KR20220119182A - 서열분석 분야에서의 뉴클레오타이드에 대한 짧은 펜던트 아암 링커 - Google Patents

서열분석 분야에서의 뉴클레오타이드에 대한 짧은 펜던트 아암 링커 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 새로운 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 화합물 및 핵산 서열분석 분야에서의 이의 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 하기 화학식 (I)를 갖는다:
Figure pat00047

식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.
더 구체적으로, 상기 화합물은 하기 화학식 (c) 또는 화학식 (t)를 갖는다:
Figure pat00048

Figure pat00049

식 중, p는 트라이포스페이트기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.

Description

서열분석 분야에서의 뉴클레오타이드에 대한 짧은 펜던트 아암 링커 {SHORT PENDANT ARM LINKERS FOR NUCLEOTIDES IN SEQUENCING APPLICATIONS}
임의의 우선권 출원에 대한 참고에 의한 원용
본 출원은 2017년 7월 12일자로 출원된 영국(GB) 출원 제1711219.4호(그 전문이 참고로 원용됨)에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 새로운 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 화합물 및 핵산 서열분석 분야에서의 이의 용도에 관한 것이다.
서열분석 기술이 진전되면서, 고속 분자 방법, 예컨대, 고상 서열분석 등에 특히 수정 가능한 개선된 서열분석 시약에 대한 수요가 발생하였다.
고속 서열분석의 소정의 타입에서, 사용된 뉴클레오타이드는 도입된 염기를 특이적으로 확인하는 형광단을 함유한다. 형광단은 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오타이드 염기에 부착될 수 있다. 따라서, 도입된 염기가 확인된 후, 링커는 절단될 수 있어서, 제거되는 형광단이 부착되고 확인되는 다음의 염기에 대해 준비되게 한다. 이러한 절단은 검출된 핵염기의 각각에 위치한 남은 "반흔(scar)" 또는 "펜던트 아암(pendant arm)" 모이어티를 남긴다. 절단 이후에 어떠한 트레이스를 남기지 않는 시약을 설계할 수 있으면서, 이것은 절단하기에 느린 경향이 있고 그러므로 특히 효율적이지 않다. 표지된 뉴클레오타이드의 효율적인 도입, 모든 도입된 표지를 제거하기 위한 효율적인 절단과 하기 뉴클레오타이드의 효율적인 도입 사이에 균형이 필요하다. 합성에 의한 서열분석(Sequencing-by-Synthesis: SBS) 사이클에서 선행 기술 뉴클레오타이드의 성능을 개선시키는 최적화된 뉴클레오타이드 구조가 본 명세서에 기재되어 있다.
적합한 뉴클레오타이드 링커는, 예를 들어, WO 제2004/018493호에 기재되어 있다. 여기서 개시된 화합물은 하기의 예시적인 화학식 (e)로 기재되어 있다:
Figure pat00001
식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다. 이것은 절단되어서 하기 화학식 (ei)의 펜던트 아암 모이어티를 남긴다:
Figure pat00002
.
출원인들은 펜던트 아암의 변경이 얻은 서열분석 데이터의 개선을 발생시킬 수 있다는 것을 알아차렸다.
개선된 뉴클레오타이드 구조물 및 서열분석에서의 이의 용도는 본 명세서에 기재되어 있다. 기재된 분자는 핵산 가닥으로 도입될 수 있다. 더 효율적인 뉴클레오타이드 도입을 허용하는 소정의 변형을 갖는 핵산 가닥이 또한 기재되어 있다. 핵산 어레이 및 서열분석에서의 이의 용도가 또한 기재되어 있다. 표지된 뉴클레오타이드 도입의 효율성 및 새로운 작제물을 사용하여 수득 가능한 서열분석 판독의 길이 및 정확성에서 특정한 개선을 볼 수 있다. 하기 기재된 분자는 긴 판독 길이가 필요할 때 또는 더 짧은 뉴클레오타이드 도입 시간이 유리할 때 특히 유리하다. 고전력 자극 소스를 사용한다.
본 개시내용은 핵산 서열분석을 위한 개선된 시약에 관한 것이다. 형광으로 표지된 뉴클레오타이드가 연장된 핵산 가닥으로 도입되는 합성에 의한 서열분석(SBS)의 반복된 사이클 동안, "반흔화 DNA 프라이머:주형이 제조된다. "반흔" 또는 "펜던트 아암"은 이것이 부착된 핵염기로부터의 형광단의 화학 절단으로부터 생긴 각각의 검출된 핵염기에 위치한 모이어티이다. 이 펜던트 아암은 반복된 SBS 사이클에 걸쳐 DNA 프라이머:주형에서 축적되어서, 천연 DNA 프라이머:주형과 상이한 분자 구조를 갖는 프라이머:주형 DNA 분자를 생성한다. 이 잔류 펜던트 아암은 새로운 유입하는 뉴클레오타이드의 도입을 느리게 하고, 따라서 오차율을 증가시키고, 특히 서열분석 실행의 나중의 단계 및 오래 가는 서열분석 실행에서 데이터 품질을 낮춘다. 본 개시내용은 서열분석 동안 DNA 프라이머:주형에서의 펜던트 아암의 크기를 최소화하는 것을 목표로 한다.
제1 양상에 따르면, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pat00003
.
식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.
뉴클레오사이드는 핵염기에 부착된 탄수화물 리보스를 갖는 화합물이다. 핵염기는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 공통의 천연 발생 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이다. 공통의 천연 발생 피리미딘은 DNA 가닥에서 시티딘(C) 및 타이민(T) 또는 RNA 가닥에서 우라실(U)이다. 리보스는 (DNA에서) 2'-데옥시리보스일 수 있다. 포스페이트 모이어티가 부착된 뉴클레오사이드는 뉴클레오타이드이고, 따라서 본 명세서에 기재된 화합물은 뉴클레오타이드의 형태일 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 화학식에서, B는 뉴클레오타이드 염기를 나타낼 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 화학식에서, B는 피리미딘 염기를 나타낼 수 있다. 염기 B는 임의의 4개의 공통의 천연 발생 염기, A, G, C 또는 T/U의 형태를 취할 수 있다. 포스페이트 모이어티는 리보스의 5'-위치에 부착될 수 있는 트라이포스페이트 모이어티일 수 있다. 본 개시내용의 화합물은 하기 화학식 (c), 화학식 (t) 또는 화학식 (a)의 화합물을 포함할 수 있다:
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
식 중, p는 트라이포스페이트기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.
트라이포스페이트 모이어티는 핵산으로의 뉴클레오타이드 화합물의 도입을 허용한다. 핵산 폴리머라제를 사용한 연장은 핵산 프라이머의 3'-OH에 대한 화합물의 부착을 허용한다. 따라서, 본 개시내용의 화합물은 올리고핵산에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 본 개시내용의 화합물을 도입시키도록 폴리머라제 연장을 겪는 핵산 프라이머의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 본 명세서에 개시된다.
올리고뉴클레오타이드에 부착된 뉴클레오타이드 화합물이 개시된다. 화합물이 형광으로 표지될 때, 일반적으로 오직 단일 변형된 화합물은 각각의 올리고뉴클레오타이드에 부착될 것이다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (I)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00007
식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.
의심을 피하도록, 도입 시 트라이포스페이트기가 모노포스페이트 다이에스터로 전환된다고 이해된다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (c), 화학식 (t) 또는 화학식 (a)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
식 중, p는 모노포스페이트기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착됨 형광단이다.
상기 화합물은 대안적으로 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (c), 화학식 (t) 또는 화학식 (a)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드로서 표시될 수 있다:
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착됨 형광단이다.
도입된 핵염기의 검출 시, 형광성 표지 및 선택적인 링커는 제거될 수 있다. 제거는 아지도기의 환원에 의해 수행되어서, O-CHNH2- 모이어티의 단편화를 초래한다. 절단 시 하이드록실기는 핵염기에 부착된 채 있고, 형광성 모이어티는 탈착된다.
따라서, 하기 화학식 (II)의 화합물이 개시된다:
Figure pat00014
식 중, B는 뉴클레오타이드 염기이다.
핵염기는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 공통의 천연 발생 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이다. 공통의 천연 발생 피리미딘은 DNA 가닥에서 시티딘(C) 및 타이민(T) 또는 RNA 가닥에서 우라실(U)이다. 리보스는 (DNA에서) 2'-데옥시리보스일 수 있다.
화학식 II의 화합물은 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 따라서, 모이어티 B는 추가의 염기에 부착된 염기일 수 있다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (ci), 화학식 (ti) 또는 화학식 (ai)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이다.
하이드록실 펜던트 아암을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 동일한 올리고뉴클레오타이드에서 다수의 펜던트 아암을 가질 수 있다. 펜던트 아암에 의해 변형된 염기는 보통 서열에서 인접할 것이다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 2개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시된다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 10개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시된다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 100개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시되어 있다.
뉴클레오타이드의 도입은 뉴클레오타이드의 하나 초과의 타입을 갖는 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 적어도 1개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 개시된다. 키트는 적어도 2개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 키트는 적어도 2개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 4개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 키트는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석 또는 단백질 결합 검정, 또는 이들의 조합에서 사용될 수 있다.
도 1은 서열분석 동안 반흔화 또는 펜던트 아암 DNA 프라이머:주형의 형성을 예시한다.
도 2는 서열분석 동안 사용된 짧은 펜던트 아암 완전 작용기화된 뉴클레오타이드(ffN)의 구조의 예를 예시한다.
도 3은 2-채널 SBS 서열분석에 대한 4개의 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드의 예를 예시한다.
