JP2001505045A

JP2001505045A - 質量決定による核酸検出方法

Info

Publication number: JP2001505045A
Application number: JP51039998A
Authority: JP
Inventors: ベルグマン，フランク; ヘルマン，ルペルト; コボルト，ウーヴェ
Original assignee: ダコエー／エス
Priority date: 1996-08-20
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 2001-04-17
Also published as: DE59710900D1; CA2263847A1; US6235476B1; EP0925373B1; AU4119497A; DK0925373T3; AU732167B2; EP0925373A1; ATE252647T1; WO1998007885A1; DE19633436A1

Abstract

(57)【要約】核酸を検出する方法において、プローブＰを核酸に含まれる部分配列Ｓに結合させ、結合産物Ｂ１を生成させ、該核酸を所定の長さの部分核酸Ｆを生じさせることにより結合産物Ｂ２に分解して、結合産物Ｂ２もしくは部分核酸Ｆをその質量に基づいて検出する。この方法は特に異なる配列を有する核酸を同時に検出するのに適する。

Description

【発明の詳細な説明】質量決定による核酸検出方法本発明は、質量に基づく核酸を検出する方法および本方法を行なうのに適する試薬に関する。微生物の存在または生物の遺伝子状態のための指標として、核酸は、より一層解析に使用されてきている。この理由は核酸に含まれる情報量である。核酸レベルでの変異の検出は、遺伝子疾患を診断する分野に特に有益であると考えられる。核酸検出の１つのタイプとして、標識プローブと検出対象の核酸とのハイブリダイゼーションが検出対象の核酸の存在の指標として評価される。これらの試験は不均一に、および均一に行なわれうる。不均一のアッセイにおいては、試料調製ステップの後、通常、単離された標的核酸は、例えば、欧州特許ＥＰ−Ｂ−０２００３６２号明細書記載のＰＣＲなどの核酸増幅方法により増幅され、ついで、それを固相に固定化し、続いてシグナルを発生するレポーター基で直接的または間接的に標識される分析物特異的なプローブで検出される。頻繁に使用される標識は放射活性または非放射活性である。また、酵素は、該酵素がある検出反応を触媒する標識として考慮に入れられる。均一のアッセイにおいては固相への結合が起こらない。このために、分析対象の核酸とプローブとから構成される二本鎖におけるインターカレーション後の測定可能な物理学的な変数の変化、例えば、その蛍光の増加（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３（５），７５３−７６０）またはその蛍光偏光における変化などを被るインターカレーター化合物がしばしば使用される。国際公開第９２／０２６３８号パンフレット記載の均一のアッセイにおいては、蛍光標識および蛍光消光剤を含むプローブを使用する。前記アッセイの間、標識は、消光剤から切断され、蛍光活性が検出される。前記不均一のアッセイおよび均一のアッセイには、化学的に複雑な、特別に標識されたプローブの使用が要求される。これらは、一方では、調製することが複雑であり、他方では、各標識毎にハイブリダイゼーション効率に不利に影響を及ぼすかどうか決定しなければならない。ＤＮＡをシークエンスする方法は、米国特許ＵＳ−Ａ−５，４５３，２４７号明細書に記載される。本方法においては、核酸断片のセットは、各セットが４種のヌクレオ塩基の１個以上で終わる、そのヌクレオチド配列が決定されるべきＤＮＡに基づいて生成される。シークエンスされるべき領域の全ての可能な断片（一本鎖）を生成しなければならない。個々の断片は、それぞれ１塩基ずつ異なる。これらの断片のそれぞれの質量は、質量分析により決定される。核酸の検出方法は、標識核酸アナログプローブが検出対象の核酸と接触され、該核酸を該プローブにより保護される領域まで分解し、複合体の存在がプローブ標識の助けで検出される国際公開第９５／１５９７４号パンフレットに記載される。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８３１−８３２およびＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１０４７−５０（１９９６）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とオリゴヌクレオチドとで構成された複合体の質量スペクトルを記載し、ここで、該ヌクレオチドは、合成的に調製され、塩基−塩基相互作用により該ＰＮＡ分子と結合する領域と同じ大きさであるかより大きい。