CN110527709B - 一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法 - Google Patents
一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法，属于生物检测领域。所述检测方法包括：利用引物组通过多重PCR扩增嵌合体的基因组DNA的检测位点，获得多重PCR扩增产物；对所述多重PCR扩增产物进行高通量测序，获得测序片段；根据所述测序片段获得所述检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型；利用所述真实多核苷酸多态性的等位基因型判定所述嵌合体是否被污染；若所述嵌合体未被污染，则计算所述嵌合体的嵌合率。当嵌合体样本中存在任何情况的污染类型时，嵌合体的多核苷酸多态性的等位基因型的数目可能超过没有污染的最大值，即4个，从而判定其存在污染，实现污染的全面质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及嵌合体的检测方法。
背景技术
在研究动物和人的骨髓移植实验中，嵌合体的嵌合率是指示供者骨髓是否发挥功能的重要参考指标。近年来，嵌合体的嵌合率的检测方法包括红细胞抗原法、染色体核型法、人类白细胞抗原分型法和短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)法。其中，STR法用得最广泛，但由于STR法在PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增过程中，存在滑脱等现象，这会导致检测的灵敏度很低。
现有一种检测嵌合体的方法，该方法采用引物组对供体、受体和嵌合体的基因组DNA进行多重PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物通过高通量测序进行检测，并分型获得多个(25～96个)SNP位点，再分别计算每个SNP位点的嵌合率，取所有的SNP位点的嵌合率的平均值作为待测样本(嵌合体)的嵌合率。上述引物组包括标签引物，在测序结果中通过标签可识别待测样本的交叉污染情况，以提高检测的灵敏度。
现有的该检测嵌合体的方法在检测时，需要在同一批次中的相邻待测样本间采用带有不同标签引物的引物组进行多重PCR扩增，用于避免相邻的待测样本间在PCR反应试剂配制过程中以及PCR扩增过程中发生交叉污染的情况。除此之外，影响检测结果的污染还包括非相邻的待测样本间的污染、PCR反应试剂配制前的污染以及空气中的气溶胶污染，这是上述检测方法不能避免的，由此会导致检测结果不准确。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法。所述技术方案如下：
本发明实施例提供了一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法，所述检测方法包括：
利用引物组通过多重PCR扩增嵌合体的基因组DNA的检测位点，获得多重PCR扩增产物，所述引物组包括正向引物和反向引物；
对所述多重PCR扩增产物进行高通量测序，获得测序片段；
根据所述测序片段获得所述检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型，所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的判定方法为：
将所述测序片段比对到参考基因组上，获得潜在多核苷酸多态性的等位基因型，所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为所述测序片段上与所述参考基因组不同的碱基序列的组合，
计算
其中，ni为判定第i个所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的判定阈值，k为判定系数，且k≥1，Nj为在所述测序片段中，观察到的支持第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目，e为检测错误率，mij为第i种和第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型间不同的碱基数目，
当观察到的支持第i种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型的所述测序片段的数目Ni≥ni时，判定第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的，并将所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型作为所述真实多核苷酸多态性的等位基因型；
利用所述真实多核苷酸多态性的等位基因型判定所述嵌合体是否被污染；
若所述嵌合体未被污染，则计算所述嵌合体的嵌合率。
具体地，所述检测位点包括多个单核苷酸多态性的碱基位点。
具体地，所述引物组的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:200所示。
具体地，所述检测位点如下所示：
*起点与*终点指在版本号为hg19的人的参考基因组上的碱基位置。
具体地，所述真实多核苷酸多态性的等位基因型和所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型均为多个单核苷酸多态性的等位基因型的组合。
具体地，其特征在于，k＝10。
具体地，所述判定嵌合体是否被污染的方法为：
统计所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量大于4个的所述检测位点的数量，并记为M；
当M≥1时，则判定所述嵌合体被污染；
当M＝0时，则判定所述嵌合体未被污染。
进一步地，所述计算所述嵌合体的嵌合率的方法为：
当判定所述嵌合体未被污染时，将所述嵌合体中，支持第i个检出的所述检测位点中的所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的所述测序片段的数目由大到小排列，排名前三位的所述测序片段的数目分别记作Ni1、Ni2和Ni3，若第i个所述检测位点中仅有1个所述真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni2＝Ni3＝0，若第i个所述检测位点中仅有2个所述真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni3＝0；
按如下方法计算第i个所述检测位点的受体等位基因型的所述支持测序片段的比例ri：
当
时，则
其中，Ni为第i个所述检测位点的测序片段的数目总和；
当
时，则
记为所有不为0的ri的值的中位值为r；
将r值代入线性回归方程，获得所述嵌合体的嵌合率R。
再进一步地，获得所述线性回归方程的方法为：
取嵌合率已知的嵌合体的样本，作为训练样本，所述训练样本的嵌合率为R’；
计算所述训练样本的r值；
以r值为自变量，R’值为因变量，计算并获得所述线性回归方程。
更进一步地，所述线性回归方程为R＝2.338r-0.0167。
本发明实施例提供了一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法，当嵌合体样本中存在任何情况的污染类型时，嵌合体的多核苷酸多态性的等位基因型的数目可能超过没有污染的最大值，即4个，从而判定其存在污染，实现污染的全面质量控制。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生物学技术人员所熟知的操作。本发明实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可以在市场上购买到。
实施例
本发明实施例提供了一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法。该检测方法具体如下：
将三个遗传背景不相同的细胞系A、细胞系B和细胞系C的细胞分别计数后，按一定比例进行混合，作为嵌合体样本1～13。在嵌合体样本1～8和嵌合体样本11～13中包括细胞系A和细胞系B，且将细胞系A与细胞系B分别作为受体与供体，将细胞系A在嵌合体样本中的细胞比例作为嵌合率的参考值。嵌合体样本9仅有细胞系A，将嵌合体样本9作为纯供体的对照样本。在嵌合体样本10中，包括细胞系A、细胞系B和细胞系C，细胞系A、细胞系B和细胞系C的细胞比例为50:40:10，将嵌合体样本10作为受污染的嵌合体样本(污染样本为细胞系C)。本发明实施例中的嵌合体样本及其嵌合率的参考值见表一，具体如下。
