KR20030032924A - 포스포로티오에이트 트리에스테르의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포스포로티오에이트 트리에스테르의 합성 방법에 관한다. 본 방법은 커플링제 및 황 전달제를 포함하는 용액 존재하에 H-포스포네이트와 알콜을 커플링시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, H-포스포네이트 및 알콜은 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드이다.
Description
본 발명은 포스포로티오에이트 트리에스테르, 특히 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트를 합성하는 방법에 관한다.
과거 15년 정도 전에는 올리고디옥시리보누클레오티드, 올리고리보누클레오티드 및 이들의 유사체의 합성 개발에 많은 진전이 있었다. DNA 및 RNA 서열의 치료적 응용에 대한 관심 증대는 이 물질의 대량 생산에 대한 요구 증대를 이끌었고 올리고누클레오티드 합성의 대규모화에 많은 노력이 있어 왔다. 실제로 이러한 작업 모두는 보다 큰 합성기의 건축 및 고체 지지체 상의 동일한 포스포르아미디트 화학을 사용하는 것을 포함하였다. 올리고누클레오티드의 합성에 대한 다른 절차는 국제 특허 출원 제WO99/09041호에 기술되어 있다. 기술된 절차는 용액내 순차적 커플링 및 황 전달 단계를 사용한다.
본 발명의 제1의 양상은 커플링제 존재하에 H-포스포네이트를 알콜과 커플링시켜 H-포스포네이트 디에스테르를 얻고 이어서 H-포스포네이트 디에스테르를 황 전달제와 반응시켜 포스포로티오에이트 트리에스테르를 얻는 것을 포함하는 포스포로티오에이트 트리에스테르의 제조 방법을 제공하며 이것은 H-포스포네이트 및 알콜 간의 커플링 반응이 황 전달제의 존재하에 일어나는 것을 특징으로 한다.
다수의 바람직한 구체예에서 이 반응은 하기 반응 도식의 예에서 보여지는 바와 같이 순차적으로 진행되어 H-포스포네이트는 커플링제 존재하에 알콜과 반응하고 제자리에서 생성된 H-포스포네이트 디에스테르는 역시 존재하는 황 전달제와 신속히 반응하는 것으로 고려된다:
[식중, Z, Z' 및 Z"은 독립적으로 보호 그룹을 나타내고 B 및 B'은 독립적으로 누클레오염기, 각 Y는 독립적으로 H, O-알킬, O-알케닐, O-보호 그룹, C-알킬 또는 C-알케닐임.
본 발명 방법에 사용된 H-포스포네이트는 보호된 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 H-포스포네이트 또는 바람직하게는 5' 또는 3' H-포스포네이트 관능, 특히 바람직하게는 3 'H-포스포네이트 관능을 포함하는 이들의 유사체인 것이 유리하다. 바람직한 누클레오시드는 2'-데옥시리보누클레오시드 및 리보누클레오시드드이고 바람직한 올리고누클레오티드는 올리고데옥시리보누클레오티드 및 올리고리보누클레오티드이다.
H-포스포네이트가 3' H-포스포네이트 관능을 포함하는 보호된 데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 올리고리보누클레오티드 유도체일 경우, 5' 하이드록시 관능은 적당한 보호 그룹으로 보호되는 것이 유리하다. 이러한 적당한 보호 그룹의 예에는 산 불안정 보호 그룹, 특히 트리틸 및 치환된 트리틸 그룹, 이를테면 디메톡시트리틸 및 9-페닐크산텐-9-일 그룹 및 FMOC와 같은 염기 불안정-보호 그룹이 포함된다.
H-포스포네이트 빌딩 블록이 5' H-포스포네이트 관능을 포함하는 보호된 데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 올리고리보누클레오티드 유도체일 경우, 3' 하이드록시 관능은 적당한 보호 그룹으로 보호되는 것이 유리하다. 적당한 보호 그룹은 3' H-포스포네이트 빌딩 블록의 5' 하이드록시 관능의 보호에 대하여 상기 기술한 것들 및 레불리노일 및 치환된 레불리노일과 같은 아실 그룹을 포함한다.
H-포스포네이트가 보호된 리보누클레오시드 또는 보호된 올리고리보누클레오티드일 경우, 2'-하이드록시 관능은 예를들어 산-불안정 아세틸 보호 그룹, 특히 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일(Fpmp) 또는 1-(2-클로로페닐)-4-에톡시피페리딘-4-일(Cpep)과 같은 1-(아릴)-4-알콕시피페리딘-4-일 그룹 및 트리알킬실일 그룹, 종종 t-부틸 메틸실일 그룹과 같은 트리(C1-4-알킬)실일 그룹과 같은 적당한 보호 그룹에 의하여 보호되는 것이 유리하다. 이와는 다르게, 리보누클레오시드 또는 올리고리보누클레오티드는 2' 위치가 더이상의 보호를 필요로 하지 않는 2'-O-알킬, 2'-O-알콕시알킬 또는 2'-O-알케닐 유도체, 통상적으로 C1-4-알킬, C1-4-알콕시C1-4-알킬 또는 알테닐 유도체일 수 있을 것이다. 본 발명 방법에 사용할 수있는 누클레오시드 및 올리고누클레오티드 유사체의 H-포스포네이트에는 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-C-알킬 및 2'-C-알케닐 치환된 누클레오시드 및 올리고누클레오티드 유도체가 포함된다.
본 발명 방법에 사용할 수 있는 다른 H-포스포네이트는 다른 다관능 알콜, 특히 알킬 알콜 및 바람직하게는 디올 또는 트리올에서 유도된다. 알킬 디올의 예에는 에탄-1,2-디올 및 분자량이 400 이하인 것들과 같은 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)이 포함된다. 알킬 트리올의 예에는 글리세롤 및 부탄 트리올이 포함된다. 통상적으로 단일 H-포스포네이트 관능만이 존재할 것이고 나머지 하이드록시 그룹은 리보누클레오시드의 5' 또는 2' 위치의 보호에 대하여 상기 기술한 것들과 같은 적당한 보호 그룹으로 보호된다.