本発明の目的は、標識プローブを要求せず、かつ異なる核酸の同時決定を可能にする核酸検出方法を提供することであった。したがって、本発明の主題は、プローブＰを核酸中に含まれる部分配列Ｓと結合させて結合産物Ｂ１を生成させ、該核酸を分解して所定の長さの部分核酸を含む結合産物Ｂ２を生成させて、結合産物Ｂ２またはその一部をその質量に基づいて検出することにより核酸を検出する方法である。本発明の意味内の核酸は、当業者に公知のＲＮＡおよびＤＮＡ等の全ての核酸を意味する。二本鎖および一本鎖核酸を検出することができる。プローブＰが鎖を置き換える性質を有する好ましい場合として、本発明の方法において、先に変性させることなく、二本鎖核酸を使用することができる。検出対象の酸は、規定された様式で分解されうる。検出対象の核酸の供給源は重要ではない。しかしながら、検出対象の核酸を含む試料は、好ましくは核酸が溶液中に存在し、かつプローブを溶解するのに便利なように前処理に供される。特に細胞または生物由来の核酸を検出する場合、核酸を取り囲む細胞壁の部分分解または完全分解により該核酸を破壊することが有利であることが証明された。界面活性剤または／およびカオトロピック塩の存在下のプロテアーゼの助けによる消化等のこのための多様な方法が当業者に知られている。この様式で調製された溶解粗試料から核酸を既に検出することが、原則的に可能であり、本発明で好ましいが、しかしながら、例えば、カオトロピック塩の存在下に核酸を固相、例えばガラス様表面へ結合させ、非結合試料成分を除くことにより核酸を妨害試料成分から最初に精製することも好ましい。つづいて固相へ結合した核酸を、例えば、低塩緩衝液により前記表面から再度取り除くことができる（例えば、国際公開第９５／０１３５９号パンフレットによる）。また、本発明は、核酸の機能に関して限定されない。核酸は、ゲノム、すなわち長い核酸であってもよいが、さらに、すでに部分的に大きさを減らした核酸、または転写物であってもよい。該核酸は特に好ましくは欧州特許ＥＰ−Ｂ−０２０１１８４号明細書記載のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）等の核酸増幅の産物である。ＰＣＲにおいて、試料中の検出対象の核酸は、試料と、一方が第１の鎖と相補的であり、他方が検出対象の核酸上の逆の鎖に相補的である２つのプライマーとを接触させることにより増幅される。該プライマーは、鋳型として検出対象の核酸を用いて、一方のプライマーの伸長の産物が、逆に他方のプライマーを伸長することに役に立ちうるように選択される。伸長は、モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いてＤＮＡポリメラーゼにより行なわれる。伸長産物は、例えば、個々の伸長ステップの間、加熱ステップ等による変性により各鋳型から分離した。かかる増幅は、他の核酸の存在下でさえも核酸の所定の部分の特異的な増幅を可能にする。したがって、検出対象の核酸は、天然の核酸だけでなく、増幅または／および修飾された核酸でもある。検出対象の核酸の特徴は、該核酸における部分配列Ｓの存在である。この部分配列は、所定かつ予め既知の配列の核酸塩基の配列から構成されている。部分配列は、５ヌクレオチドを超えることが好ましく、好ましくは６〜１００ヌクレオチドであり、特に好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長である。該部分配列は、好ましくはプローブに接近可能な核酸の領域である。それは、検出の根拠であることを意図する配列情報、例えば、ある変異が生じることが予想されるまたは一定の生物に特徴的である配列を含む。この変異は、１もしくは複数の点変異、１もしくは複数の欠失、１もしくは複数の挿入または多型であってもよい。生物による感染、遺伝子疾患またはかかる疾患の疾病素質の指標である変異が特に好ましい。かかる変異の例示は、Ｐ５３遺伝子における偏りである。感染の検出の例示は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３１８２１６号明細書に記載されたＨＣＶ −ＲＮＡの存在に基づくＣ型肝炎ウイルスの検出である。この場合、ｃＤＮＡは、例えば、ＨＣＶ−ＲＮＡから産生され、これは、所望の部分領域、例えば、非コード領域内でＰＣＲの介助により増幅される。本発明の方法は、異なる配列、起源または／および機能の核酸の同時検出に特に適する。ついで、これはこれらの核酸の異なる部分配列に基づく。部分配列Ｓは同じ長さまたは異なる長さのものであってもよいが、それらは好ましくは異なる塩基配列を有する。