表一为嵌合体及其嵌合率的参考值与实测值
在表一中，本发明实施例提供的嵌合体1～13的嵌合率的实测值(R)的检测方法，具体步骤如下：
提取嵌合体样本的基因组DNA。
利用引物组通过多重PCR扩增嵌合体样本的基因组DNA的检测位点，获得多重PCR扩增产物。
对多重PCR扩增产物进行高通量测序，获得测序片段。其中，检测位点包括多个单核苷酸多态性(SNP)的碱基位点。检测位点及对应的引物组如表二所示：
表二为检测位点及对应的引物组
在表二中，起点*与终点*指在版本号为hg19的人的参考基因组上的碱基位置。
本发明实施例的一个检测位点中可能包含多个SNP，而不是一个SNP。因此，区分嵌合体样本中供体与受体的能力大大地提升了。假定SNP中的两种等位基因型在人群中的频率均为50％，那么，受体等位基因型与供体等位基因型不相同的概率为50％，即该SNP只有50％的概率可以区分供体与受体，从而可以用于嵌合体样本的区分。在本实施例中，位点1中包含有3个SNP碱基，那么，这3个SNP碱基只要有一个在供体与受体间不同，即可将嵌合体中的供体与受体区分开来，也就是说可以用于嵌合体样本的检测，且可用于嵌合体样本检测的概率为1-(50％×50％)3＝98.44％，因此，本发明中，更多的检测位点对嵌合体样本检测来说是可用的有效检测位点。
在本实施例中，按Qiagen公司提供的人类组织和细胞DNA提取试剂盒(货号为51304)提取并纯化嵌合体样本1～13的基因组DNA，其操作步骤参见该试剂盒的说明书进行。在美国热电公司合成并混合表二中位点1到位点100中所有的引物作为引物组。按美国热电公司生产的扩增子建试剂盒(货号为4475345)扩增嵌合体样本1～13的基因组DNA，其操作步骤参见该试剂盒的说明书进行，获得多重PCR扩增产物，利用该试剂盒和多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，其操作步骤参见该试剂盒的说明书进行。利用美国热电公司生产的S5高通量测序仪对构建的高通量测序文库进行高通量测序，其操作步骤参见该试剂盒的说明书进行，高通量测序的深度设置每个嵌合体样本为2百万条测序片段，高通量测序的长度为300bp。每个嵌合体样本获得的测序片段的数量见表一。
根据测序片段获得检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型。具体地，真实多核苷酸多态性的等位基因型为多个单核苷酸多态性(SNP)等位基因型的组合。真实多核苷酸多态性的等位基因型的判定方法为：将测序片段比对到参考基因组上，获得潜在多核苷酸多态性的等位基因型，潜在多核苷酸多态性的等位基因型为测序片段上与参考基因组不同的碱基序列的组合。
计算
其中，ni为判定第i个潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的判定阈值，k为判定系数，且k≥1，Nj为在测序片段中，观察到的支持第j种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目，e为检测错误率，mij为第i种和第j种潜在多核苷酸多态性的等位基因型间不同的碱基数目。
当观察到的支持第i种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目Ni≥ni时，判定第j种潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的，并将潜在多核苷酸多态性的等位基因型作为真实多核苷酸多态性的等位基因型。
将获得的嵌合体样本1的测序片段利用Bowtie 2软件(版本号：2.1.0)比对到人的参考基因组(版本号为hg19)的第1个检测位点上，共有19752个测序片段获得了成功的比对。测序片段上与参考基因组不同的碱基序列的组合共有5622种，即存在5622种潜在多核苷酸多态性的等位基因型。第2种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的支持测序片段的数目N2＝1，与第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型间不同的碱基的数目为m12＝2，本实施例采用热电公司的S5测序仪进行检测，统计综合错误率e＝1％，因此，将上述数据代入
也就是说，只有0.0001个第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段可能由第2种潜在多核苷酸多态性的等位基因型通过误差变来。按相同的方法，计算其它5600种潜在多核苷酸多态性的等位基因型变为第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目，并取数目之和为
条，即因为误差形成的第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目平均为1.01条。为了保证判定潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的，取k＝10，即
条。观察到的支持第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目N1＝18001≥n1＝10.1条，即观察到的支持第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目大于由误差导致的测序片段的数目的10倍，因此，不可能是完全由误差导致，因此判定第1种潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的，从而将该潜在多核苷酸多态性的等位基因型作为真实多核苷酸多态性的等位基因型。按以上方法计算其它5599个潜在多核苷酸多态性的等位基因型的ni的值，他们均大于Ni的值，表明在误差引起的范围内，因此，均判定为非真实的等位基因型。因此，在本实施例中，第1个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型仅1个，其支持的测序片段数目N1＝18001。
依次按第1个检测位点的方法，判定并获得嵌合体样本1的所有检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型。例如，第3个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型有2个，其支持的测序片段数目分别N1＝5021，N2＝4556；第9个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型有3个，其支持的测序片段数目分别N1＝1360，N2＝1034，N3＝201；第13个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型有2个，其支持的测序片段数目分别N1＝1224，N2＝166。
按嵌合体样本1的方法，依次判定并获得其余12个嵌合体样本的每个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型及其支持的测序片段的数目。
利用真实多核苷酸多态性的等位基因型判定嵌合体是否被污染。具体方法包括：统计真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量大于4个的检测位点的数量，并记为M；当M≥1时，则判定嵌合体样本被污染；当M＝0时，则判定嵌合体样本未被污染。
根据上述测序片段的数目的检测结果，在嵌合体样本1中的第1个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量为1，依次统计嵌合体样本1中每个检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量，统计其中大于4个真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量M＝0，从而判定嵌合体样本1未被污染。
按嵌合体样本1的方法，依次判定其余12个嵌合体样本受污染的情况，发现仅嵌合体样本11的M＝5>0，因此，嵌合体样本11被判定污染，其余嵌合体样本的M值均为0，判定没有被污染，这与真实情况一致，这个表明本实施例判定嵌合体样本是否被污染的方法是准确的。
