JP6894747B2

JP6894747B2 - 重合体

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Publication number: JP6894747B2
Application number: JP2017083067A
Authority: JP
Inventors: 真範関; 圭吾水澤; 東　隆司; 隆司東; 賢杉田
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Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2037-04-19
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Description

本発明は、フェノキサジン化合物構造を含む新規の重合体に関する。

ＤＮＡを構成する塩基の一つであるデオキシグアノシンが活性酸素による酸化作用により８位が酸化され、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（以降、８ＯＨｄＧと記載）が生成する。８ＯＨｄＧは、生成すると比較的安定な物質として速やかに尿中に排泄される。そのため、８ＯＨｄＧの排出量は活性酸素種による生体への影響を反映すると考えられており、８ＯＨｄＧは現在最も広く用いられている酸化ストレスマーカーの一つである。

８ＯＨｄＧは、互変異性体を有し、下記のようにあらわされる。

フェノキサジン化合物は核酸塩基に対して親和性を示す。親和性を向上するために、フェノキサジン化合物の構造について、様々な改良がされており（特許文献１）、フェノキサジン化合物の中には、８ＯＨｄＧに対して親和性があるものが見出されている（非特許文献１）。また、フェノキサジン化合物をシリカゲル粒子に固定したものが開示されている（特許文献２）。

国際公開第９９／０２４４５２号公報国際公開第２０１２／１３３３０６号公報

Ｌｉ，Ｚ．，ｅｔ．ａｌ，；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１８，３９９２−３９９８（２０１０）Ｋｕｅｉ−ＹｉｎｇＬｉｎ，ｅｔ．ａｌ，：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０（３３），８５３１−８５３２（１９９８）

非特許文献１に記載の８ＯＨｄＧに対して親和性があるフェノキサジン化合物は、合成に手間がかかる。また、低分子であるために、８ＯＨｄＧとの分離が困難で、使用した誘導体の再利用はしづらい。また、特許文献２に記載のシリカゲルに固定したフェノキサジン化合物は、シリカゲルを主体としているため、固定化できる量が限られ、等量使用した際は、吸着できる８ＯＨｄＧの濃度範囲が狭い。

本発明の目的は、８ＯＨｄＧとの高い親和性を持ち、繰り返し使用可能かつ適用濃度範囲が広い重合体を提供することにある。

上記の目的は、以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、以下で表される式（１）の繰り返し単位を含む重合体、

ただし、式（１）中、Ｒ^１，Ｒ^２は、それぞれ、繰り返し単位ごとに独立であり、Ｒ^１は水素原子またはアルキル基を表し、Ｒ^２は少なくとも１以上の繰り返し単位においては、以下の式（２）で表され、その他の繰り返し単位においては、フェニル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシル基であり、それらの基はアルキル基で置換されていてもよく、式（２）は以下で表され、

ただし、式（２）中、Ｒ^３は水素原子、アルキル基またはアリール基を表し、Ｌは、２価の連結基であり、＊は式（１）との結合部位を指す。

本発明により、フェノキサジン化合物を導入した新規な重合体が提供される。本発明のフェノキサジン化合物を導入した重合体は、８ＯＨｄＧに高い親和性を有し、繰り返し使用可能な８ＯＨｄＧ検出剤として良好に作用する。

本発明の実施形態に係る重合体は有機ポリマーの主鎖、フェノキサジン骨格をもつ側鎖が結合した構造を有する。具体的には以下の式（１）の繰り返し単位を含む重合体である。

ただし、式（１）中、Ｒ^１，Ｒ^２は、それぞれ、繰り返し単位ごとに独立であり、Ｒ^１は水素原子またはアルキル基を表し、Ｒ^２は少なくとも１以上の繰り返し単位においては、式（２）で表され、その他の繰り返し単位においては、フェニル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシル基であり、それらの基はアルキル基で置換されていてもよい。

式（２）はフェノキサジン化合物の構造を有する。

式（２）の中のＲ^３におけるアルキル基としては、特に限定されるものではなく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロヘキシル基等の直鎖、分岐および環状のアルキル基が挙げられる。さらにアルキル基が、アリール基等の置換基を有しても良い。

式（２）の中のＲ^３におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、ピレニル基、フルオレニル基、フルオラテニル基、アルキルフェニル基、アルキルナフチル基、アルキルアントラセニル基、アルキルピレニル基、アルキルフルオレニル基、アルキルフルオラテニル基等が挙げられる。これらのアリール基はそれぞれ置換基を有しても良い。

本発明の実施形態に係るフェノキサジン化合物は、式（２）中の２価の連結基Ｌを介して、式（１）で表されるユニットを有する高分子と結合する。連結基Ｌは、２価の連結基であれば特に限定されるものではないが、製造の容易性の観点から、アミド結合、エステル結合を含むものが好ましく、特に、エステル結合を含むものが好ましい。

すなわち、連結基Ｌの例としてオキシカルボニル基（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボニルオキシ基（−ＣＯ−Ｏ−）、カルボニルアミノ基（−ＣＯ−ＮＨ−）またはアミノカルボニル基（−ＮＨ−ＣＯ−）、あるいは、これらの基のいずれかの末端、または両方の末端にさらにアルキレン基を含む基を挙げることができる。