본 발명 방법에 사용되는 알콜은 통상적으로 유리 하이드록시 그룹, 바람직하게는 유리 3' 또는 5' 하이드록시 그룹 및 특히 바람직하게는 5' 하이드록시 그룹을 포함하는 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드이다.
알콜이 보호된 누클레오시드 또는 보호된 올리고누클레오티드일 경우, 바람직한 누클레오시드는 데옥시리보누클레오시드 및 리보누클레오시드이고 바람직한 올리고누클레오티드는 올리고데옥시리보누클레오티드 및 올리고리보누클레오티드이다.
알콜이 유리 5'-하이드록시 그룹을 포함하는 데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 올리고리보누클레오티드일 경우, 3'-하이드록시 관능은 적당한 보호 그룹으로 보호되는 것이 유리하다. 이러한 보호 그룹의 예는 레불리노일 및 치환된 레불리노일 그룹과 같은 감마 케토산에서 유도된 것들과 같이 통상적으로 C16이하를 포함하는 아실 그룹 및 유사 그룹을 포함한다. 치환된 레불리노일 그룹에는 특히 5,5,5-트리플루오로레불리노일과 같은 5-할로-레불리노일이 포함되고 유사 그룹에는 예를들어 벤조일프로피오닐 그룹이 포함된다. 기타의 이러한 보호 그룹에는 라우로일 그룹과 같이 특히 선형 또는 분지형 C6-16알카노일 그룹을 포함하는 지방산 알카노일 그룹; 벤조일 및 치환된 벤조일 그룹, 이를테면 알킬, 통상적으로 C1-4-알킬- 및 할로, 통상적으로 클로로 또는 플루오로 치환된 벤조일 그룹; 및 실일 에테르, 이를테면 알킬, 통상적으로 C1-4-알킬 및 아릴, 통상적으로 페닐, 실일 에테르, 특히 t-부틸 디메틸 실일 및 t-부틸 디페닐 실일 그룹이 포함된다.
알콜이 3'-하이드록시 그룹을 포함하는 보호된 데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 올리고리보누클레오티드일 경우, 5'-하이드록시 관능은 적당한 보호 그룹으로 보호되는 것이 유리하다. 적당한 보호 그룹은 데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오티드 및 올리고리보누클레오티드의 5' 하이드록시 그룹의 보호에 대하여 상기 기술한 것들이다.
알콜이 리보누클레오시드 또는 올리고리보누클레오티드일 경우, 2'-하이드록시 관능은 아세틸 보호 그룹, 특히 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일(Fpmp) 또는 1-(2-클로로페닐)-4-에톡시피페리딘-4-일(Cpep)과 같은 1-(아릴)-4-알콕시피페리딘-4-일 그룹 및 트리알킬실일 그룹, 종종 t-부틸 메틸실일 그룹과 같은 트리(C1-4-알킬)실일 그룹과 같은 적당한 보호 그룹에 의하여 보호되는 것이 유리하다. 이와는 다르게, 리보누클레오시드 또는 올리고리보누클레오티드는 2' 위치가 더이상의 보호를 필요로 하지 않는 2'-O-알킬, 2'-O-알콕시알킬 또는 2'-O-알케닐 유도체, 통상적으로 C1-4-알킬, C1-4-알콕시C1-4-알킬 또는 알테닐 유도체일 수 있을 것이다. 본 발명 방법에 사용할 수 있는 누클레오시드 및 올리고누클레오티드 유사체의 H-포스포네이트에는 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-C-알킬 및 2'-C-알케닐 치환된 누클레오시드 및 올리고누클레오티드 유도체가 포함된다.
본 발명 방법에 사용할 수 있는 다른 H-포스포네이트는 다른 다관능 알콜, 특히 알킬 알콜 및 바람직하게는 디올 또는 트리올에서 유도된다. 알킬 디올의 예에는 에탄-1,2-디올 및 분자량이 400 이하인 것들과 같은 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)이 포함된다. 알킬 트리올의 예에는 글리세롤 및 부탄 트리올이 포함된다. 통상적으로 단일 H-포스포네이트 관능만이 존재할 것이고 나머지 하이드록시 그룹은 리보누클레오시드의 5' 또는 2' 위치의 보호에 대하여 상기 기술한 것들과 같은 적당한 보호 그룹으로 보호된다. 그러나, 하나 이상의 하이드록시 그룹 상에 동일한 커플링을 이루고자 할 경우 하나 이상의 유리 하이드록시 그룹이 존재할 수 있을 것이다.
유리 하이드록시 그룹을 포함하는 올리고누클레오티드 H-포스포네이트 또는올리고누클레오티드 중 어느 하나 또는 둘다를 사용할 경우, 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 포스페이트 및 포스포로티오에이트 결합 모두를 포함할 수 있는 누클레오티드간 결합이 보호되는 것이 바람직하다. 이러한 보호 그룹의 예는 업계에 널리 공지되어 있는데 아릴 그룹, 메틸 또는 치환된 알킬 그룹, 바람직하게는 2-시아노에틸 그룹 및 알케닐 그룹이 포함된다.
본 발명 방법은 용액내에서 수행할 수 있다. 이러한 용액상 합성이 이용될 경우, 본 발명 방법에 사용될 수 있는 유기 용매는 할로알칸, 특히 디클로로메탄, 에스테르, 특히 에틸 아세테이트와 같은 알킬 에스테르 및 메틸 또는 에틸 프로피오네이트, 아미드, 이를테면 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 및 N,N'-디메틸이미다졸리돈 및 피리딘과 같은 염기성 친핵 용매를 포함한다. 커플링 및 황 전달 단계의 바람직한 용매는 피리딘, 디클로로메탄 및 이들의 혼합물, 특히 바람직하게는 피리딘이다. 사용되는 유기 용매는 바람직하게는 실질적으로 무수이다.
본 발명의 혹종의 구체예에서, H-포스포네이트 또는 알콜, 바람직하게는 알콜은 고체 지지체에 결합된다. 가장 바람직하게는, 고체 지지체에 결합된 알콜은 5'-위치에 유리 하이드록시 그룹을 가지는 누클레오시드 또는 누클레오티드이고 3'-위치를 통하여 고체 지지체에 결합된다. 사용될 수 있는 고체 지지체는 실질적으로 사용되는 용매에 불용성이고 올리고누클레오티드의 고체상 합성에 대하여 업계에 널리 공지된 지지체를 포함한다. 예에는 실리카, 조절된 공극 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐아세테이트와 같은 중합체 및 폴리스티렌-폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체와 같이 폴리스티렌을 포함하는 중합체가 포함된다. 또, 바란다면 펩티드의 고체상 합성에 더 통상적으로 사용되는 것들과 같은 폴리(아크릴아미드)지지체를 사용할 수 있을 것이다.
