CZ20022930A3

CZ20022930A3 - Způsob výroby fosfonothioátových triesterů

Info

Publication number: CZ20022930A3
Application number: CZ20022930A
Authority: CZ
Inventors: Colin Bernard Reese
Original assignee: Avecia Limited
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2002-11-13
Also published as: US20030099981A1; WO2001064702A1; KR20030032924A; PL362067A1; CN1406242A; GB0004889D0; DK1272501T3; DE60103145D1; EP1272501B1; CA2401083A1; NO20024155D0; CN1262557C; MXPA02008530A; EP1272501A1; NO20024155L; AU2001235766B2; JP2003525305A; ATE266037T1; HUP0204249A2; HUP0204249A3

Description

Způsob výroby fosfonothioátových triesterů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby fosfonothioátových triesterů, obzvláště oligonukleotidů včetně oligonukleotidových fosfonothioátů

Dosavadní stav techniky

V posledních patnácti letech byl učiněn enormní pokrok v rozvoji syntézy oligodeoxyribonukletidů (DNA sekvence), oligoribonukleotidů (RNA sekvence) a jejich analogů. Zvýšený zájem o terapeutické aplikace DNA a RNA sekvencí vedl ke zvýšenému zájmu o větší množství těchto materiálů a bylo učiněno hodně práce v oblasti rozšíření měřítka výroby oligoneukletidů. Prakticky všechna tato práce zahrnovala sestrojování větších a větších syntetizátorů a využití fosforamiditové chemie na pevných nosičích. Alternativní postup syntézy oligonukleotidů je popsán v mezinárodní patentové přihlášce W099/09041. Popsaný postup používá postupně kapling a krok přenosu síry v roztoku.

Podstata vynálezu

V prvním aspektu tohoto vynálezu je popsán způsob výroby fosfonothioátových triesterů, zahrnující kapling H-fosfonátů s alkoholem v přítomnosti kondenzačního činidla za vzniku Hfosfonát-diesterů a následnou reakci fosfonát-diesteru s činidlem přenášejícím síru, což vede ke vzniku fosfonothioátových triesterů, přičemž tento způsob výroby je

9 · ·

9 9 9 9 99 • 99999 99 « 9 9 9 9 9

9999 99 99 99

9

9999 charakterizován tím, že kondenzační reakce mezi H-fosfonátem a alkoholem probíhá v přítomností činidla přenášejícího síru.

V mnoha preferovaných provedeních je popsáno sekvenční provedení reakce, kde H-fosfonát reaguje s alkoholem v přítomnosti kondenzačního činidla a H-fosfonát diester vzniklý in šitu v reakci velmi rychle reaguje s činidlem přenášejícím síru, přítomném v reakční směsi, jak je uvedeno v příkladu reakčního schématu:

kde Z, Z' a Z'' nezávisle reprezentují chránící skupiny, B a B' jsou nezávisle nukleové báze a každé Y nezávisle reprezentuje H, O-alkyl, O-alkenyl, O-chránící skupinu, Calkyl nebo C-alkenyl.

H-fosfonátem používaným ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu je s výhodou chráněný nukleosid nebo oligonukleotid H-fosfonát nebo jejich analogy, s výhodou zahrnující 5' nebo 3' H-fosfonátovou funkci, obzvláště výhodně 3' H-fosfonátová funkce. Preferované nukleosidy jsou 2' -deoxyribonukleosidy a ribonukleosidy; preferované oligonukleotidy jsou oligodeoxyribonukleotidy a oligoribonukleotidy.

Když H-fosfonát je chráněný deoxyribonukleosidový, ribonukleosidový, oligodeoxyribonukleotidový nebo • · · · 9 · 9 ·

• · · • 9 • · ··· · oligoribonukleotidový derivát zahrnující 3'H-fosfonátovou funkci, 5' hydroxylová funkce je s výhodou chráněná vhodnou chránící skupinou. Příklady těchto vhodných chránících skupin zahrnují chránící skupiny labilní v kyselém prostředí, obzvláště tritylové a substituované tritylové skupiny jako je dimethoxytritylová a 9-fenylxanthen-9-ylová skupina, popř. chránící skupiny labilní v bazickém prostředí jako je FMOC.

Když je H-fosfonátový stavební blok chráněný deoxyribonukleosidový, ribonukleosidový, oligodeoxyribonukleotidový nebo oligoribonukleotidový derivát zahrnující 5' H-fosfonátovou funkci, 3' hydroxyskupina je s výhodou chráněná vhodnou chránící skupinou. Vhodné chránící skupiny zahrnují výše popsané skupiny pro chránění 5' hydroxylové funkce 3' H-fosfonátových stavebních bloků a acyl jako je třeba levulinoylová a substituovaná levulinoylová skupina.

Když je H-fosfonát chráněný ribonukleosid nebo chráněný oligoribonukleotid 2'-hydroxylová funkce je s výhodou chráněná vhodnou chránící skupinou, např. acetálovou chránící skupinou labilní v kyselém prostředí, obzvláště 1-(aryl)-4alkoxypiperidin-4-ylová skupinou jako je 1-(2-fluorfenyl)-4methoxypiperidin-4-yl (Fpmp) nebo 1-(2-chlorfenyl)-4ethoxypiperidin-4-yl (Cpep) a trialkylové skupiny, často tri(Cl-4-alkyl)silylové skupiny jako je terč. butyldimethylsilylová skupina. Alternativně, ribonukleosid nebo oligonukleotid může být 2'-O-alkylový, 2’-O-alkoxyalkylový nebo 2'-O-alkenylový derivát, obvykle Ci_₄ alkylový, Ci_₄alkoxyCi_₄alkylový nebo alkenylový derivát, přičemž v tomto případě poloha 2' nepotřebuje chránění. H-fosfonáty nukleosidových a oligonukleotidových analogů, které mohou být použity ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu zahrnují 2'fluor-, 2'-amino-, 2'-C-alkyl- a 2’-C-alkenyl-substituované nukleosidové a oligonukleotidové deriváty.

* ♦ • · ♦ 1 • · • fc fcfc <

• · · · · • · · · fc fcfcfc fc · ♦ 9 9 • · · · · · 4 • fc ·· • 9 · ·

9 · ♦ · · 9

9 9

9999

Další H-fosfonáty, které mohou být použity ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu, jsou odvozeny od jiných polyfunkčních alkoholů, obzvláště alkyla-lkoholů a s výhodou diolů nebo triolů. Příklady alkyldiolů zahrnují ethan-1,2diol a póly(ethylenglykoly) s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou ty, které mají hmotnost do 400. Příklady alkyltriolů zahrnují glycerín a butantrioly. Obvykle bude přítomna pouze jedna H-fosfonátová funkce, zbývající hydroxyskupiny jsou chráněny vhodnými chránícími skupinami jako jsou skupiny popsané výše pro chránění 5' nebo 2' poloh ribonukleosidů.

