CN1406242A - 制备硫代磷酸三酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合成硫代磷酸三酯的方法，所述方法包括H－膦酸酯和醇在既含有偶合剂又含有硫转移剂的溶液存在下进行偶合，优选H－膦酸酯和醇为被保护的核苷或低聚核苷酸。

Description

制备硫代磷酸三酯的方法
本发明提供了合成硫代磷酸三酯的方法，特别是低聚核苷酸和包含低聚核苷酸的硫代磷酸酯的方法。
大约在过去的15年里，对于低聚脱氧核糖核苷酸(DNA序列)、低聚核糖核苷酸(RNA序列)及其类似物的合成已经有了巨大的进展。人们对于DNA和RNA序列在治疗应用方面与日俱增的兴趣使得对更大量物质的需求日益增加，大规模合成低聚核苷酸的许多工作已经进行。事实上，所有这些工作已包括制造越来越大的合成器，在一种载体上应用相同的氨基磷酸酯化学反应。用于合成低聚核苷酸的可选择的方法公开于国际专利申请WO99/09041中，该公开的方法使用在溶液中顺序偶合和硫转移的步骤。
根据本发明的第一方面，提供一种制备硫代磷酸三酯方法，包括：在偶合剂存在下将H-膦酸酯与醇进行偶合形成一种H-膦酸二酯，随后，该H-膦酸二酯与硫转移剂反应形成硫代磷酸三酯，其特征在于H-膦酸酯和醇之间的偶合反应在硫转移剂的存在下发生。
在许多优选实施方案中，预计反应经由如下顺序进行：即，在偶合剂存在下H-膦酸酯与醇反应，形成的H-膦酸二酯与同时存在的硫转移剂原位快速反应，如下述反应流程所示：其中，Z，Z′和Z″独立地表示保护基，B和B′独立地为核碱(nucleobase)，每一个Y独立地表示H、O-烷基、O-烯基、O-保护基、C-烷基或C-烯基。
在本发明方法中，有利的是，所用的H-膦酸酯是被保护的核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯或其类似物，优选其包括5′或3′H-膦酸酯官能团，特别优选3′H-膦酸酯官能团。优选的核苷为2′-脱氧核糖核苷和核糖核苷；优选的低聚核苷酸为低聚脱氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸。
当H-膦酸酯为含有3′H-膦酸酯官能团的被保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脱氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物时，5′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的。这种适合的保护基的实例包括酸活泼的保护基，特别是三苯甲基和取代的三苯甲基，如二甲氧基三苯甲基和9-苯基氧杂蒽-9-基；以及碱活泼的保护基，如FMOC。
当H-膦酸酯结构单元为含有5′H-膦酸酯官能团的被保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脱氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物时，3′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的。适合的保护基包括那些以上公开的用于保护3′H-膦酸酯结构单元中5′-羟基官能团的基团和酰基，如乙酰丙酰基(levulinoyl)和取代的乙酰丙酰基。
当H-膦酸酯为保护的核糖核苷或保护的低聚核糖核苷酸时，2′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的，所述保护基为，如酸活泼的乙缩醛保护基，特别是1-(芳基)-4-烷氧基哌啶-4-基，如1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)；和三烷基甲硅烷基，优选三(C1-4烷基)甲硅烷基，如叔丁基二甲基硅烷基。作为选择，核糖核苷或低聚核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-烯基衍生物，通常为C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或烯基衍生物，在这一情况下，2′位不需要更进一步的保护。可以用于本发明方法中的核苷和低聚核苷酸类似物的H-膦酸酯包括2′-氟、2′-氨基、2′-碳-烷基和2′-碳-烯基取代的核苷和低聚核苷酸衍生物。
其它可以用于本发明方法的H-膦酸酯源于其它的多元醇，特别是烷基醇，优选二醇或三醇。烷基二醇的实例包括乙烷-1，2-二醇和低分子量聚乙二醇，如分子量最多至400的聚乙二醇。烷基三醇的实例包括甘油和丁烷三醇。通常，只存在唯一的H-膦酸酯官能团，其余的羟基被适合的保护基保护，所述保护基为如上文公开的用于保护核糖核苷5′或2′位的那些保护基。