고체 지지체를 사용할 경우, 알콜 또는 H-포스포네이트, 가장 통상적으로는 알콜이 바람직하게는 3'-위치를 통하여 절단가능한 링커로 고체 지지체에 결합되는 것이 통상적이다. 사용할 수 있는 링커의 예에는 우레탄, 옥살일, 숙시닐 및 아미노-유도된 링커와 같이 올리고누클레오티드의 고체상 합성에 대하여 업계에 널리 공지된 것들을 포함한다.
본 발명 방법은 H-포스포네이트 또는 알콜, 각각 커플링제 및 황-전달제의 용액내 고체에 결합된 H-포스포네이트 또는 알콜의 슬러리를 교반시켜 수행할 수 있다. 이와는 다르게, 고체 지지체를 칼럼내에 패킹시켜 칼럼을 통해 H-포스포네이트, 커플링제 및 황-전달제의 용액을 통과시킬 수 있다.
H-포스포네이트 및 알콜이 모두 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드일 경우, 본 발명은 H-포스포네이트 커플링 반응을 기초로 하는 올리고데옥시리보누클레오티드, 올리고리보누클레오티드 및 이들의 유사체의 단계별 및 블록 합성에 대한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양상에 따르면, 3'-말단 H-포스포네이트 관능을 가지는 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드 및 5'-말단 하이드록시 관능을 가지는 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드를 적당한 커플링제 및 적당한 황-전달제의 존재하에 반응시키는데, 보호된 디누클레오시드 또는 올리고누클레오티드 H-포스포네이트 중간물이 생성되고 상기 중간물은 제자리 반응에 의하여 적당한 황-전달제로 황-전달을 거친다.
하이드록시 보호 그룹의 존재 외에, 본 발명에 사용되는 누클레오시드/누클레오티드내 존재하는 염기 또한 필요할 경우 적당한 보호 그룹에 의하여 보호되는 것이 바람직하다. 존재할 수 있는 유기 염기는 천연 및 비천연 누클레오염기와 같은 누클레오염기, 특히 퓨린, 이를테면 하이포크산틴 및 특히 A 및 G 및 피리미딘, 특히 T, C 및 U를 포함한다. 예를들어 A 및/또는 C는 벤조일 및 치환된 벤조일 예를들어 알킬 또는 알콕시, 종종 C1-4-알킬 또는 C1-4-알콕시-, 벤조일; 피발오릴; 및 아미딘, 특히 디알킬아미노메틸렌, 바람직하게는 디(C1-4-알킬)아미노에틸렌, 이를테면 디메틸 또는 디부틸 아미노메틸렌으로 보호될 수 있다. G는 O6상에서 예를들어 페닐 그룹 및 치환된 페닐, 예를들어 2,5-디클로로페닐 및 N2상에서 예를들어 이소부티릴 그룹과 같은 아실 그룹으로 보호될 수 것이다. T 및 U는 일반적으로 보호를 요하지 않으나 혹종의 구체예에서는 예를들어 O4에서 예를ㄷ르어 2,4-메틸페닐과 같은 페닐 그룹 및 치환된 페닐로, N3에서 피발로일옥시메틸, 벤조일, C1-4-알킬벤조일 또는 C1-4-알콕시벤조일과 같은 알킬 또는 알콕시 치환된 벤조일로 보호하는 것이 유리할 수 있을 것이다.
알콜 및/또는 H-포스포네이트가 보호된 하이드록시 그룹을 가지는 보호된 투클레오시드 또는 올리고누클레오티드일 경우, 하이드록시 보호 그룹 중 하나를 제거하여 본 발명 방법을 수행한 후 그 지점에서 추가의 커플링이 이루어지도록 할 수 있을 것이다. 제거되는 보호 그룹 및 그 지점에서 수행되는 이후 반응은 제조할 분자 형태에 따라 달라질 것이다. 커플링을 용액내에서 수행할 경우, 제거되는 보호 그룹은 3'-하이드록시 관능 상의 것일 수 있을 것이다. 따라서 제조되는 올리고누클레오티드는 H-포스포네이트내로 전환된 다음 예를들어 의도하는 올리고누클레오티드 서열의 합성에서 5'-하이드록시 그룹을 포함하는 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드로 본 발명 방법에 따른 추가 커플링을 통하여 진행될 수 있ㅎ을 것이다. 바람직하게는, 커플링을 용액내에서 수행할 경우, 5'-보호 그룹은 제거된다. 이것은 H-포스포네이트 부분으로 전환되어 3'-하이드록시 그룹과 같은 유리 하이드록시 그룹으로 다시 커플링될 수 있을 것이다. 그러나, 보호 해제된 5'-하이드록시 그룹은 3'-H-포스포네이트 부분을 포함하는 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드와 반응하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 3'-위치를 통하여 고체 지지체에 결합된 올리고누클레오티드로 고체상 합성을 사용하여 커플링시킬 경우, 제거되는 보호 그룹은 5'-위치가 바람직하다. 유리 5'하이드록시는 H-포스포네이트 부분으로 전환시켜 다른 커플링에서 사용할 수 있을 것이다. 그러나, 유리 5'-하이드록시는 가장 바람직하게는 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드 H-포스포네이트, 가장 바람직하게는 3'-H-포스포네이트이다. 올리고누클레오티드가 5'위치를 통하여 고체 지지체에 결합될 경우 해당 반응을 사용할 수 있음은 인지할 것이다. 필요하다면, 유리 하이드록시 그룹은 이 목적에 대해 업계에 공지된 방법을 사용하여 H-포스포네이트 부분으로 전환시킬 수 있다. 의도하는 커플링이 완결되었을때 누클레오티드간 결합, 3' 및 5'-하이드록시 그룹 및 염기로부터 보호 그룹을 제거하고 적절할 경우 고체 지지체로부터 생성물을 분리시키는 단계로 본 방법을 진행시킬 수 있을 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 적당한 커플링제 및 적당한 황-전달제의 존재하에 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시리보누클레오시드 또는 리보누클레오시드 3'-H-포스포네이트 또는 보호된 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 3'-H-포스포네이트 및 유리 5'-하이드록시 관능을 포함하는 성분을 커플링시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명 방법에서, 현재 이용할 수 있는 혹종의 적당한 커플링제 및 황-전달제를 사용할 수 있을 것이다.