若嵌合体样本未被污染，则计算嵌合体样本的嵌合率。计算嵌合体样本的嵌合率的方法为：当判定嵌合体样本未被污染时，将嵌合体样本中支持第i个检出的检测位点中的真实多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目由大到小排列，排名前三位的测序片段的数目分别记作Ni1、Ni2和Ni3，若第i个检测位点中仅有1个真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni2＝Ni3＝0，若第i个检测位点中仅有2个真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni3＝0；
按如下方法计算第i个检测位点的受体等位基因型的支持测序片段的比例ri：
当
时，则
其中，Ni为第i个检测位点的测序片段的数目总和；
当
时，则
记为所有不为0的ri的值的中位值为r；
将r值代入线性回归方程，获得所述嵌合体的嵌合率R。
获得线性回归方程的方法为：取嵌合率已知的嵌合体的样本，作为训练样本，训练样本的嵌合率为R’；计算训练样本的r值；以r值为自变量，R’值为因变量，计算并获得线性回归方程。
根据上述结果，除嵌合体样本11被污染外，其余的嵌合体样本均未被污染，可以用于嵌合率的计算。将嵌合体样本1中，支持第1个检测位点中的真实多核苷酸多态性的等位基因型仅1个，因此，测序片段的数目由大到小排列，排名前三位的测序片段的数目分别为18001、0和0。按第1个检测位点的方法，将嵌合体样本1中所有其它检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型的支持测序片段的数目按由大到小排列，例如，第3个检测位点的排列结果为：5021、4556和0；第9个检测位点的排列结果为：1360、1034和201；第13个检测位点的排列结果为：1224、166和0。对于第1个检测位点，
因此，
(其中，19233为第1个嵌合体样本在第1个检测位点的所有测序片段的数量)。按第1个检测位点的方法，依次计算其它检出的检测位点的ri的值，并获得所有检出的检测位点的ri的值的中值r＝0.23。按嵌合体样本1的方法，依次计算其余未被污染的嵌合体样本的r的值。其中，嵌合体样本11、嵌合体样本12和嵌合体样本13的r的值分别为0.070、0.023和0.009。
将嵌合体样本1到嵌合体样本9作为训练样本，训练样本的嵌合率参考值为R，上述计算获得的训练样本的嵌合体的r的值作为因变量，R的值作为自变量，拟合获得线性回归方程为R＝2.338r-0.0167
将嵌合体样本11、嵌合体样本12和嵌合体样本13的r的值代入上述方程，获得它们的实测值分别为14.69％、3.71％和1.14％，该值与嵌合率参考值15％、3％和0.5％较为接近，表明本实施例获得的嵌合率实测值较为精准。
本发明实施例提供了一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法，当嵌合体样本中存在任何情况的污染类型时，嵌合体的多核苷酸多态性的等位基因型的数目可能超过没有污染的最大值，即4个，从而判定其存在污染，实现污染的全面质量控制。此外，本发明实施例只检测嵌合体，不检测供体与受体，使得检测方法更加简单，成本更低。同时，本发明实施例不需要识别嵌合体的序列标签，可大幅度降低引物数量与引物成本。本发明中，每个检测位点检测n个SNP位点(即MNP，多核苷酸多态性的等位基因型)，因此，等位基因型数量至多为2n个，单个检测位点区分嵌合体中供体与受体的能力，呈指数级上升。本发明中，嵌合体中供体或受体的多核苷酸多态性的等位基因型出错的概率降至em，可见，错误率呈指数级下降。在本发明中，若供体与受体的多核苷酸多态性的等位基因型分别为AAA和CCC，那么，由CCC因为误差变成AAA的概率为e＝(1％)3＝0.0001％，远小于0.5％的嵌合率，因此，可以检出0.5％的嵌合率(0.5％的AAAA和99.5％的CCCC构成的嵌合体)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉拜肯生物科技有限公司；彭海
<120> 一种仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法
<160> 200
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtgaaaaga agtagagaat ccacca 26
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcagtcata atacatgcca tgtagaatg 29
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctttggca ttacagtaca gact 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggcatgct gaatcccagt aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gattggaagg aggcatacca gt 22
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcagaaaaat aactagaaat gaaggaaagt gga 33
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgtgcccat ctcttaccaa g 21
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<211> 22
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ccagcacagt ctctacctag tcc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agattagact agatgtagag tggatattga c 31
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagagggttg gcaagccata aa 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccaccctca agaacaggat tt 22
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtgtctggtg aaggttcact ttctaa 26
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 33
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcaaaaagtt ctattggaca gtgctgat 28
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ttgggaagca gaggtttaat tgagt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgggaagca gaggtttaat tgagt 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tctataggtt tgaagcctag gctgta 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tctataggtt tgaagcctag gctgta 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccttcctct ctttgttttt atccttctg 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtgactga atgtcctttt tctgt 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcagaagaa ttacttcaac atgggat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tttttattat ggttagctgt cacatacaac ttt 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