도 4A 내지 도 4C는 2개의 상이한 폴리머라제(PolA 및 PolB) 및 2개의 상이한 주형 라이브러리(PhiX 및 인간)에 의한 2-채널 변형된 Hiseq(등록상표)에서 표준 및 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드에 의해 관찰된 서열분석 메트릭의 예를 나타낸다.
도 5A 및 도 5B는 2-채널 변형된 Miseq(등록상표)에서 표준 또는 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드에 의해 관찰된 서열분석 메트릭의 예를 나타낸다.
본 개시내용은 형광 검출 및 합성에 의한 서열분석의 방법에 특히 적합한 신규한 화합물을 제공한다. 짧아진 잔류 펜던트 아암을 갖는 화합물은 소정의 핵산 서열분석 분야를 개선한다.
제1 양상에 따르면, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pat00018
식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; Fl은 선택적인 링커를 통해 부착된 형광단이다.
뉴클레오사이드는 핵염기에 부착된 탄수화물 리보스를 갖는 화합물이다. 핵염기는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 공통의 천연 발생 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이다. 공통의 천연 발생 피리미딘은 DNA 가닥에서 시티딘(C) 및 타이민(T) 또는 RNA 가닥에서 우라실(U)이다. 리보스는 (DNA에서) 2'-데옥시리보스일 수 있다. 포스페이트 모이어티가 부착된 뉴클레오사이드는 뉴클레오타이드이고, 따라서 본 명세서에 기재된 화합물은 뉴클레오타이드의 형태일 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 화학식에서, B는 뉴클레오타이드 염기를 나타낼 수 있다.
Fl은 형광단이다. 따라서, 본 개시내용의 화합물은 형광으로 표지된다. 형광단의 성질은 중요하지 않고, 임의의 공지된 형광성 종, 예를 들어, 로다민 또는 사이아닌으로부터 선택된 화합물을 포함할 수 있다. 형광단은 선택적인 링커를 통해 핵염기에 부착될 수 있다. 링커의 기능은 일반적으로 뉴클레오타이드에 대한 형광단의 화학 부착을 돕는 것이다. 링커는, 예를 들어, 선택적으로 하나 이상의 이종원자 대체를 갖는 알킬 사슬일 수 있다. 링커는 화학 커플링 반응을 수월하게 하도록 아마이드 또는 에스터기를 함유할 수 있다. 링커는 클릭 화학을 이용하여 합성될 수 있다. 링커는 트라이아졸기를 함유할 수 있다. 링커는 다른 아릴기를 함유할 수 있다.
링커의 예는 하기와 같은 종을 포함할 수 있다:
Figure pat00019
식 중, n은 2 내지 6의 정수이고, Fl은 형광단이다.
뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 리보스 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스일 수 있다. 리보스는 단일 뉴클레오타이드로의 도입을 제한하도록 하나 이상의 2' 또는 3' 차단기를 가질 수 있다. 차단기는 아지도메틸기일 수 있다. 리보스는 3'-아지도메틸 차단기를 갖는 2'-데옥시리보스일 수 있다. 차단기는 알릴기일 수 있다. 리보스는 3'-알릴 차단기를 갖는 2'-데옥시리보스일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 화학식에서, B는 피리미딘 염기를 나타낼 수 있다. 염기 B는 임의의 4개의 공통의 천연 발생 염기, A, G, C 또는 T/U의 형태를 취할 수 있다. 포스페이트 모이어티는 리보스의 5'-위치에 부착될 수 있는 트라이포스페이트 모이어티일 수 있다. 본 개시내용의 화합물은 하기 화학식 (c1), 화학식 (t1) 또는 화학식 (a1)의 화합물을 포함할 수 있다:
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
식 중, p는 트라이포스페이트기이고; n은 2 내지 6의 정수이고; Fl은 형광단이다.
트라이포스페이트 모이어티는 핵산으로의 뉴클레오타이드 화합물의 도입을 허용한다. 핵산 폴리머라제를 사용한 연장은 핵산 프라이머의 3'-OH에 대한 화합물의 부착을 허용한다. 따라서, 본 개시내용의 화합물은 올리고핵산에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 본 개시내용의 화합물을 도입시키도록 폴리머라제 연장을 겪는 핵산 프라이머의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 본 명세서에 개시된다.
올리고뉴클레오타이드에 부착된 뉴클레오타이드 화합물이 개시되어 있다. 화합물이 형광으로 표지되는 경우, 일반적으로 오직 단일 변형된 화합물이 각각의 올리고뉴클레오타이드에 부착될 것이다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (III)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00023
식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고; n은 2 내지 6의 정수이고; Fl은 형광단이다.
의심을 피하도록, 도입 시 트라이포스페이트기가 모노포스페이트 다이-에스터로 전환된다고 이해된다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (c1), 화학식 (t1) 또는 화학식 (a1)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
식 중, p는 모노포스페이트기이고; n은 2 내지 6의 정수이고; Fl은 형광단이다.
상기 화합물은 대안적으로 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (c1), 화학식 (t1) 또는 화학식 (a1)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드로서 표시될 수 있다:
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이고; n은 2 내지 6의 정수이고; Fl은 형광단이다.
주어진 임의의 예에서, n은 2 내지 6일 수 있다. 주어진 임의의 예에서, n은 2일 수 있다. 주어진 임의의 예에서, n은 3일 수 있다. 주어진 임의의 예에서, n은 4일 수 있다. 주어진 임의의 예에서, n은 5일 수 있다. 주어진 임의의 예에서, n은 6일 수 있다.
도입된 핵염기의 검출 시, 형광성 표지 및 선택적인 링커는 제거될 수 있다. 제거는 아지도기의 환원에 의해 수행되어서, O-CHNH2- 모이어티의 단편화를 초래한다. 절단 시 하이드록실기는 핵염기에 부착된 채 있고, 형광성 모이어티는 탈착된다.
따라서, 하기 화학식 (II)의 화합물이 개시된다:
Figure pat00030
식 중, B는 뉴클레오타이드 염기이다.
핵염기는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 공통의 천연 발생 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이다. 공통의 천연 발생 피리미딘은 DNA 가닥에서 시티딘(C) 및 타이민(T) 또는 RNA 가닥에서 우라실(U)이다. 리보스는 (DNA에서) 2'-데옥시리보스일 수 있다.
화학식 II의 화합물은 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 따라서, 모이어티 B는 추가의 염기에 부착된 염기일 수 있다. 따라서, 3'-뉴클레오타이드가 하기 화학식 (ci), 화학식 (ti) 또는 화학식 (ai)의 화합물인 올리고뉴클레오타이드가 개시된다:
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이다.
하이드록실 펜던트 아암을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 동일한 올리고뉴클레오타이드에서 다수의 펜던트 아암을 가질 수 있다. 펜던트 아암에 의해 변형된 염기는 보통 서열에서 인접할 것이다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 2개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시된다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 10개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시된다. 화학식 (II)에 따른 화합물의 100개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 개시되어 있다.
뉴클레오타이드의 도입은 뉴클레오타이드의 하나 초과의 타입을 갖는 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 적어도 1개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 개시된다. 키트는 적어도 2개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 키트는 적어도 2개의 뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드인 4개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 키트는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석 또는 단백질 결합 검정, 또는 이들의 조합에서 사용될 수 있다.
적어도 1개의 뉴클레오타이드가 본 개시내용의 뉴클레오타이드인 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 본 명세서에 제공된다. 키트는 2개 이상의 표지된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 2개 이상의 형광성 표지에 의해 표지될 수 있다. 표지 중 2개 이상은 레이저일 수 있는 단일 여기원을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 여기 밴드는 적어도 부분적으로 중첩할 수 있어서, 스펙트럼의 중첩 영역에서의 여기는 표지 둘 다가 형광을 방출하게 한다. 특정한 실시형태에서, 2개 이상의 표지로부터의 방출은 스펙트럼의 상이한 영역에서 발생해서, 적어도 하나의 표지의 존재는 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있다.
키트는 4개의 표지된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 여기서 4개의 뉴클레오타이드 중 첫 번째는 본 명세서에 개시된 바와 같다. 이러한 키트에서, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드는 선택적으로 제1 뉴클레오타이드에서의 표지로부터 분광학적으로 상이하고 선택적으로 서로에서의 표지로부터 분광학적으로 상이한 화합물에 의해 각각 표지될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 화합물은 구별되는 흡광도 최대 및/또는 방출 최대를 가질 수 있어서, 화합물(들)은 다른 화합물로부터 구별 가능하다. 예를 들어, 각각의 화합물은 구별되는 흡광도 최대 및/또는 방출 최대를 가질 수 있어서, 각각의 화합물은 다른 3개의 화합물로부터 구별 가능하다. 최대가 아닌 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부가 상이할 수 있고, 이 차이가 화합물을 구별하기 위해 이용될 수 있다고 이해될 것이다. 키트는 화합물 중 2개 이상이 600㎚ 초과의 구별되는 흡광도 최대를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 화합물은 통상적으로 640㎚ 초과의 영역에서의 광을 흡수한다.
본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오타이드 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 공정 또는 성분 포함)을 검출, 측정 또는 확인하도록 사용될 수 있다. 화합물, 뉴클레오타이드 또는 키트를 사용할 수 있는 예시적인 기법은 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)을 포함한다. 사용은 특정한 기법을 수행하기 위한 자동화 기구, 예컨대 자동화 서열분석 기구에 있을 수 있다. 서열분석 기구는 상이한 파장에서 조작하는 2개의 레이저를 함유할 수 있다.