Alkohol použitý ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu je obvykle chráněný nukleosid nebo oligonukleotid obsahující volnou hydroxyskupinu, s výhodou volnou 3' nebo 2' polohu ribonukleosidů.

Když je alkohol chráněný oligonukleotid, preferované deoxyribonukleosidy oligonukleosidy oligoribonukleotidy.

Když j e ribonukleosidový, oligonukleotidový a

j sou nukleosid nebo chráněný nukleosidy jsou ribonukleosidy a preferované oligodeoxyribonukleotidy a alkoholem deoxyribonukleosidový, oligodeoxyribonukleotidový nebo derivát obsahující volnou 5'hydroxyskupinu, 3'-hydroxyskupina je s výhodou chráněna vhodnou chránící skupinou. Příklady takovýchto chránících skupin zahrnují acylové skupiny, obvykle obsahujících až 16 atomů uhlíku, jako třeba acylové skupiny odvozené od gamaketokyselin jako třeba levulinoylová a substituovaná podobné skupiny. Substituované levulinoylová skupina a levulinoylové skupiny obzvláště zahrnuj í halogensubstituované levulinoylové skupiny jako třeba 5,5,5tríjřluorlevulinoyl, analogické skupiny zahrnují např.

♦ · ·· ·♦ • · « ·

9 9 ·99

9

99 9 ·9 «· ·· ·· ·· » · · · · · · 9 ·· 99 9

9 9 9 9 · 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99 9 9 benzoylpropionylové skupiny. Další takovéto chránící skupiny zahrnují mastné alkanoylové skupiny, benzoylové a substituované benzoylové skupiny, jako třeba benzoylové skupiny substituované s alkylem, obvykle alkylem majícím 1 až 4 atomy uhlíku, a halogenem, obvykle s chlorem nebo fluorem, a silylethery, jako alkylsilylethery, obvykle s alkyly majícími 1 až 4 atomy uhlíku, a arylsilylethery, obvykle fenylsilylethery, obzvláště terč.butyidimethylsilylová a terč.butyldifenylsilyletherová skupina.

Když je alkoholem chráněný deoxyribonukleosid, ribonukleosid, oligodeoxyribonukleotid nebo oligoribonukleotid obsahující volnou 3'-hydroxyskupinu je 5'hydroxyskupina s výhodou chráněna vhodnou chránící skupinou. Vhodné chránící skupiny jsou ty, které byly popsány výše pro chránění 5'-hydroxyskupiny deoxyribonukleosidů, ribonukleosidů, oligodeoxyribonukleosidů a oligoribonukleotid 3' H-fosfonátů.

Když je alkoholem ribonukleosid nebo oligoribonukleotid je 2'-hydroxyskupina s výhodou chráněna vhodnou chránící skupinou jako jsou acetálové chránící skupiny, obzvláště 1(aryl)-4-alkoxypiperidin-4-ylová skupina jako třeba l—(2— fluorfenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl (Fpmp) nebo 1-(2chlorfenyl)-4-ethoxypiperidin-4-yl (Cpep); a trialkylsilylové skupiny, často tri (Ci_₄ alkyl) silylové skupiny jako je terč.butyidimethylsilylová skupina. Alternativně může být ribonukleosid nebo oligoribonukleotid 2’-O-alkylový, 2'-0~ alkoxyalkylový nebo 2'-O-alkenylový derivát, obvykle Ci-₄alkylový, Ci_₄ alkoxyCi-₄alkylový nebo alkenylový derivát, přičemž v tomto případě nepotřebuje poloha 2' žádnou další ochranu. Nukleosidové a oligonukleotidové analogy, které mohou být použity jako alkoholy ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu zahrnují 2'-fluor, 2'-amino, 2'-C-alkyl a 2'φφ φφ φφ φ« φφ ·♦

ΦΦΦ»Φ*·Φ«*·· ·····»* · · · • ··· · · ·· ·«· · t φ φ φφφ» φφφ ···· φ* »· φ· ·· »»»»

C-alkenyl-substituované nukleosidové a oligonukleotidové deriváty.

Další alkoholy, které mohou být použity ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu jsou nesacharidové polyoly, obzvláště alkylpolyoly a s výhodou dioly nebo trioly. Příklady alkyldiolů zahrnují ethan-1,2-diol a póly(ethylenglykoly) s nízkou molekulovou hmotností jako ty, které mají molekulovou hmotnost do 400. Příklady alkyltriolů Nahrnují glycerín a butantrioly. Obvykle bude přítomna pouze jedna volná hydroxylové skupina, zbývající hydroxyskupiny jsou chráněny vhodnými chránícími skupinami jako třeba těmi, které byly popsány výše pro chránění poloh 5' nebo 2' ribonukleosidů. Ovšem může být přítomna více než jedna volná hydroxyskupina, pokud je to potřeba k provedení stejné kondenzace na více než jedné hydroxyskupiny.

Jestliže se použije jeden nebo oba oligonukleotid Hfosfonáty nebo oligonukleotid obsahující volnou hydroxyskupinu, jsou internukleotidová spojení, která mohou zahrnovat fosfátové, fosfonothioátové nebo jak fosfátové tak i fosfonothioátové spojení, s výhodou chráněny. Příklady chránících skupin jsou dobře známy v současném stavu techniky a zahrnují arylové skupiny, methyl nebo substituované alkylskupiny, s výhodou 2-kyanoethylskupiny, a alkenylové skupiny.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu může být prováděn v roztoku. Když se použije syntéza v roztoku, organická rozpouštědla, která mohou být použita e způsobu výroby podle tohoto vynálezu, zahrnují haloalkany, obzvláště dichlormethan, estery, obzvláště alkylestery jako je ethylacetát a methyl- nebo ethyl-propionát, amidy jako třeba dimethylformamid, N-methylpyrrolidinon a. N',N'dimethylimidazolidinon, a bazická nukleofilní rozpouštědla

» φ

« φ

φ φφφφ φφ φ φ * · φφ φφ φ φ «φ φφφφ jako je třeba pyridin. Preferovaná rozpouštědla pro kapling a činidla pro přenos síry zahrnují pyridin, dichlormethan a jejich směsi, obzvláště výhodně pyridin. Použitá organická rozpouštědla jsou s výhodou prakticky suchá.