적당한 커플링제의 예에는 알킬 및 아릴 산 클로라이드, 알칸 및 아렌 설포닐 클로라이드, 알킬 및 아릴 클로로포르메이트, 알킬 및 아릴 클로로설파이트 및 알킬 및 아릴 포스포로클로리데이트가 포함된다.
사용할 수 있는 적당한 알킬 산 클로라이드의 예에는 선형 및 환식 알카노일 클로라이드를 포함하는 C2-C16알카노일 클로라이드, 특히 피발로일 클로라이드 및 아다만탄 카보닐 클로라이드가 포함한다. 사용할 수 있는 적당한 아릴 산 클로라이드의 예에는 C1-4-알콕시, 할로, 특히 플루오로, 클로로 및 브로모와 같이 치환된 및 치환되지 않은 벤조일 클로라이드 및 C1-4-알킬 치환된 벤조일 클로라이드가 포함된다. 치환될 경우, 특히 알킬 및 할로 치환체의 경우 1-3개의 치환체가 종종 존재한다.
사용할 수 있는 적당한 알칸설포닐 클로라이드의 예에는 C1-C16알칸설포닐클로라이드가 포함한다. 사용할 수 있는 아렌설포닐 클로라이드의 예에는 C1-4-알콕시, 할로, 특히 플루오로, 클로로 및 브로모와 같이 치환된 및 치환되지 않은 벤젠설포닐 클로라이드 및 C1-4-알킬 치환된 벤젠설포닐 클로라이드가 포함된다. 치환될 경우, 특히 알킬 및 할로 치환체의 경우 1-3개의 치환체가 종종 존재한다.
사용할 수 있는 적당한 알킬 클로로포르메이트의 예에는 C2-C16알킬 클로로포르메이트가 포함한다. 사용할 수 있는 아릴 클로로포르메이트의 예에는 C1-4-알콕시, 할로, 특히 플루오로, 클로로 및 브로모와 같이 치환된 및 치환되지 않은 페닐 클로로포르메이트 및 C1-4-알킬 치환된 페닐 클로로포르메이트가 포함된다. 치환될 경우, 특히 알킬 및 할로 치환체의 경우 1-3개의 치환체가 종종 존재한다.
사용할 수 있는 적당한 알킬 클로로설파이트의 예에는 C1-C16알킬 클로로설파이트가 포함한다. 사용할 수 있는 아릴 클로로설파이트의 예에는 C1-4-알콕시, 할로, 특히 플루오로, 클로로 및 브로모와 같이 치환된 및 치환되지 않은 페닐 클로로설파이트 및 C1-4-알킬 치환된 페닐 클로로설파이트가 포함된다. 치환될 경우, 특히 알킬 및 할로 치환체의 경우 1-3개의 치환체가 종종 존재한다.
사용할 수 있는 적당한 알킬 포스포로클로리데이트는 디(C1-C6알킬)포스포로클로리데이트를 포함한다. 사용할 수 있는 아릴 포스포로클로리데이트의 예는 C1-4-알콕시, 할로, 특히 플루오로, 클로로 및 브로모와 같이 치환된 및 치환되지 않은디페닐 포스포로클로리데이트 및 C1-4-알킬 치환된 디페닐 포스포로클로리데이트를 포함한다. 치환될 경우, 1-3 치환체는 특히 알킬 및 알로 치환체의 경우 종종 존재한다.
사용할 수 있는 다른 커플링제는 Wada등의 J.A.C.S. 1997, 119, pp12710-12721(본원에 참고문헌으로 포함됨)에 기술된 클로로-, 브로모- 및 (벤조트리아조-1-일옥시)-포스포늄 및 카르보늄 화합물이다.
바람직한 커플링제는 디아릴 포스포로클로리데이트, 특히 식 (ArO)2POCl[식중, Ar은 바람직하게는 페닐, 2-클로로페닐, 2,4,6-트리클로로페닐 또는 2,4,6-트리브로모페닐임]을 가지는 것들이다.
황-전달제의 성질은 올리고누클레오티드, 포스포로티오에이트 유사체 또는 혼합된 올리고누클레오티드/올리고누클레오티드 포스포로티오에이트가 필요한지 여부에 따라 달라질 것이다. 본 발명 방법에 사용되는 황 전달제는 종종 하기 일반화학식을 가진다:
L ----- S ----- D
[식중, L은 이탈그룹, D는 아릴 그룹, 메틸 또는 치환된 알킬 그룹, 바람직하게는 2-시아노에틸 그룹 또는 알케닐 그룹임.
통상적으로 이탈 그룹은 질소-황 결합을 구성하도록 선택한다. 적당한 이탈 그룹의 예는 모폴린-3,5-디온과 같은 모폴린과 같은 이미드; 프탈이미드, 숙신이미드 및 말레이미드; 인다졸, 특히 4-니트로인다졸과 같이 전자-유인 치환체를가지는 인다졸 및 트리아졸을 포함한다.
최종 생성물에 표준 포스포디에스테르 결합이 필요할 경우, 황 전달제, D부분은 페닐 또는 나프틸 그룹과 같은 아릴 그룹을 나타낸다. 적당한 아릴 그룹의 예는 치환된 및 치환되지 않은 페닐 그룹, 특히 할로페닐 및 알킬페닐 그룹, 특히 4-할로페닐 및 4-알킬페닐, 통상적으로 4-(C1-4-알킬)페닐 그룹, 가장 바람직하게는 4-클로로페닐 및 p-톨일 그룹을 포함한다. 적당한 부류의 표준 포스포디에스테르-지향 황-전달제의 예는 N-(아릴설파닐)프탈이미드 또는 N-(아릴설파닐)숙신이미드, 예를들어 N-(페닐설파닐)숙신이미드(또는 말레이미드와 같은 기타 이미드도 사용할 수 있음)이다.