본 개시내용은 형광으로 표지된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(변형된 뉴클레오타이드)의 접합체를 제공한다. 표지된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 효소 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오타이드를 표지하기 위해, 예컨대, 비제한적인 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고상 증폭, 폴리뉴클레오타이드 서열분석(예를 들어, 고상 서열분석), 닉 번역 반응(nick translation reaction) 등에서 유용하다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 또는 핵염기에서의 부위에서 표지될 수 있다. 당해 분야에 공지된 것처럼, "뉴클레오타이드"는 질소함유 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트기로 이루어진다. RNA에서 당은 리보스이고 DNA에서 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록실기가 없는 당이다. 질소함유 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌(A) 또는 구아닌(G)일 수 있고, 피리미딘은 사이토신(C), 타이민(T) 또는 RNA의 맥락에서, 우라실(U)일 수 있다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스터이고, 에스터화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록실기에서 발생한다. 뉴클레오타이드는 보통 모노, 다이- 또는 트라이포스페이트이다.
"뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 소실된다. 뉴클레오사이드 유사체의 예는 표지가 염기에 연결되고 당 분자에 부착된 포스페이트기가 없는 것일 것이다.
염기가 보통 퓨린 또는 피리미딘이라 불리지만, 숙련자는 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기를 겪는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 역량을 변경하지 않는 유도체 및 유사체가 구입 가능하다는 것을 이해할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모 화합물의 것과 동일하거나 이를 가깝게 닮았지만, 유도체 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드가 또 다른 분자에 연결되게 하는, 예를 들어, 상이한 또는 추가적인 측기와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 유도체는 왓슨-클릭 짝짓기를 겪을 수 있다. "유도체" 및 "유사체"는 또한, 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유도체를 포함한다. 이러한 유도체 및 유사체는 예를 들어, 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 기재되어 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로di티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 연결 등을 포함하는 변형된 포스포다이에스터 연결을 가질 수 있다.
형광단은, 예를 들어, 링커를 통해 뉴클레오타이드 염기에서의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 왓슨-클릭 염기 짝짓기는생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 특정한 핵염기 표지 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 상기 기재된 바대로, 링커기는 염료를 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 공유 부착시키도록 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 표지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 효소적으로 도입 가능하거나 효소적으로 연장 가능할 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는 뉴클레오타이드를 화합물에 연결하기에 충분한 길이일 수 있어서, 화합물은 전체 결합 및 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오타이드의 인식을 상당히 방해하지 않는다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서 거리는, 예를 들어, 절단 부위 또는 표지로부터의 뉴클레오타이드 염기이다.
본 개시내용에 따라 표지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pat00034
염료가 형광성 화합물일 때, B는, 예를 들어, 우라실, 타이민, 사이토신, 아데닌, 구아닌 등과 같은 핵염기이고, L은 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 선택적인 링커기이다. R'는 H, 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스터 유사체, 반응성 인 함유 기에 부착된 -O- 또는 차단기에 의해 보호된 -O-일 수 있다. R"는 H, OH, 포스포르아미다이트 또는 3'OH 차단기일 수 있고, R"'는 H 또는 OH이다. R"가 포스포르아미다이트일 때, R'는 자동화 합성 조건 하에 후속하는 단량체 커플링을 허용하는 산-절단 가능한 하이드록실 보호기이다.
또 다른 대안적인 실시형태에서, 염기에 부착된 펜토스 당의 3' 탄소 및 염료(또는 염료 및 링커 작제물)에 차단기가 없고, 예를 들어, 추가의 뉴클레오타이드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다. 따라서, 블록은 입체 장애로 인할 수 있거나, 염료가 당의 3' 위치에 부착되든지 또는 아니든지, 크기, 전하 및 구조의 조합으로 인할 수 있다.
또 다른 대안적인 실시형태에서, 차단기는 펜토스 당의 2' 또는 4' 탄소에 존재하고, 추가의 뉴클레오타이드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다.
차단기의 사용은 변형된 뉴클레오타이드가 도입될 때, 예컨대, 연장을 중단시킴으로써 중합이 제어되게 한다. 예를 들어, 비제한적인 예에 의해 화학 조건의 변화에 의해 또는 화학 블록의 제거에 의해, 차단 효과가 가역적인 경우, 연장은 소정의 점에서 중단되고 이어서 계속되게 허용될 수 있다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 3'OH 차단기는 WO 제2004/018497호에 개시된 모이어티를 포함할 것이다. 예를 들어, 차단기는 아지도메틸(CH2N3) 또는 알릴일 수 있다.
특정한 실시형태에서, (염료와 뉴클레오타이드 사이의) 링커 및 차단기는 둘 다 존재하고, 별개의 모이어티이다. 특정한 실시형태에서, 링커 및 차단기는 둘 다 실질적으로 유사한 조건 하에 절단 가능하다. 따라서, 염료 화합물 및 블록 둘 다를 제거하는 데 유일한 단일 처리가 필요하므로, 탈보호 및 탈차단 과정은 더 효율적일 수 있다. 그러나, 몇몇 실시형태에서 링커 및 차단기는 구별되는 조건 하에 개별적으로 절단 가능하기 보다는 유사한 조건 하에 절단 가능할 필요가 없다.
본 개시내용은 또한 형광성 화합물을 도입하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 연결에서 연결된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 각각으로 이루어진 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는, 본 명세서에 기재된 (예를 들어, 염료 화합물로 표지된) 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드와 조합되어, 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드 이외의 천연 발생 뉴클레오타이드, 비천연 발생(또는 변형된) 뉴클레오타이드 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 또한 비천연 골격 연결 및/또는 비뉴클레오타이드 화학 변형을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물로 이루어진 키메라 구조가 또한 고려된다.
본 개시내용에 따른 형광성 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오사이드)는, 스스로든 또는 더 큰 분자 구조 또는 접합체로 도입되거나 회합되든, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드에 부착된 형광성 표지의 검출을 포함하는 방법과 같은 임의의 분석 방법에서 사용될 수 있다. 이 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드로 도입된"은 5' 포스페이트가, 자체가 더 긴 폴리뉴클레오타이드 사슬의 일부를 형성할 수 있는, 제2 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실기에 대한 포스포다이에스터 연결에서 연결된다는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드의 3' 말단은 추가의 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트에 대한 포스포다이에스터 연결에서 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 하나의 비제한적인 실시형태에서 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드로 도입된 변형된 뉴클레오타이드를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 적어도 하나의 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드로 도입하는 단계 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오타이드(들)에 부착된 염료 화합물로부터의 형광성 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오타이드로 도입된 변형된 뉴클레오타이드(들)를 검출하는 단계를 포함한다.
이 방법은 본 개시내용에 따른 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드로 도입되는 합성 단계 (a) 및 이의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 폴리뉴클레오타이드로 도입된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드(들)가 검출되는 검출 단계 (b)를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드는 폴리머라제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오타이드로 도입된다. 그러나, 예를 들어, 화학 올리고뉴클레오타이드 합성 또는 비표지된 올리고뉴클레오타이드에 대한 표지된 올리고뉴클레오타이드의 결찰과 같은 폴리뉴클레오타이드에 대한 변형된 뉴클레오타이드의 연결의 다른 방법을 이용할 수 있다. 따라서, 용어 "도입하는"은, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 화학 방법, 및 효소 방법에 의한 폴리뉴클레오타이드 합성을 포함할 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 합성 단계는 수행되고, 선택적으로 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 형광으로 표지된 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오타이드 가닥에서의 유리 3' 하이드록실기와 변형된 뉴클레오타이드에서의 5' 포스페이트기 사이의 포스포다이에스터 연결의 형성을 허용하는 조건 하에 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 대한 뉴클레오타이드의 상보성 염기-짝짓기(complementary base-pairing)에 의해 유도된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
