) и дифференциации указанных видов от других парнокопытных - домашних представителей семейства Полорогие (Бык - Bos taurus, Овца - Ovis aries, Коза - Capra hircus) и дикого Зубра (Bos bonasus), а также семейства Свиные - Кабан дикий (Sus scrofa scrofa)/Свинья домашняя (Sus s. domestica) - в криминалистике при экспертном исследовании вещественных доказательств по делам о незаконной охоте, краже домашнего скота и др. Изобретение может также применяться при установлении источников происхождения или состава мясопродуктов, в мониторинге стад диких животных в природоохранных или экологических целях, а также при проведении научных исследований.
Сведения о предшествующем уровне техники
Вопросы о видовой принадлежности исходного биологического материала изначально возникли в пищевой промышленности в отношении переработанных продуктов, таких как фарш, колбасы и т.п., в связи с проверкой соответствия качества, заявленного производителем, используемому в действительности сырью [4-10].
В экспертно-криминалистической практике установление видовой принадлежности исходного биологического материала [1-3] существенно при расследовании фактов экономического мошенничества в пищевой промышленности, а также в расследовании правонарушений экологического и природоохранного характера. Наиболее распространенным преступлением такого рода является незаконная охота (браконьерство). Доказывание фактов браконьерства осложняется тем, что наиболее распространенные объекты незаконной охоты - дикий кабан, косуля, лось, олень - не только являются родственными видами между собой, но и состоят в филогенетическом родстве с домашними животными (свинья, бык, коза, овца). В системе классификации живых организмов все они относятся к одному отряду Парнокопытные, включающему 3 семейства: семейство Оленевые (лось, олень, косуля, лань), семейство Полорогие (зубр, бык, овца, коза) и семейство Свиные (дикий кабан и домашняя свинья).
Достоверное определение видового происхождения в случае генетически родственных видов возможно путем проведения исследования на молекулярном уровне, что соответствует возможностям современного ДНК-анализа. Известны различные подходы к установлению источника происхождения биологического материала на молекулярном уровне.
1. Первые работы с использованием ДНК для выявления видового источника происхождения мяса животных основывались на гибридизации меченых зондов ДНК с образцами геномной ДНК, ковалентно связанной с нейлоновыми мембранами, в формате слот- или дот-блоттинга [4, 6, 10]. Используя такие методы, были однозначно идентифицированы образцы ДНК кур и свиней [6], выделенные из приготовленного мяса и коммерческих продуктов [4, 6], и свинина в смесях свинины с говядиной [10]. Были получены зонды на мясо козы, барана и быка, специфичность которых была не абсолютна, но достаточна для решения ряда практических задач [6, 11]. В работах [5, 7, 12] было описано использование видоспецифичных зондов на основе сателлитной ДНК и достижение четкой идентификации биологических образцов крупного рогатого скота, оленя, свиньи, курицы, индейки, кролика, овцы и козы в исходных продуктах. Продемонстрировано присутствие различных видов мяса в смесях и в широком ряду технологически переработанных, подвергшихся нагреванию и консервированию продуктов [5, 7].
Однако тестирование ДНК указанными выше подходами достаточно трудоемко, в современной судебной экспертизе вышеперечисленные подходы не используются.
2. Анализ последовательностей митохондриальной ДНК.
Имеется ряд сообщений о перспективности определения животных, от которых произошел различный биологический материал, путем исследования митохондриальных генов цитохрома b, цитохромоксидазы I, 16S рРНК [13, 14]. Наиболее проработано исследование митохондриального гена цитохрома b, накоплен значительный объем данных о последовательностях этого гена у различных видов животных, что иногда позволяет по однонуклеотидным заменам распознать даже близкородственные виды. С одной стороны, моноаллельное состояние и многокопийность митохондриальной ДНК в клетке обеспечивает ей некоторое преимущество перед ядерной ДНК в криминалистических исследованиях по идентификации видовой принадлежности животных образцов. С другой стороны, митохондриальная ДНК также проявляет некоторую внутривидовую вариабельность и поэтому следует с осторожностью делать выводы при изучении различий между организмами, основанных на полиморфизме единичных нуклеотидов в ограниченном числе локусов [15].
Недостатком данного подхода является то, что для установления структуры амплифицированных последовательностей митохондриальной ДНК требуется многостадийная и достаточно трудоемкая процедура их секвенирования. С другой стороны, современные технологии, разработанные для многолокусного генотипирования полиморфизма единичных нуклеотидов (минисеквенирование и гибридизация на олигонуклеотидных микроматрицах), дорогостоящи и требуют предварительного знания геномной последовательности, характерной для того или иного вида, так называемого референсного генома [16]. На
- 1 036754 сегодняшний день эта информация опубликована для одомашненных видов (бык, овца, коза, свинья) и косули (Capreolus capreolus), но пока недоступна для остальных видов животных отряда Парнокопытные
[17].
3. Рестрикционное расщепление продуктов ПЦР.
Этот подход (ПЦР+ПДРФ) подразумевает двухэтапное исследование: полимеразная цепная реакция на первом этапе и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов на втором этапе. Chikuni et al. [18] предложили праймеры для ПЦР, основанные на последовательности сателлитной I-ДНК овцы [19], которые взаимодействовали с ДНК овцы и козы, но не других видов, таких как крупный рогатый скот, азиатский буйвол, олень, конь, свинья, курица или кролик. Овечий фрагмент размером 374 п.н. разрезался на фрагменты 236 и 138 п.н. ферментом ApaI. Поскольку данный сайт рестрикции отсутствовал в козьем фрагменте, тот оставался неразрезанным, и разницу можно было визуализировать электрофорезом в агарозном геле. Данный подход впоследствии нашел широкое применение для идентификации многих видов мясных животных [9, 20, 21].
При использовании данного подхода возможен скрининг продуктов ПЦР без секвенирования. С другой стороны, такого рода исследования проводятся в ручном режиме, что неудобно для криминалистических лабораторий. Кроме того, метод обладает некоторыми недостатками: а) довольно часто происходит неполное расщепление ампликонов, б) внутривидовая вариабельность может привести к удалению или созданию дополнительных сайтов рестрикции, что потенциально может приводить к экспертным ошибкам, в) метод не является универсальным для видовой идентификации диких парнокопытных животных.
4. ПЦР с видоспецифичными и группоспецифичными праймерами.
Для идентификации видов, для которых имеется детальная информация о последовательностях ДНК, на основе филогенетически информативного полиморфизма единичных нуклеотидов созданы видоспецифичные праймеры. В соответствующих строгих условиях ПЦР такие праймеры дают продукт только в присутствии ДНК данного вида, при этом можно предсказать длину продукта амплификации. Таким образом, идентификация подтверждается, если ампликон соответствующего размера идентифицируется при электрофоретическом разделении. Сочетание видоспецифичных праймеров для различных видов животных позволяет детектировать одновременное присутствие более одного вида.
При другом подходе используют неселективный праймер, который обычно основывается на последовательности, общей для всех изучаемых в данной системе видов. Вариация точного положения данной группоспецифичной последовательности в гене становится причиной изменения размеров продуктов амплификации.
Использующие подобный режим мультиплексные реакции описаны для мясных видов животных [8]. Неселективные праймеры, общие для всех изучаемых в данной системе видов, дают возможность устанавливать принадлежность животных к надвидовым таксонам.