式（２）で示されるフェノキサジン化合物の構造の具体例は以下の式（９’）から（２５’）および（６’）で示すことができる。ただし、本発明はこれらに限られるものではない。

本発明の実施形態に係る重合体とは、単一の単量体の重合により合成されるいわゆるホモポリマー、および複数の単量体の重合により合成されるいわゆる共重合体のいずれであってもよい。

式（１）中のＲ^１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、炭素原子数が１乃至６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロヘキシル基等の直鎖、分岐および環状のアルキル基が挙げられる。Ｒ^１は、製造の容易性の観点から水素原子またはメチル基である場合が好ましい。

本発明の実施形態に係る重合体は、式（２）で表されるフェノキサジン化合物の構造を、重合体中に複数含んでも良い。フェノキサジン化合物の構造の導入数を増やすことで重合体を等量使用した際に溶液中の８ＯＨｄＧ量の濃度が高い場合にも対応可能である。また、８ＯＨｄＧが吸着後の重合体は、重合体の組成に対して適切な溶媒（メタノール、酢酸エチル、希塩酸等）で洗浄することで、繰り返しの利用が可能である。

本発明の実施形態に係る重合体は、式（１）で表される繰り返し単位を３０以上１００以下含むことが好ましく、４０以上６０以下含むことがさらに好ましい。繰り返し単位の数（分子量）が小さいと溶剤との親和性が高く、繰り返し利用するための分離が困難となる。また繰り返し単位の数（分子量）が大きいと溶剤との親和性が低下し、標的化合物の検出がしにくくなる。

また、本発明の実施形態に係る重合体は、Ｒ^２が上記式（２）である式（１）で表される繰り返し単位の数を、５以上１０以下含むことが好ましい。
また、本発明のさらなる実施形態に係る重合体は、以下で表される式（２６）の繰り返し単位を含む、

ただし、式（２６）中、Ｒ^３は水素原子、アルキル基またはアリール基を表す。
本実施形態に係る重合体は、さらに以下で表される式（２７）の繰り返し単位を含むことができる。

ただし、式（２７）中、Ｘは、対イオンを表す。対イオンに限定はなく、たとえば、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンを例示することができる。

本発明の実施形態に係る化合物の合成ルートの一例を説明する。
次に、式（１）で表される単量体単位を有する重合体の合成について説明する。公知の合成法が使用でき、具体的にはモノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエステル、スチレン系モノマー等を用いることができ、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合等の方法により重合することができる。製造容易性の点からラジカル重合が好ましい。また、フェノキサジン化合物の構造を導入する前の重合体は、市販品を用いることもできる。たとえば、市販品として、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、その他アクリル樹脂あるいは、共重合体である、ジョンクリル（登録商標）（ＪＯＮＣＲＹＬ）等を用いることができる。ジョンクリルは、（メタ）アクリル酸と（メタ）アクリル酸アルキルエステル、および／またはαメチルスチレン等のスチレン系モノマーとの共重合体であり、より具体的には、ジョンクリル６７（重量平均分子量１２，５００、酸価２１３ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル６７８（重量平均分子量８，５００、酸価２１５ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル５８６（重量平均分子量４，６００、酸価１０８ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル６８０（重量平均分子量４，９００、酸価２１５ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル６８２（重量平均分子量１，７００、酸価２３８ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル６８３（重量平均分子量８，０００、酸価１６０ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル６９０（重量平均分子量１６，５００、酸価２４０ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリル８１９（重量平均分子量１４，５００、酸価７５ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリルＪＤＸ−Ｃ３０００（重量平均分子量１０，０００、酸価８５ｍｇＫＯＨ／ｇ）、ジョンクリルＪＤＸ−Ｃ３０８０（重量平均分子量１４，０００、酸価２３０ｍｇＫＯＨ／ｇ）などが挙げられる。
なお、フェノキサジン化合物の構造は、モノマーの段階で導入してもよいし、重合された後に導入してもよい。

フェノキサジン化合物の誘導体は、非特許文献２を参照して合成することができる。以下に反応式を示す。

５−ブロモ−２´−デオキシウリジンジアセテート（３）を出発原料として、２−アミノレゾルシノールとの反応により化合物（４）とし、２−（カルボベンゾキシアミノ）−１−エタノールを反応させることで化合物（５）とし、アンモニアを作用させることで環化と同時にアセチル基の脱保護を行い、中間体（６）を合成することができる。水酸基をシリル基で保護し、ベンジルオキシカルボニル基を水素添加により脱保護し化合物（７）とし、生じたアミノ基を各種カルバメートに導くことで中間体（８）を合成することができる。

フェノキサジン化合物を式（１）で表される重合体に導入するには公知の方法が利用できる。例として、縮合反応により、ヒドロキシル基を有するフェノキサジン化合物とカルボキシル基を有する重合体を使用することで、連結基Ｌがオキシカルボニル基である化合物を合成することができる。反応の際は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩等を使用することができる。