V některých provedeních tohoto vynálezu je H-fosfonát nebo alkohol, s výhodou alkohol, připojen na tuhý nosič. Výhodněji, alkohol připojený k tuhému nosiči je nukleosid nebo nukleotid mající volnou hydroxyskupinu v poloze 5' a je připojen k tuhému nosiči pomocí polohy 3'. Tuhé nosiče, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, jsou v podstatě nerozpustné v použitém rozpouštědle a zahrnují takové nosiče, které jsou dobře známé v současném stavu techniky pro syntézu oligonukleotidů na pevné fázi. Příklady zahrnují silikagel, sklo s definovanou velikostí pórů, polystyren, kopolymery zahrnující polystyren jako jsou kopolymery polystyrenpoly(ethylenglykol) a polymery jako jsou polyvinylacetát. Kromě toho mohou být podle potřeby použity póly(akrylamidové) nosiče, jako jsou ty, které se běžně používají pro syntézu peptidů na pevné fázi.

Když je použit pevný nosič, alkohol nebo H-fosfonát, nej častěji alkohol, je běžně vázán k pevnému nosiči prostřednictvím štěpitelné spojky, s výhodou prostřednictvím polohy 3' . Příklady spojek, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, jsou dobře známé odborníkům v oboru syntézy oligonukleotidů v pevné fázi a jsou to např. urethanové, oxalylové, sukcinylové spojky a spojky odvozené od aminoskupiny.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu může být prováděn mícháním směsi alkoholu nebo H-fosfonátu vázaného k pevnému nosiči v roztoku H-fosfonátu nebo alkoholu, kaplovacího činidla a činidla přenášejícího síru. Alternativně může být pevný nosič nanesen do kolony a roztok H-fosfonátu,

V» ·>*

4 4

4

4 4

4 4 4

4« 4» * 4 4 « • 4 4 ♦ 44

4 · kaplovacího činidla a činidla přenášejícího síru může být protlačován přes kolonu.

Jsou-li H-fosfonát a alkohol oba chráněné nukleosidy nebo oligonukleosidy, vynález popisuje vylepšený způsob krokové a blokové syntézy oligodeoxyribonukleotidů, oligoribonukleotidů a jejich analogů, založený na Hfosfonátových kaplovacích reakcích. Podle preferovaného provedení tohoto vynálezu se nechají reagovat chráněné nukleosidy nebo oligonukleotidy s 3'-terminální Hfosfonátovou funkcí a chráněné nukleosidy nebo oligonukleotidy s 5'-terminální hydroxylovou funkcí v přítomnosti jak vhodného kaplovacího činidla tak i vhodného činidla pro přenos síry, přičemž se tvoří chráněný dinukleosidový nebo oligonukleotidový H-fosfonátový intermediát a zmíněný intermediát podléhá přenosu síry pomocí in šitu reakce s vhodným činidlem pro přenos síry.

Kromě přítomnosti chráněných hydroxyskupin jsou podle potřeby s výhodou chráněny vhodnou chránící skupinou také báze přítomné v nukleosidech/nukleotidech použitých podle tohoto vynálezu. Organické báze, které mohou být přítomny, zahrnují nukleobáze jako jsou přírodní nebo nepřírodní nukleobáze a obzvláště puriny jako je hypoxanthin a obzvláště A a G, pyrimidiny jako jsou T, C a U. Použité chránící skupiny jsou takové, které jsou známé v oboru chránění těchto bází. Například, A a C mohou být chráněny benzoylem, včetně substituovaného benzoylu, jako třeba benzoylu substituovaného s alkylovou nebo alkoxylovou skupinou jako třeba Ci_₄ alkyl nebo Ci_₄alkoxy-skupinou, benzoylem, pivaloylem a amidinem, obzvláště dialkylaminomethylenem, s výhodou di(Ci~₄alkyl)aminomethylenem jako je dimethyl nebo dibutylaminomethylen. G může být ochráněn na 06 například pomocí fenylové skupiny, včetně substituovaného fenylu, např. 2,5-dichlorfenyl a také • · · 9 *44 9 · ·

»4 »9

9 9 « 94 · • « 9 9 4 9 « ♦ « 4 9

9 4 *4 • · · ·

»·»· na N2 např. pomocí acylové skupiny jako je isobutyrylová skupina. T a U obecně nevyžadují chránění, ovšem v některých provedeních tohoto vynálezu mohou být výhodně ochráněny např. na 04 pomocí fenylové skupiny, včetně substituované fenylové skupiny jako např. 2,4-dimethylfenyl nebo na N3 pomocí pivaloyloxymethylové skupiny, benzoylové skupiny, alkyl nebo alkoxysubstituované benzoylové skupiny jak je Ci_₄alkyl- nebo Ci_₄alkoxybenzoyl.

Když je alkohol a/nebo H-fosfonát chráněný nukleosid nebo oligonukleotid, mající chráněnou hydroxyskupinu, jedna z hydroxy-chránících skupin může být odstraněna po provedení způsobu výroby podle tohoto vynálezu za účelem dalšího kaplingu v tomto místě. Odstraněná chránící a následná reakce provedená na tomto místě budou záviset na typu připravované molekuly. Když se kapling bude provádět v roztoku, může být odstraněnou chránící skupinou 3'-hydroxyskupina. Takto vzniklý oligonukleotid může být převeden na H-fosfonát a poté může být podroben dalším kaplingům podle způsobu výroby podle tohoto vynálezu, např. s nukleosidem nebo oligonukleotidem obsahujícím 5'-hydroxyskupinu, při syntéze požadované oligonukleotidové sekvence. Je-li kapling prováděn v roztoku, je s výhodou odstraňována 5'-chránící skupina. Ta může být převedena na H-fosfonátovou skupinu a dále kaplována s volnou hydroxyskupinou, jako třeba s hydroxyskupinou 3' . Je ovšem preferováno, když se odchráněná 5'-hydroxyskupina nechá reagovat s nukleosidem nebo oligonukleotidem obsahujícím 3'-H fosfonátovou skupinu. Když se provádí kapling s využitím syntézy na pevné fázi, s výhodou s oligonukleotidem navázaným na pevný nosič prostřednictvím polohy 3', je s výhodou odstraněna chránící skupina v poloze 5'. Volná 5'hydroskupina může být převedena na H-fosfonátovou skupinu a použita v dalším kaplingu. Nejvíce je ovšem preferováno, když > « • ·

• 9 9»

9 · 9 · 9 9

9 9 9 · · 9 ·· 9» se volná 5'-hydroxyskupina nechá kaplovat s nukleosidovým nebo oligonukleotidovým H-fosfonátem, nejvýhodněji s 3'-H fosfonátem. Je zřejmé, že odpovídající reakce mohou být použity tam, kde je oligonukleotid navázán na tuhý nosič prostřednictvím polohy 5' . Podle potřeby mohou být volné hydroxyskupiny převedeny na H-fosfonátové skupiny s využitím postupů známých v oboru. Po provedení požadovaného kaplingu může způsob výroby pokračovat podle potřeby s odstraněním chránících skupin z internukleotidového spojení, 3'- a 5'hydroxyskupin a z bází kvůli oddělení produktu .z pevného nosiče.