Описан метод, основанный на вариабельности контрольного региона митохондриальной ДНК (мтДНК), известного как D-петля (D-loop). У представителей семейства Оленевые этот регион содержит как консервативные зоны (идентичные последовательности между видами семейства), так и участки, которые содержат мутации (однонуклеотидные замены), делеции или инсерции. Авторы предложенного метода сосредоточили свое внимание на одном из участков D-петли, который различается по размеру у оленя и косули (у оленя на этом участке имеются делеции общей длиной 12 пар нуклеотидов, п.н.). Для детекции различий в размере амплифицируемых фрагментов (12 п.н.) проводили анализ фрагментов мтДНК в полиакриламидном геле [22].
Как правило, видо- и группоспецифические праймеры основаны на митохондриальных генах, в связи с чем существует вероятность, что амплификация может быть нарушена вследствие внутривидовой вариабельности. Кроме того, образование видоспецифичных продуктов ПЦР происходит в достаточно строгих условиях ПЦР, что не всегда выполнимо в условиях исследования криминалистических образцов. Для разработки новых, более эффективных и надежных видо- и группоспецифических праймеров необходима детальная информация о последовательностях ДНК всех близкородственных видов в рассматриваемой системе видов.
5. Способ идентификации путем генотипирования полиморфных коротких тандемных повторов (STR) и сравнения множества ПЦР-продуктов некоторой совокупности STR-локусов для сравниваемых объектов [23].
В настоящее время сравнительное исследование полиморфизма STR-локусов является главенствующим подходом при идентификации личности человека и его биологических следов в судебноэкспертной практике. Для исследования полиморфизма STR-локусов домашних животных с известной геномной последовательностью разработаны коммерческие наборы реагентов. Так, корпорация Applied Biosystems (США) [24] поставляет наборы StockMarks for Cattle Genotyping Kit Bovine (11 динуклеотидных локусов, крупный рогатый скот), StockMarks for Dog Genotyping Kit Canine (10 динуклеотидных локусов, собаки), StockMarks for Horses Equine Genotyping System (17 динуклеотидных локусов, лошади). Корпорация Promega (США) [25] производит набор The MeowPlex (11 тетрануклеотидных локусов для идентификации домашних кошек). Корпорация Mentype (Германия) [26] является изготовителем набора
- 2 036754
Mentype Animaltype Pig Kit (11 тетранук-лестидных локусов, свиньи).
Коммерческие тест-системы для генотипирования диких животных отсутствуют. Имеется ряд научных публикаций о полиморфизме STR-локусов оленя [27, 28], косули [29, 30], дикого кабана [31] и других видов диких животных, на основе которых возможна идентификация отдельных особей, например, в рамках криминалистических исследований.
Вместе с тем, в связи с существованием феномена адресной перекрестной амплификации у родственных видов, криминалистической ДНК-идентификации отдельных особей диких животных обязательно должно предшествовать установление видовой принадлежности животного - видовая идентификация, поскольку для идентификации особи могут быть использованы только праймеры, специфичность взаимодействия которых с ДНК данного вида доказана. Наиболее распространенные промысловые дикие животные Беларуси (олень, лось, косуля, кабан) относятся к одному отряду Парнокопытные, который включает 3 семейства - Оленевые (виды - олень, лось, косуля, лань), Полорогие (дикий вид - зубр, домашние - крупный рогатый скот, овца, коза) и Свиные (дикий кабан и домашняя свинья). С точки зрения генетики ДНК-идентификацию отдельной особи в данном случае предстоит осуществлять в широкой группе диких и домашних представителей родственных видов. Проведение генотипирования с целью идентификации особи с неустановленной видовой принадлежностью может приводить к ошибочным результатам, поскольку высокоспецифичные для одного вида праймеры могут быть частично эффективными при генотипирования ДНК другого, генетически родственного вида.
Таким образом, приведенный выше анализ уровня техники показал, что в настоящее время отсутствуют эффективные способы видовой идентификации биологических образцов диких животных в кругу представителей отряда Парнокопытные. Кроме того, описанные в литературе подходы не учитывают требование технологичности процессов, задействованных в современных судебно-экспертных лабораториях, в которых основной и наиболее доступной технологией стала мультилокусная ПЦР-амплификация STR-локусов с использованием флуоресцентно-меченных праймеров и анализ продуктов ПЦР методом капиллярного электрофореза на автоматизированных секвенаторах.
С учетом изложенного выше, в данной области техники существует потребность в разработке способа и тест-системы для видовой ПЦР-идентификации диких видов животных семейства Оленевые и их дифференциации от домашних животных отряда Парнокопытные и диких зубра и кабана.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание способа видовой ДНК-идентификации диких видов животных семейства Оленевые и дифференциации представителей семейства Оленевые от домашних животных отряда Парнокопытные и диких зубра и кабана (по типу дикий - домашний) на основе STR-локусов, а также разработка тест-системы для установления видовой принадлежности диких животных семейства Оленевые и дифференциации их от других парнокопытных (домашнего скота, зубра и кабана) с помощью данного способа.
Поставленная задача решается заявляемым способом на основе феномена адресной перекрестной амплификации STR-локусов у представителей родственных видов животных.
Феномен перекрестной адресной амплификации базируется на высоком уровне консервативности фланкирующих праймер-связывающих участков, сохраняющих схожие последовательности ДНК среди близкородственных видов [32-34].
Для нейтральных ДНК-маркеров в большинстве своем наблюдается следующая закономерность: перекрестная амплификация становится менее вероятной с усилением эволюционной дивергенции между видами в силу случайного накопления мутаций во фланкирующих областях [35]. При нарастании филогенетической дистанции между видами такое ограничение перекрестной применимости микросателлитного локуса может сначала проявляться нарушением амплификации и, следовательно, невыявлением отдельных аллелей (так называемых нуль-аллелей) [36], а в конечном итоге приводить к полной невозможности амплификации на основе данной пары праймеров.
Успешно амплифицируемые маркеры по своему проявлению у целевого вида (вид, на котором апробируется указанный ДНК-маркер) разделяются на две группы: мономорфные, т.е. характеризующиеся единственным аллелем у всех представителей вида, и полиморфные, т.е. имеющие более одного аллельного варианта (качественные признаки). Одновременно при межтаксонном переносе маркеров может также наблюдаться сдвиг в большую или меньшую сторону размерных диапазонов амплифицируемых фрагментов ДНК (количественные признаки).
Технически задача решается заявляемым способом - путем использования набора праймеров полиморфных STR-локусов нескольких видов-источников (вид, для которого микросателлитный маркер был изначально разработан) для генотипирования ДНК целевых видов (вид, на котором апробируется указанный маркер) с использованием заявляемой или аналогичной мультиплексной тест-системы и оценкой совокупности качественных (невыявление, мономорфное выявление, полиморфное выявление) и количественных (молекулярный размер) параметров продуктов амплификации.
Преимуществом заявляемого способа и тест-системы является возможность проведения видовой ДНК-идентификации диких животных семейства Оленевые отряда Парнокопытные с использованием общепринятых ПЦР-технологий - путем мультиплексного генотипирования STR-локусов ДНК, выделен
- 3 036754 ной из идентифицируемого образца, с последующим электрофоретическим анализом флуоресцентномеченных продуктов ПЦР с использованием традиционного для ДНК-лабораторий оборудования. Дополнительным преимуществом является возможность использования генотипов информационно значимых полиморфных локусов, полученных при видовой идентификации образца, на второй стадии идентификационного исследования, на которой осуществляется идентификация конкретной особи установленного вида животного (например, в криминалистических исследованиях).
Сущность заявляемого способа и тест-системы заключается в следующем.