用于本发明方法的醇通常为含有游离羟基，优选游离的3′或5′-羟基，特别优选5′-羟基的保护的核苷或低聚核苷酸。
当醇为保护的核苷或保护的低聚核苷酸时，优选的核苷为脱氧核糖核苷和核糖核苷，优选的低聚核苷酸为低聚脱氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸。
当醇为含有游离5′-羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脱氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物时，3′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的。这种保护基的实例包括酰基，通常含有最高达16个碳原子，如源自γ-酮酸的那些酰基，例如乙酰丙酰基和取代的乙酰丙酰基，和类似的基团。取代的乙酰丙酰基尤其包括5-卤代乙酰丙酰基，例如5，5，5-三氟乙酰丙酰基；类似的基团包括，例如苯甲酰基丙酰基。其它的这种保护基包括脂肪族烷酰基，尤其包括直链或支链的C6-16烷酰基，例如月桂酰基；苯甲酰基和取代的苯甲酰基，例如烷基(通常为C1-4烷基)和卤素(通常为氯或氟)取代的苯甲酰基；以及甲硅烷基醚，例如烷基(通常为C1-4烷基)和芳基(通常为苯基)甲硅烷基醚，尤其是叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基。
当醇为含有游离3′-羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脱氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物时，5′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的。适合的保护基为那些以上公开的用于保护脱氧核糖核苷、核糖核苷，低聚脱氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸3′H-膦酸酯中5′-羟基的保护基。
当醇为核糖核苷或低聚核糖核苷酸时，2′-羟基官能团被适合的保护基保护是有利的，所述保护基为，如乙缩醛保护基，特别是1-(芳基)-4-烷氧基哌啶-4-基，如1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)；和三烷基甲硅烷基，优选三(C1-4烷基)甲硅烷基，如叔丁基二甲基硅烷基。作为选择，核糖核苷或低聚核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-烯基衍生物，通常为C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或烯基衍生物，在这一情况下，2′位不需要更进一步的保护。在本发明方法中，可以用作醇的核苷和低聚核苷酸类似物包括2′-氟、2′-氨基、2′-碳-烷基和2′-碳-烯基取代的核苷和低聚核苷酸衍生物。
其它可以用于本发明方法的醇为非糖类多元醇，特别是烷基多元醇，优选二元醇或三元醇。烷基二元醇的实例包括乙烷-1，2-二醇和低分子量聚乙二醇，如分子量最多至400的聚乙二醇。烷基三醇的实例包括甘油和丁烷三醇。通常，只存在唯一的游离羟基官能团，其余的羟基被适合的保护基保护，所述保护基为如上文公开的用于保护核糖核苷5′或2′位的那些保护基。但是，如果需要在一个以上的羟基上进行相同的偶合的话，可以存在一个以上游离的羟基。
当使用含有游离羟基的低聚核苷酸H-膦酸酯或低聚核苷酸之一或二者均使用时，优选将核苷酸间键保护起来，所述核苷酸间键可以包括磷酸酯键、硫代磷酸酯键或者磷酸酯和硫代磷酸酯键两者都包括。这种保护基的实例在本领域中是众所周知的，包括芳基、甲基或取代的烷基，优选2-氰乙基和烯基。
本发明的方法可以在溶液中进行。当使用这种液相合成法时，可以用于本发明方法的有机溶剂包括卤代烷，特别是二氯甲烷；酯，特别是烷基酯，如乙酸乙酯、丙酸甲酯或丙酸乙酯；酰胺，例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和N，N′-二甲基咪唑啉酮；和碱性亲核溶剂，例如吡啶。用于偶合和硫转移步骤的优选的溶剂是吡啶、二氯甲烷及其混合物，特别优选吡啶。使用的有机溶剂优选基本上无水。
在本发明的某些实施方案中，H-膦酸酯或醇，优选乙醇，键接到一种载体上。最优选，键接到载体上的醇为在5′-位上含有游离羟基的核苷或核苷酸，并通过3′-位键接到载体上。可以使用的载体在所使用的溶剂中基本上不溶，并且包括低聚核苷酸固相合成领域中众所周知的载体。其实例包括二氧化硅、受控的小孔玻璃、聚苯乙烯、含有聚苯乙烯的共聚物，例如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物以及如聚乙酸乙烯酯的聚合物。另外，如果需要的话，也可以使用聚丙烯酰胺载体，例如通常用于肽固相合成中的那些载体。