V obzvláště preferovaném provedení poskytuje vynález způsob výroby zahrnující kapling 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)2'-deoxyribonukleosidového nebo ribonukleosidového 3'-Hfosfonátu nebo chráněného oligodeoxyribonukleotidového nebo oligoribonukleotidového 3'-H-fosfonátu a komponentou mající 5'-hydroxyfunkci v přítomnosti jak vhodného kaplovacího činidla tak i vhodného činidla pro přenos síry.

Ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu může být použito libovolné vhodné kaplovací činidlo nebo činidlo pro přenos síry známé v současném stavu techniky.

Příklady vhodných kaplovacích činidel zahrnují alkyl a arylacylchloridy, alkan- a arensulfonylchloridy, alkyl a arylchlorformiáty, alkyl a aryichlorsulfity a alkyl a arylfosforochloridáty.

Příklady vhodných alkylacylchloridů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují C₂ až Ci₈alkanoylchloridy, včetně lineárních a cyklických alkanoylchloridů, a obzvláště pivaloylchlorid a adamantankarbonylchlorid. Příklady arylacylchloridů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují substituované a nesubstituované benzoylchloridy jako jsou Ci11 to· ·· to* toto > · to · · · · · • · ·· · · · • · · to·· · · • · · · · · · ·· toto toto·· obzvláště ···· ·*

C₄-alkoxysubstituované, halogensubstituované, chlor- a brom-substituované, a C1-4 alkylsubstituované benzoylchloridy. Jsou-li substituovány, obvykle jsou přítomny 1 až 3 substituenty, obzvláště v případě alkyl a halogen substituentů.

Příklady vhodných alkansulfonylchloridů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují Ci až Ci₆alkansulfonylchloridy. Příklady arensufonylchloridů, použitelných podle tohoto vynálezu, zahrnují substituované a nesubstituovaná benzensulfonylchloridy jako jsou Ci_4 alkoxysubstituované, halogensubstituované, obzvláště fluor-, chlora brom-substituované a C1-4 alkylsubstituované benzensulfonylchloridy. Jsou-li substituovány, obvykle jsou přítomny 1 až 3 substituenty, obzvláště v případě alkyl a halogen substituentů.

Příklady vhodných alkyl-chlorformiátů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují C₂ až Ci₆ alkylchlorformiáty. Příklady vhodných aryl-chlorformiátů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují substituované nebo nesubstituovaná fenyl-chlorformiáty, jako jsou C1-4 alkoxy-substituované, halogensubstituované, obzvláště fluor-, chlor- a brom-substituované a C1-4 alkylsubstituované fenyl-chlorformiáty. Jsou-li substituovány, obvykle jsou přítomny 1 až 3 substituenty, obzvláště v případě alkyl a halogen substituentů.

Příklady vhodných alkyl-chlorsulfitů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují Ci až Ci6 alkylchlorsulfity. Příklady vhodných aryl-chlorsulfitů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují substituované nebo nesubstituované fenyl-chlorsulfity, jako jsou C1-4 alkoxy-substituované, halogensubstituované, obzvláště fluor-, chlor- a brom-substituované a Ci_₄ • · alkylsubstituované fenyl-chlorsulfity. Jsou-li substituovány, obvykle jsou přítomny 1 až 3 substituenty, obzvláště v případě alkyl a halogen substituentů.

Příklady vhodných alkyl-fosfonochloridátů, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují di(Ci až C₆alkyl)-fosfonochloridáty. Příklady vhodných arylfosfonochloridátů, které mohou být použity podle tohoto nebo nesubstituované jsou Ci-4 alkoxyvynálezu, zahrnují substituované difenyl- fosfonochloridáty, jako substituované, halogensubstituované, obzvláště fluor-, chlora brom-substituované a Ci-₄ alkylsubstituované difenylfosfonochloridáty. Jsou-li substituovány, obvykle jsou přítomny 1 až 3 substituenty, obzvláště v případě alkyl a halogen substituentů.

Další kaplovací činidla, která mohou být použita, jsou chlor-, brom- a (benzotriazo-l-yloxy)fosfoniové a karboniové sloučeniny, popsané ve Wada et al., J. Amer. Chem. Soc. 1997, 119, str. 12710-12721 (zahrnutý zde jako reference).

Preferovaná kaplovací činidla jsou diarylfosfonochloridáty, obzvláště takové, které mají vzorec (ArO)₂POCl, kde Ar je s výhodou fenyl, 2-chlorfenyl, 2,4,6trichlorfenyl nebo 2,4,6-tribromfenyl.

Druh činidla přenášejícího síru bude záviset na tom, zda je požadován oligonukleotid, fosfonothioátový analog nebo směsný oligonukleotid/oligonukleotidový fosfonothioát. Činidla přenášející síru používaná ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu mají často obecný vzorec:

L----S----D kde L reprezentuje odstupující skupinu a D představuje arylovou skupinu, methyl nebo substituovanou alkylovou skupinu, s výhodou 2-kyanoethylovou skupinu nebo alkenylovou skupinu. Běžně se odstupující skupina vybírá tak, aby • 0

0 » 0· « » 0 0 0

0 0 0 0 « zahrnovala vazbu dusík-síra. Příklady vhodných odstupujících skupin zahrnují imidy jako jsou morfoliny jako třeba morfolin-3,5-dion, ftalimidy, sukcinimidy a maleinimidy, indazoly, obzvláště indazoly s elektron-přitahujíčími substituenty jako je 4-nitroindazol a triazoly.

Kde je v konečném produktu vyžadováno standardní fosfonodiesterové spojení, představuje skupina D v činidlu přenášejícím síru arylovou skupinu jako je fenyl nebo naftylová skupina. Příklady vhodných arylových skupin zahrnují substituované nebo nesubstituované fenylové skupiny, obzvláště halogensubstituované fenylové a alkylfenylové skupiny, obzvláště 4-halofenyl a 4-alkylfenyl, obvykle 4(Ci_₄alkyl) fenylové skupiny, nejvýhodněji 4-chlorf enylové a ptolylové skupiny. Příklad vhodné skupiny standardního činidla pro přenos síry reagujícího s fosfordiesterem je N(arylsulfanyl)ftalimid nebo N-(arylsulfanyl)sukcinimid, např. N-(fenylsulfanyl)suksinimid (nebo mohou být použity jiné imidy jako jsou maleinimidy).