. ДНК из идентифицируемого объекта извлекают с использованием общепринятых процедур.
. Проводят генотипирование (амплификацию) полученной ДНК с использованием тест-системы, включающей праймеры, специфичные к различным видам отряда Парнокопытные, в том числе по п.3, в условиях, описанных в п.4.
. Состав заявляемой тест-системы для видовой ДНК-идентификации биологических образцов диких животных семейства Оленевые - Лось (Alces alces), Олень (Cervus elaphus), Косуля (Capreolus capreolus), Лань (Dama dama) и дифференциации представителей семейства Оленевые от других парнокопытных (домашний скот - бык, овца, коза, свинья; дикие - зубр и кабан).
Заявляемая тест-система предназначена для мультиплексной амплификации и флуоресцентной полихромной детекции 10 STR-локусов и включает основные локусы:
STR-локуса - BM1824, CSSM036, BL4, специфичные к ДНК быка (крупного рогатого скота). Амплифицируемые фрагменты содержат в своей структуре у вида-источника динуклеотидные тандемные повторы;
STR-локуса - T108 и T501, специфичные к ДНК оленя. Амплифицируемые фрагменты содержат в своей структуре у вида-источника тетрануклеотидные тандемные повторы;
STR-локуса - RT9 и RT24, специфичные к ДНК северного оленя Карибу. Амплифицируемые фрагменты содержат в своей структуре у вида-источника динуклеотидные тандемные повторы;
STR-локус - McM505, специфичный к ДНК овцы. Амплифицируемые фрагменты содержат в своей структуре у вида-источника динуклеотидные тандемные повторы;
STR-локус - SO766, специфичный к ДНК свиньи, с динуклеотидным тандемным повтором;
и дополнительные локусы:
STR-локус DYS392, специфичный к ДНК человека в качестве контроля на ингибирование ПЦР, укомплектованные в 2 набора: первый набор включает комплект праймеров для локусов BM1824, CSSM036, T108, T501, RT9 и RT24, а также дополнительный локус DYS392 и фрагмент ДНК человека в качестве контроля на ингибирование ПЦР; второй набор содержит локусы BM1824, T108, RT9, BL4, McM505 и локус SO766, специфичный к ДНК свиньи.
Структура праймеров (синтетических олигонуклеотидов) и тип флуоресцентной метки приведены в табл. 1.
Таблица 1
Структура праймеров, тип флуоресцентной метки локусов заявляемой тест-системы
| Локус | Структура праймера (5’ —> 3’) | SEQ ID NO: | |
| 1.ВМ1824 (D1S34) | F: R~ | TMR/- CATTCTCCAACTGCTTCCTTG GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC | SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 |
| 2. CSSM036 | F: rT | JOE/- AAGAAGTACTGGTTGCCAATCGTG GGATAACTCAACCACACGTCTCTG | SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 |
| З.Т108 | F: rT | FAM/- CATGTGGAGATAGGTAGACAGA CCATTCTGAGTAGCTGATTCA | SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 |
| 4. Т501 | F: rT | FAM/- CTCCTCATTATTACCCTGTGAA ACATGCTTTGACCAAGACC | SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 |
| 5.RT9 | F: R~ | JOE/- TGA AGT TTA ATT TCC ACT CT CAG TCA CTT TCA TCC CAC AT | SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 |
| 6. RT24 | F: rT | ROX/- TGT АТС CAT CTG GAA GAT TTC AG CAG TTT AAC CAG TCC TCT GTG | SEQ ID NO: 11 |
| SEQ ID NO: 12 |
- 4 036754
| 7.BL4 | F: R: | JOE/- AAATTTTTCATCCTTCTTTCTGAC TCACCCTGACTGTGAATGC | SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 |
| 8.МсМ505 | F: ЙГ | FAM/- ATCAGCACCATCTTAGGCCTAGA TGTAGATTCCCTCAATATAAAAATGGT | SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 |
| 9.SO766 | F: ΪΪΓ | FAM/- GTGTAGATATGTGTCTGTACA AGACCTCCTATTAGAGGTGGA | SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 |
| 10.DYS392 | F: R: | TMR/- TAGAGGCAGTCATCGCAGTG GACCTACCAATCCCATTCCTT | SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 |
Концентрация (мкМ) синтетических олигонуклеотидов следующая: BM1824 - 0,013-0055, CSSM036 - 0,013-0,080; T108 - 0,015-0,045, T501 - 0,015-0,090; RT9 - 0,03-0,15; RT24 - 0,025-0,150, BL4 0,05-0,20; McM505 - 0,03-0,10, SO766 - 0,2-0,3; DYS392 - 0,01 - 0,10.
Состав буферного раствора следующий: 10 мМ трис pH 8,6, 50 мМ KCl, 1,7 - 2,5 мМ MgCl2.
Раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов: 200 мкМ (по 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата: дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ).
4. Условия проведения амплификации.
Мультилокусную ПЦР проводят на программируемых приборах термоциклического типа (амплификаторах) iCycler (BIO-RAD, США) и GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) и аналогах в следующем режиме:
цикл [95°С, 3 мин-э-96°С, 30 сек], циклов [94°С, 45 сек —* 60°С, 1 мин —> 68°С, 1 мин] цикл [93,5°С, 45 сек —> 59’С, 1 мин —► 68°С, 1 мин], цикл [4°С, хранение].
Объем реакционной смеси 10-15 мкл.
Фермент Taq-полимеразу добавляют в количестве 0,75-1 ед.
Исследуемую ДНК добавляют в количестве 5-20 нг.
5. Электрофоретическая идентификация продуктов ПЦР.
Идентификацию продуктов ПЦР проводят методом капиллярного электрофореза в автоматическом ДНК-секвенаторе серии 3500, 3130 (Applied Biosystems, США) и аналогах в режиме генотипирования. Спектральную калибровку ДНК-секвенатора проводят с использованием химического стандарта (калибратора), содержащего набор красителей, которые включены в праймеры. Протокол анализа (assay) создают на основе матрицы спектральной калибровки в соответствии со специализированным пользовательским протоколом для соответствующей модели анализатора. Пробоподготовку проводят путем добавления формамида в соотношении 1:1 с последующей термоденатурацией. Определение размеров выявленных фрагментов в исследуемых локусах проводят с использованием внутреннего стандарта размера GeneScan LIZ и специализированной программы GeneMapper®ID-X.
6. Последовательность выполняемых действий при исследовании и анализе результатов.
Действие 1: из образца выделяют ДНК, проводят амплификацию исследуемой ДНК с набором № 1 и разделяют продукты ПЦР.
Стадия 1. Анализ локуса BM1824.
Вариант А.
Наблюдаемый феномен - мономорфное выявление фрагмента размером в 139 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК диких парнокопытных семейства Оленевые (лось, олень, косуля, лань).
Вариант Б.
Наблюдаемый феномен - полиморфное выявление фрагментов (гетерозигота либо гомозигота) размером > 179 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК домашнего крупного рогатого скота (семейство Полорогие) либо дикого представителя этого же семейства - зубра.
Вариант В.
Наблюдаемый феномен - полное невыявление фрагментов, в том числе в локусе DYS392 человека.
Вывод - ингибирование ПЦР.
Действие 2: принимают меры по повышению качества исследуемой ДНК.
Вариант Г.
Наблюдаемый феномен - невыявление фрагментов во всех локусах, кроме локуса DYS392 человека. Вывод:
а) непригодность ДНК для ПЦР (при сильной деградации ДНК);
б) ДНК происходит не от представителей отряда Парнокопытные (при хорошем качестве ДНК);
в) ДНК происходит от видов Овца, Коза, Кабан дикий/свинья домашняя отряда Парнокопытные.