当使用载体时，醇或H-膦酸酯，往往是醇，通常通过可裂连接剂(linker)，优选通过3′-位键合到载体上。可以使用的连接剂的实例包括低聚核苷酸固相合成领域中众所周知的那些，例如尿烷，草酰、琥珀酰和氨基衍生的连接剂。
本发明的方法可以通过分别在H-膦酸酯或醇溶液中搅拌键合到固体上的醇或H-膦酸酯、偶合剂和硫转移剂的浆液而进行。作为选择，可以将载体装到一个柱中，使H-膦酸酯、偶合剂和硫转移剂的溶液经过该柱。
当H-膦酸酯和醇两者都是保护的核苷低聚核苷酸时，本发明提供了一种以H-膦酸酯偶合反应为基础，逐步和分段合成低聚脱氧核糖核苷酸、低聚核糖核苷酸及其类似物的改进方法。根据本发明的一个优选方面，带有3′-端H-膦酸酯官能团的保护的核苷或低聚核苷酸和带有5′-端羟基官能团的保护的核苷或低聚核苷酸在适合的偶合剂和适合的硫转移剂两者都存在的情况下反应，其中形成保护的二核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯中间产物，所述中间产物通过与适合的硫转移剂原位反应实现硫转移。
除存在羟基保护基外，当必要时，存在于本发明使用的核苷/核苷酸中的碱也优选用适合的保护基给以保护。可以存在的有机碱包括核碱，如天然的和非天然的核碱，特别是嘌呤，例如次黄嘌呤，尤其是A和G，和嘧啶，尤其是T、C和U。使用的保护基为这种碱保护领域中已知的那些保护基，例如，A和/或C可以用如下的基团给以保护，所述基团为苯甲酰基，包括取代的苯甲酰基，如烷基或烷氧基(常常是C1-4烷基或C1-4烷氧基-)苯甲酰基；新戊酰基；和脒，特别是二烷基氨基亚甲基，优选二(C1-4-烷基)氨基亚甲基，如二甲基或二丁基氨基亚甲基。在0-6上时，G可可以用苯基，包括取代的苯基，例如2，5-二氯苯基保护，在N-2上时，可以用例如酰基，如异丁酰基保护。T和U通常不需要保护，但是在某些实施方案中，将其进行保护可能是有利的，例如，在0-4上时，可以用苯基，包括取代的苯基，如2，4-二甲苯基保护，或在N-3上时，用新戊酰氧甲基、苯甲酰基、烷基或烷氧基取代的苯甲酰基，如C1-4烷基或C1-4烷氧基苯甲酰基保护。
当醇和/或H-膦酸酯是含有被保护羟基的保护的核苷或低聚核苷酸时，为了在该点上进一步偶合，可以在进行本发明的方法之后除去一个羟基保护基，除去的保护基和随后在该点上进行的反应将取决于要制备的分子的类型。当在溶液中发生偶合时，去除的保护基可以是3′-羟基官能团上的保护基。在合成所需要的低聚核苷酸序列中，由此形成的低聚核苷酸可以转化为H-膦酸酯，然后可以根据本发明的方法进一步偶合，例如与含有5′-羟基的核苷或低聚核苷酸进一步偶合。优选，当在溶液中发生偶合时，除去5′-保护基，其可以转变成H-膦酸酯结构部分，然后与游离羟基，如3′-羟基更进一步偶合。但是，优选脱保护的5′-羟基与含有3′-H-膦酸酯结构部分的核苷或低聚核苷酸反应。当使用固相合成法时，优选与通过3′-位键接到载体上的低聚核苷酸发生偶合，除去的保护基优选在5′-位上。游离的5′-羟基可以转变成H-膦酸酯结构部分并用于更进一步的偶合。但是，最优选游离的5′-羟基与核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯偶合，最优选3′-H-膦酸酯。应该承认，当低聚核苷酸通过5′-位键接到载体上时，可以使用相应的反应。当需要的时候，可以使用本领域已知的方法将游离的羟基转变成H-膦酸酯结构部分。当所需的偶合完成后，可以继续进行下面的步骤，以从核苷酸间键、3′和5′-羟基以及碱上除去保护基，并且，如果合适的话，从载体上分离出产物。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括在适合的偶合剂和适合的硫转移剂均存在的情况下，将5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧核糖核苷或核糖核苷3′-H-膦酸酯或保护的低聚脱氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸3′-H-膦酸酯和含有游离的5′-羟基官能团的组分偶合。
在本发明的方法中，可以使用任何适用于先有技术的适合的偶合剂和硫转移剂。
适合的偶合剂的实例包括烷基和芳基酰氯、烷烃和芳烃磺酰氯、烷基和芳基氯甲酸酯、烷基和芳基氯亚硫酸酯和烷基和芳基氯代磷酸酯。
可以使用的适合的烷基酰氯的实例包括C2-C16烷酰基氯，包括直链和环烷酰氯，特别是新戊酰氯和金刚烷碳酰氯。可以使用的芳基酰氯的实例包括取代和未取代的苯甲酰氯，如C1-4烷氧基、卤素，特别是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯甲酰氯。当被取代时，往往存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代基的情况下。