최종 생성물에 포스포로티오에이트 디에스테르 결합이 필요할 경우, 성분 D는 메틸, 치환된 알킬 또는 알케닐 그룹을 나타낸다. 적당한 치환된 알킬 그룹의 예는 치환된 메틸 그룹, 특히 벤질 및 알킬- 통상적으로 C1-4-알킬-, 알콕시- 통상적으로 C1-4-알콕시-, 니트로 및 할로- 통상적으로 클로로-치환된 벤질 그룹과 같은 치환된 벤질 그룹 및 치환된 에틸 그룹, 특히 2-(4-니트로페닐)에틸 및 2-시아노에틸 그룹과 같이 2-위치가 전자-흡인 치환체로 치환된 에틸 그룹을 포함한다. 적당한 알케닐 그룹의 예는 알릴, 크로틸 및 4-시아노부트-2-에닐 그룹이다. 적당한 부류의 포스포로티오에이트-지향 황-전달제의 예는 예를들어4-[(2-시아노에틸)-설파닐]모폴린-3,5-디온과 같은 (2-시아노에틸)설파닐 유도체 또는 3-(프탈이미도설파닐)프로파노니트릴 또는 더 바람직하게는 3-(숙신이미도설파닐)프로파노니트릴과같은 해당 시약이다.
다수의 구체예에서, 황 전달제는 H-포스포네이트 모노에스테르 및/또는 H-포스포네이트 모노에스테르와 커플링제의 반응으로 생성되는 활성화된 종 보다 H-포스포네이트 디에스테르, 특히 H-포스포네이트와 알콜의 커플링으로 생성된 H-포스포네이트 디에스테르와 더 신속히 반응하도록 선택한다.
본 발명 방법은 약 -55 - 35℃의 온도 범위에서 수행하는 것이 편리할 수 있다. 온도 범위가 약 0-30℃인 것이 유리하다. 실온(통상적으로 10-25℃, 예를들어 약 20-25℃)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명 방법에서 H-포스포네이트와 알콜의 몰비는 종종 약 0.9:1-3:1, 통상적으로 약 1:1-2:1, 바람직하게는 약 1.1:1-1.5:1, 이를테면 이량체를 제조할 경우에는 약 1.2:1 또는 보다 큰 단위로 제조할 경우에는 약 1.4:1로 선택한다. 그러나 하나 이상의 유리 하이드록실 상에 동시에 커플링을 일으킬 경우에는 몰비는 비율적으로 증가될 것이다. 커플링제와 알콜의 몰비는 종종 약 1:1-10:1, 통상적으로 약 1.5:1-6:1, 바람직하게는 약 2:1-4:1로 선택된다. 황 전달제와 알콜의 몰비는 종종 약 1:1-10:1, 통상적으로 약 1.5:1-5:1, 바람직하게는 약 2:1-3:1로 선택한다.
본 발명 방법에서, H-포스포네이트 및 알콜은 용액으로 미리 혼합하여 이 혼합물에 커플링제 및 황-전달제의 혼합물을 가할 수 있다. 시약 첨가는 통상적으로 연속적으로 또는 점진적으로 수행한다.
용액에 사용되는 커플링제 및 황 전달제의 농도는 사용하는 용매의 성질에따라 종종 달라질 것이다. 통상적으로 0.5M 이하, 예를들어 0.05-0.35M의 농도를 사용한다. 다수의 구체예에서, 황 전달제의 농도를 약 0.2M, 커플링제의 농도를 0.3M 사용할 수 있다.
H-포스포네이트 및 알콜 중 하나 또는 둘다를 용액으로 사용할 경우, 사용되는 농도는 용매의 성질, 특히 H-포스포네이트 또는 알콜의 분자량에 따라 달라질 것이다. 커플링제 및 황 전달제에 대하여 상기한 농도를 사용할 수도 있을 것이나 다수의 구체예에서는 약 0.1M의 농도를 사용한다.
본 발명 방법에서 특히 본 방법을 단계적으로 수행할 경우 적절한 황 전달제의 선택에 의하여 동일한 분자내에 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 디에스테르 누클레오티드간 결합을 둘다 함유하는 올리고누클레오티드를 제조할 수 있다.
본 발명 방법은 일반적으로 2이상의 누클레오티드 잔기를 포함하는 올리고누클레오티드를 제조하는데 사용하는 것이 바람직하다. 상한은 제조하고자 하는 올리고누클레오티드의 길이에 따라 달라질 것이다. 본 발명 방법으로 제조되는 올리고누클레오티드는 종종 40 이하, 통상적으로 35 이하, 바람직하게는 5-25, 이를테면 8-20의 누클레오티드 잔기를 포함한다. 본 발명 방법의 커플링 및 황 전달 단계는 의도하는 길이 및 서열을 얻을 수 있도록 충분한 회수로 반복된다. 본 발명 방법은 특히 2, 3, 4, 5 또는 6 누클레오티드 잔기, 특히 이량제, 삼량체 및 사량체를 포함하는 올리고누클레오티드의 제조에 적당하다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명 방법은RNA, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-알콕시알킬-RNA및 2'-O-알케닐-RNA서열의 합성에 사용할 수 있다. 예를들어 해당 보호 누클레오시드 빌딩 블록, 암모늄 p-크레실 H-포스포네이트 및 피발로일 클로라이드로부터 2'-O-(예를들어 fpmp와 같은 보호 그룹)-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-리보누클레오티드 3'-H-포스포네이트9및 2'-O-(알킬, 알콕시알킬 또는 알케닐)-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-리보누클레오티드 3'-H-포스포네이트10a-c를 사용할 수 있을 것이다.