cctggccaca ctctttcaat gt 22
<210> 114
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
agatgattat ttgagcagtt agtggaaatg a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
attctaagtg ttaatgggca gcatct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gggcattcta aaattaccag caga 24
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gggcattcta aaattaccag caga 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gcaaatctga taaaggatgt tggtgg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
cagtgttgtc aggagttctt ggt 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tttaccacgc tgtggctatg taa 23
<210> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ttccttgttt ttggcattta gaagaagtc 29
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
cattaacctg agccttaatg ttaggaaaga 30
<210> 123
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
tgtctagtga caagttcaat gacaagtac 29
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
ggacttagca tgcttcttaa ggcat 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gccctactag cccttactca ca 22
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
aaagagttcc ttgagtatag gaacgaaac 29
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ttggagctca tagtggacca gta 23
<210> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
cagtactgct ggtctcagtt attcc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
gctccataga gctccaggat tc 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
agaacttgtg tgaaagaatt ttgacaagg 29
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
cacgagaacc cagtggaaat gt 22
<210> 133
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gaaatattgt gctacctttc taaatcggc 29
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
aatcttgcct gcatcagatt tgc 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
cagcaggagg tcatttgtgg ta 22
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
agagttactg caagggattc atgg 24
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gatcatcatc atgtagtcaa cacatagaca 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
gactgtgatg acgtccatta tctatgt 27
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gactgtgatg acgtccatta tctatgt 27
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
ggctggatgg ataggcttct atttg 25
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gcaccaggct ttaagggaca 20
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
tgctctgatt aggagacaac acattatttt 30
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
caaaatgccc taatcattgc agga 24
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
ctctggtctc taacacctca caga 24
<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ggattcagag agcttcctgg ga 22
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
cacaggtcaa gggctcaatg t 21
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
tgacatatct aacaggagtt tggaaagc 28
<210> 148
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
gcagtgtctg agctacattt ctcataag 28
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gtgatgttac atagccacag gga 23
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
gtagctcctt gttcccttct cttt 24
<210> 151
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
tgacgctttg aaaagaagga aattctg 27
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tggatatttt agatcccaca cgtaaatgag 30
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ccttatgtac agccatgcat ggt 23
<210> 154
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
tatgatggaa gtcagatata ccatgcaga 29
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
acagttccgc aggaaactta caa 23