本発明の範疇において、プローブＰは、検出対象の核酸の部分配列Ｓに結合しうる分子として理解される。結合は、塩基−塩基相互作用、具体的にはワトソン −クリックまたは／およびフーグスティーン塩基対形成を介して生じる。プローブＰの配列は、好ましくは、それが完全、すなわち部分配列Ｓの領域内でこの部分配列に対して１００％の相補性であるように選択される。しかしながら、この要求は、該部分配列に非常に類似しているが検出されるべきではない部分配列を含む試料に核酸が存在する場合、すなわち検出対象の核酸に特異的なプローブを用いた好ましい場合において絶対必要であるだけである。一方、さらに本発明は、単離され、かつ可能であれば１つの群として検出するべき多様な核酸に対して異なるミスマッチを有するが、それにもかかわらず該群の全てのメンバーとのハイブリダイゼーションが起こるのに十分な長さであるプローブによること、あるいはミスマッチの発生にもかかわらず、該群の全てのメンバーとのハイブリダイゼーションが可能なプローブとの結合のためのハイブリダイゼーション条件を選択すること、あるいは群内に強く保存された配列領域由来のプローブ配列を選択することのいずれかによって、一定の部分配列を有するが、他の領域（例えば、トポロジカルな群のメンバー、例えば、１つの科の細菌）で異なる全ての核酸の通常の検出を可能にする。プローブＰは、部分配列Ｓの領域内で核酸を分解に対して保護する分子である。さらに該プローブは、好ましくは選択された条件下の分解に対し、それ自体耐性である。したがって、該プローブは、一方で天然の糖リン酸骨格を有するプローブ、例えばオリゴヌクレオチド、およびさらに天然の糖リン酸骨格とは異なる骨格、例えば、ペプチド骨格もしくは２’−アリルリボースホスフェートもしくはそれらの混合物を有するプローブである。好ましいプローブは、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載される。これらのプローブは、同じ塩基配列の対応するオリゴヌクレオチドと比較して相補的な核酸に対する増加したアフィニティーを有する。とりわけ、それらはＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖内に入り込むことができる。本発明の範疇のプローブＰは、適切に規定された長さおよび組成を有し、とりわけ規定された大きさまたは／および質量を有する。具体的には予めプローブＰの質量が知られている。最初のステップにおいて、結合産物Ｂは、検出対象の核酸とプローブＰとから形成される。このため、検出対象の核酸を含む試料はプローブＰと接触される。プローブＰは、好ましくは溶液中に存在し、所定量の試料液と組み合わせられる。結合産物は、二本鎖、すなわち各々の場合において、プローブＰの一方の鎖が検出対象の核酸の一方の鎖に結合される、あるいは三本鎖、すなわち検出対象の核酸の２つの鎖がプローブの一方の鎖と結合するか、２つのプローブもしくは１つのプローブの２つの部分が核酸の一方の鎖に結合するなどであってもよい。結合の条件は、プローブおよび核酸の型に依存する。ハイブリダイゼーションの場合、ストリンジェンシーは、例えば、塩濃度、温度などを変えることにより調整されうる。また、結合の特異性は、これらのパラメータに影響されうる。国際公開第９２／２０７０２号パンフレットのペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いる場合、非常に低塩濃度（１００μＭ未満）で処理することもできる。最も簡単な場合、プローブの核酸への結合は、核酸を含む試料溶液にプローブを添加することにより始まる。この場合、プローブは溶解したまたは固体の型で、単独の試薬または結合もしくは続くステップに要求されたもしくは所望の他の試薬との試薬混合物として、用いられうる。さらなる試薬は、例えば、緩衝液が可能である。しかしながら、原則として、試料をプローブの溶液に添加すること等により、プローブＰを核酸を含む溶液とのいかなる組み合わせ方法も可能である。続くステップにおいて、結合産物Ｂ１を含む試料を、核酸が分解されて結合産物Ｂ２を生じる条件に供す。本発明の１つの重要な特徴は、分解が所定の長さの部分核酸Ｆを生成することである。分解は、場合により、部分核酸の混合物を生成するであろう。これは、分解が相対的に長い時間で行われる場合であろう。ついで、複数のヌクレオチドであって、好ましくはプローブＰよりも５ヌクレオチド未満短い産物が形成してもよい。その結果、たとえプローブＰがハイブリダイズし、よって部分核酸Ｆが形成したという事実が部分配列Ｓが本来存在するという指標として役立ちうるとしても、部分核酸Ｆは、部分配列Ｓに相補的である部分を含むことが好ましい。