화학적으로 유용한 리보자임 서열에 대하여, 비교적 큰 규모의 RNA 합성은 상당히 실질적으로 중요한 문제이다. 2'-O-알킬, 2'-O-치환된 알킬 및 2'-O-알케닐 [특히 2'-O-메틸, 2'-O-알릴 및 2'-O-(2-메톡시에틸)]-리보누클레오시드를 올리고누클레오티드에 도입시키는 것은(Sproat, B.S. 'Methods in Molecular Biology, Vol.20. Protocols for Oligonucleotides and Analogs', Agrawal, S., Ed., Humana Press, Totowa, 1993), 이러한 개질들이 누클레아제 이화 내성 및 얻어지는 올리고머 상의 양호한 잡종형성 특성을 의미하므로 현재 훨씬 중요한 문제이다.
황 전달 단계는 제자리에서, 즉 커플링 반응에 의하여 생성되는 중간물의 분리 및 정제 없이 H-포스포네이트 커플링의 생성시 수행한다. 황 전달제는 커플링제와 동시에 가하는 것이 바람직하다. 사용되는 황-전달제 및 커플링제는 둘다 부반응을 최소화하도록, 커플링 율이 모노-에스테르 H-포스포네이트와 황 전달제의 부반응 율보다 선호적이도록 선택한다. 시약의 선택은 커플링되는 알콜 및 H-포스포네이트의 성질에 영향을 받는다.
본 커플링 절차는 황 전달을 전체 올리고머 서열의 조립후 단한번 하기 보다는 각 커플링 단계에서 수행하는 H-포스포네이트 고체상 합성법(Froehler등, Methods in Molecular Biology, 1993)과는 상이하다.
보호 그룹은 특정 보호 그룹 및 관능에 대하여 업계에 공지된 방법을 사용하여 제거할 수 있다. 예를들어 전이 보호그룹, 특히 레불리노일-형 보호 그룹과 같은 감마 케토산은 히드라진 처리, 예를들어 van Boom. J.H.; Burgers, P.M.J.Tetrahedron Lett., 1976, 4875-4878에 기술된 매우 온건한 조건하에 히드라진으로 처리하는 것과 같은 완충된 히드라진 처리로 제거할 수 있다. 얻어지는 유리 3'-하이드록시 관능을 가지는 부분적으로 보호되는 올리고누클레오티드는 이후 올리고누클레오티드의 블록 합성에 사용할 수 있는 중간물인 해당 H-포스포네이트 및 이들의 포스포로티오에이트 유사체로 전환시킬 수 있을 것이다.
의도하는 생성물을 보호해제할 경우 포스포로티오에이트 결합을 형성하는 포스포러스 상의 보호 그룹을 먼저 제거하는 것이 통상적이다. 예를들어 시아노에틸 그룹은 DABCO, 1,5-디아자비싸이클로[4.3.0]논-5-엔(DBN), 1,8-디아자비싸이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU) 또는 트리에틸아민과 같은 강염기 아민으로 처리하여 제거할 수 있다.
포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합 및 염기 잔기 상의 페닐 및 치환된 페닐 그룹은 예를들어 알독심의 공액 염기, 바람직하게는 E-2-니트로벤즈알독심 도는 피리딘-2-카복스알독심의 공액 염기로 옥시메이트 처리하여 제거할 수 있다(Reese등, Nucleic Acides Res. 1981). Kamimura, T.등J. Am. Chem. Soc., 1984, 106 4552-4557 및 Sekine, M.등,Tetrahedron, 1985, 41, 5279-5288, S-페닐 포스포로티오에이트 중간물을 기초로 하는 용액내 포스포트리에스테르법에 의한 올리고누클레오티드 합성법; 및 van Boom 및 그의 동료들의 S-(4-메틸페닐)포스포로티오에이트 중간물을 기초로 하는 올리고누클레오티드 합성법(Wreesman, C.T.J.등,Tetrahedron Lett., 1985, 26, 933-936)
은 모두 옥시메이트 이온으로 S-페닐 포스포로티오에이트를 탈블록킹하는 것은 천연 포스포디에스테르 누클레오티드간 결합으로 유도되었음을 증명하였다. 본 발명에서 E-2-니트로벤즈알독심의 공액 염기로 S-(페닐)-보호된 포스포로티오에이트를 탈블록킹하는 것은 순조롭게 진행되고 누클레오티드간 절단은 검출되지 않는다.
예를들어 벤조일, 피발로일 및 아미딘 그룹과 같은 기타 염기 보호 그룹은 농축된 수성 암모니아로 처리하여 제거할 수 있다.
존재하는 트리틸(모노메톡시- 및 디메톡시-트리틸 포함) 그룹은 산으로 처리하여 제거할 수 있다. 올리고데옥시리보누클레오티드 합성에서 전체 비블록킹 방법에 대하여 본 발명의 또다른 중요한 고려점은 트리틸, 종종 5'-말단 DMTr의 제거는 특히 혹종의 6-N-아실-2'-데옥시아데노신 잔기의 탈퓨린화 없이 보호 그룹('탈트리틸화')이 진행되어야 한다는 것이다. 본 발명의 구체예에서 본 발명가는 고체 상 합성에서 완전히 피하는 것이 여려울 것인 이러한 탈퓨린화는 저온에서 염화수소 희석 용액으로, 특히 -50℃에서 디옥산-디클로로메탄(1:8 v/v) 용액내 약 0.45M의 염화수소로 '탈트리틸화'하여 완전히 억제할 수 있음을 발견하였다. 이들 반응 조건하에, '탈트리틸화'는 신속하게, 어떤 경우에는 5분 이내에 완결될 수 있다. 예를들어 6-N-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신을 이러한 조건하에 디옥산-디클로로메탄내 염화수소로 처리할 경우 '탈트리틸화'는 2분후에 완결되었으나 탈퓨린화는 4시간후에도 검출되지 않았다.
실일 보호 그룹은 예를들어 테트라부틸암모늄 플루오라이드와 같은 테트라알킬 암모늄 플루오라이드 염의 용액으로 플루오라이드 처리하여 제거할 수 있을 것이다.
Fpmp 보호 그룹은 온건한 조건 하에 산성 가수분해하여 제거할 수 있을 것이다.