可以使用的适合的烷基磺酰氯的实例包括C1-C16烷基磺酰氯。可以使用的芳基酰氯的实例包括取代和未取代的苯磺酰氯，如C1-4烷氧基、卤素，特别是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯磺酰氯。当被取代时，往往存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代基的情况下。
可以使用的适合的烷基氯甲酸酯的实例包括C2-C16烷基氯甲酸酯。可以使用的芳基氯甲酸酯的实例包括取代和未取代的苯基氯甲酸酯，如C1-4烷氧基、卤素，特别是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯基氯甲酸酯。当被取代时，往往存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代基的情况下。
可以使用的适合的烷基氯亚硫酸酯的实例包括C1-C16烷基氯亚硫酸酯。可以使用的芳基氯亚硫酸酯的实例包括取代和未取代的苯基氯亚硫酸酯，如C1-4烷氧基、卤素，特别是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯基氯亚硫酸酯。当被取代时，往往存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代基的情况下。
可以使用的适合的烷基氯代磷酸酯的实例包括二(C1-C6烷基)氯代磷酸酯。可以使用的芳基氯代磷酸酯的实例包括取代和未取代的二苯基氯代磷酸酯，如C1-4烷氧基、卤素，特别是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的二苯基氯代磷酸酯。当被取代时，往往存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代基的情况下。
可以使用的另外的偶合剂为：氯、溴和(苯并三唑-1-基氧)-鏻和正碳化合物，由Wada等人公开于J.A.C.S.，1997，119，12710-12721页中(其在此引入作为参考)。
优选的偶合剂为二芳基氯代磷酸酯，特别是符合(ArO)2POCl的那些，其中Ar优选为苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
硫转移剂的性质将取决于是否需要低聚核苷酸、硫代磷酸酯类似物或混合低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯。用于本发明方法的硫转移剂往往具有如下通式：
                       L----S----D
其中，L表示离去基团，D表示芳基、甲基或取代的烷基，优选2-氰乙基，或烯基。通常选择包含N-S键的离去基团。适合的离去基团的实例包括酰亚胺，如吗啉，例如吗啉-3，5-二酮；酞酰亚胺、琥珀酰亚胺和顺丁烯二酰亚胺；吲唑，特别是带有吸电子取代基的吲唑，如4-硝基吲唑；和三唑。
当最终产物中需要标准的磷酸二酯键时，硫转移剂的结构部分D表示芳基，例如苯基或萘基。适合的芳基的实例包括取代和未取代的苯基，特别是卤代苯基和烷代苯基，尤其是4-卤代苯基和4-烷代苯基，通常为4-(C1-4烷基)苯基，最优选4-氯苯基和对甲苯基。能得到标准磷酸二酯的适合的硫转移剂种类的实例为N-(芳基硫烷基)酞酰亚胺，或N-(芳基硫烷基)琥珀酰亚胺，比如N-(苯基硫烷基)琥珀酰亚胺(或也可以使用其它的酰亚胺，例如顺丁烯二酰亚胺)。
当最终产物中需要硫代磷酸二酯键时，结构部分D表示甲基、取代的烷基或烯基。适合的取代烷基的实例包括取代的甲基，特别是苄基和取代的苄基，例如烷基，通常是C1-4烷基；烷氧基，通常是C1-4烷氧基；硝基；和卤素，通常是氯；取代的苄基和取代的乙基，特别是在2-位上被吸电子取代基取代的乙基，如2-(4-硝基苯基)乙基和2-氰乙基。适合的烯基的实例是烯丙基、2-丁烯基和4-氰基丁-2-烯基。能得到硫代磷酸酯的适合的硫转移剂的实例是，例如，(2-氰乙基)硫烷基衍生物，如4-[(2-氰乙基)-硫烷基]吗啉-3，5-二酮或相应的试剂，如3-(苯二甲酰亚氨基硫烷基)丙腈，或更优选3-(丁二酰亚胺基硫烷基)丙腈。
在许多实施方案中，硫转移剂的选择应使其能更快速地与H-膦酸二酯反应，特别是与由H-膦酸酯和醇偶合形成的H-膦酸二酯的反应比起与H-膦酸单酯和/或由H-膦酸单酯与偶合剂反应形成的活化物质的反应更快。
本发明的方法可以方便地在约-55℃-约35℃的温度范围内进行。在约0℃-约30℃的温度范围内更有利，最优选采用的温度为室温(通常为10-25℃，如约20-25℃)。