상기 방법의 모든 실시형태에서, 검출 단계가 수행될 수 있는 한편, 변형된 뉴클레오타이드가 도입된 폴리뉴클레오타이드 가닥은 주형 가닥에 어닐링되거나, 2개의 가닥이 분리되는 변성 단계 후. 추가의 단계, 예를 들어, 화학 또는 효소 반응 단계 또는 정제 단계는 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 변형된 뉴클레오타이드(들)를 도입시키는 표적 가닥은 단리되거나 정제될 수 있고, 이어서 추가로 처리되거나 후속하는 분석에서 사용된다. 예로서, 합성 단계에서 변형된 뉴클레오타이드(들)에 의해 표지된 표적 폴리뉴클레오타이드는 후속하여 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 단계의 생성물은 추가의 반응 단계로 처리될 수 있고, 원하는 경우, 이들 후속하는 단계의 생성물은 정제되거나 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기법에 친숙한 사람에게 널리 공지될 것이다. 일 실시형태에서, 합성 단계는 적합한 폴리머라제 효소의 존재 하에 주형 가닥에 상보적인 연장된 표적 가닥을 형성하도록 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 전구체를 사용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 다른 실시형태에서, 합성 단계는 자체가 표적 및 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 카핑(copying)으로부터 유래된 어닐링된 상보성 가닥으로 이루어진 표지된 이중 가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계 닉 번역, 가닥 대체 중합, 무작위 프라이밍된 DNA 표지화 등을 포함한다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드의 도입을 촉매화할 수 있는 것이다. 다양한 천연 발생 또는 변형된 폴리머라제를 사용할 수 있다. 예로서, 열안정한 폴리머라제는 열순환처리 조건을 이용하여 수행되는 합성 반응에 사용될 수 있는 한편, 열안정한 폴리머라제는 단열 프라이머 연장 반응에 원해지지 않을 수 있다. 본 개시내용에 따른 변형된 뉴클레오타이드를 도입할 수 있는 적합한 열안정한 폴리머라제는 WO 제2005/024010호 또는 WO 제06120433호에 기재된 것을 포함한다. 37℃와 같은 더 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소는 반드시 열안정한 폴리머라제일 필요는 없고, 따라서 폴리머라제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥 대체 활성 등과 같은 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.
구체적인 비제한적인 실시형태에서, 본 개시내용은 핵산 서열분석, 재서열분석, 전체 게놈 서열분석, 단일 뉴클레오타이드 다형현상 점수화의 방법 또는 폴리뉴클레오타이드로 도입할 때 본 명세서에 기재된 염료에 의해 표지된 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 검출을 수반하는 임의의 다른 분야를 포함한다. 형광단을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드에 의해 표지된 폴리뉴클레오타이드의 사용으로부터 이익을 얻는 임의의 다양한 다른 분야는 본 명세서에 기재된 염료에 의해 표지된 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 사용할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드 합성에 의한 서열분석 반응에서 본 개시내용에 따른 변형된 뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 일반적으로 서열분석되는 주형 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오타이드 사슬을 형성하도록 폴리머라제 또는 리가제를 사용하여 5'→3' 방향에서 성장하는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 대한 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 순차적인 첨가를 수반한다. 하나 이상의 첨가된 뉴클레오타이드(들)에 존재하는 염기의 식별은 검출 또는 "영상화" 단계에서 결정될 수 있다. 첨가된 염기의 식별은 각각의 뉴클레오타이드 도입 단계 후 결정될 수 있다. 주형의 서열은 이어서 관습적인 왓슨-클릭 염기 짝짓기 규칙을 이용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 식별의 결정을 위해 본 명세서에 기재된 염료에 의해 표지된 변형된 뉴클레오타이드의 사용은, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형현상의 점수화에서 유용할 수 있고, 이러한 단일 염기 연장 반응은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
본 개시내용의 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열은 도입된 뉴클레오타이드(들)에 부착된 형광성 표지(들)의 검출을 통해 서열분석되는 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 초기의 가닥에 대한 하나 이상의 뉴클레오타이드의 도입을 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열분석은 적합한 프라이머에 의해 프라이밍될 수 있고(또는 헤어핀의 일부로서 프라이머를 함유하는 헤어핀 작제물로서 제조됨), 초기의 사슬은 폴리머라제 촉매화된 반응에서 프라이머의 3' 말단에 대한 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 단계별 방식으로 연장된다.
특정한 실시형태에서, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 트라이포스페이트(A, T, G 및 C)는 독특한 형광단에 의해 표지될 수 있고, 또한 비제어된 중합을 방지하기 위해 3' 위치에서의 차단기를 포함한다. 대안적으로, 4개 중 1개의 뉴클레오타이드는 비표지될 수 있다(어두움). 폴리머라제 효소는 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보성인 초기의 사슬로 뉴클레오타이드를 도입하고, 차단기는 뉴클레오타이드의 추가의 도입을 방지한다. 임의의 도입되지 않은 뉴클레오타이드는 세척될 수 있고, 각각의 도입된 뉴클레오타이드로부터의 형광성 신호는 적합한 수단, 예컨대 레이저 여기를 이용한 전하 커플링된 장치 및 적합한 방출 필터에 의해 광학적으로 '판독'될 수 있다. 3'-차단기 및 형광단 화합물은 이어서 제거(탈보호)될 수 있어서, 추가의 뉴클레오타이드 도입을 위해 (동시에 또는 순차적으로) 초기의 사슬을 노출시킨다. 통상적으로, 도입된 뉴클레오타이드의 식별은 각각의 도입 단계 후 결정될 것이지만, 이것은 엄격히 필수적이지는 않다. 유사하게, 미국 특허 제5,302,509호는 고체 지지체에 부동화된 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기 방법은, 상기 예시된 것처럼, DNA 폴리머라제의 존재 하에 부동화된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 가닥으로 형광으로 표지된, 3'-차단된 뉴클레오타이드 A, G, C 및 T의 도입을 이용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 도입하지만, 3'-차단기에 의한 추가의 첨가가 방지된다. 도입된 뉴클레오타이드의 표지는 이어서 결정되고, 차단기는 화학 절단에 의해 제거될 수 있어서, 추가의 중합이 발생하게 허용한다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석되는 핵산 주형은 이것이 서열에 원해지는 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오타이드의 첨가를 위한 프라이머 또는 개시 점으로서 작용하는 유리 3' 하이드록실기를 갖는 이중 가닥 영역을 통상적으로 포함할 것이다. 서열분석되는 주형의 영역은 상보성 가닥에서 이 유리 3' 하이드록실기를 오버행(overhang)할 것이다. 서열분석되는 주형의 오버행 영역은 단일 가닥일 수 있지만, 이중 가닥일 수 있고, 단 서열분석되는 주형 가닥에 상보성인 가닥에서 "닉이 존재"하여서 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH 기를 제공한다. 이러한 실시형태에서, 서열분석은 가닥 대체에 의해 진행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 유리 3' 하이드록실기를 보유하는 프라이머는 서열분석되는 주형의 단일 가닥 영역에 혼성화하는 별개의 성분(예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오타이드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 서열분석되는 프라이머 및 주형 가닥은 각각, 예를 들어, 헤어핀 루프 구조와 같은 분자내 듀플렉스를 형성할 수 있는 부분적으로 자가 상보성인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오타이드 및 이것이 고체 지지체에 부착될 수 있는 방법은 국제 출원 공보 WO 제0157248호 및 WO 제2005/047301호에 개시되어 있다. 뉴클레오타이드는 성장하는 프라이머에 연속하여 첨가될 수 있어서, 5'→3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 사슬을 합성시킨다. 첨가되는 염기의 성질은 반드시는 아니지만 특히 각각의 뉴클레오타이드 첨가 후 결정될 수 있어서, 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공한다. 따라서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트기에 의한 포스포다이에스터 연결의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실기에 뉴클레오타이드를 연결함으로써 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오타이드)으로 도입된다.
서열분석되는 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드로 이루어진 하이브리드 분자일 수 있다. 핵산 주형은 천연 발생 및/또는 비천연 발생 뉴클레오타이드 및 천연 또는 비천연 골격 연결을 포함할 수 있고, 단 이들은 서열분석 반응에서 주형의 카핑을 방지하지 않는다.
소정의 실시형태에서, 서열분석되는 핵산 주형은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 연결 방법을 통해, 예를 들어, 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체(예를 들어, 실리카계 지지체)에 직접적으로 부착될 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오타이드의 직접적인 공유 부착을 허용하거나, 자체가 고체 지지체에 비공유로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 다중전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오타이드를 부동화시키기 위한 몇몇 방식으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드가 실리카계 지지체에 직접 부착된 어레이는, 예를 들어, WO 제00006770호에 개시된 것이고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 유리에서의 펜던트 에폭사이드기와 폴리뉴클레오타이드에서의 내부 아미노기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 부동화된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, W0 제2005/047301호에 기재된 바대로 황계 친핵체와 고체 지지체와의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체 지지된 주형 폴리뉴클레오타이드의 더 추가의 예는 주형 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, W0 제00/31148호, W0 제01/01143호, W0 제02/12566호, W0 제03/014392호, 미국 특허 제6,465,178호 및 W000/53812호에 기재된 바대로 실리카 기반 또는 다른 고체 지지체에 지지된 하이드로겔에 부착되는 경우이다.