<210> 156
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
tctcagagat ctgatggttt ttaaagtgg 29
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
gacccaaagg caaagtgcta aac 23
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
gctgttgttt tgcaggtgaa aaga 24
<210> 159
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
agtgtttgtg gaacatctca gtttga 26
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
cctgtccatc tctccagagg t 21
<210> 161
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tgcactaagt atagtatctg ccaagtact 29
<210> 162
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ccttctctaa aattgctccc tcatct 26
<210> 163
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
tggataaagc accatgtatc ttcagg 26
<210> 164
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
cctttaatcc aaagcaaata gattccca 28
<210> 165
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cctttaatcc aaagcaaata gattccca 28
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
aggcctcaga aatctggaaa acc 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
aggcctcaga aatctggaaa acc 23
<210> 168
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
tacacagaat gactaaggaa accaatgac 29
<210> 169
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
gtgcacactt acctggtgat ct 22
<210> 170
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
agtcatgaca accaaaactg tctttaga 28
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
ggagccttag ttccagctca tat 23
<210> 172
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
gacaatctcc aaaggaaaaa cctagagat 29
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
cttgcgtgtg gctctttcaa g 21
<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
caaatcacat actttactca caagcaagtc 30
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
gcagttatgg cacaggactg tt 22
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
tgcaagatac atagatgggc taaagtattg 30
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
ggtgggttaa gcatttcctt agc 23
<210> 178
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
cagtctagga cacaactgca gt 22
<210> 179
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
tctaaggtct aacatctaac ttctacctgt c 31
<210> 180
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
ctgttcatta gaccatcaga catgagac 28
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
tctgcttctc acatcctcag gaa 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
tctgcttctc acatcctcag gaa 23
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
ccaccctcac taatgatggg a 21
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
gcgtggagaa gataaagccc t 21
<210> 185
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
ggttaaataa agacagtgtt ggtctccaa 29
<210> 186
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
ggttaaataa agacagtgtt ggtctccaa 29
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
taagtcccaa agtgttcatc aaagtgt 27
<210> 188
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
gaacaatctt ggtgactaga cttcatgaa 29
<210> 189
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
caatagcata aagacactcc cacct 25
<210> 190
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
gggtgggtta tttagaattt tctggaaaag 30
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
agcactgacc ctgtagagat gt 22
<210> 192
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
tatgtcagac tgaaagatac acctctgaa 29
<210> 193
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
tgagggctgt catctgactt ga 22
<210> 194
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
caacccactt gagagtgact atctg 25
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
acagaagtga tgaggtgtcc tttc 24
<210> 196
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