これは、混合物の約５０％を超える、好ましくは７０％を超えて構成する後期の測定の基礎である主要な産物を提供することを妨げない。測定感度が高ければ高いほど、さらに主要な産物が存在するのは当然である。当業者は、分解の主要な産物、すなわち部分核酸が予め質量スペクトルを記録し、最も高いシグナルを選択することによる質量測定の対象であるべきものを認識することができる。この部分核酸は、最初にプローブＰと結合した核酸の一部である。この場合、部分配列Ｓは分解されない。また、核酸を部分配列Ｓに完全に分解されないことも可能であるが、核酸を完全に分解してプローブＰに結合する塩基のみを遊離することが好ましい。核酸の分解は、例えば、一本鎖領域を除去すること、１もしくは複数の二本鎖切断および特にプローブＰの部分配列Ｓへの結合を保持している間により、核酸の長さ、特に部分配列Ｓの外側の領域の減少として解されることが好ましい。基本的に、分解は、いかなる様式でも行ないうる。しかしながら、それは、好ましくは酵素的に行われる。好適な酵素は、ヌクレアーゼ、具体的にはＤＮアーゼ、ＲＮアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼ、例えばウシ膵臓由来のＤＮアーゼＩ〔例えば、リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ），Ｕ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６７，６，３３５；ランコワスキー（Ｌａｎｋｏｗｓｋｉ），Ｍ．，ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ，１９６１，５，１２５；クラーク（Ｃｌａｒｋ），Ｐ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９７４，１３，５０９８〕、マイクロコッカス・ルテウアス（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕａｓ）由来のエキソヌクレアーゼＶ〔例えば、アナイ（Ａｎａｉ），Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，７６７〕、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来のヌクレアーゼＳ７〔例えば、アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ），Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２３６，３０１４；クサカ（Ｃｈｓａｋａ），Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６４，２３９，３４９８；ランコワスキー（Ｌａｎｋｏｗｓｋｉ），Ｍ．，ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ，１９６１，５，１４２〕、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のヌクレアーゼＳ１〔例えば、アンドー（Ａｎｄｏ）、Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９６６，１１４，１５８；フォクト（Ｖｏｇｔ），Ｖ．Ｍ．，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７３，３３，１９２；フォクト（Ｖｏｇｔ），Ｖ．Ｍ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９８０，６５，２４８〕またはマングビーンの苗条由来のマングビーンヌクレアーゼ〔例えば、サング（Ｓｕｎｇ），Ｓ．Ｃ．ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６２，２３７，５０６〕などの一本鎖および／または二本鎖切断ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡ切断活性を有する。該酵素は、分解対象の核酸の型（ｄｓＤＮＡまたは／およびＲＮＡ）により選択される。酵素混合物、例えば、ＤＮアーゼＩおよびヌクレアーゼＳ１の使用も有利である。好ましくはプローブに結合した核酸が規定の所定の長さを有するまで分解反応を行う。また、検出対象の核酸は別として試料に存在する検出されるべきでない全ての核酸を、好ましくはできるだけ完全に分解するべきである。この段階は、用いられた条件に依存するが、通常２時間未満、好ましくは３０分未満で完了される。