주형 폴리뉴클레오타이드가 부동화될 수 있는 특정한 표면은 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아마이드 하이드로겔은 상기 인용된 문헌 및 WO 제2005/065814호에 기재되어 있다.
DNA 주형 분자는 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 분야에 유용할 수 있다. 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 비드 라이브러리가 제조될 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이의 생성 방법은 문헌[Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드를 사용한 이러한 비드의 어레이의 서열분석은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
서열분석되는 주형(들)은 고체 지지체에서 "어레이"의 일부를 형성할 수 있고, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터링된 어레이 및 비드 어레이를 포함하는 고밀도 어레이의 모든 타입에 적용 가능하다. 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 고체 지지체 상의 핵산 분자의 부동화에 의해 형성된 것(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 본질적으로 임의의 타입의 어레이에서의 주형을 서열분석하기 위해 사용될 수 있다.
그러나, 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드는 클러스터링된 어레이의 서열분석의 맥락에서 특히 유리하다. 클러스터링된 어레이에서, (대개 부위 또는 특징이라 칭하는) 어레이 상의 구별되는 영역은 다수의 폴리뉴클레오타이드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 다수의 폴리뉴클레오타이드 분자는 개별적으로 광학 수단에 의해 해상 가능하지 않고, 대신에 앙상블로서 검출된다. 어떻게 어레이가 형성되는지에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 카피(예를 들어, 부위는 특정한 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 종에 균일함) 또는 심지어 적은 수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 카피(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 카피)를 포함할 수 있다. 핵산 분자의 클러스터링된 어레이는 당해 분야에 일반적으로 공지된 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예로서, WO 제98/44151호 및 WO 제00/18957호(이들의 각각은 본 명세서에서 원용됨)는 부동화된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 이루어진 어레이를 형성하도록 주형 및 증폭 산물 둘 다가 고체 지지체 상에 부동화된 채 있는 핵산의 증폭의 방법을 기재한다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이에 존재하는 핵산 분자는 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된변형된 뉴클레오타이드를 사용하는 서열분석에 적합한 주형이다.
본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드는 또한 단일 분자 어레이에서의 주형의 서열분석에서 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단일 분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위로 분포된(또는 어레이된) 폴리뉴클레오타이드 분자의 집단을 의미하고, 여기서 집단의 모든 기타로부터의 임의의 개별 폴리뉴클레오타이드의 간격은 개별 폴리뉴클레오타이드 분자를 개별적으로 해상할 수 있게 하는 것이다. 고체 지지체의 표면에 부동화된 표적 핵산 분자는 따라서 몇몇 실시형태에서 광학 수단에 의해 해상될 수 있다. 이것은 각각 하나의 폴리뉴클레오타이드를 나타내는 하나 이상의 구별되는 신호가 사용된 특정한 영상화 장치의 해상 가능한 영역 내에 발생한다는 것을 의미한다.
어레이에서의 인접한 폴리뉴클레오타이드 분자 사이의 공간이 적어도 100㎚, 더 특히 적어도 250㎚, 훨씬 더 특히 적어도 300㎚, 훨씬 더 특히 적어도 350㎚인 단일 분자 검출이 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 단일 분자 형광성 점으로서 개별적으로 해상 가능하고 검출 가능하고, 상기 단일 분자 형광성 점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광퇴색(photobleaching)을 나타낸다.
용어 "개별적으로 해상된" 및 "개별 해상"은, 시각화될 때, 이웃하는 분자로부터 어레이에서의 하나의 분자를 구별할 수 있다는 것을 기술하도록 본 명세서에 사용된다. 어레이에서의 개별 분자 사이의 분리는 부분적으로 개별 분자를 해상하기 위해 이용된 특정한 기법에 의해 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 공개 출원 WO 제00/06770호 및 WO 제01/57248호를 참조하여 이해될 것이다. 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드의 하나의 용도가 합성에 의한 서열분석 반응에 있더라도, 변형된 뉴클레오타이드의 유용성은 이러한 방법으로 제한되지 않는다. 사실, 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드로 도입된 뉴클레오타이드에 부착된 형광성 표지의 검출을 요하는 임의의 서열분석 방법론에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드는 자동화 형광성 서열분석 프로토콜, 특히 생어(Sanger) 및 동료의 사슬 종결 서열분석 방법에 기초한 형광단-종결자 사이클 서열분석에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 프라이머 연장 서열분석 반응에서 사이클 서열분석 및 효소를 사용한다. 소위 생어 서열분석 방법, 및 관련된 프로토콜(생어-타입)은 표지된 다이데옥시뉴클레오타이드를 갖는 무작위화된 사슬 종결을 이용한다.
본 개시내용은 또한 형광단으로 표지된 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가의 성분에 의해 함께 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 것이다. 추가의 성분(들)은 상기 기재된 방법 또는 하기 실시예 부문에서 확인된 하나 이상의 성분일 수 있다. 본 개시내용의 키트로 조합될 수 있는 성분의 몇몇 비제한적인 예는 하기 기재되어 있다.
특정한 실시형태에서, 키트는 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드에 의해 함께 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 비표지된 또는 네이티브 뉴클레오타이드 및/또는 형광으로 표지된 뉴클레오타이드 또는 임의의 이들의 조합과 조합되어 공급될 수 있다. 따라서, 키트는 본 개시내용에 따라 염료에 의해 표지된 변형된 뉴클레오타이드 및 다른, 예를 들어, 선행 기술 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 조합은 별개의 개별 성분(예를 들어, 용기 또는 관마다 하나의 뉴클레오타이드 타입)으로서 또는 뉴클레오타이드 혼합물(예를 들어, 동일한 용기 또는 관에서 혼합된 2개 이상의 뉴클레오타이드)로서 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된 복수, 특히 2개, 더 특히 4개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 염료 화합물 없이 어둡게 될 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드가 상이한 염료 화합물로 표지되는 경우, 키트의 특징은 상기 염료 화합물이 분광학적으로 구별 가능한 형광단이라는 것이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "분광학적으로 구별 가능한 형광단"은, 2개 이상의 이러한 염료가 하나의 샘플에 존재할 때, 형광성 검출 설비(예를 들어, 상업용 모세관 기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광성 에너지를 방출하는 형광단을 의미한다. 형광단 화합물로 표지된 2개의 변형된 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 때, 몇몇 실시형태의 특징은 분광학적으로 구별 가능한 형광단이, 예를 들어, 동일한 레이저에 의해 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이다. 형광단 화합물로 표지된 4개의 변형된 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 때, 몇몇 실시형태의 특징은 분광학적으로 구별 가능한 형광단 중 2개가 둘 다 하나의 파장에서 여기될 수 있고, 다른 2개의 분광학적으로 구별 가능한 염료가 둘 다 또 다른 파장에서 여기될 수 있다는 것이다. 특정한 여기 파장은 532㎚, 630㎚ 내지 700㎚, 특히 660㎚이다.
일 실시형태에서, 키트는 본 개시내용의 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드 및 제2 염료에 의해 표지된 제2 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 염료는 적어도 10㎚, 특히 20㎚ 내지 50㎚의 흡광도 최대에서의 차이를 갖는다. 더 특히, 2개의 염료 화합물은 15 내지 40㎚의 스토크스(Stokes) 쉬프트를 갖고, 여기서 "스토크스 쉬프트"는 피크 흡수와 피크 방출 파장 사이의 거리이다.
추가의 실시형태에서, 키트는 형광단으로 표지된 2개의 다른 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 염료는 488㎚ 내지 550㎚, 특히 532㎚에서 동일한 레이저에 의해 여기된다. 염료는 적어도 10㎚, 특히 20㎚ 내지 50㎚의 흡광도 최대의 차이를 가질 수 있다. 더 특히, 2개의 염료 화합물은 20 내지 40㎚의 스토크스 쉬프트를 가질 수 있다. 훨씬 더 특히, 2개의 염료 화합물은 640㎚ 미만, 특히 600㎚ 미만의 상이한 흡광도 최대를 가질 수 있다. 본 개시내용의 폴리메틴 염료로부터 분광학적으로 구별되고 상기 기준을 충족시키는 특정한 염료는 미국 특허 제5,268,486호(예를 들어, Cy3) 또는 WO 제0226891호(Alexa 532; Molecular Probes A20106)에 기재된 바와 같은 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 바와 같은 비대칭 폴리메틴이다. 대안적인 염료는 로다민 유사체, 예를 들어, 테트라메틸 로다민 및 이의 유사체를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, 본 개시내용의 키트는 동일한 염기가 2개의 상이한 화합물로 표지된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오타이드는 제1 형광성 화합물, 예를 들어, 650㎚ 초과에서 흡수하는 '적색' 형광단으로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오타이드는 분광학적으로 구별되는 화합물, 예를 들어, 600㎚ 미만에서 흡수하는 '녹색' 형광단으로 표지될 수 있다. 제3 뉴클레오타이드는 제1 형광단 및 분광학적으로 구별되는 화합물의 혼합물로서 표지될 수 있고, 제4 뉴클레오타이드는 '어둡고', 표지를 함유하지 않을 수 있다. 단순한 조건에서 따라서 뉴클레오타이드 1 내지 4는 '녹색', '적색', '적색/녹색' 및 어둡게 표지될 수 있다. 기기장치를 더 단순화하도록, 4개의 뉴클레오타이드는 단일 레이저에 의해 여기된 2가지 염료로 표지될 수 있고, 따라서 뉴클레오타이드 1 내지 4의 표지는 '적색 1', '적색 2"적색 1/적색 2', 및 어둠 또는 '녹색 1', '녹색 2"녹색 1/녹색 2' 및 어둡게일 수 있다.