gcaaagggat agagaataca atggagag 28
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
agaggtcttg catttgctaa taaatcct 28
<210> 198
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
gaagggactt ttaaactgac caagtaaga 29
<210> 199
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
ggctgtcagt atgacatctg ca 22
<210> 200
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
gtgaaggcct caatggacaa ag 22
Claims (7)
1.一种非诊断目的的仅基于嵌合体的嵌合率的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
利用引物组通过多重PCR扩增嵌合体的基因组DNA的检测位点，所述检测位点包括多个单核苷酸多态性的碱基位点，获得多重PCR扩增产物，所述引物组包括正向引物和反向引物；
对所述多重PCR扩增产物进行高通量测序，获得测序片段；
根据所述测序片段获得所述检测位点的真实多核苷酸多态性的等位基因型，所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的判定方法为：
将所述测序片段比对到参考基因组上，获得潜在多核苷酸多态性的等位基因型，所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为所述测序片段上与所述参考基因组不同的碱基序列的组合，所述真实多核苷酸多态性的等位基因型和所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型均为多个单核苷酸多态性的等位基因型的组合；
计算
其中，ni为判定第i个所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的判定阈值，k为判定系数，且k≥1，Nj为在所述测序片段中，观察到的支持第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型的测序片段的数目，e为检测错误率，mij为第i种和第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型间不同的碱基数目，
当观察到的支持第i种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型的所述测序片段的数目Ni≥ni时，判定第j种所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型为真实的，并将所述潜在多核苷酸多态性的等位基因型作为所述真实多核苷酸多态性的等位基因型；
利用所述真实多核苷酸多态性的等位基因型判定所述嵌合体是否被污染；
若所述嵌合体未被污染，则计算所述嵌合体的嵌合率，计算所述嵌合体的嵌合率的方法为：
当判定所述嵌合体未被污染时，将所述嵌合体中，支持第i个检出的所述检测位点中的所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的所述测序片段的数目由大到小排列，排名前三位的所述测序片段的数目分别记作Ni1、Ni2和Ni3，若第i个所述检测位点中仅有1个所述真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni2＝Ni3＝0，若第i个所述检测位点中仅有2个所述真实多核苷酸多态性的等位基因型，则规定Ni3＝0；
按如下方法计算第i个所述检测位点的受体等位基因型的支持测序片段的比例ri：
当
时，则
其中，Ni为第i个所述检测位点的测序片段的数目总和；
当
时，则
记所有不为0的ri的值的中位值为r；
将r值代入线性回归方程，获得所述嵌合体的嵌合率R。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物组的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:200所示。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测位点如下所示：
*起点与*终点指在版本号为hg19的人的参考基因组上的碱基位置。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，k＝10。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，判定嵌合体是否被污染的方法为：
统计所述真实多核苷酸多态性的等位基因型的数量大于4个的所述检测位点的数量，并记为M；
当M≥1时，则判定所述嵌合体被污染；
当M＝0时，则判定所述嵌合体未被污染。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，获得所述线性回归方程的方法为：
取嵌合率已知的嵌合体的样本，作为训练样本，所述训练样本的嵌合率为R’；
计算所述训练样本的r值；
以r值为自变量，R’值为因变量，计算并获得所述线性回归方程。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述线性回归方程为R＝2.338r-0.0167。
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|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109554443A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-02 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | 一种基于高通量测序技术检测dmd基因变异的引物及其应用 |
| CN109666745A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-04-23 | 领星生物科技（上海）有限公司 | 染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
| US20160194694A1 (en) * | 2011-04-28 | 2016-07-07 | Life Technologies Corporation | Multiplex transcriptome analysis |
-
2019
- 2019-07-19 CN CN201910654646.4A patent/CN110527709B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109554443A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-02 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | 一种基于高通量测序技术检测dmd基因变异的引物及其应用 |
| CN109666745A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-04-23 | 领星生物科技（上海）有限公司 | 染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Single-cell mutational profiling and clonal phylogeny in cancer";Nicola E. Potter et al.;《Genome Research》;20131231;第2115-2125页 * |
| "造血干细胞移植后嵌合状态的检测及定量研究进展";石慧文;《国外医学输血及血液学分册》;20041231;第27卷(第5期);第395-398页 * |
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