ついで、溶液は、規定の平均質量（具体的にはプローブＰの長さに依存する）を有する結合産物Ｂ２およびより低いが規定の質量を有するできるだけ過剰のプローブＰ、低分子分解産物、例えば、通常未確定で異なる低い質量を有するモノヌクレオチドおよび酵素、例えば、高い質量を有するＤＮアーゼ（通常２０，０００Ｄを超える）を含む。そこで、結合産物Ｂ２は、プローブＰおよび部分配列Ｓを含む短くした核酸（部分核酸Ｆ）から構成される。それゆえに、結合産物Ｂ２は、所定かつ規定のプローブ質量ＳＭを有し、質量ＦＭを有する部分配列Ｆの長さおよび塩基組成に依存する質量を有する。そこで、分解条件の選択により、質量Ｍの複合体は、長さまたは塩基組成のいずれかを決定するために使用しうる。また塩基組成は、部分配列Ｓ内の検出対象の核酸配列に依存する。本発明は、特に混合物における測定に有利であるが、さらに所望であれば、結合産物またはその一部を分解後および測定前に精製しうる。分解条件の選択から生じる核酸を検出する可能性を、図１および図２に示す。図１は、塩基配列の１つの位置（８位）で異なる２つの核酸（ＤＮＡ）が存在する場合の本発明の方法を示す。ＰＮＡプローブとＤＮＡとの結合（反応Ａ）および続く突出一本鎖部分の消化（反応Ｂ）がそれぞれ異なる分子量Ｍ１およびＭ２を有する２つの規定の複合体に帰することを示す。２つの複合体は、塩基ＣとＧとの間の差異に正確に対応する分子量の差異に基づいて、明白に分類され、同定されうる。図２は、２つの異なる核酸を同時に決定できる場合を示す。２つの核酸配列のそれぞれは、異なる部分配列Ｓを有する。各部分配列Ｓに相補的である異なる長さのＰＮＡプローブ（１２マーおよび１３マー）を対応する核酸にハイブリダイズする。結合産物Ｂ１およびＢ１’が形成する。プローブにより保護されない部分配列Ｓの酵素的分解の後、１つは異なる質量Ｍ１（Ｂ２）およびＭ２（Ｂ２’ ）を有する結合産物Ｂ２およびＢ２’を得る。示された反応は、単独の試験混合物で同時に行われうる。結合産物Ｂ２の存在は、検出対象の核酸の存在を示す。このため、結合産物Ｂ２またはその一部のいずれの質量が決定される。決定に好適なＢ２の部分は、例えば、プローブＰおよび部分核酸Ｆである。部分核酸Ｆの決定が好ましい。例えば、アルカリによる処理による鎖分離などにより結合産物Ｂ２を破壊し、部分核酸を遊離することにより、これを行なうことができる。また別法として、決定は、結合産物Ｂ２の部分、特に５塩基を超える、好ましくは結合産物Ｂ２からイオン化の間遊離される部分核酸Ｆの部分の質量を検出することにより行われうる。結合産物Ｂ２は、その質量に基づき本発明により検出される。一本鎖または二本鎖の核酸の質量は、原則として質量スペクトル法により決定されうる。当該分野の現状によれば、穏やかなイオン化手法は、結合産物Ｂ２、部分核酸ＦまたはプローブＰの質量スペクトルを記録するに適し、大気圧イオン化（ＡＰＩ）法、特にエレクトロスプレーイオン化〔ＥＳＩ、グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）ら，ＪＡＣＳ１９９５，１１７，８３１〕法は、特に好適である。さらに、好適な方法は、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６８巻，３，５２７ −５３３（１９９６）に記載されている。使用されるイオン化手法のみが、本明細書に記載された検出方法に関連がある。基本的に、例えば、四重極質量分析計、飛行時間質量分析計、イオントラップまたはセクターフィールド装置などの、全てのこれらのイオン化手法と組み合わすことができる質量分析計を用いて、イオン化で形成されたイオンの質量を決定することができる。さらに、質量分析計をＭＳ／ＭＳまたはＭＳ^Ωモードで作動させて選択性または感度を改良できる。さらに、マトリックス−支持レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）をイオン化手法として用いることができる。Ｕ．ピエルズ（Ｐｉｅｌｅｓ）ら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３，第２１巻，３１９１またはＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６７，４１３９−４１４４）記載のＭＡＬＤＩＴＯＦ法が特に適切であると思われる。測定は、正電荷イオンおよび好ましくは負電荷イオンで行なうことができる。ＥＳＩを用いて負電荷イオンで試料を測定するために、例えば、反応混合物は、酢酸アンモニウム緩衝液に溶解し、この緩衝溶液を流速１０ｎｌ／分〜１ｍｌ／分でイオン化系に送り込む。溶液を電場で噴霧することによりイオンを形成させ、それにより気体で送り込むことにより、この過程を気体の作用で支持または熱により支持することができる。