在本发明的方法中，H-膦酸酯与醇的摩尔比往往选择在约0.9∶1-约3∶1范围内，通常为约1∶1-约2∶1，优选约1.1∶1-约1.5∶1，如当制备二聚物时为摩尔比约1.2∶1，当制备更大的单元时为约1.4∶1。但是，当同时进行一个以上游离羟基的偶合时，摩尔比将成比例地增加。偶合剂和醇的摩尔比往往选择在约1∶1-约10∶1的范围内，通常为约1.5∶1-约6∶1，优选约2∶1-约4∶1。硫转移剂和醇的摩尔比往往选择在约1∶1-约10∶1的范围内，通常为约1.5∶1-约5∶1，优选约2∶1-约3∶1。
在本发明的方法中，H-膦酸酯和醇可以在溶液中进行预混，然后在该混合物中加入偶合剂和硫转移剂的混合物。在加料时间内，通常连续或逐渐加入反应剂。
在溶液中使用的偶合剂和硫转移剂的浓度往往取决于所使用溶剂的性质。通常使用的浓度最高为0.5M，例如，在0.05M-0.35M范围内。在许多实施方案中，可以使用的硫转移剂的浓度为约0.2M，偶合剂的浓度为约0.3M。
当H-膦酸酯和醇之一或两者均以溶液形式使用时，所使用的浓度将取决于溶剂的性质，特别是H-膦酸酯或醇的分子量。尽管在许多实施方案中使用的浓度为约0.1M，但是对偶合剂和硫转移剂来说，可以使用上述浓度范围。
在本发明的方法中，通过选择适当的硫转移剂可以制备在相同分子中含有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键的低聚核苷酸，特别是当该方法以多步方法进行时。
本发明的方法优选用于制备通常含有两个或多个核苷酸残基的低聚核苷酸。其上限取决于所希望制备的低聚核苷酸的长度。往往，通过本发明的方法制备的低聚核苷酸含有最多至40个核苷酸残基，通常最多至35个核苷酸残基，优选含有5-25，如8-20个核苷酸残基。为得到所需的长度和序列，可将本发明方法的偶合和硫转移步骤重复足够多的次数。本发明的方法特别适于制备含有2、3、4、5或6个核苷酸残基的低聚核苷酸，特别是二聚物、三聚物和四聚物。
正如前面所述，本发明的方法可用于合成RNA、2′-O-烷基-RNA、2′-O-烷氧基烷基-RNA和2′-O-烯基RNA序列。可以，例如由相应保护的核苷结构单元、对羟甲苯基铵的H-膦酸酯和新戊酰氯制备2′-O-(保护基，如fpmp)-5′-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷的3′-H-膦酸酯(9)和2′-O-(烷基、烷氧基烷基或烯基)-5′-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷的3′-H-膦酸酯(10a-c)。
Figure A0180589000121
                                                         10a R＝Me
                                                         10b R＝CH2CH＝CH2
                                                         10c R＝CH2CH2OMe
对于化学治疗有用的核糖酶序列来说，相对大规模的RNA合成是现实中相当重要的一个问题。将2′-O-烷基、2′-O-取代烷基和2′-O-烯基[特别是2′-O-甲基、2′-O-烯丙基和2′-O-(2-甲氧基乙基)]-核糖核苷(Sproat，B.S.在Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocolsfor Oligonucleotides and Analogs′，Agrawal，S.，Ed.，HumanaPress，Totowa，1993中提到)引入到低聚核苷酸中是目前非常重要的一个问题，因为这些改性使得所得低聚物既对核酸酶消化具有抵抗力又具有优良的杂交性质。
硫转移步骤在H-膦酸酯原位偶合的产物上进行，即，对于经偶合反应制备的中间产物不进行分离和纯化。优选硫转移剂与偶合剂同时加入。对所使用的硫转移剂和偶合剂进行选择以将副反应减到最小，这样会有助于使偶合速率大于H-膦酸单酯与硫转移剂的副反应速率。反应剂的选择受到将要偶合的H-膦酸酯和醇的性质的影响。
这一偶合方法与下述H-膦酸酯进行固相合成(Froehler等人，Methods in Molecular Biology，1993)中的偶合方法的不同之处在于在每一偶合步骤中都进行硫转移，而不是仅仅在全部低聚物序列组合之后进行一次。
可以使用本领域已知的除去具体保护基和官能团的方法除去保护基。例如，暂时的保护基，尤其是γ-酮酸，如乙酰丙酰基类型保护基，可以通过用肼，如缓冲的肼进行处理除去，例如，在非常温和的条件下用肼进行处理(由van Boom.J.H.；Burgers，P.M.J.在TetrahedronLett.，1976，4875-4878中公开)，然后，所得带有游离3′-羟基官能团的部分保护的低聚核苷酸可以被转化为相应H-膦酸酯，它是一种可用于低聚核苷酸和其硫代磷酸酯类似物嵌段合成的中间体。