Действие 3: проводят амплификацию исследуемой ДНК с набором № 2.
- 5 036754
Стадия 2. Совместный количественный и качественный анализ фрагментов (см. также схему, табл.
2-9).
Ситуация 1. При мономорфном выявлении локуса BM1824 - 139 п.н.
Вариант А.
Наблюдаемый феномен: мономорфное выявление фрагментов в локусах T108 - 130 п.н.; T501 - 226 п.н.; RT24 - 192 п.н. Полиморфное выявление фрагментов в локусах RT9 - аллели 101, 103 п.н.; CSSM036 - аллели 160, 162 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК косули.
Вариант Б.
Наблюдаемый феномен: мономорфное выявление фрагментов в локусах T108 - 121 п.н.; T501 - 228 п.н.; RT9 - 107 п.н.; RT24 - 216 п.н.; CSSM036 - 158 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК лани.
Вариант В.
Наблюдаемый феномен: мономорфное выявление фрагментов в локусах CSSM036 - 172 п.н.; T108 125 п.н. Полиморфное выявление фрагментов в локусах T501 - аллели 121, 217 п.н.; RT9-118-129 п.н.; RT24-240-271 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК лося.
Вариант Г.
Наблюдаемый феномен: мономорфное выявление фрагментов в локусах CSSM036 - 158 п.н.; RT24 185 п.н. Полиморфное выявление фрагментов в локусах RT9 - аллели 107, 109 п.н.; T108 - 134-182 п.н.; T501 - 227-257 п.н.
Вывод - исследуемый образец содержит ДНК оленя.
Ситуация 2. При полиморфном выявлении локуса BM1824 - 179-191 п.н.
Вариант А.
Наблюдаемый феномен: невыявление фрагментов в локусах T108, T501, мономорфное выявление фрагмента в локусе RT24 - 208 п.н. (у зубра полиморфное 202-212 п.н.). Полиморфное выявление фрагментов в локусе CSSM036 - фрагменты размером > 161 п.н.: в локусе RT9 - фрагменты размером > 110 п.н.
Вывод: исследуемый образец содержит ДНК крупного рогатого скота либо зубра.
Действие 4. При необходимости дифференцировать KPC и зубра переходят к исследованию полиморфизма мтДНК.
Ситуация 3. Если реализовано действие 3 - проведена амплификация исследуемой ДНК с набором № 2.
Вариант А.
Наблюдаемый феномен: полиморфное выявление фрагментов во всех локусах: BM1824 - аллели 169, 173, 175 п.н.; T108 - 122-124 п.н.; RT9 - 116-135 п.н.; BL4 - 155-163 п.н.; McM505 - 114-118 п.н. Невыявление в локусе SO766.
Вывод: исследуемый образец содержит ДНК овцы.
Вариант Б.
Наблюдаемый феномен: мономорфное выявление фрагментов в локусах BM1824 -171 п.н.; T108 124 п.н.; BL4 - 145п.н. Полиморфное выявление в локусе McM505, 92-94 п.н. Невыявление в локусах RT9 и SO766.
Вывод: исследуемый образец содержит ДНК козы.
Вариант В.
Наблюдаемый феномен: невыявление фрагментов в 5 локусах - BM1824, T108, RT9, BL4, McM505. Полиморфное выявление фрагментов в локусе SO766 свиньи (фрагменты 430-490 п.н.).
Вывод - ДНК происходит от представителя семейства Свиные (кабан дикий или домашняя свинья).
Вариант Г.
Наблюдаемый феномен: невыявление фрагментов во всех 6 локусах.
Вывод - ДНК происходит не от представителей отряда Парнокопытные.
На стр. 13 приведена схема идентификации видов животных по результатам генотипирования. Поскольку маркер BM1824 у всех диких видов отряда Парнокопытные - за исключением зубра - амплифицируется единым фрагментом с молекулярным размером 139 п.н., анализ результатов генотипирования с целью видовой идентификации биологического объекта начинают с локуса BM1824.
- 6 036754
Схема идентификации видов животных по результатам генотипирования,
НЕИЗПЕС1 НАМ ДНК ' ί Генотипирование, набор №1 с локусом DYS392 человека
Невыявление фрагмента (Η) Т
Локус ВМ1824
Мономорфное выявление фрагмента (М), 139 п.н.
кусе DYS392 человека
Ингибирова- I ниеПЦР [
ДНК диких рогатых копытных
Полиморфное
J ВЫЯКПРЯИР
I фрагмента (И), 179-191 п&
Генотипирование, набор №2, включающий локус свиньи SO766
CSSMO36: М172
CSSM036: М 158
CSSMO36: Ml58
CSSMO36: П 161183
Т1О8: Н
Т501:Н
RT9: П 110-128
RT24:
CSSM036:160. 162,160.162 Т108:М130 Т5О1:М22б та ιοι,ιοι/ιω RT24:M192
Локус ВМ1824,169-175
I
Т108: П 134-182
Т5О1: П 227-257
RT9: 107,107/109
RT24: М 185
ВМ1824:М171
Т1О8:М124
Т108: М 125
ТОТ а-121.b-217 manii8-i24
RT24:П 240-271
мтДНК
- -I ВМ1824:П 169,173. 175 Т1Д&П122-124 НТ9:П 116-135 В14:П 155-163 МсМЖ:П114-Н8
| 41 | , 4 L |
| ОВЦА | | I КОЗА |
Для установления вида необходимо
7. Примеры реализации способа с использованием заявляемой тест-системы.
Приведены электрофореграммы и в таблицах указаны молекулярные размеры фрагментов, полученные для секвенаторов Applied Biosystems серии 3500, полимера POP-4 и размерного стандарта GeneScan-600 LIZ SizeStandard v.2.0. Использование других серий генетических анализаторов, полимера или размерного стандарта может привести к незначительному изменению размеров фрагментов.
На фиг. 1 приведен скриншот с секвенатора Applied Biosystems 3500 электрофореграммы продуктов генотипирования ДНК лося с использованием заявляемой тест-системы. Программой GeneMapper®IDX на основе маркерной панели Diffplex продукты ПЦР идентифицированы как принадлежащие к семейству Оленевые (локус BM1824, Cervidae); виду Лось (Alces). В табл. 2 приведен комплекс признаков, выявляющийся при генотипировании ДНК вида Лось.
Таблица 2
Особенности выявления признаков у представителей вида Лось
| Признаки | ___________Локусы | |||||
| ВМ1824 | CSSM036 | Т108 | Т501 | RT9 | RT24 | |
| Размеры аллелей, п.н. | 139 | 172 | 125 | 121,217 | 118-129 | 240-271 |
| Характер выявления | М мономорфный | М мономорфный | М мономорфный | 2 фрагмента или мономорфный | П полиморфный | П полиморфный |
| Диагностическое значение | Идентификация вида Лось | Идентификация особей лося |
На фиг. 2 приведен скриншот с секвенатора Applied Biosystems 3500 электрофореграммы продуктов генотипирования ДНК оленя с использованием заявляемой тест-системы. Программой GeneMapper®IDX на основе маркерной панели Diffplex продукты ПЦР идентифицированы как принадлежащие к семейству Оленевые (локус BM1824, Cervidae); виду Олень (Cervus). В табл. 3 приведен комплекс признаков, выявляющийся при генотипировании ДНК вида Олень.