키트가 상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오타이드를 갖는 구성과 관련하여 상기 예시되어 있지만, 키트가 동일한 염료 화합물을 갖는 2, 3, 4개 이상의 상이한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다고 이해돌 것이다.
특정한 실시형태에서, 키트는 폴리뉴클레오타이드로의 변형된 뉴클레오타이드의 도입을 촉매화할 수 있는 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 이러한 키트에 포함되는 다른 성분은 완충제 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드 및 상이한 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 다른 임의의 뉴클레오타이드 성분은 사용 전 희석되는 농축된 형태로 키트에 제공될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 적합한 희석 완충제를 또한 사용할 수 있다. 다시, 본 명세서에 기재된 방법에서 확인된 하나 이상의 성분은 본 개시내용의 키트에 포함될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 것처럼, 단수 형태의 표현은, 달리 명확히 그리고 모호하지 않게 하나의 지시대상으로 제한되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 주목한다. 본 개시내용의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변경이 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태가 첨부된 청구항 및 이의 균등물의 범주 내에 다른 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다.
실시예
추가적인 실시형태는 하기 실시예에서 추가로 자세히 개시되어 있고, 이 실시예는 어떤 방식으로도 청구항의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1. 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 합성
Figure pat00035
반응식 1: 2개의 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 합성의 예(pppT-sPA-Fl 및 pppT-sPA2-Fl, 식 중 Fl은 형광단임)
중간체 L2의 합성
출발 재료 L1(1.07g, 4m㏖)을 무수 DMF(15㎖)에 용해시키고, 이어서 빙욕에 0℃에서 질소 하에 두었다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(884㎕, 4.8m㏖), 이어서 PyBOP(2.29g, 4.4m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 N-(5-아미노펜틸)-2,2,2-트라이플루오로아세트아마이드, 트라이플루오로아세테이트염(1.5g, 4.8m㏖), 이어서 N,N-다이아이소프로필에틸아민(1㎖, 5.4m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 빙욕으로부터 제거하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100㎖)에 용해시켰다. 용액을 3×100㎖의 희석된 수성 KHSO4(pH=1), 1×50㎖의 물, 2×100㎖의 포화 수성 NaHCO3로 추출하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물을 실리카겔 상에서의 플래시 크로마토그래피(DCM 중의 에틸 아세테이트의 선형 구배, 50% 내지 100%)에 의해 정제시켰다. L2는 깨끗한 점성의 오일(1.60g, 3.59m㏖, 90%)로서 단리되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7.45 (m, 1H, Ar CH), 7.33 (m, 2H, Ar CH), 7.07 (m, 2H, Ar CH, NH), 6.57 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 4.85 (t, J = 4.9 Hz, 1H, CH-N3), 4.22 (dd, J = 10.4, 5.1 Hz, 1H, CH2-OAr), 4.16 (dd, J = 10.5, 4.7 Hz, 1H, CH2-OAr), 4.00 (ddd, J = 10.1, 4.9, 2.9 Hz, 1H, CH2-O), 3.83 (m, 2H, CH2-OH), 3.75 (ddd, J = 9.8, 6.6, 3.0 Hz, 1H, CH2-O), 3.45 (q, J = 6.7 Hz, 2H, CH 2 -NH), 3.36 (q, J = 6.6 Hz, 2H, CH 2 -NH), 2.78 (t, J = 6.2 Hz, 1H, OH), 1.65 (m, 4H, CH 2 -CH2-NH), 1.41 (p, J = 7.4, 6.9 Hz, 2H, CH 2 -CH2-CH2-NH). 19F NMR (376.5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75.7. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) 167.5 (s), 158.2 (s), 137.5 (s), 135.9 (s), 129.7 (d), 128.2 (d), 119.6 (d), 118.5 (d), 113.2 (d), 89.9 (d), 71.4 (t), 69.4 (t), 61.6 (t), 39.7 (t), 39.4 (t), 29.0 (t), 28.1 (t), 23.6 (t). LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 446 (M-H+); (+ve) m/z 448 (M+H+), 470 (M+Na+).
링커 sPA LN3 TFA의 합성
알코올 L2(500㎎, 1.12m㏖)를 아세토나이트릴(15㎖)에 용해시키고, 이어서 이것에 TEMPO(70㎎, 0.448m㏖)를 첨가하였다. NaH2PO4
Figure pat00036
2H2O(1.1g, 7.2m㏖) 및 NaClO2(405㎎, 4.48m㏖)를 10㎖의 물에 용해시키고, 반응물에 첨가하였다. 이어서, 수성 NaClO(14.5% 이용 가능한 염소, 1.32㎖, 2.24m㏖)를 첨가하였으며, 용액이 즉시 어두운 갈색으로 변했다. 반응물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 이 시간 동안, 갈색의 색상이 오렌지색으로 옅어졌다. 반응물이 무색으로 변할 때까지, 농축 수성 Na2S2O3로 반응 중지시켰다. 아세토나이트릴을 감압 하에 증발시키고, 용액을 20㎖의 물로 희석시키고, 트라이에틸아민(대략 1㎖)으로 염기성화시켰다. 용액을 10㎖의 에틸 아세테이트로 추출하고, 수성 상을 감압 하에 농축시켰다. 미정제 sPA LN3 TFA를 C18 상에서의 역상 크로마토그래피(수중 아세토나이트릴의 선형 구배, 0% 내지 30%)에 의해 정제시켜, 깨끗한 오일(438㎎, 0.95m㏖, 85%)로서 단리시켰다. RP-HPLC: tR = 17.9분(5 내지 50%의 0.1M TEAB/아세토나이트릴, YMC-C18 분석 칼럼에서). 1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ (ppm) 8.03 (br s, 1H, NH), 7.63 (s, 1H, NH), 7.54 (s, 1H, Ar), 7.42 (d, J = 7.7 Hz, 1H, Ar), 7.34 (t, J = 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar), 5.10 (m, 1H, CH-N3), 4.35 (dd, J = 10.9, 3.7 Hz, 1H, CH2O), 4.18 (dd, J = 10.8, 6.1 Hz, 1H, CH2O), 4.09 (m, 2H, CH2O), 3.32 (m, 2H, CH 2 -NH), 3.27 (m, 2H, CH 2 -NH), 3.02 (q, J = 7.3 Hz, 2H, Et3N), 1.60 (m, 4H, CH 2 -CH2-NH), 1.39 (m, 2H, CH 2 -CH2-CH2-NH), 1.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H, Et3N). 19F NMR (376.5 MHz, CD3CN): δ (ppm) -76.5. 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ (ppm) 173.1 (s), 170.0 (s), 159.9 (s), 137.5 (s), 131.0 (d), 125.7 (d), 121.4 (d), 119.2 (d), 114.5 (d), 90.8 (d), 70.5 (t), 66.7 (t), 41.0 (t), 40μ.8 (t), 30.2 (t), 29.7 (t), 25.4 (t). LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 460 (M-H+). (+ve) m/z 484 (M+Na+), 561 (M+Et3NH+)
중간체 L3의 합성
출발 재료 L1(658㎎, 2.46m㏖)을 무수 DMF(10㎖)에 용해시키고, 이어서 빙욕에 0℃에서 질소 하에 두었다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(544㎕, 2.95m㏖), 이어서 PyBOP(1.41g, 2.71m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 0℃에서 20분 동안 교반하고, 이어서 N-(2-아미노에틸)-2,2,2-트라이플루오로아세트아마이드, 트라이플루오로아세테이트염(796㎎, 2.95m㏖), 이어서 N,N-다이아이소프로필에틸아민(589㎕, 3.2m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 빙욕으로부터 제거하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100㎖)에 용해시켰다. 용액을 3×100㎖의 희석된 수성 KHSO4(pH=1), 1×50㎖의 물, 2×100㎖의 포화 수성 NaHCO3로 추출하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물을 실리카겔 상에서의 플래시 크로마토그래피(DCM 중의 에틸 아세테이트의 선형 구배, 50% 내지 100%)에 의해 정제시켜, 점성의 오일(0.91g, 2.24m㏖, 91%)로서 단리시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8.19 (br s, 1H, NH), 7.39 (d, J = 1.7 Hz, 1H, Ar CH), 7.38 - 7.30 (m, 2H, Ar), 7.24 (t, J = 5.5 Hz, 1H, Ar CH), 7.07 (dt, J = 7.2, 2.1 Hz, 1H, Ar CH), 4.84 (t, J = 4.9 Hz, 1H, CH-N3), 4.20 (dd, J = 10.5, 5.1 Hz, 1H, CH2-OAr), 4.15 (dd, J = 6.0, 4.5 Hz, 1H, CH2-OAr), 4.00 (ddd, J = 10.2, 4.8, 3.0 Hz, 1H, CH2-O), 3.88 - 3.79 (m, 2H, CH2-OH), 3.74 (ddd, J = 9.8, 6.4, 3.2 Hz, 1H, CH2-O), 3.65 (m, 2H, CH 2 -NH), 3.58 (m, 2H, CH 2 -NH), 2.82 (t, J = 5.6 Hz 1H, OH). 19F NMR (376.5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75.9. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 404 (M-H+); (+ve) m/z 406 (M+H+), 428 (M+Na+)
sPA2 LN3 TFA의 합성
알코올 L3(230㎎, 0.567m㏖)을 아세토나이트릴(10㎖)에 용해시키고, 이어서 이것에 TEMPO(35㎎, 0.27m㏖)를 첨가하였다. NaH2PO4
Figure pat00037