形成されたイオンを電場で収束させ、適切な絞りまたはキャピラリーを介して質量分析計の高真空領域に移送する。一重または多重脱プロトン化分子のイオン系列は、例えば、電荷に対する質量の割合が四重極質量分析計で測定されるこれらのイオン化条件下に特徴的に形成される。試料に含まれる成分の分子量は、得られたイオン系列から算出されうる〔ジェイ・ビーフェン（Ｊ．Ｂ．Ｆｅｎｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８９，２４６，６４−７０〕。得られたイオン強度は、溶液中の成分の濃度に相関関連する。さらに、イオン化段階に時々生じるナトリウムまたはカリウムアダクトなどのアダクトも評価に用いられうる。正電荷イオンは、例えば、酢酸を含む緩衝溶液中で測定され、プロトン化分子のイオン化系列を生じさせる。測定および評価は陰極モードにおける測定と同様に行われる。かかる質量スペクトルを記録する装置は、例えば、ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＳｃｉｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ、ＭｉｃｒｏＭａｓｓなどから得ることができる。測定精度は、約±１〜２ダルトンに相当する計算質量から約０．０１％（ＥＳＩ）または０．１％（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）の偏差であるべきであろう。終了反応混合物で直接試料の質量を決定する別法として、測定前に試料を精製または濃縮することもできる。濾過段階（限外濾過）またはクロマトグラフィーによる精製段階がこのために好ましく用いられ、なかでもクロマトグラフィー過程は、特に自動化でき、質量分析計との直接カップリング過程として用いることができる。クロマトグラフィー過程は、例えば、逆相、イオン交換、ゲル濾過およびアフィニティクロマトグラフィー等である。さらに、電気泳動およびとりわけキャピラリー電気泳動過程もよく適する。結合産物Ｂ２の質量は、検出対象の直接または間接の指標である。図１の左カラムの場合、プローブと部分配列Ｓとの１００％の相補性が規定された分子量に帰するため、期待される質量は、使用されたプローブ配列から直接決定することができる。したがって、この質量の確実なシグナルの発現は、検出対象の核酸の存在の指標である。さらに、他の方法で検出された部分核酸Ｆの質量も、検出対象の核酸の存在を表示する。図１の右カラムの場合、偏差ΔＭは検出対象の核酸がＣ／Ｇ置換により１００％相補性の場合に期待される配列とは異なるという結論を可能にする。これを用いて、この変異を正確に検出することができる。決定される質量のシグナルが、１００％相補性について計算されたシグナルと塩基ＧおよびＣの差により異なる場合、この変異Ｃ−＞Ｇが存在する。このことは、測定シグナルと予想シグナル間の大きさの差異が塩基置換および特に特定の１種を示唆するので、本発明の方法は個々の変異の特異的決定に大変有利に使用しうることを示す。しかしながら、さらに、本発明の方法は、図２に示される異なる配列を有する核酸の同時検出に用いることもできる。この場合、２または数個のプローブＰ１、Ｐ２．．．ＰＮを単独のプローブＰの代わりに試料と接触させる。核酸が存在する場合、これらの各プローブは、あらかじめ決定された質量を有するシグナルに帰する。異なる配列および任意に異なる長さの可能なプローブＰの数および選択にほとんど制限がないので、この方法を用いて、異なる核酸のほとんどいかなる数をも検出することができる。しかしながら、先行技術の方法は、まさにこの場合、多数の異なる標識および可能な異なる検出方法を必要とする。したがって、さらに本発明は、プローブが核酸を含む通常の溶液に可溶性であり、かつＮが自然数であって異なるプローブの数を示す異なる質量のプローブＰ１、Ｐ２．．．ＰＮの混合物に関する。異なる質量は、異なる配列または異なる長さまたは異なる修飾基またはそれらの組み合わせのいずれかにより達成される。さらに、本発明の他のプローブの性質は、この場合にも適用する。したがって、プローブＰ１、Ｐ２．．．ＰＮのそれぞれは、試験対象の試料に存在するならば、適合する核酸との異なる結合産物Ｂ１を形成することができる。該プローブは、好ましくは天然由来ではないもの、例えばＰＮＡなどである。異なるプローブは、大体同じ決定の条件を用いるために、好ましくは同じ構成成分量でまたは少なくとも大きくは異ならない量で存在する。さらに、本発明の方法は、プローブを変異が局在しうるアレルの領域に１００％相補的である各々の場合に用いるならば、変異を検出するのに特に適する。