Таблица 3
Особенности выявления признаков у представителей вида Олень благородный
| Признаки | Локусы ____ | |||||
| ВМ1824 | CSSM036 | RT9 | RT24 | Т108 | Т501 | |
| Размеры аллелей, п.н. | 139 | 158 | 107,109 | 185 | 134-182 | 227-257 |
| Характер выявления | М, мономорфный | м, мономорфный | 2 фрагмента или мономорфный | м, мономорфный | п, полиморфный | п, полиморфный |
| Диагностическое значение | Идентификация вида Олень | Идентификация особей оленя |
На фиг. 3 приведен скриншот с секвенатора Applied Biosystems 3500 электрофореграммы продуктов генотипирования ДНК косули с использованием заявляемой тест-сисгемы. Программой GeneMapper®ID-X на основе маркерной панели Diffplex продукты ПЦР идентифицированы как принадлежащие к семейству Оленевые (локус BM1824, Cervidae); виду Косуля (Capreolus). В табл. 4 приведен комплекс признаков, выявляющийся при генотипировании ДНК вида Косуля.
- 7 036754
Таблица 4
Особенности выявления признаков у представителей вида Косуля европейская
| Признаки | Локусы | |||||
| ВМ1824 | CSSM036 | Т108 | Т501 | RT9 | RT24 | |
| Размеры млелей, п.н. | 139 | 160,162 | 130 | 226 | 101, 103 | 192 |
| Характер выявления | М мономорфный | 2 фрагмента или мономорфный | м мономорфный | М мономорфный | 2 фрагмента или мономорфный | М моно морфный |
| Ди агностическое значение | Идентификация вида Косуля |
При генотипировании ДНК вида Лань (Dama dama) для задействованных в тест-системе локусов выявляются следующие амплифицированные фрагменты (табл. 5).
Таблица 5
Особенности выявления признаков у представителей вида Лань
| Признаки | Локусы | |||||
| ВМ1824 | CSSM036 | Т108 | Т501 | RT9 | RT24 | |
| Размеры аллелей, п.н. | 139 | 158 | 121 | 228 | 107 | 214 |
| Характер выявления | М мономорфный | М мономорфный | М мономорфный | М мономорфный | М мономорфный | М мономорфный |
| Диагностическое значение | Идентификация вида Лань |
На фиг. 4 приведен скриншот с секвенатора Applied Biosystems 3500 электрофореграммы продуктов генотипирования ДНК быка с использованием заявляемой тест-системы. Программой GeneMapper®IDX на основе маркерной панели Diffplex продукты ПЦР идентифицированы как принадлежащие виду Бык домашний (Bos). В табл. 6 приведен комплекс признаков, выявляющийся при генотипировании ДНК вида Бык.
Таблица 6
Осо бенности выявления признаков у представителей вида Бык домашний
| Признаки | Локусы | |||||
| Т108 | Т501 | RT24 | ВМ1824 | CSSM036 | RT9 | |
| Размеры аллелей, п.н. | - | - | 208 | 179-191 | 161-183 | 110-128 |
| Характер выявления | н, невыявление | н, невыявление | м, мономорфный | п, полиморфный | п, полиморфный | п, полиморфный |
| Ди агностическое значение | Идентификация крупного рогатого скота | Идентификация особей крупного рогатого скота |
При генотипировании ДНК вида Коза (Capra hircus) для задействованных локусов выявляются следующие амплифицированные фрагменты, табл. 7.
Таблица 7
Особенности выявления признаков у представителей вида Коза домашняя
| Признаки | Локусы | |||||
| BL4 | МсМ505 | ВМ1824 | Т108 | RT9 | SO766 | |
| Размеры аллелей, п.н. | 145 | 92-94 | 171 | 124 | ||
| Характер выявления | м, мономорфный | п, полиморфный | М, мономорфный | М, мономорфный | н, невыявление | н, невыявление |
| Диагностическое значение | Идентификация вида Коза |
При генотипировании ДНК вида Овца (Ovis aries) для задействованных локусов выявляются следующие амплифицированные фрагменты (табл. 8).
Таблица 8
Особенности выявления признаков у представителей вида Овца домашняя
| Признаки | Локусы | |||||
| BL | МсМ505 | ВМ1824 | Т108 | RT9 | SO766 | |
| Размеры аллелей, п.н. | 155-163 | 114-118 | 169,173, 175 | 122-124 | 116-135 | - |
| Характер выявления | п, полиморфный | п, полиморфный | 2 фрагмента или мономорфный | п, полиморфный | п, полиморфный | н, невыявление |
| Диагностическое значение | Идентификация вида и особей овцы |
При генотипировании ДНК вида Кабан (Sus scrofa) для задействованных локусов выявляются следующие амплифицированные фрагменты (табл. 9).
- 8 036754
Таблица 9
Особенности выявления признаков у представителей вида Кабан европейский
| Признаки | Локусы | |||||
| BL | МсМ505 | ВМ1824 | Т108 | RT9 | SO766 | |
| Размеры аллелей, п.н. | - | - | - | - | - | 430-490 |
| Характер выявления | н, невыявление | н, невыявление | н, невыявление | н, невыявление | н, невыявление | п, полиморфный |
| Диагностическое значение | Идентификация вида Кабан/Свинья |
9. Физическая природа генетических различий между родственными видами, определяющая получение технического результата.
Физическая природа различий амплифицированных фрагментов между генетически родственными видами определяется различиями в первичных последовательностях соответствующих участков ДНК у сравниваемых видов. На рис. 1-6 приведены результаты секвенирования фрагментов ДНК, полученных путем апмлификации одного и того же локуса у разных животных.
Обозначения, здесь и далее: B.t. - ДНК быка домашнего (Bos taunus), крупный рогатый скот; A.a. ДНК лося (Alces dices); C.e. - ДНК оленя (Cervus elaphus); C.c. - ДНК косули (Capreolus capreolus); D.d. ДНК лани (Dama dama).
B.t.: CATTCTCCAACTGCTTCCTTGAAATGGTGCGTGAAAGGTAAACTGAGACATGAATATTAAAATAAGTTTTCATTCTACTCACACTTTTTTGGAAATTTGGCTAA
A.a. :..............................A.....A.........................A.G..............T.....G.....A............
C.e. :..............................A.....A.........................A.....C.....................TA............
C.c. :..............................A.....A........................GA............................A............
D.d. :..............................A.....A.........................A............................A. . . .G.......
B.t.: GTGACATGACTAAGCAACTAACACACACACACACACACACACACACACACGCACAGAAAGTTAGATTGGAAAAACACCTTGCTC
A.a. : . .--------------------------------------------------. T AC.......................
C.e. : . .--------------------------------------------------.T......C.......................
C.c. : . .----------------------------------------------------------C.......................
D.d. : . .--------------------------------------------------.T......C.......................
Рис. 1. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса BM1824 у крупного рогатого скота (Bos taurus, B.t.), лося (Alces alces, A.a.), оленя (Cervus elaphus, C.e.), косули (Capreolus capreolus, C.c.) и лани (Dama dama, D.d.). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутст вующие нуклеотиды.
Как следует из рис. 1, у диких видов Лось, Олень, Косуля и Лань в локусе BM1824 в сравнении с видом-источником - Бык домашний имеется одинаковая делеция в 50 п.п., полностью элиминирующая тандемный участок с CA-повтором, который и определяет полиморфизм аллелей в локусе BM1824 у крупного рогатого скота, выражающийся в различиях размеров аллелей данного локуса. У всех диких представителей семейства Оленевые полиморфизм в локусе BM1824 отсутствует и амплифицируется фрагмент одного и того же размера - 139 п.н.