一旦产生所需的产物，当对其进行脱保护时，通常首先除去产生硫代磷酸酯键的磷上的保护基。例如，通过用强碱性的胺，如DABCO、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或三乙胺进行处理可以除去氰乙基。
硫代磷酸酯核苷酸间键和碱残基上的苯基和取代苯基可以通过进行肟盐处理，例如用醛肟的共轭碱，优选E-2-硝基苯醛肟或吡啶-2-醛肟(carboxaldoxime)的共轭碱进行处理除去(Reese等人，Nucleic AcidsRes.1981)。Kamimura，T.等人在J.Am.Chem.Soc.，1984，106，4552-4557中，Sekine，M.等人在Tetrahedron，1985，41，5279-5288中描述的以S-苯基硫代磷酸酯为中间体，在溶液中通过膦酸三酯方式合成低聚核苷酸的方法中，以及van Boom及其同事在以S-(4-甲基苯基)硫代磷酸酯为中间体合成低聚核苷酸的方法(Wreesman，C.T.J.等人，Tetrahedron Lett.，1985，26，933-936)中都阐述了用肟盐离子将S-苯基硫代磷酸酯去保护(使用Reese等人1978年的方法；Reese、C.B.；Zard，L.，Nucleic Acids Res.，1981，9，4611-4626)得到天然的磷酸二酯核苷酸间键。在本发明中，使用E-2-硝基苯醛肟的共轭碱对S-苯基保护的硫代磷酸酯进行脱保护可以很顺利地进行，没有发现任何核苷酸间键的开裂。
其它的碱保护基，例如苯甲酰基、新戊酰基和脒基团可以通过用浓氨水处理除去。
存在的三苯甲基(包括单甲氧基-和二甲氧基三苯甲基)可以通过用酸处理除去。在低聚脱氧核糖核苷酸合成中的整体脱保护策略中，本发明需要考虑的另一个重要因素是三苯甲基(经常是5′-端DMTr)保护基的去除(脱三苯甲基作用)应该在没有相应的脱嘌呤作用的情况下进行，特别是在不存在任何6-N-酰基-2′-脱氧腺苷残基的情况下进行。根据本发明的一个实施方案，本发明人已经发现这种在固相合成中也许很难完全避免的脱嘌呤作用可以通过在低温下用盐酸稀溶液，尤其是在-50℃下，用0.45M氯化氢的二氧六环-二氯甲烷(1∶8v/v)溶液进行处理得以完全的抑制。在这种反应条件下，脱三苯甲基作用可以迅速完成，而且在某些情况下，脱三苯甲基作用可以在5分钟后或更少的时间里完成。例如，在这种条件下，当用氯化氢的二氧六环-二氯甲烷溶液处理6-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷时，脱三苯甲基作用在2分钟后完成，而甚至在4小时后也没有发现脱嘌呤作用。
通过用氟化物处理，例如用如四丁基氟化铵的四烷基氟化铵盐溶液处理可以除去甲硅烷基保护基。
Fpmp保护基可以通过在温和条件下进行酸性水解而除去。
本发明的方法可以用于制备(a)只含有磷酸二酯，(b)只含有硫代磷酸二酯和(c)含有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键的低聚核苷酸序列。
很显然，当本发明的方法用于嵌段合成时，对于如何得到所需的产物可以有许多选择性的路线，这将取决于所需的产品性质。例如，制备八聚物时可以通过制备二聚物，然后将其偶合得到四聚物，之后再偶合得到所需的八聚物；或者，可以将二聚物和三聚物偶合形成五聚物，然后将其与另外一种三聚物偶合制备所需的八聚物。策略的选择由用户决定，但是，这种嵌段偶合的共有特征是含有两个或更多单元的H-膦酸酯与同样含有两个或更多单元的低聚物醇偶合。最通常的是低聚核苷酸3′-H-膦酸酯与含有游离5′-羟基官能团的低聚核苷酸偶合。
本发明的方法也可以用于制备环状低聚核苷酸，特别是环状低聚脱氧核糖核苷酸和环状核糖核苷酸。在制备环状低聚核苷酸的过程中，制备含有H-膦酸酯官能团，往往是3′或5′H-膦酸酯的低聚核苷酸，然后通过适当的脱保护引入游离的羟基官能团。游离羟基官能团位置的选择通常与H-膦酸酯相适应，例如，5′-羟基官能团将与3′H-膦酸酯偶合，而3′-羟基官能团将与5′H-膦酸酯偶合，然后，羟基和H-膦酸酯官能团可以在偶合剂的存在下，在溶液中进行分子内偶合，之后进行原位硫转移。
所需的产物，尤其是脱保护的低聚核苷酸，如只含有磷酸二酯或只含有硫代磷酸酯核苷酸间键，或含有磷酸二酯和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键的混合物的脱保护低聚核苷酸通过本领域已知的方法进行纯化是有利的，如用一个或多个离子交换色谱、反相色谱、从适当的溶剂中沉淀的方法进行纯化。也可以使用其他方法，如超滤。
现在，将参考以下实施例对本发明的方法进行阐述，其目的不在于对本发明的方法进行限定。