본 발명 방법은 (a)포스포디에스테르만으로, (b)포스포로티오에이트 디에스테르만으로 및 (c)포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 디에스테르 누클레오티드간 결합을 함께 사용하여 올리고누클레오티드 서열의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명 방법을 블록 합성에 적용할 경우 의도하는 생성물을 얻는 다수의 대체 방법을 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 이들은 의도하는 생성물의 성질에 따라 달라질 것이다. 예를들어 8량체는, 사량체를 얻기 위하여 커플링된 다음 의도하는 8량체를 얻도록 커플링되는 이량체의 제조에 의하여 제조할 수 있을 것이다. 이와는 다르게, 이량체 및 삼량체가 커플링되어 오량체를 생성시키고 이것이 다른 삼량체와 커플링되어 의도하는 8량체를 생성시킬 수 있을 것이다. 방법의 선택은 사용자의 판단에 따른다. 그러나, 이러한 블록 커플링의 통상적인 특징은 둘 이상의 단위를 포함하는 올리고머 H-포스포네이트를 역시 둘 이상의 단위를 포함하는 올리고머 알콜과 커플링시키는 것이다. 올리고누클레오티드 3'-H-포스포네이트를 유리 5'-하이드록시 관능을 가지는 올리고누클레오티드와 커플링시키는 것이 가장 통상적이다.
본 발명 방법은 또한 환식 올리고누클레오티드, 특히 환식 올리고데옥시리보누클레오티드 및 환식 리보누클레오티드를 제조하는데 사용할 수 있다. 환식 올리고누클레오티드의 제조에서, H-포스포네이트 관능, 종종 3' 또는 5' H-포스포네이트를 포함하는 올리고누클레오티드가 제조되고 유리 하이드록시 관능은 적절한 보호해제로 도입된다. 유리 하이드록시 관능의 위치는 통상적으로 H-포스포네이트에 해당하도록, 예를들어 5' 하이드록시 관능은 3' H-포스포네이트와 커플링되고 3' 하이드록시 관능은 5' H-포스포네이트와 커플링되도록 선택한다. 하이드록시 및 H-포스포네이트 관능은 이후 커플링제의 존재하에 용액내에서 분자간 커플링된 다음 제자리에서 황 전달이 뒤따른다.
의도하는 생성물, 특히 포스포로디에스테르만을 포함하거나 포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합만을 포함하거나 포스포디에스테르 및 하나 이상의 포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합을 함께 포함하는 보호해제된 올리고누클레오티드와 같은 보호해제된 올리고누클레오티드는 이온-교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 적절한 용매로 침전시키는 것과 같은 것을 하나 이상 사용하여 업계에 공지된 방법으로 정제하는 것이 유리하다. 한외여과와 같은 생성물의 추가 가공 또한 사용할 수 있을 것이다.
이제 본 발명 방법을 다음 실시예를 참조로 예시하고자 하며 이는 제한의 의도는 아니다.
실시예에서 누클레오시드 잔기 및 누클레오티드간 결합이 이탤릭체일 경우 이것은 어떤 식으로든 보호되고 있음을 나타냄을 주의하여야 한다. 본 맥락에서,A, C, G, T및 T(이탤릭체 아님)는 벤조일 그룹으로 N-6에서 보호되는 2'-데옥시아데노신, 벤조일 그룹으로 N-4에서 보호되는 2'-데옥시시티딘, 이소부티릴 및 2,5-디클로로페닐 그룹으로 N-2 및 O-6에서 보호되는 2'-데옥시구아노신, 페닐 그룹으로 O-4에서 보호되는 티민 및 보호되지 않는 티민을 나타낸다. 예를들어 도식3에 나타낸 바와 같이p(s)및p(s')는 각각 S-(2-시아노에틸) 및 S-(페닐) 포스포로티오에이트를 나타내고 보호되지 않으므로 이탤릭체가 아닌 p(H)는 단량체에 결합되거나 서열의 말단에 위치할 경우 H-포스포네이트를 그렇지 않을 경우 H-포스포네이트 디에스테르를 나타낸다.
N-[(2-시아노에틸)설파닐]숙신이미드
N-브로모숙신이미드(17.90g, 0.10mol) 및 디-(2-시아노에틸)디설파이드 (17.20g, 0.10mol)를 아르곤 대기에서 2시간동안 무수 1,2-디클로로에탄(30ml)내에서 환류하에 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 헥산(300ml)을 가하고 혼합물을 10분간 교반하였다. 상층액을 디캔트하고 오일성 잔기를 에틸 아세테이트(20ml)로 10분간 적정하였다. 얻어지는 고체를 여과로 수거하여 에테르(70ml)로 세척하여 회백색 고체(12.74g, 67.3%)로표제 화합물을 얻었다(무수 에탄올로 재결정한 물질에서의 측정치 : C, 45.8; H, 4.3; N, 15.2. C7H8N2O2S는 요한다 : C, 45.64; H, 4.38; N, 15.21%), 융점 110-112℃; δH[(CD3)2SO] 2.71(4H,s), 2.75(2H,t,J6.9), 3.02(2H,t,J6.9); δC[(CD3)2SO]17.9, 32.8, 118.2, 177.9.
N-(페닐설파닐)숙신이미드
N-브로모숙신이미드(8.90g, 50.0mol) 및 디페닐 디설파이드(10.9g, 49.9mmol)를 2시간동안 무수 1,2-디클로로에탄(40ml)내에서 환류하에 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 헥산(150ml)을 가하고 혼합물을 30분동안 교반하였다. 생성물을 여과로 수거하고 헥산(50ml)으로 세척하였다. 무수 에탄올로 재결정하여 표제 화합물을 무색의 결정(6.2g, 59.8%)으로 얻었다. 융점 110-112℃(lit.7115-116℃); δH[(CD3)2SO] 2.84(4H,s), 7.32(5H,m); δC[(CD3)2SO] 28.8, 126.3, 127.6, 129.2, 135.3, 177.2.