Tam kde je ve finálním produktu vyžadováno fosfonothioátové spojení, reprezentuje skupina D methyl, substituovanou alkylovou nebo alkenylovou skupinu. Příklady vhodných substituovaných alkylových skupin zahrnují substituované methylové skupiny, obzvláště benzylovou a substituované benzylové skupiny, jako jsou alkylsubstituované, obvykle Ci-₄alkylsubstituované, obvykle alkoxysubstituované, nitrosubstituované

Ci-₄alkoxy substituované, a halogensubstituované, obvykle chlorsubstituované benzylové skupiny a substituované ethylové skupiny, obzvláště ethylové skupiny substituované v poloze 2 se substituenty přitahujícími elektrony jako je 2-(4nitrofenyl)ethylová a 2-kyanoethylová skupina. Příklady vhodných alkenylových skupin jsou allylová, krotylová a 4• · • · • · ♦ · • 9 · Φ ·· ·· • · · Φ

Φ Φ · kyanobut-2-enylová skupina. Příklady vhodných skupin činidel přenášejících síru poskytujících fosfonothioáty jsou (2kyanoethyl)sulfanylové deriváty jako jsou 4-[(2-kyanoethyl)sulfanyl]morfolin-3,5-dion nebo odpovídající činidla jako je 3-(ftalimidosulfanyl)propannitril nebo preferovanější 3(sukcinimidosulfanyl)propannitril.

V mnoha provedeních tohoto vynálezu je činidlo přenášející síru vybráno tak, aby reagovalo rychleji s Hfosfonátovým diesterem, obzvláště H-fosfonátovým diesterem vzniklým kaplingem H-fosfonátu a alkoholu, než s Hfosfonátovým monoesterem a/nebo s aktivovanou částicí vzniklou reakcí H-fosfonátového monoesteru s kaplovacím činidlem.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu může být běžně prováděn při teplotách v rozmezí od asi -55 °C do asi 35 °C. S výhodou se teplota pohybuje v rozmezí od asi 0 °C do přibližně 30 °C. Nejvýhodněji se používá laboratorní teplota (běžně v rozsahu od 10 do 25 °C, například přibližně 25 °C).

Molární poměr H-fosfonátu k alkoholu ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu je často vybrán tak, aby byl v rozmezí od 0,9:1 do 3:1, běžně od 1:1 do asi 2:1 a s výhodou od 1,1:1 do asi 1,5:1, jako třeba 1,2:1 při přípravě dimerů nebo asi 1,4:1 při přípravě vyšších jednotek. Ovšem, kde dochází současně ke kaplingu na více než jedné volné hydroxylové skupině, molární poměr bude úměrně zvýšen. Molární poměr kaplovacího činidla k alkoholu je často vybrán tak, aby byl v rozmezí od asi 1:1 do přibližně 10:1, běžně od asi 1,5:1 do asi 6:1 a s výhodou od asi 2:1 do přibližně 4:1. Molární poměr činidla pro přenos síry k alkoholu je často vybrán tak, aby byl v rozmezí od asi 1:1 db přibližně 10:1, běžně v rozmezí od 1,5:1 do asi 5:1 a s výhodou od asi 2:1 do přibližně 3:1.

• · ·

Ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu mohou být Hfosfonát a alkohol předem smíchány v roztoku a směs kaplovacího činidla a činidla přenášejícího síru může být přidána k této směsi. Reakční podmínky jsou běžně kontinuální nebo se mění během doby přidávání.

Koncentrace použitého kaplovacího činidla a činidla pro přenos síry v roztoku budou často záviset na druhu použitého rozpouštědla. Běžně se používají koncentrace až do 0,5 M, například koncentrace v rozmezí od 0,05 M do 0,35 Μ. V mnoha provedeních je používána koncentrace činidla pro přenos síry přibližně 0,2 M a koncentrace kaplovacího činidla přibližně 0,3 M.

Když se použijí H-fosfonát a alkohol nebo jeden z nich v roztoku, použitá koncentrace bude záviset na druhu rozpouštědla a obzvláště na molekulové hmotnosti H-fosfonátu nebo alkoholu. Mohou být použity koncentrace v rozmezí popsaném pro kaplovací činidla a činidla pro přenos síry, ačkoliv mnohá provedení tohoto vynálezu používají koncentrace přibližně 0,1 M.

Ve způsobu výroby podle tohoto vynálezu je možné připravit oligonukleotidy obsahující jak fosfonodiesterová tak i fosfonothioátová diesterová spojení mezi nukleotidy v jedné molekule, a to výběrem vhodného činidla pro přenos síry, obzvláště když se proces provádí postupně.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu se s výhodou používá pro přípravu oligonukleotidů typicky obsahujících 2 nebo více nukleotidových zbytků. Horní hranice bude záviset na délce požadovaného oligonukleotidu. Oligonukleotidy připravované podle tohoto vynálezu často obsahují až 40 nukleotidových zbytků, běžně až 35 nukleotidových zbytků a s výhodou od 5 do 25 jako třeba od 8 do 20 nukleotidových zbytků. Kaplovací krok a krok přenosu síry ve způsobu výroby podle tohoto • · • · vynálezu se opakují dostatečněkrát násobně za vzniku sekvence požadované délky. Způsob výroby podle tohoto vynálezu je obzvláště vhodný pro přípravu oligonukleotidů obsahujících 2,

3, 4, 5 nebo 6 nukleotidových zbytků a obzvláště dimerů, trimerů a tetramerů.

Jak bylo uvedeno dříve, způsob výroby podle tohoto vynálezu může být použit při syntéze sekvencí RNA, 2'-0alkyl-RNA, 2'-O-alkoxyalkyl-RNA a 2'-O-alkenyl-RNA. 2'-0(chránící skupina např. fpmp)-5'-0-(4,4-dimethoxytrityl)ribonukleosid 3'-H-fosfonáty 9 a 2'-O-(alkyl, alkoxyalkyl nebo alkenyl)-5'-0-(4,4-dimethoxytrityl)-ribonukleosid 3'-Hfosfonáty lOa-c mohou být připraveny např. z odpovídajících chráněných nukleosidových stavebních bloků, amonium-p-kresyl H-fosfonátu a pivaloylchloridu.