2H2O(575㎎, 3.68m㏖) 및 NaClO2(205㎎, 2.26m㏖)를 10㎖의 물에 용해시키고, 반응물에 첨가하였다. 이어서 수성 NaClO(14.5% 염소 함량, 0.671㎖, 1.13m㏖)를 첨가하였으며, 용액이 즉시 어두운 갈색으로 변했다. 반응물을 실온에서 18시간 교반하였다. 이 시간 동안, 갈색의 색상은 오렌지색으로 옅어졌다. 반응물이 무색으로 변할 때까지, 농축 수성 Na2S2O3로 반응을 중지시켰다. 아세토나이트릴을 감압 하에 증발시키고, 용액을 10㎖의 물로 희석시키고, 트라이에틸아민(대략 0.6㎖)으로 염기성화시키고, 10㎖의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 상을 감압 하에 농축시켰다. 미정제 sPA2 LN3 TFA를 C18 상에서의 역상 크로마토그래피(수중 아세토나이트릴의 선형 구배, 0% 내지 20%)에 의해 정제시켜, 깨끗한 오일(트라이에틸암모늄염으로서 224mg, 0.43m㏖, 77%)로서 단리시켰다. RP-HPLC: tR = 17.9분(5% 내지 40%의 0.1M TEAB/아세토나이트릴 구배, YMC-C18 분석 칼럼에서). 1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ (ppm) 8.52 (br s, 1H, NH), 8.34 (br s, 1H, NH), 7.77 (s, 1H, Ar), 7.49 (dt, J = 7.7, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.38 (t, J = 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.10 (ddd, J = 8.2, 2.6, 1.0 Hz, 1H, Ar), 5.14 (dd, J = 6.7, 3.4 Hz, 1H, CH-N3), 4.48 (dd, J = 11.5, 3.4 Hz, 1H, CH2O), 4.20 (dd, J = 11.5, 6.7 Hz, 1H, CH2O), 4.11 (d, J = 1.4 Hz, 2H, CH2O), 3.66 - 3.42 (m, 4H, CH 2 -NH), 3.05 (q, J = 7.3 Hz, 5H, Et3N), 1.22 (t, J = 7.3 Hz, 8H, Et3N). 19F NMR (376.5 MHz, CD3CN): δ (ppm) -76.3. 13C NMR (101 MHz, CD3CN): δ (ppm) 173.1 (s), 166.9 (s), 157.6 (s), 135.7 (s), 129.3 (d), 120.0 (d), 118.0 (d), 117.0 (s), 112.1 (d), 88.4 (d), 68.8 (t), 67.6 (t), 45.1 (t), 39.2 (t), 38.4 (t), 7.5 (q). LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 418 (M-H+).
pppT-sPA 및 pppT-sPA2의 일반적인 합성
링커(sPA-LN3-TFA 또는 sPA2-LN3-TFA, 0.089m㏖)를 2×2㎖의 무수 N,N'-다이메틸포름아마이드(DMF)와 공증발시키고, 이어서 2㎖의 무수 DMF에 용해시켰다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(33㎕, 0.178m㏖), 이어서 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 32㎎, 0.106m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 한편, 트라이포스페이트 PA-TTP(0.1m㏖)의 수용액을 증발시켜 감압 하에 건조시키고, 수중 300㎕의 0.1M 트라이에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB) 용액에 재현탁시켰다. 링커 용액을 트라이포스페이트에 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 1㎖의 메탄올 및 3㎖의 수성 수산화암모늄 33%에 용해시켰다. 용액을 실온에서 7시간 동안 교반하고, 이어서 증발 건조시켰다. 미정제물을 0.1M TEAB 및 아세토나이트릴에 의해 용리되는 YMC-Pack-Pro C18 칼럼을 사용하여 분취용 스케일 RP-HPLC에 의해 정제시켰다. pppT-sPA: 수율: 67%. RP-HPLC: tR = 16.9분(5% 내지 35%의 0.1M TEAB/아세토나이트릴 구배, YMC-C18 분석 칼럼에서). LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 922 (M-H+), 461 (M-2H+). pppT-sPA2: 수율: 65%. RP-HPLC: tR = 17.5분(5% 내지 30%의 0.1M TEAB/아세토나이트릴, YMC-C18 분석 칼럼에서). LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 880 (M-H+), 440 (M-2H+).
pppT-sPA-Fl 및 pppT-sPA2-Fl의 일반적인 합성
형광단 카복실레이트(Fl, 0.0105m㏖)를 2×2㎖의 무수 N,N'-다이메틸포름아마이드(DMF)와 공증발시키고, 이어서 2㎖의 무수 N,N'-다이메틸아세트아마이드 DMA에 용해시켰다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(15㎕, 0.084m㏖), 이어서 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 0.012m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 45분 동안 교반하였다. 한편, 트라이포스페이트 pppT-sPA 또는 pppT-sPA2(0.084m㏖)의 수용액을 증발시켜 감압 하에 건조시키고, 수중 300㎕의 0.1M 트라이에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB) 용액에 재현탁시켰다. 형광단-NHS 에스터 용액을 트라이포스페이트에 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 미정제물을 (0.1M TEAB 내지 1M TEAB의 구배, 20% 아세토나이트릴에 의해) DEAE-Sephadex 상에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 그리고 분취용 스케일 RP-HPLC(YMC-Pack-Pro C18 칼럼, 0.1M TEAB 및 아세토나이트릴로 용리)에 의해 정제시켰다.
N -(아미노알킬)-2,2,2-트라이플루오로아세트아마이드의 일반적인 합성
Figure pat00038
반응식 2: N-트라이플루오로아세트아미도-다이아민의 일반적인 합성.
tert-부틸 (아미노알킬)카바메이트(48m㏖)를 무수 DCM(60㎖)에 용해시키고, 빙욕에 질소 하에 두었다. 트라이에틸아민(103m㏖), 이어서 트라이플루오로아세트산 무수물(53m㏖)을 적하하였다. 반응물을 빙욕으로부터 제거하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 200㎖의 DCM으로 희석시키고, 2×200㎖의 포화 수성 NaHCO3로 추출하였다. 유기 상을 무수 MgSO4 위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제물을 실리카겔(석유 에터/에틸 아세테이트 3:7) 상에서의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
tert-부틸 ( 5-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)펜틸)카바메이트 (n=5): 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 6.40 (br s, 1H, NH), 4.49 (br s, 1H, NH), 3.30 (q, J = 6.8 Hz, 2H, CH 2 -NH), 3.06 (q, J = 6.6 Hz, 2H, CH 2 -NH), 1.56 (p, J = 7.2 Hz, 2H, CH 2- CH2-NH), 1.45 (p, J = 7.0 Hz, 2H, CH 2- CH2-NH), 1.37 (m, 9H, CH3), 1.31 (m, 2H, CH 2- CH2-CH2-NH). 19F NMR (376.5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75.8.
tert-부틸 ( 2-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)에틸)카바메이트 (n=2): 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7.72 (br s, 1H, NH), 4.86 (br s, 1H, NH), 3.39 (m, 2H, CH2-NH), 3.31 (m, 2H, CH2-NH), 1.38 (s, 9H, CH3). 19F NMR (376.5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -76.1.
tert-부틸 (2-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)알킬)카바메이트(44m㏖)를 무수 DCM(40㎖) 및 트라이플루오로아세트산(40㎖)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 교반하고, 1시간 동안 공기에 개방하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 물에 용해시키고, 50㎖의 DCM으로 추출하고, 이어서 수성 상을 증발 건조시켰다. 잔류물을 100㎖의 에탄올 및 4×100㎖의 아세토나이트릴과 공증발시켰다.
N -(5-아미노펜틸)-2,2,2-트라이플루오로아세트아마이드(n=5): 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) 9.44 (br s, 1H, NH), 7.75 (br s, 3H, NH), 3.17 (q, J = 6.7 Hz, 2H, CH 2 -NH), 2.77 (m, 2H, CH 2 -NH), 1.57-1.45 (m, 4H, CH 2- CH2-NH), 1.29 (m, 2H, CH 2 -CH2-CH2-NH). 19F NMR (376.5 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) -74.4, -74.7.
N -(2-아미노에틸)-2,2,2-트라이플루오로아세트아마이드(n=2): 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) 9.58 (br t, 1H, NHCO), 8.04 (br s, 3H, NH), 3.45 (m, 2H, CH2NHCO), 2.98 (m, 2H, CH2NH). 19F NMR (376.5 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) -74.0, -74.4.
실시예 2. SBS 서열분석에서의 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 사용
짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드의 서열분석 성능은 표준 절단 가능한 링커에서 동일한 형광성 기를 함유한 표준 SBS 뉴클레오타이드의 것과 비교되었다. 2-채널 SBS 서열분석에 적합한 형광단으로 표지된 4개의 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드(2개의 A, C, T)(도 3), 및 어두운 G는 DNA 폴리머라제 및 도입 완충제를 포함하는 용액에 포함되고, 각각 150회 사이클의 2의 판독에서 서열에 대한 2-채널 변형된 Hiseq(등록상표) 또는 2-채널 변형된 Miseq(등록상표)에서 사용되었다. 서열분석 메트릭(예를 들어, 페이징(phasing), 프리페이징(prephasing), 백분율 오차율 및 백분율 Q30)은 동일한 조건(예를 들어, 도입 온도, 도입 시간, 폴리머라제, 주형 라이브러리) 하에 모든 4개의 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드 또는 모든 표준 뉴클레오타이드를 사용하여 수행된 실험 사이에 비교되었다. 결과는 도 4A 내지 도 4C 및 도 5A 및 5B에 도시되어 있다.
도 4A 내지 도 4C는 50℃ 도입 온도 및 10초 도입 시간을 이용하여 2개의 상이한 폴리머라제(PolA 및 PolB) 및 2개의 상이한 주형 라이브러리(PhiX 및 인간)에 의해 2-채널 변형된 Hiseq(등록상표)에서 표준 및 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드에 의해 관찰된 서열분석 메트릭(페이징, 예비페이징, 오차율%, Q30%)의 예를 나타낸다. 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드를 사용할 때, 페이징 및 오차율(%)의 감소 및 Q30(%)의 증가가 사용된 폴리머라제 또는 주형에서 독립적으로 관찰되었다.
도 5A 및 도 5B는, 상이한 도입 시간을 허용하는, PhiX 주형에서 60℃ 도입 온도에서의 2-채널 변형된 Miseq(등록상표)에서 표준 또는 짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드에 의해 관찰된 서열분석 메트릭(페이징 및 오차율%)의 예를 나타낸다.
짧은 펜던트 아암 뉴클레오타이드는 백분율 오차율에 대한 상당한 영향 없이 도입 시간의 대략 50% 감소를 허용하였다. 시험된 가장 짧은 도입 시간(10+5초)에서, 백분율 오차율은, 표준 뉴클레오타이드에 의한 2.5% 오차율에 비해서, 여전히 1% 미만이었다.