DMTr-Tp(s)T-Lev(B=B'=티민-1-일)의 제조
DMTr-Tp(H)(B=티민-1-일)(0.853g, 1.2mmol) 및 HO-T-Lev(B'=티민-1-일) (0.340g, 1.0mmol)를 무수 피리딘(2ml)과 동시 증발시키고 실온에서 잔기를 무수피리딘(6ml)내에 재용해시켰다. 이 용액에 무수 피리딘(6ml)내 디페닐 포스포로티오에이트(0.52ml, 3.5mmol) 및 N-[(2-시아노에틸)설파닐]숙신이미드(0.46g, 2.5mmol) 용액을 5분에 걸쳐 한방울씩 가하였다. 5분후 물(1ml)을 가하였다. 반응 혼합물을 다시 5분간 교반한 다음 디클로로메탄(50ml) 및 포화 수성 소듐 하이드로젠 카보네이트 용액(50ml)으로 분별하였다. 유기층을 분리한 다음 포화 수성 소듐 하이드로젠 카보네이트 용액(2x30ml)으로 다시 세척하였다. 수거한 유기층을 건조(MgSO4)하고 감압하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 상에서 쇼트 칼럼 크로마토그래피로 분급하고 적절한 분급물을 증발시키고 CH2Cl2-MeOH(96:4v/v)로 용출하여 DMTr-Tp(s)T-Lev(B=B'=티민-1-일)을 무색의 발포체(1.009g, 99.3%)로 얻었다; δP[(CD3)2SO] 27.9, 27.7, 27.0(약 0.7%).
본 발명 방법의 추가 실시예는 디페닐 포스포로티오에이트5b(2.5mmol)및 무수 피리딘(6ml)내 N-[(2-시아노에틸)설파닐]-숙신이미드 또는 N-(페닐설파닐)-숙신이미드(8a또는8b, 2.5mmol)의 용액을 H-포스포네이트 단량체(1.2 또는 1.4mmol) 및 무수 피리딘(6ml)내 5'-OH 성분(1.0mmol)의 교반 용액에 5분에 걸쳐 한방울씩 가함으로써 수행하였다. 5-25분간이 더 지난후(총 반응 시간 참조) 생성물을 수거하여 크로마토그래피하였다. 얻어진 결과는 표1에 나타낸다.
Claims (16)
- 커플링 존재하에 H-포스포네이트를 알콜과 커플링시켜 H-포스포네이트 디에스테르를 얻은 다음 H-포스포네이트 디에스테르를 황 전달제와 반응시켜 포스포로티오에이트 트리에스테르를 얻는 포스포로티오에이트 트리에스테르의 제조 방법으로서, H-포스포네이트 및 알콜간의 커플링 반응이 황 전달제의 존재하에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, H-포스포네이트가 3'-H-포스포네이트 관능을 포함하는 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드인 방법.
- 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 알콜이 유리 5'-하이드록시 관능을 포함하는 보호된 누클레오시드 또는 올리고누클레오티드인 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 커플링제가 식 (ArO)2POCl(식중, Ar은 페닐, 2-클로로페닐, 2,4,6-트리클로로페닐 또는 2,4,6-트리브로모페닐임)의 디아릴 포스포로티오에이트인 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 황 전달제가 하기 일반 화학식을 가지는 방법:L ----- S ----- D[식중, L은 이탈 그룹이고 D는 아릴 그룹, 메틸 그룹, 치환된 알킬 그룹 또는 알케닐 그룹임.
- 제5항에 있어서, 이탈 그룹이 모폴린-3,5-디온, 프탈이미드, 숙신이미드, 말레이미드 또는 인다졸이고 D가 4-할로페닐 그룹, 4-알킬페닐 그룹, 메틸 그룹, 벤질 그룹, 알킬벤질 그룹, 할로벤질 그룹, 알릴 그룹, 크로틸 그룹, 2-시아노에틸 그룹 또는 2-(4-니트로페닐)에틸 그룹인 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, H-포스포네이트 및 알콜이 독립적으로 데옥시리보누클레오시드, 올리고데옥시리보누클레오시드, 리보누클레오시드, 2'-O-(알킬, 알콕시알킬 또는 알케닐)-리보누클레오시드, 올리고누클레오티드 및 2'-O-(알킬, 알콕시알킬 또는 알케닐)-올리고리보누클레오티드로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, H-포스포네이트 또는 알콜, 바람직하게는 알콜이 고체 지지체에 결합되는 방법.
- 제8항에 있어서, 알콜이 고체 지지체에 결합되고 5'-위치에 유리 하이드록시그룹을 가지는 누클레오시드 또는 누클레오티드이며 3'-위치를 통하여 고체 지지체에 결합되는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 고체 지지체에 결합된 알콜을 H-포스포네이트, 커플링제 및 황 전달제를 포함하는 용액과 접촉시키는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 상에서 수행하는 방법.
- 제11항에 있어서, 커플링제 및 황 전달제를 포함하는 용액을 H-포스포네이트 및 알콜을 포함하는 용액에 가하는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드 H-포스포네이트 및/또는 유리 3' 또는 5'-하이드록시 관능을 포함하는 올리고누클레오티드를 사용하고 올리고누클레오티드 H-포스포네이트 및 유리 3' 또는 5'-하이드록시 관능을 포함하는 올리고누클레오티드가 하나 이상의 포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합을 포함하는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 포스포트리에스테르가 2-8, 바람직하게는 2-4의 누클레오티드 잔기를 포함하는 방법.
- a) 커플링제 존재하에 보호된 누클레오시드 또는 3' 또는 5'-H-포스포네이트 관능을 포함하는 올리고누클레오티드 H-포스포네이트를 보호된 누클레오시드 또는 유리 3' 또는 5'-하이드록시 관능을 포함하는 올리고누클레오티드와 커플링시켜 H-포스포네이트 디에스테르를 생성시키고 제자리에서 H-포스포네이트 디에스테르를 황 전달제와 반응시켜 포스포로티오에이트 트리에스테르를 얻는 단계(상기에서 H-포스포네이트 및 알콜간의 커플링 반응은 황 전달제의 존재하에 일어남); 및b) a)에서 얻은 포스포로티오에이트 트리에스테르를 보호해제하여 탈보호된 올리고누클레오티드, 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트 또는 혼합된 올리고누클레오티드, 올리고누클레오티드/포스포로티오에이트를 얻는 단계를 포함하는, 탈보호된 올리고누클레오티드, 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트 또는 혼합된 올리고누클레오티드/올리고누클레오티드 포스포로티오에이트의 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 탈보호된 올리고누클레오티드, 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트 또는 혼합된 올리고누클레오티드/올리고누클레오티드 포스포로티오에이트를 이후 정제시키는 방법.
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