应当指出，在实施例中，当核苷残基和核苷酸间键用斜体字印刷时，表示它们被以某种方式进行了保护。在本发明中，A，C、G，T和T(这一个未用斜体字印刷)表示在N-6上用苯甲酰基保护的2′-脱氧腺苷，在N-4上用苯甲酰基保护的2′-脱氧胞苷，在N-2和O-6上用异丁酰基和2，5-二氯苯基保护的2′-脱氧鸟苷，在0-4上用苯基保护的胸腺嘧啶和未保护的胸腺嘧啶。例如，正如在反应方案3中所表示的一样，p(s)和p(s′)分别表示S-(2-氰乙基)和S-(苯基)硫代磷酸酯，而p(H)(它没有被保护，因此不用斜体字印刷)，如果它位于序列末尾或连到单体上时表示H-膦酸单酯，其他情况下则表示H-膦酸二酯。
实施例N-[(2-氰乙基)硫烷基]琥珀酰亚胺
在干燥的1，2-二氯乙烷(30毫升)中，于氩气气氛下将N-溴代丁二酰亚胺(17.80g，0.10mol)和二(2-氰乙基)二硫化物(17.20g，0.10mol)加热回流2小时。把反应混合物冷却到室温后，加入己烷(300ml)，将混合物搅拌10分钟。倾出上层，油状残余物用乙酸乙酯(20ml)研磨10分钟，通过过滤收集所得固体，用乙醚(70ml)洗涤，得到标题化合物，其为黄白色固体(12.4g，67.3％)。(用纯乙醇进行重结晶得到的物质中，发现：C，45.8；H，4.3；N，15.2；C7H8N2O2S计算值：C，45.64；H，4.38；N，15.21％)；m.p.110-112℃；δH[(CD3)2SO]2.71(4H，s)，2.75(2H，t，J＝6.9)，3.02(2H，t，J＝6.9)；δC[(CD3)2SO]17.9，32.8，118.2，177.9。N-(苯基硫烷基)琥珀酰亚胺
在干燥的1，2-二氯乙烷(40ml)中，将N-溴代丁二酰亚胺(8.90g，50.0mmol)和二硫化联苯(10.9g，49.9mmol)加热回流2小时，把反应混合物冷却到室温后，加入己烷(150ml)，将混合物搅拌30分钟。通过过滤收集产物，用己烷(50ml)洗涤，用纯乙醇重结晶得到标题化合物，其为无色晶体(6.2g，59.8％)，熔点110-112℃(lit.7115-116℃)；δH[(CD3)2SO]2.84(4H，s)，7.32(5H，m)；δC[(CD3)2SO]28.8，126.3，127.6，129.2，135.3，177.2。DMTr-Tp(s)T-Lev(B＝B′＝胸腺嘧啶-1-基)的制备
DMTr-Tp(H)(B＝胸腺嘧啶-1-基)(0.852g，1.2mmol)和HO-T-Lev(B′＝胸腺嘧啶-1-基)(340g，1.0mmol)与干燥的吡啶(2ml)共蒸发，然后在室温下将残余物重新溶解于干燥的吡啶(6ml)中，于5分钟内，向此溶液中逐滴加入N-[(2-氰乙基)硫烷基]琥珀酰亚胺(0.46g，2.5mmol)和氯代膦酸二苯基酯(0.52ml，3.5mmol)的干燥吡啶(6ml)溶液。5分钟后，加入水(1ml)，然后，将反应混合物另外搅拌5分钟，之后将其分配在二氯甲烷(50ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)中。分离有机层，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(2×30ml)进行进一步的洗涤。合并有机层，干燥(MgSO4)，在减压下浓缩，残余物通过短硅胶柱色谱分离，把用CH2Cl2-MeOH(96∶4v/v)洗脱得到的馏份蒸发，得到DMTr-Tp(s)T-Lev(B＝B′＝胸腺嘧啶-1-基)，其为无色泡沫(1.009g，99.3％)；δp[(CD3)2SO]27.9，27.7，27.0(ca.0.7％)。
本发明方法的其他实施例按如下方法进行：在室温下，5分钟内，向搅拌的H-膦酸酯单体(1.2或1.4mmol)和5′-OH组分(1.0mmol)的无水吡啶(6ml)溶液中滴加二苯基氯代膦酸酯5b(2.5mmol)和N-[(2-氰乙基)硫烷基]-或N-(苯基硫烷基)-琥珀酰亚胺(8a或8b，2.5mmol)的无水吡啶(6ml)溶液，5-25分钟后(参见总反应时间)，收集产物，用色谱进行分离，结果示于表1：
                                                      表1
项目号 H-膦酸酯单体(摩尔当量) 5’-OH组分 偶合剂 硫转移剂 总反应时间(分) 分离得到的产品收率(％)
 1  DMTr-Tp(H)(1.2) HO-T-Lev  5b  8a  10  DMTr-Tp(s)T-Lev  99.3
 2  DMTr-Tp(H)(1.2) HO-T-Lev  5b  8b  10  DMTr-Tp(s′)T-Lev  96.7
 3  DMTr-Tp(H)(1.2) HO-T-Lev  5b  8a  10  DMTr-Tp(s)T-Lev  97.6
 4  DMTr-Ap(H)(1.2) HO-C-Lev  5b  8b  10  DMTr-Ap(s′)C-Lev  96.7