С . е . : CATGTGGAGATAGGTAGACAGATGGAGAGAGGATAGAGATATATSATAeATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAGATAAATCAGGCAGAGAGAG A.a. :.........................................А ------------------------Т А.......................А. . . . .
С.с. :.........................................А ------------------------Т А. . . .G..................А.........
D.d. :................................................ А.........
С . е . : CAAATACCATCTTTGGCAACCTCTGAATCAGCTACTCAGAATGG A.a. : . . . .С.........А.............................
C.c.:.G..С....................................... D.d.:............................................
Рис. 2. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса T108 у оленя (Cervus elaphus, C.e.), лося (Alces alces, A.a.), косули (Capreolus capreolus, C.c.) и лани (Dama dama, D.d.). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутствующие нуклеотиды.
Отсутствие полиморфизма в локусе T108 у видов Лось, Косуля и Лань в сравнении с видомисточником (Олень) определяется делециями и однонуклеотидными точечными заменами в тандемной области, полиморфной у вида-источника - Олень Cervus elaphus.
C.e.: CTCCTCATTATTACCCTGTGAAGTTGACACAGTTATTATATGGATGAGGATACTAAGGCTCAGAGAAATAAACTGTAGGTATCTAGGCAGAATTAAAACCCAATATGTACAAGCATATTGTG
A.a. [ long] :...............................................................................C.................................T........
A.a. [short] :-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C.c.: ..........................................................................................................................
D.d.: ....................................................T.....................................................................
C.e.: CAAATCTGACTCATATTTTTTTTTT------ACTATGTATGTGTATATAGATAGGTAGATAGATAGATAGATAGAGATATATTTAATTGGTTGCATCGGGTCTTGGTCAAAGCATGT
A.a. [ long]:...........TG......... —.......TA..................T...........................................
A.a. [short] :--------------------------------------------—.......TA..................T...........................................
C.c.: ...........AG.......... —........A.....C....................................A...................
D.d.: ...................A..................................A..............................................................
Рис. 3. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса T501 у оленя (Cervus elaphus, C.e.), лося (Alces alces, A.a.), косули (Capreolus capreolus, C.c.) и лани (Dama dama, D.d.). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутствующие нуклеотиды.
Отсутствие полиморфизма в локусе T501 у видов Лось, Косуля и Лань в сравнении с видомисточником (Олень) определяется делениями и однонуклеотидными точечными заменами в тандемной области, полиморфной у вида-источника - Олень Cervus elaphus.
B.t.: AAGAAGTACTGGTTGCCAATCGTGTTGCTTCACACACACACACACACACACACACACACACACACAAATCCAACAACAGCCAAATGACTA—TGANNNNAAAAATGGAGTATGCCATG
A.a.:............................C.G.G...G...G...N........................................A.A..AC.. . GGGG. . . .G.T............
C.e.:............................C.G.G....................................................A.A. .AC. . .GGGG. . - . GCT............
C.c.:............................C.G.G....................................................A.A. .AC. . .GGGG. . G.GCT............
B.t.: GGAGATGTAGGGGCTTCCAAAGATCGTCCAAAGACAGAGACGTGTGGTTGAGTTATCC A. a. : . . . . G. . C.................A................................
C.e.:...,G..C.T...............A................................
C.c. : . . . .G. .CGT. .A............A................................
- 9 036754
Рис. 4. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса CSSM036 у крупного рогатого скота (Bos taurus, B.t.) [GenBank U03827], лося (Alces alces, A.a.), оленя (Cervus elaphus, C.e.) и косули (Capreolus capreolus, C.c). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутствующие нуклеотиды.
Отсутствие полиморфизма в локусе CSSM036 у видов Лось, Олень, Косуля в сравнении с видомисточником (Бык домашний) определяется делениями и однонуклеотидными точечными заменами в тандемной области, полиморфной у вида-источника - Быка домашнего.
R. t. : TGAAGTTTAATTTCCACTCTATT-CTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATGTAAATCTTGATGACTGCTGACTTGGAGCCTGGGGTGCATGTGGGATGAAAGTGACTG A.a. :.......................А.................................Т.....................................G...............................
С.е. :.......................-...............Т--------------------------. .СА..........С..............G...............................
С.с. :.....................С,-.......................................................................G...............................
Рис. 5. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса RT9 у северного оленя карибу (Rangifer tarandus, R.t.) [GenBank U90741], лося (Alces alces, A.a.), оленя (Cervus elaphus, C.e.) и косули (Capreolus capreolus, C.c.). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутствующие нуклеотиды.
Тандемная область локуса RT9 у вида-источника - северного оленя - менее всего делетирована у вида Лось, в связи с чем данный локус у вида Лось выявляет полиморфизм, в то время как более обширные делеции у видов Олень и Косуля приводят к наличию у них только двух вариантов аллелей.
R.t.: TGTATCCATCTGGAAGATTTCAGAAATGATACTAAGTCAGAARAACACWTTGCAGAAGAGTGAGTGTGAG--------------------------------------TGTGTGTGTGTGTGTG
A.a.: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN....................GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG................
C.e. :...................................T A. . . .AG--------------------------------------------------------------------------C.c. :...................................T A....AG..T..........T ----------------------------------------. . .C
R.t.: TGTGTGTGTGTGTGTGT AGGGAGAGAGAAAGMAGCTYAAGAMAGT AWACAATAATGTGTMTTGKTGAGATATATTAAACAAATACTACAAAGTGARRGCTGGTCCMMMNAGCTACCAC A. a . :.................GTGTGT ...A C.-....-T...-....T............A...-..................NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
C.e. :-----------------------. ..A T....-....-T...-....T...G A. . .T......................G AAA. . .C. . . AAAA.........
C.c. :-----------------------. ..A......................A...T.........G............G AAA. . .C. . .AAAA.........
R.t.: AGAGGACTGGTTAAACTG
A.a.:NNNNNNNNNNNNNNNNNN C.e . :.................. C.c. :..................
Рис. 6. Множественное сравнение последовательностей STR-локуса RT24 у карибу (Rangifer tarandus, R.t.) [GenBank U90746], лося (Alces alces, A.a.), оленя (Cervus elaphus, C.e.) и косули (Capreolus capreolus, C.c.). Точками (.) отмечены идентичные нуклеотиды, прочерками (-) - отсутствующие нуклеоти ды.
Тандемная область локуса RT24 у вида-источника - северного оленя - не только сохранилась у вида Лось, но и дополнилась обширным полиморфным участком с GA-повторами, что в сумме определяет полноценный полиморфизм данного локуса и у вида Лось. В то же время у видов Олень и Косуля в полиморфной зоне имеются обширные делеции, определяющие мономорфное существование данного локуса у видов Олень и Косуля.
- 10 036754
Источники информации.
Linacre, A. DNA typing in wildlife crime: recent developments in species identification / A. Linacre, S.S Tobe H Forensic Sci Med Pathol. - 2010. - Vol. 6. - P. 195-206.
DNA detective: a review of molecular approaches to wildlife forensics / E.A. Alacs [et al.] П Forensic Sci Med Pathol. - 2010. - Vol. 6. - P. 180-194.
A molecular genetic approach for forensic animal species identification / C. Bellis [et al.] П Forensic Science International 134. - 2003. - Vol. 99. - P. 108.