Et₃N⁺H

10a R = Me

10b R = CH₂CH=CH₂

10c R = CH₂CH₂OMe

Pro chemoterapeuticky užitečné ribozymové sekvence je předmětem značné praktické důležitosti syntéza RNA v relativně velkém měřítku. Zabudování 2'-O-alkyl-, 2'-0substituovaný alkyl- a 2'-0-alkenyl [obzvláště 2'-0-methyl, 2'-O-allyl a 2'-0-(2-methoxyethyl)]ribonukleosidů (Sproat, B. S., v Methods in Molecular Biology, vol. 20. Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Agrawai, S., Ed., Humana Press, Totowa, 1993) do oligonukleotidů je v současné době velmi důležité, protože tyto modifikace vykazují jak resistenci • · vůči trávení nukleásou tak i dobré hybridizační vlastnosti výsledných oligomerů.

Krok přenosu síry se provádí na produktu kaplingu Hfosfonátu in šitu, to jest bez separace a čištění intermediátu vzniklého kaplovací reakcí. S výhodou se činidlo pro přenos síry přidává současně s kaplovacím činidlem. Použité činidlo pro přenos síry a kaplovací činidlo se vybírá tak, aby byly minimalizovány vedlejší reakce, tedy aby rychlost kaplingu byla favorizována ve srovnání s rychlostí vedlejší reakce monoester-H-fosfonátu s činidlem pro přenos síry. Výběr činidel je ovlivněn druhem použitého H-fosfonátu a alkoholu, které mají být zkondenzovány.

Způsob kaplingu podle tohoto vynálezu se liší od postupu využívajícího H-fosfonátový přístup k syntéze v tuhé fázi (Froehler et al., Methods in Molecular Biology, 1993) v tom, že přenos síry se provádí v každém kaplovacím kroku spíše než v jednom kroku následujícím po vytvoření celé sekvence oligomerů.

Chránící skupiny mohou být odstraněny s využitím způsobů známých v oboru chránících skupin a funkcí. Například, přechodné chránící skupiny, obzvláště gama-ketokyseliny jako jsou chránící skupiny levulinoylového typu, mohou být odstraněny reakcí s hydrazinem, např. pufrovaným hydrazinem, jako třeba reakcí s hydrazinem za velmi mírných podmínek popsaných v van Boom, J. H.; Burgers, Ρ. M. J. Tetrahedron Lett., 1976, 4875-4878. Vzniklé částečně chráněné oligonukleotidy s volnými 3'-hydroxy funkcemi mohou být poté převedeny na odpovídající H-fosfonáty, které jsou intermediáty jež mohou být použity pro blokovou syntézu oligonukleotidu a jejich fosfonothioátových analogů.

Při deprotekcí požadovaného produktu po jeho přípravě, jsou obvykle nejdříve odstraněny chránící skupiny na fosforu • · * · « • « * ' ·

9 9 9

99999 · ·

999 · ·· <

99

9 9 9

9999 produkujícím fosfonothioátová spojení. Například, kyanoethylová skupina může být odstraněna reakcí se silně bazickým aminem jako je DABCO, 1,5-diazabicyklo[4.3,0]non-5(DBU) nebo na na en (DBN), 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en triethylamin.

Fenylové a substituované fenylové skupiny fosfonothioátových mezinukleotidových spojeních a bazických zbytcích mohou být odstraněny reakcí s oximátem, např. s konjugovanou bází aldoximu, s výhodou odvozenou od E2-nitrobenzaldoximu nebo pyridin-2-karbaldoximu (Reese et al., NUcleic Acids Res. 1981). Kamimura, T. et al., v J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 4552-4557 a Sekine, M. et al.,

Tetrahedron, 1985, 41, 5279-5288 v přístupu k syntéze oligonukleotidů fosfonotriesterovou metodou v roztoku založené na S-fenylfosfonothioátových intermediátech; a van Boom a jeho spolupracovníci v přístupu k syntéze oligonukleotidů, založené na S-(4-methylfenyl)fosfonothioátových intermediátech (Wreesman, C. T. J. et al., Tetrahedron Lett., 1985, 26, 933-936) demonstrovali, že odblokování S-fenylfosfonothioátů s oximátovými ionty (s využitím metody Reese et al., 1978; Reese, C. B., Zard, L. Nucleic Acids Res., 1981, 9, 4611-4626) vede k přirozeným fosfonodiesterovým internukleotidovým spojením. V tomto vynálezu probíhá odblokování S-(fenyl)-chráněných fosfonothioátů s konjugovanou bází E-2-nitrobenzaldoximu hladce a s neměřitelným štěpením internukleotidových spojení.

Další bazické chránící skupiny jako jsou např. benzoylové, pivaloylové a amidinové skupiny mohou být odstraněny reakcí s koncentrovaným vodným amoniakem.

Tritylové (včetně monomethoxy- a dimethoxy-tritylových) skupiny mohou být odstraněny reakcí s kyselinou. S ohledem na celkovou strategii odchránění při syntéze *9 * 4 · 4 • · ·

944 · • ·

4 4 9 · ·

4 »

4 94

4 4 9

4 4 4

4 9 4

44 • 4 4 4

4 4

4 4 4

4 4

4944 oligodeoxyribonukleotidů je dalším důležitým rysem tohoto vynálezu, že odstraňování trytylové chránící skupiny, často 5'-terminální DMTr, (detritylace) by měla probíhat bez současné depurinace, obzvláště jakýchkoliv 6-N-acyl-2'deoxyadenosinových zbytků. Podle jednoho z provedení tohoto vynálezu přihlašovatelé shledali, že takováto depurinace, které je patrně obtížné se vyhnout při syntéze v tuhé fázi, může být zcela potlačena provedením „detritylace” s ředěným roztokem chlorovodíku při nízké teplotě, obzvláště s 0,45 M chlorovodíkem v dioxanu-dichlormethanu (1:8 v/v) při -50 °C. Za těchto podmínek může být „detritylace provedena rychle a v některých případech již po 5 nebo méně minutách. Například, když byl nechán 6-N-benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'deoxyadenosin reagovat s roztokem chlorovodíku v dioxanudichlormethanu za těchto podmínek, „detritylace” byla ukončena po 2 min, ovšem depurinace nebyla detekována ani po 4 hod.

Silylové chránící skupiny mohou být odstraněny reakcí s fluoridem, např. s roztokem tetraalkylamonného fluoridu jako je tetrabutylamonium-fluorid.

Fpmp chránící skupiny mohou být odstraněny kyselou hydrolýzou za mírných podmínek.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu může být použit pro přípravu oligonukleotidových sekvencí s (a) výlučně fosfonodiesterovými, (b) výlučně fosfonothioát diesterovými a (c) kombinací jak fosfonodiesterových tak i fosfonothioát diesterových internukleotidových spojení.