 5  DMTr-Cp(H)(1.2) HO-G-Lev  5b  8a  10  DMTr-Cp(s)G-Lev  97.0
 6  DMTr-Cp(H)(1.4) HO-Tp(s)T-Lev  5b  8a  30  DMTr-Cp(s)Tp(s)T-Lev  97.4
 7  DMTr-6p(H)(1.4) HO-Cp(s)G-Lev  5b  8a  15  DMTr-Gp(s)Cp(s)G-Lev  97.0
 8  DMTr-Gp(H)(1.4) HO-Cp(s)T-Lev  5b  8a  30  DMTr-Gp(s)Cp(s)T-Lev  94.2
 9  DMTr-Tp(H)(1.4) HO-Tp(s)T-Lev  5b  8a  30  DMTr-Tp(s)Tp(s)T-Lev  95.1

Claims (16)

1.一种制备硫代磷酸三酯方法，包括：在偶合剂存在下将H-膦酸酯与醇偶合形成一种H-膦酸二酯，随后，H-膦酸二酯与硫转移剂反应形成硫代磷酸三酯，其特征在于H-膦酸酯和醇之间的偶合反应在硫转移剂的存在下发生。
2.根据权利要求1的方法，其中H-膦酸酯是含有3′-H-膦酸酯官能团的保护的核苷或低聚核苷酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中醇是含有游离5′-羟基官能团的保护的核苷或低聚核苷酸。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中偶合剂为具有分子式(ArO)2POCl的二芳基氯代膦酸酯，其中Ar表示苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中硫转移剂具有以下通式：
                    L------S------D
其中L表示离去基团，D表示芳基、甲基、取代的烷基或烯基。
6.根据权利要求5的方法，其中离去基团为吗啉-3，5-二酮、酞酰亚胺、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或吲唑，D表示4-卤代苯基，4-烷基苯基、甲基、苄基、烷基苄基、卤代苄基、烯丙基、2-丁烯基、2-氰乙基或2-(4-硝基苯基)乙基。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中H-膦酸酯和醇独立地选自脱氧核糖核苷、低聚脱氧核糖核苷、核糖核苷、2-O′-(烷基、烷氧基烷基或烯基)核糖核苷、低聚核糖核苷酸和2-O-(烷基、烷氧基烷基或烯基)低聚核糖核苷酸。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中H-膦酸酯或醇，优选醇键接到载体上。
9.根据权利要求8的方法，其中醇键接到载体上，所述醇为在5′-位上含有游离羟基的核苷或核苷酸，其通过3′-位键接到载体上。
10.根据权利要求8或9的方法，其中键接到载体上的醇和含有H-膦酸酯，偶合剂和硫转移剂的溶液接触。
11.权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述方法在液相中进行。
12.根据权利要求11的方法，其中将含有偶合剂和硫转移剂的溶液加入到含有H-膦酸酯和醇的溶液中。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用含有游离3′或5′-羟基官能团的低聚核苷酸H-膦酸酯和/或低聚核苷酸，并且该含有游离3′或5′-羟基官能团的低聚核苷酸H-膦酸酯和低聚核苷酸之一或两者均含有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述膦酸三酯含有2-8，优选2-4个核苷酸残基。
15.一种制备脱保护的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯的方法，包括：
a)在偶合剂的存在下，将含有3′或5′-H-膦酸酯官能团的保护的核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯与含有游离3′或5′-羟基官能团的保护的核苷或低聚核苷酸偶合形成H-膦酸二酯，和将该H-膦酸二酯与硫转移剂原位反应制备硫代磷酸三酯，其中H-膦酸酯和醇之间的偶合反应在硫转移剂的存在下发生；和
b)将a)中制备硫代磷酸三酯脱保护以形成脱保护的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯。
16.根据权利要求15的方法，其中随后对脱保护的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯进行纯化。
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