Baur, C. Identification of Heat Processed Meat by DNA Analysis / C. Baur, J. Teifelgreding, E. Liebhardt 11 Arch. Lebensmittelhyg. - 1987. - Vol. 38. - P. 172-174.
Species Identification by Oligonucleotide Hybridisation: The Influence of Processing on Meat Products / J.A. Buntjer [et al.] // J. Food Sci. Ag. - 1999. - Vol. 79. - P. 53-57.
Species Identification of Cooked Meats by DNA Hybridization Assay / К Chikuni [et al.] //Meat Sci. - 1990. - Vol. 27.-P. 119-128.
Hunt, D.J. Identification of the Species of Origin of Raw and Cooked Meat Products Us- ing Oligonucleotide Probes / D.J. Hunt, H.C. Parkes, I.D. Lumley II Food Chem. 1997. - Vol. 60. - P. 437-442.
A Quick and Simple Method for the Identification of Meat Species and Meat Products by PCR Assay / T. Matsunaga [et al.] П Meat Sci. - 1999. - Vol. 51. - P. 143-148.
Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis: A Simple Method for Species Identification in Food / R. Meyer [et al.] // J AO AC Int. 1995.-Vol. 78.-P. 1542-1551.
Wintero, A.K. A Comparison of DNA-Hybridization, Immunodiffusion, Countercurrent Immunoelectrophoresis and Isoelectric Focusing for Detecting the Admixture of Pork to Beef / A.K. Wintero, P.D. Thomsen, W. Davis И Meat Sci. - 1990. - Vol. 27. - P. 7585.
Ebbehoj, K.F. Differentiation of Closely Related Species by DNA Hybridisation / K.F. Ebbehaj, P.D. Thomsen П Meat Sci. - 1991. - Vol. 30. - P. 359-366.
Buntjer, J.B. Rapid Species Identification by Using Satellite DNA Probes / J.B. Buntjer, J.A. Lenstra, N.Z. Haagsma// Lebensm. Unters. Forsch. - 1995. - Vol. 201. - P. 577582.
Dynamics of Mitochondrial DNA Evolution in Animals: Amplification and Sequencing with Conserved Primers I T.D. Kocher [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. Vol. 86. - P. 6196-6200.
Species Identification Through DNA “Barcodes” / G. Ferri [et al.] // Genetic Testing and Molecular Biomarkers. - 2009. - Vol. 13, № 3. - P. 421-426.
Chow, S. Intra- and Interspecific Restriction Fragment Length Polymorphism in Mitochondrial Genes of Thunnus Tuna Species / S. Chow, S. Inogue H Bull. Nat. Inst. Far Seas Fish. - 1993. - Vol. 30. - P. 207-224.
- 11 036754
Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology / J.M. Butler П Elsevier Academic Press, San Diego. -2012.- 704 p.
Сайты: UCSC Genome Bioinformatics: https ://genome- euro.ucsc.edu/goldenPath/credits.html; NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10731; www.ncbi.nhn.nih.gov/genome/?term=capreolus
Polymerase Chain Reaction Assay for Detection of Sheep and Goat Meats / K. Chikuni [et al.] II Meat Sci. - 1994. - Vol. 37. - P. 337-345.
Reisner, A.H. Apparent Relatedness of the Main Component of Ovine 1.714-Satellite DNA to Bovine 1.715-Satellite DNA/ A.H. Reisner, C.A. Bucholtz// EMBO J.1983.-Vol. 12.-P. 1145-1149.
Wolf, C. PCR-RFLP Analysis of Mitochondrial DNA: A Reliable Method for Species Identification/ C. Wolf, J. Rentsch, P. Hubner// J. Agric. Food Chem.- 1999.Vol. 47.-P. 1350-1355.
Evaluation of a DNA Fingerprinting Method for Determining the Species of Origin of Meats / L. Partis [et al.] П Meat Sci. - 2000. - Vol. 54. - P. 369-376.
Galan, M. Distinguishing red and roe deer using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method / M. Galan [et al.] И Wildlife Society Bulletin. - 2005. - Vol. 33, № 1. - P. 204-211.
Caskey C.T., Edwards A.O. / DNA typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic shot tandem repeats И Патент US005364759A, Nov. 15, 1994;
StockMarks® for Horse, Cattle and Dog Genotyping Kits User Protocol ( https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4346135)
J.M. Butler, V.A. David, S. J. O’Brien, M. Menotti-Raymond / The MeowPlex: A New DNA Test Using Tetranucleotide STR Markers for the Domestic Cat П Profiles in DNA - 2002 - Vol. 5(2) - P. 7-10 (worldwide.promega.com).
http://www.biotype.de/fileadmin/user/MANUALS/Animaltype_Pig_eng.pdtMeredith E.P., Rodzen J.A. , Levine K.F. , Bank J.D. / Characterization of an additional 14 microsatellite loci in California Elk (Cervus elaphus) for use in forensic and population applications I I Conservation Genetics - 2005 - Vol. 6 - P. 151-153;
Kenneth C.J., Kenneth F.L.Banks J.D. / Characterization of 11 polymorphic tetranucleotide microsatellites for forensic applications in California Elk (Cervus elaphus canadensis) I I Molecular Ecology Notes - 2002 - Vol. 2 - P. 425-427.
Lorenzini, R./ The rediscovery of the Italian roe deer: genetic differentiation and management implications //Itai. J. Zool. - 2002. - Vol. 69. - P. 367-379.;
Fickel J. and Reinsch A. I Microsatellite markers for the European Roe deer (Capreolus capreolus) П Molecular Ecology - 2000 - Vol 9 P. 993-1011.
Rohrer, G.A., L.J. Alexander, J.W. Keele, T.P. Smith and C.W. Beattie. IA microsatellite linkage map of the porcine genome // Genetics - 1994 - Vol. 136 - P. 231-45.
Comparison of genetic diversity at microsatellite loci in near-extinct and nonendangered species of Mexican goodeine fishes and prediction of cross-amplification within the family I R.M. Hamill [et al.] 11 Journal of Fish Biology. - 2007. - Vol. 70. P. 16-32.
Koskinen, M.T. Cross-species amplification of salmonid microsatellites, which reveal polymorphism in European and Arctic grayling, Salmonidae: Thymallus spp. I M.T. Koskinen, C.R. Primmer//Hereditas. - 1999.-Vol. 131.-P. 171-176.
Sun, H.S. Exploiting dinucleotide microsatellites conserved among mammalian species / H.S. Sun, B.W. Kirkpatrick И Mammalian Genome. - 1996. - Vol. 7. - P. 128-132.
Erler, A. Development of Y-chromosomal microsatellite markers for nonhuman primates / A. Erler, M. Stoneking, M. Kayser II Molecular Ecology. - 2004. - Vol. 13.P. 2921-2930.
Paetkau, D. The molecular-basis and evolutionary history of a microsatellite null allele in bears / D. Paetkau, C. Strobeck H Molecular Ecology. - 1995. - Vol. 4. - P. 519-520.