さらに、本発明の方法は、既知配列の核酸または断片（標準核酸ＳＮ）と適合する（例えば、１００％相補性）標準プローブＳＰとを反応混合物に添加し、これらを検出対象の核酸と同じ処理に供する場合、核酸の定量的な検出に特に適する。この場合、シグナルはあらかじめ決定された質量で予想され、測定することもできる。シグナルの強度は、濃度に比例する。（既知もしくは規定された量の）標準核酸のシグナルのレベルを使用し、検出対象の核酸に期待される質量のシグナルのレベルと標準核酸のシグナルのレベルとの間の割合を比較または／および形成することにより検出対象の核酸の量を決定することができる。定量的な評価に加えて、標準核酸の使用は正しい試験機能の対照を可能にする。シグナルが測定できない場合、試験は欠陥である。１つの変形として、さらにプローブＰは、例えば、特異的な配列を有するプローブと、同じ質量を有するが他の配列を有するプローブとを区別する化学基等で標識されうる。これは、非常に密接に関連した配列を有する核酸間の区別をも可能にする。さらに、標識される複数のプローブは、同時試験に使用されうる。さらに、プローブは、例えば、カルボキシルもしくはスルホン酸基などの陰極モードにおけるマススペクトラムを記録するための負電荷基、または陽極モードのための正電荷基などのイオン化しやすい基で提供されうる。これらの基は、好ましくは数倍存在する、すなわち、ここでは該プローブはポリ−もしくはオリゴ−アニオンまたはカチオンの性質を有する。これらの基は、マススペクトル決定の感度を増加する。部分配列Ｓの存在は、本発明の方法において、２つのレベルで決定されうる。まず、定義された部分核酸Ｆ、すなわちその分解条件に耐える能力は、すでに部分配列Ｓの存在の指標であり、一方、質量の決定を用いて、部分核酸Ｆもしくは部分配列Ｓの配列を確認または配列における偏りを決定することができる。本発明の方法は、多くの異なる方法にうまく使用することができる。それは、任意に均一の方法であり、すなわち関与する化学反応が、好ましくは１つの相、好ましくは液相でおこる。かかる反応は、制御がより簡単で、より迅速に行なう条件下に起こる。さらに、本発明の方法は従来利用可能な方法よりも、一層迅速でありうる。さらに、慣用の方法よりも、感度が高く、検出対象の核酸増幅を回避することさえ可能である。標識プローブの使用を回避することが可能である。かなり特定の質量の存在が試験結果に用いられるので、装置は、まさに要求された質量範囲で高解像度を与えるように設計されうる。該段階中に形成される、または添加される他の産物（例えば、一本鎖断片またはプローブ）は、結合産物Ｂ２または部分核酸Ｆと有意に異なる質量を有する。さらに、該方法は自動化可能である。さらに、本発明の方法は異なる配列を有する複数の核酸または１つの核酸の異なる配列の同時決定に非常に適する。この場合、これらの配列に相補的な複数のＰＮＡ組み合わせが用いられる。特に好ましい態様において、手法は下記のとおりである：第１段階として、決定対象の核酸を任意に細胞から溶解により遊離する。該核酸はつづいて固体表面、例えばガラス様表面などに固定化し、残りの試料溶液を除去する。ついで、該核酸を表面から分離し、部分配列をＰＣＲにより増幅する。次の段階として、結合産物Ｂ１に相補的な配列を有するＰＮＡプローブＰと増幅核酸の部分配列Ｓとをハイブリダイズする。つづく段階として、結合産物Ｂ１を至適な酵素緩衝液中、部分配列Ｓを有する部分核酸ＦとＰＮＡプローブＰから構成される結合産物Ｂ２を形成するために用いる酵素の至適温度で、ヌクレアーゼ混合物により結合産物Ｂ１を消化する。Ｂ２は、イオン交換クロマトグラフィーにより他の反応成分から遊離され、つづいてＢ２を含む画分をマススペクトルシステムに載せる。結合産物Ｂ２または部分核酸Ｆの質量を決定する。下記実施例によりさらに本発明を詳説する：実施例配列５’−ＴＡＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：１）を有する２．７ｎｍｏｌ（水中５μｌ）のオリゴヌクレオチドと配列Ｈ₂ Ｎ−ＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧ−Ｈを有する２．７ｎｍｏｌ（水中５μｌ）ＰＮＡとをピペットにより添加し、ついで１０μｌの２×アッセイ緩衝液（６０ｍＭ酢酸Ｎａ，１００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭ酢酸Ｚｎ，０．００２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ４．６）を添加する。試料を３分間９５℃まで加熱し、ついで３７℃に冷却する。つづいて、１ＵマングビーンヌクレアーゼＩ（ベーリンガーマンハイム）を添加し、試料を１０分間３７℃でインキュベートする。