Claims (25)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pat00039

    식 중, B는 뉴클레오사이드 염기이고;
    Fl은 형광단이고;
    B가 퓨린 뉴클레오사이드 염기일 때 B는 8번 위치에서 부착되고, B가 피리미딘 뉴클레오사이드 염기일 때 B는 5번 위치에서 부착되는 것인, 화합물.
  2. 제1항에 있어서, B는 뉴클레오타이드 염기인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, B는 피리미딘 염기인, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (c) 또는 화학식 (t)를 갖는, 화합물:
    Figure pat00040

    Figure pat00041

    식 중, P는 트라이포스페이트기이고;
    Fl은 형광단이다.
  5. 제2항에 있어서, B는 7-데아자퓨린 염기인, 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (a)를 갖는, 화합물:
    Figure pat00042

    식 중, P는 트라이포스페이트기이고;
    Fl은 형광단이다.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단이 알킬 사슬 링커를 포함하는 것인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 알킬 사슬 링커는 하나 이상의 헤테로원자 치환을 갖고/갖거나, 아미드 또는 에스테르기를 포함하고/하거나, 아릴기, 선택적으로 트라이아졸기를 포함하는 것인, 화합물.
  9. 올리고뉴클레오타이드에 부착된 제2항에 따른 화합물을 포함하는 화합물.
  10. 제2항에 따른 화합물로 표지된 올리고뉴클레오타이드.
  11. 하기 화학식 (II)의 화합물:
    Figure pat00043

    식 중, B는 뉴클레오타이드 염기이고;
    B가 퓨린 뉴클레오타이드 염기일 때 B는 8번 위치에서 부착되고, B가 피리미딘 뉴클레오타이드 염기일 때 B는 5번 위치에서 부착되는 것인, 화합물.
  12. 제11항에 있어서, B는 피리미딘 염기인, 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (ci) 또는 화학식 (ti)를 갖는, 화합물:
    Figure pat00044

    Figure pat00045

    식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이다.
  14. 제11항에 있어서, B는 7-데아자퓨린 염기인, 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (ai)를 갖는, 화합물:
    Figure pat00046

    식 중, Oln은 올리고뉴클레오타이드이다.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 2개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  18. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 10개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  19. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 100개 이상의 카피를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  20. 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트로서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물인 표지된 뉴클레오타이드인, 키트.
  21. 제20항에 있어서, 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물인 표지된 뉴클레오타이드인, 키트.
  22. 제20항에 있어서, 4개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물인 표지된 뉴클레오타이드인, 키트.
  23. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 사용을 포함하는, 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 단백질 결합 검정, 또는 이들의 조합을 수행하는 방법.
  24. 제10항에 따른 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 단백질 결합 검정, 또는 이들의 조합을 수행하는 방법.
  25. 제16항에 따른 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 단백질 결합 검정, 또는 이들의 조합을 수행하는 방법.
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