Claims (2)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Тест-система для ДНК-идентификации биологических образцов диких животных семейства Оленевые (Лось, Alces alces; Олень, Cervus elaphus; Косуля, Capreolus capreolus; Лань, Dama dama) и дифференциации представителей семейства Оленевые от диких (Кабан, Sus scrofa; Зубр, Bos bonasus) и домашних представителей отряда Парнокопытные (Бык, Bos taurus; Овца, Ovis aries; Коза, Copra hircus; Свинья домашняя, Sus scrofa domestica), состоящая из следующих компонентов: буферный раствор для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), раствор 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), раствор Taq-полимеразы, мультиплексный набор праймеров генетически родственных видов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-20; из них 7 пар в наборе 1, специфичных для амплификации локусов оленя T108 и T501 (комплекты праймеров № 3 и 4 табл. 1 соответственно), быка BM1824 и CSSM036 (комплекты праймеров № 1 и 2 табл. 1 соответственно), северного оленя RT9 и RT24 (комплекты праймеров №5 и 6 табл. 1 соответственно) и дополнительного локуса человека DYS392 (комплект праймеров № 10 табл. 1) в качестве контроля на ингибирование ПЦР, и 6 пар в наборе 2, специфичных для амплификации локусов оленя T108, быка BM1824 и BL4 (комплект праймеров № 7 табл. 1), северного оленя RT9, овцы McM505 (комплект праймеров № 8 табл. 1) и локуса свиньи SO766 (комплект праймеров № 9 табл. 1), при этом каждый комплект праймеров указанной мультиплексной системы представляет собой пару синтетических олигонуклеотидов, причем в химическую структуру одного из них введен флуоресцентно меченый нуклеотид, а праймеры находятся в следующей концентрации:для синтетических олигонуклеотидов: SEQ ID NO: 1-2 - 0,013-0,055; SEQ ID NO: 3-4 - 0,013-0,080; SEQ ID NO: 5-6 - 0,015-0,045; SEQ ID NO: 7-8 - 0,015-0,090; SEQ ID NO: 9-10 - 0,03-0,15; SEQ ID NO: 11-12 - 0,025-0,150; SEQ ID NO: 13-14 - 0,05-0,20; SEQ ID NO: 15-16 - 0,03-0,10; SEQ ID NO: 17-18 0,2-0,3; SEQ ID NO: 19-20 - 0,01-0,10 (мкМ); причем буферный раствор имеет следующий состав: 10 мМ Трис pH 8,6, 50 мМ KCl,1,7-2,5 мМ MgCl2;раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов имеет следующую концентрацию: 200 мкМ (по 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата: dATP, dCTP, dGTP, dTTP);а фермент Taq-полимераза находится в количестве 0,75-1 ед. (в объеме реакционной смеси 15 мкл).
- 2. Способ видовой ДНК-идентификации биологических образцов диких животных семейства Оленевые (Лось, Alces alces; Олень, Cervus elaphus; Косуля, Capreolus capreolus; Лань, Dama dama) и дифференциации представителей семейства Оленевые от диких (Кабан, Sus scrofa; Зубр, Bos bonasus) и домашних (Бык, Bos Taurus; Овца, Ovis aries; Коза, Copra hircus; Свинья домашняя, Sus s. domestica) представителей отряда Парнокопытные, отличающийся тем, что ДНК определяемых видов генотипируют с использованием мультиплексного набора праймеров по п.1, специфичных к ДНК остальных генетически родственных видов семейства Оленевые и Полорогие, что позволяет проводить видовую ДНКидентификацию биологических образцов диких животных семейства Оленевые и дифференциацию их от домашних животных отряда Парнокопытные на основе совокупности качественных (невыявление амплифицированного(ых) фрагмента(ов), мономорфное или полиморфное выявление амплифицированного(ых) фрагмента(ов)) и количественных (молекулярные размеры фрагмента(ов)) различий продуктов ПЦР.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201600045A EA036754B1 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201600045A EA036754B1 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201600045A1 EA201600045A1 (ru) | 2017-06-30 |
| EA036754B1 true EA036754B1 (ru) | 2020-12-16 |
Family
ID=59206014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201600045A EA036754B1 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA036754B1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927660B (zh) * | 2022-09-23 | 2024-07-02 | 北京麋鹿生态实验中心 | 一种鉴定麋鹿的检测标志物、引物组、试剂盒及方法 |
| CN118168662B (zh) * | 2024-05-13 | 2024-08-13 | 中国刑事警察学院 | 一种野生动物保护区的踪迹监控方法及系统 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012155084A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Netbio, Inc. | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci |
| EP2889381A1 (en) * | 2013-12-27 | 2015-07-01 | Universite De Liege | Detection method for species specific identification of nucleic acid of interest |
-
2015
- 2015-12-07 EA EA201600045A patent/EA036754B1/ru unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012155084A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Netbio, Inc. | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci |
| EP2889381A1 (en) * | 2013-12-27 | 2015-07-01 | Universite De Liege | Detection method for species specific identification of nucleic acid of interest |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KIM Eung Soo et al. Multiplex polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence-based capillary electrophoresis for identification of deer species from antlers. African Journal of Biotechnology, 2012, 11(13), p. 3179-3186, реферат, с. 3180-3181, 3184-3185 * |
| ЕПИШКО О.А. и др. Метод оценки достоверности происхождения крупного рогатого скота по полиморфизму нуклеотидных последовательностей ДНК// Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной образованию кафедр кормления сельскохозяйственных животных; физиологии, биотехнологии и ветеринарии и 15-летию кафедры ихтиологии и рыбоводства УО "БГСХА". - Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2011, с. 42-49 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201600045A1 (ru) | 2017-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2239896C (en) | Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of hla types | |
| Partis et al. | Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the species origin of meats | |
| KR101823368B1 (ko) | 돈육내 다가 불포화지방산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도 | |
| Girish et al. | A rapid method for authentication of Buffalo (Bubalus bubalis) meat by Alkaline Lysis method of DNA extraction and species specific polymerase chain reaction | |
| JP4481491B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
| Rodríguez-Ramírez et al. | Authentication and traceability of foods from animal origin by polymerase chain reaction-based capillary electrophoresis | |
| US7872116B2 (en) | Identification of cell culture contaminants among Mollicutes species by a PCR based assay | |
| KR101777161B1 (ko) | 개의 고관절이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 멀티플렉스 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법 | |
| Bottero et al. | Differentiation of five tuna species by a multiplex primer-extension assay | |
| Osek et al. | Listeria monocytogenes in foods—From culture identification to whole‐genome characteristics | |
| US6846633B1 (en) | Nucleotide sequences for detection of Bacillus anthracis | |
| Fajardo et al. | Analysis of mitochondrial DNA for authentication of meats from chamois (Rupicapra rupicapra), pyrenean ibex (Capra pyrenaica), and mouflon (Ovis ammon) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism | |
| EA036754B1 (ru) | Способ и тест-система для видовой идентификации оленевых и их дифференциации от других парнокопытных | |
| KR101312480B1 (ko) | 돼지의 갈비뼈 수 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 | |
| Losi et al. | An alternative method to isoenzyme profile for cell line identification and interspecies cross-contaminations: cytochrome b PCR-RLFP analysis | |
| US6284466B1 (en) | Method of detecting genetic polymorphisms using over represented sequences | |
| Gupta et al. | Single-nucleotide primer extension assay of mtDNA to authenticate cattle and buffalo meat | |
| EP1660675B1 (en) | Polymorphism of the igf2 gene and improving production characteristics of cattle | |
| US20070009910A1 (en) | Primers, probes and reference plasmid for detection of meat adulteration | |
| RU2809553C1 (ru) | Способ определения аллелей гена fgfr3 методом пцр в «реальном времени» | |
| KR102083675B1 (ko) | 단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법 | |
| CN110527709B (zh) | 一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法 | |
| KR101557407B1 (ko) | 한우의 개체식별방법 및 키트 | |
| KR101823376B1 (ko) | 돈육내 스테아릭산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도 | |
| AU2004201351B2 (en) | CRH and POMC effects on animal growth |