酵素反応は１ｍＭＥＤＴＡ（２５μｌ）の添加により終了させる。その後、溶液を水で０．５ｍｌまで希釈し、ＮＡＰ−５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により脱塩する。ウィルム（Ｗｉｌｍ）ら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ６８（１９９６）、５２７−５３３（ＰａｒｅｎｔＩｏｎＳｃａｎｓｏｆＵｎｓｅｐａｒａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅＭｉｘｔｕｒｅｓ）記載の方法をマススペクトル解析に用いる。衝突セルを有する質量分析計ＡＰＩＩＩＩトリプルステージ四重極（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＳｃｉｅｘＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、非エレクトロスプレーイオン源で；極性陰極モード、スプレーポテンシャル−７５０Ｖ、スキャンレンジ３５０−１４００Ｄａ、ステップ幅０．２Ｄａ、ドエル時間１ｍＳ；１１スキャンを加え、イオンｍ／ｚ７９のプレカーサーイオンスキャンモード、衝突ガスアルゴン、衝突エネルギー３５ｅＶ／電荷。ＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の典型的なスペクトラムを図３に示す。生データのデコンボルーションの後、二本鎖で８７０９Ｄａの分子量（理論的な期待値８７１１Ｄａ）を得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月２０日（１９９８．８．２０）【補正内容】請求の範囲１． − ペプチド核酸の群から選択されるプローブＰを核酸に含まれる部分配列Ｓへ結合させ、結合産物Ｂ１を生じさせるステップ、 − プローブＰへの結合を保持しながら、該核酸を分解して所定の長さの部分核酸Ｆを含む結合産物Ｂ２を生じさせるステップ、 − 結合産物を質量スペクトルにより検出する、結合産物Ｂ２の検出ステップ、を含む核酸の検出方法。２．該プローブＰが部分配列Ｓの領域の核酸の分解を妨げることができる、請求項１記載の方法。３．該分解を酵素的に行なう、請求項１または２記載の方法。４．酵素または酵素混合物が一本鎖および／または二本鎖切断活性ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡ切断活性を有する、請求項３記載の方法。５．酵素がＳ１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項３記載の方法。６．異なる質量を有するプローブを検出対象の核酸のそれぞれに結合させ、これらの結合産物を請求項１記載のステップに供すことにより同時に複数の核酸を検出する、請求項１記載の方法。７．核酸が、プローブを結合させる前に予め精製される、請求項１記載の方法。８．質量分析評価が定量的に行なわれる、請求項１記載の方法。９．異なる質量を有する多くのペプチド核酸プローブの混合物を溶解型で含む、異なる配列を有する多くの核酸の同時検出のための試薬。

Claims

【特許請求の範囲】１． − プローブＰを核酸に含まれる部分配列Ｓへ結合させ、結合産物Ｂ１を生じさせるステップ、 − 該核酸を分解して所定の長さの部分核酸Ｆを含む結合産物Ｂ２を生じさせるステップ、 − その質量に基づいて結合産物Ｂ２またはその一部を検出するステップ、を含む核酸の検出方法。２．該プローブＰが部分配列Ｓの領域の核酸の分解を妨げることができる、請求項１記載の方法。３．該分解を酵素的に行なう、請求項１または２記載の方法。４．酵素または酵素混合物が一本鎖および／または二本鎖切断活性ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡ切断活性を有する、請求項３記載の方法。５．酵素がＳ１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項３記載の方法。６．異なる質量を有するプローブを検出対象の核酸のそれぞれに結合させ、これらの結合産物を請求項１記載のステップに供すことにより同時に複数の核酸を検出する、請求項１記載の方法。７．核酸が、プローブを結合させる前に予め精製される、請求項１記載の方法。８．該結合産物がマススペクトルにより検出される、請求項１記載の方法。９．質量分析評価が定量的に行なわれる、請求項８記載の方法。１０．異なる質量を有する天然に生じない多くのプローブの混合物を溶解型で含む、異なる配列を有する多くの核酸の同時検出のための試薬。