Je-li způsob výroby podle tohoto vynálezu aplikován na blokovou syntézu, bude zřejmé, že je v rámci požadovaného produktu možná řada alternativních strategií. To bude záviset na druhu požadovaného produktu. Například, oktamer může být získán přípravou dimeru, kaplováním produktu za vzniku • Φ

Φ Φ Φ

Φ Φ

ΦΦΦ Φ Φ • Φ ΦΦ Φ · Φ ·

Φ · ·

ΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦ tetrameru a jeho následným kaplingem za vzniku požadovaného oktameru. Alternativně, dimer a trimer může být kaplován za vzniku pentameru, který pak bude kaplován s dalším trimerem za vzniku požadovaného oktameru. Výběr strategie je na straně uživatele. Ovšem obecným rysem blokové strategie je to, že oligomer H-fosfonát obsahuje dvě nebo více jednotek kaplovaných s oligomerním alkoholem také zahrnujícím dvě nebo více jednotek. Nejčastěji, oligonukleotid 3'-H-fosfonáty jsou kaplovány s oligonukleotidy majícími volné 5'-hydroxy funkce.

Způsob výroby podle tohoto vynálezu může být použit pro přípravu cyklických oligonukleotidů, obzvláště cyklických oligodeoxyribonukleotidů a cyklických ribonukleotidů. Při přípravě cyklických oligonukleotidů se připraví oligonukleotid obsahující H-fosofnátovou funkci, často 3' nebo 5' H-fosofnát, a volná hydroxyskupina se zavede příslušnou deprotekcí. Pozice volné hydroxyskupiny se obvykle vybírá tak, aby odpovídala H-fosfonátu, například 5'-hydroxy skupina by měla být kaplována se 3'-H-fosfonátem a 3'-hydroxy skupina by měla být kaplována s 5'-H-fosfonátem. Hydroxylové a H-fosfonátové funkce poté mohou být kaplovány intramolekulárně v roztoku v přítomnosti kaplovacího činidla a tato reakce je následována in šitu přenosem síry.

Požadovaný produkt, obzvláště odchráněný oligonukleotid, jako je odchráněný oligonukleotid zahrnující výlučně fosfodiesterová nebo výlučně internukleotidová spojení nebo směs alespoň jednoho fosfonothioátových spojení se s výhodou čistí způsoby známými v oboru, jako třeba jednduchou nebo násobnou iontově-výměnnou chromatografií, chromatografií s reverzní fází a srážením z vhodného rozpouštědla. Také může být použito další fosfonothioátová fosfodiesterových a internukleotidových opracování produktu např. pomocí ultrafiltrace.

φφφφ φ-φ

Příklady provedení vynálezu

Způsob výroby podle tohoto vynálezu bude dále ilustrován pomocí následujících příkladů, které ovšem nejsou zamýšleny jako omezující.

V příkladech provedení je třeba si povšimnout, že všude kde jsou nukleosidové zbytky a internukleotidová spojení popsány italikou, označuje to, že jsou nějakým způsobem ochráněny. V tomto kontextu G, C, G, T a T (který není italikou) reprezentují 2'-deoxyadenosin chráněný na N-6 s benzoylovou skupinou, 2'-deoxycytidin chráněný na N-4 s benzoylovou skupinou, 2'-deoxyguanosin chráněný na N-2 a na 0-6 s isobutyryiovou a 2,5-dichlorfenylovou skupinou, thymin chráněný na 0-4 s fenylovou skupinou a nechráněný thymin. Například, jak je naznačeno ve schématu 3, p(s) a p(s') reprezentují S-(2-kyanoethyl) a S-(fenyl) fosfonothioáty a p(H), který není chráněný a tedy není označený italikou, reprezentuje H-fosfonátový monoester, pokud je umístěn na konci sekvence nebo připojen k monomeru, jinak reprezentuje H-fosfonátový diester.

N- [(2-Kyanoethyl)sulfanyl]sukcinimid

N-Bromsukcinimid (17,80 g, 0,10 mol) a di-(2-kyanoethyl) disulf id (17,20 g, 0,10 mol) byly 2 h zahřívány pod refluxem ve 30 ml suchého 1,2-dichlorethanu pod argonovou atmosférou. Reakční směs pak byla ochlazena na laboratorní teplotu, bylo přidáno 300 ml hexanu a směs byla míchána 10 min. Horní vrstva byla dekantována a olejový zbytek byl 10 minut triturován s ethyl-acetátem (20 ml). Získaná tuhá látka byla sebrána filtrací a promyta s etherem (70 ml) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bělavé tuhé látky (12,4 g, 67,3%) (nalezeno v materiálu překrystalizovaném z absolutního • · 1 • φ · • · ♦ ΦΦΦ ·* φφ φφ • φ φ · • φ φφ φ · · · • · φ φ ♦ Φ φφ φφ φφ φ φ φ φ · φ φ » φ • Φ φφφφ ethanolu: C, 45,8; Η, 4,3; Ν, 15,2. C7H8N2O2S vyžaduje: C, 45,64; Η, 4,38; Ν, 15,21%), bod tání: 110-112 °C, δ_Η [(CD₃)₂SO] 2,71 (4Η, s) , 2,75 (2H, t, J = 6,9 Hz), 3,02 (2H, t, J= 6,9 Hz), δ₀ [(CD₃)₂SO] 17,9, 32,8, 118,2, 177,9.

N- (Fenylsulfanyl)sukcinimid

N-Bromsukcinimid (8,90 g, 50,0 mmol) a difenyldisulfid (10,9 g, 49,9 mmol) byly 2 h zahřívány pod refluxem. ve 40 ml suchého 1,2-dichlorethanu pod argonovou atmosférou. Reakční směs pak byla ochlazena na laboratorní teplotu, bylo přidáno 150 ml hexanu a směs byla míchána 30 min. Produkt byl sebrán filtrací a promyt s hexanem (50 ml). Rekrystalizace z absolutního ethanolu poskytla titulní sloučeninu ve formě bezbarvých krystalů (6,2 g, 59,8%), bod tání: 110-112 °C (lit. ⁷ 115-116 °C) ; δ_Η [(CD₃)₂SO] 2,84 (4H, s) , 7,32 (5H, m) ; 6_C [(CD₃)₂SO] 28,8, 126, 3, 127,6, 129,2, 135, 3, 177,2.