その他にも、例えば、カルボキシル基を有するフェノキサジン化合物と、ヒドロキシル基を有する重合体を使用することで、連結基Ｌがカルボニルオキシ基である化合物を、カルボキシル基を有するフェノキサジン化合物と、アミノ基を有する重合体を使用することで、連結基Ｌがカルボニルアミノ基である化合物を、アミノ基を有するフェノキサジン化合物と、カルボキシル基を有する重合体を使用することで、連結基Ｌがアミノカルボニル基である化合物を合成することができる。

本発明の実施形態に係る化合物の合成に用いられるフェノキサジン化合物の具体例としてフェノキサジン化合物（９）から（２５）および中間体（６）を以下に示す。ただし、本発明はこれらに限られるものではない。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。

＜合成例１＞
＜重合体１の合成＞
ポリアクリル酸（和光純薬工業株式会社製）に対して、フェノキサジン化合物（９）をモル比で１：１としクロロホルム中で混合した後、縮合剤として１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加え一晩撹拌した。反応終了後、水で洗浄し減圧濾過ついで真空乾燥を行うことで目的とする重合体１を得た。

＜重合体２の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１２）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体３の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１４）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体４の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１５）に代えた以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体５の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１６）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体６の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１７）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体７の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（６）に代えた以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体８の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１９）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体９の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（２２）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体１０の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（２３）に代える以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体１１の合成＞
ポリアクリル酸をジョンクリル６８３（ＢＡＳＦ社製）に代えた以外は、重合体１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体１２の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１１）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体１３の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１５）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体１４の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１７）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体１５の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（６）に代えた以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体１６の合成＞
ジョンクリル６８３とフェノキサジン化合物（９）のモル比を１：２に代えた以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体１７の合成＞
ジョンクリル６８３とフェノキサジン化合物（９）のモル比を１：５に代えた以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体１８の合成＞
ジョンクリル６８３とフェノキサジン化合物（９）のモル比を１：１０に代えた以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得た。

＜重合体１９の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（１９）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体２０の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（２２）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

＜重合体２１の合成＞
フェノキサジン化合物（９）をフェノキサジン化合物（２３）に代える以外は、重合体１１の合成例と同様な方法で目的とする重合体を得る。

ここで、重合体７を例に、本発明の実施例における８−ＯＨｄＧの吸着率の算出方法について説明する。なお以下の蛍光の測定は、分光蛍光光度計Ｆ−４５００（日立ハイテクノロジー社製）を用いた。
重合体７（２ｍｇ）をクロロホルム３ｍｌに溶解させ、ＵＶを測定し得られた値からフェノキサジン誘導体の濃度を算出した。フェノキサジン誘導体濃度にして３０μＭのクロロホルム溶液を調製し、蛍光を測定した（ＦＬ_ｆ）。ここに１当量の３ｍＭの８−ＯＨｄＧのクロロホルム（１０％ジメチルスルホキシド）溶液を加え、蛍光を測定した（ＦＬ_Ｏ）。１−ＦＬ_Ｏ／ＦＬ_ｆを算出し、吸着率とした。

吸着率の評価としては、本発明の実施例においては下記の基準とし、Ａ〜Ｃまでを許容レベル、Ｄが許容できないレベルとした。
Ａ：吸着率が０．９０以上
Ｂ：吸着率が０．７５以上、０．９０未満
Ｃ：吸着率が０．５０以上、０．７５未満
Ｄ：吸着率が０．５０未満

本発明の実施例で得られた重合体の吸着率の評価結果を表１に記載する。

ここで、重合体１５、比較例として中間体（６）を例に、重合体の再利用について記載する。評価に使用した重合体１５をメタノールで洗浄した後、再度吸着率を測定した。中間体（６）についても同様な操作を行い、吸着率を測定した。それぞれの操作を５回行った結果を表２に示す。比較例に対し、実施例２２においては、５回目の吸着においても、吸着率が低下しなかった。

本発明の実施例において、式（２）で表される、フェノキサジン化合物が複数導入した重合体１５乃至１８をそれぞれ等量用いて、８−ＯＨｄＧ溶液の量を０〜１０当量加えて吸着率の測定を行い、経時変化を観察した。重合体１５に対して、それぞれ蛍光強度が飽和する量は、フェノキサジン化合物の導入量に比例した。
以上より本発明の重合体は８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの検出、検量に用いることができ、また、洗浄により繰り返し用いられることが示された。

本発明における重合体は８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの検出により、生体内における酸化ストレスの特異的な検知を比較的に安価、簡便に行うことができる。さらには、使用後も簡便な処理により再利用することができる。

Claims

以下で表される式（２６）の繰り返し単位、及び式（２７）の繰り返し単位を含む重合体、

ただし、式（２６）中、Ｒ^３は水素原子、アルキル基またはアリール基を表し、
式（２７）中、Ｘは、対イオンを表す。
前記Ｒ^３が、メチル基、フェニル基、または下記式（３０）で表わされる基である請求項１に記載の重合体。
８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの検出に用いられる請求項１又は２に記載の重合体。
前記式（２６）で表される繰り返し単位を３０以上１００以下含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の重合体。
前記式（２６）で表される繰り返し単位を４０以上６０以下含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の重合体。