Příprava DMTr-Tp (s)Τ-Lev (B=B'=thymin-l-yl)

DMTr-Tp(H) (B=thymin-l-yl) (0,852 g, 1,2 mmol) a HO-TLev (B'= thymin-l-yl) (0,340 g, 1,0 mmol) byly společně odpařeny se suchým pyridinem (2 ml) a zbytek byl poté opět rozpuštěn v suchém pyridinu (6 ml) při laboratorní teplotě. K tomuto roztoku byl přikapán během 5 minut roztok N-[(2kyanoethyl)sulfanyl]sukcinimid (0,46 g, 2,5 mmol) a difenyl fosfonochloridátu (0,52 ml, 3,5 mmol) v 6 ml suchého pyridinu. Po 5 minutách byl přidán 1 ml vody. Reakční směs byla poté míchána dalších 5 minut a byla rozdělena mezi 50 ml dichlormethanu a 50 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva byla oddělena a poté znovu promyta s nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 30 ml) . Spojené organické *

• * 9

44

4 4 4

4 4 #

4«

9444

4

94 4 •

4«

9 9

9

4

9

4944 vrstvy byly sušeny nad MgSO₄ a zkoncentrovány za sníženého tlaku. Zbytek byl chromatografován pomocí krátké kolony silikagelu. Odpaření odpovídajících frakcí, eluovaných pomocí CH₂Cl₂-MeOH (96:4 v/v) poskytlo DMTr-Tp (s) T-Lev (B = B' = thymin-l-yl) ve formě bezbarvé pěny (1, 009 g, 99,3 %) ; δ_Ρ[(CD₃)₂SO] 27,9, 27,7, 27,0 (přibližně 0,7%).

Další příklady způsobu výroby podle tohoto vynálezu byly provedeny přidáním roztoku difenyl fosfonochloridátu 5b (2,5 mmol) a N- [(2-kyanoethyl)sulfanyl]- nebo N- (fenylsulfanyl)sukcinimidu 8a nebo 8b, 2,5 mmol) v bezvodém pyridinu (6 ml) po kapkách během 5 minut k míchanému roztoku H-fosfonátového monomeru (1,2 nebo 1,4 mmol) a 5'-OH komponentě (1,0 mmol) v bezvodém pyridinu (6 ml) při laboratorní teplotě. Po další době (5 až 25 minut) (viz celkový reakční čas) byl produkt zpracován a chromatografován. Získané výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1.

99

9 9 9

9 9

999

9

9999 99 • fc 99 9 9 9 9

9 «

9 9

9999 mr-tor-o^foeiTo> co r~ co o ca ů) σ>

jí. I— kl O £<2.S<2. č-řč-3·

2 2 2

Q Q Q Q b- fr- t>> σ> o o>

u > fc;2j ω i cl Q. CD PU

Q. CL Q.

<3 třCD

d. i li. I— I— H 2 2 2 Q Q Q

Μ· lO O> CJ>

•2.

tří? CD tSJO

OOOOOOtOOO τ-τ-ττ-τ-(9τ-(*>Ο <eJ3<eACS<B<e<VCB wcocowcow»»» >O

Q >£<

Q<

X «β

Η

g.

i g

Λ) g

<2 s « h .0 o >U o &.

X) X) íí ΔΔΔΛΔ Δ 101010101010101010

μ. CD ¢. t-L Η Η μ. Ó CĎ β’δ'δ'ιί'

I I I I I I I I t

OOOOOOQOO

XXXXXXXXX

X X X X X X X X X oú cl e£ cx α. a. o, 0.5 1- + (- + 0()001Η’Η’Η’ΗΗΗΗ-ΗΗ· sssssssss

ΩΩΩΩΩΩΩΩΩ

NcovmcDNcoo) fl/ 2<W~2<?3O • · 99 99 ·· »9

9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 *· 9 9 « • 99999 99 999 · 9 • 9 999* 999 »«99 99 99 99 99 9999

Claims

Patentové nároky

1. Způsob výroby fosfonothioátových triesterů, vyznačující se tím, že se H-fosfonát kondenzuje s alkoholem v přítomnosti kondenzačního činidla za vzniku H-fosfonátového diesteru a následně se H-fosfonátový diester nechá reagovat s činidlem přenášejícím síru, čímž vznikne fosfonothioátový triester, přičemž kondenzační reakce mezi H-fosfonátem a alkoholem se provádí v přítomnosti činidla přenášejícího síru.
2. Způsob výroby podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že H-fosfonát je ochráněný nukleosid nebo oligonukleotid obsahující 3'-H-fosfonátovou funkci.
3. Způsob výroby podle nároků 1 a 2, vyznačuj ící se t i m, že alkohol je chráněný nukleosid nebo oligonukleotid obsahující volnou 5'-hydroxyskupinu.
4. Způsob výroby podle nároků 1 až 3, vyznačuj ící se t í m, že kondenzační činidlo je diarylfosfonochloridát vzorce (ArO)₂POCl, kde Ar představuje fenyl, 2-chlorfenyl, 2,4,6-trichlorfenyl nebo 2,4,6-tribromfenyl.
5. Způsob výroby podle nároků 1 až 4, vyznačuj ící se t í m, že činidlo přenášející síru má obecný chemický vzorec

L----S----D kde L reprezentuje odstupující skupinu a D představuje arylovou skupinu, methylovou skupinu, substituovanou alkylovou skupinu nebo alkenylovou skupinu.

• · 4 • · · · · • 44 4 • ·*4 4 ·

4 · 4» • 4 4 4

4 4 4 4

4 4 • 4

44 4444

β. Způsob výroby podle nároku 5,vyznačující se tím, že odstupující skupinou je morfolin-3,5-dion, ftalimid, sukcinimid, maleinimid nebo indazol a D představuje 4-halogenfenylovou skupinu, 4-alkylfenylovou skupinu, methylovou skupinu, benzylovou skupinu, alkylbenzylovou skupinu, halogenbenzylovou skupinu, allylovou skupinu, krotylovou skupinu, 2-kyanoethylovou skupinu nebo 2—(4— nitrofenyl)ethylovou skupinu.
7. Způsob výroby podle nároků 1 až 6, vyznačuj ící se t í m, že H-fosfonát a alkohol jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující deoxyribonukleosidy, oligodeoxyribonukleosidy, ribonukleosidy, 2-0'-(alkyl, alkoxyalkyl nebo alkenyl)-ribonukleosidy, oligoribonukleotidy a 2-0'-(alkyl, alkoxyalkyl nebo alkenyl)-oligoribonukleotidy.
8. Způsob výroby podle nároků 1 až 7, vyznačuj ící se t í m, že H-fosfonát nebo alkohol, s výhodou alkohol, je připojen k pevnému nosiči.
9. Způsob výroby podle nároku 8, vyznačující se tím, že alkohol je připojen k tuhému nosiči, alkohol je nukleosid nebo nukleotid mající volnou hydroxyskupinu v poloze 5' a je připojen k tuhému nosiči prostřednictvím polohy 3'.
10. Způsob výroby podle nároků 8a 9, vyznačuj ící se t í m, že alkohol připojený k tuhému nosiči se nechá kontaktovat s roztokem obsahujícím H-fosfonát, kondenzační činidlo a činidlo přenášející síru.