JP6175358B2 - 重合性基を有するクマリン化合物 - Google Patents
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Description
本発明は、重合性基としてスチレン基を有し、スチレン及びスチレン誘導体との共重合性に優れたクマリン化合物に関する。
標識として蛍光物質を利用した粒子状の診断用マーカーの検討が行われている（例えば、特許文献１及び２を参照）。このような粒子状の診断用マーカーでは、低分子量の蛍光物質が使用されているが、低分子量の蛍光物質は、粒子からのブリードや生体内での溶出の可能性があることから、高分子量の蛍光物質や、粒子を形成するポリマーと重合可能な蛍光物質の開発が望まれている。
一方、クマリン（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン）は、無蛍光性であるが、７位にアミノ基やヒドロキシ基等の電子供与性置換基を導入することにより強い蛍光を発するようになる。このため、７−アミノクマリン誘導体は４８０〜５００ｎｍ近辺の蛍光を発する色素として使用され、中でもクマリン６（下式（２ａ））やクマリン７（下式（２ｂ））は強い蛍光強度を有することから蛍光試薬として使用されてきた。
一方、クマリン（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン）は、無蛍光性であるが、７位にアミノ基やヒドロキシ基等の電子供与性置換基を導入することにより強い蛍光を発するようになる。このため、７−アミノクマリン誘導体は４８０〜５００ｎｍ近辺の蛍光を発する色素として使用され、中でもクマリン６（下式（２ａ））やクマリン７（下式（２ｂ））は強い蛍光強度を有することから蛍光試薬として使用されてきた。
重合性基を有するクマリン化合物としては、Ｎ−アクリルスルホアミド基（−ＳＯ2ＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ2）を有するクマリン化合物（例えば、特許文献３を参照）やＮ，Ｎ−ジアリルスルホアミド基（−ＳＯ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）2）を有するクマリン化合物（例えば、特許文献４を参照）等が知られている。
しかし、Ｎ−アクリルスルホアミド基は、加水分解安定性に問題があり、水分の多い環境下では加水分解する可能性があった。また、粒子状の診断用マーカーでは、粘着性を有しない、ある程度硬い粒子が求められるため、粒子を構成するポリマーとしては、スチレン及びスチレン誘導体のポリマーが好ましいが、Ｎ−アクリルスルホアミド基やＮ，Ｎ−ジアリルスルホアミド基は、スチレンやスチレン誘導体との共重合性が十分ではなかった。
従って、本発明の目的は、加水分解安定性に優れ、スチレン化合物との共重合成に優れ、水分散性が良好であり、診断用マーカーとして有用な新規のクマリン化合物を提供することにある。
従って、本発明の目的は、加水分解安定性に優れ、スチレン化合物との共重合成に優れ、水分散性が良好であり、診断用マーカーとして有用な新規のクマリン化合物を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、加水分解安定性に優れ、スチレン化合物との共重合成に優れたクマリン化合物について種々検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、下記一般式（１）で表されるクマリン化合物を提供するものである。
即ち本発明は、下記一般式（１）で表されるクマリン化合物を提供するものである。
また、本発明は、前記クマリン化合物と、他のラジカル重合性化合物、好ましくは生体の特定部位や特定細胞に、特異的な結合性や相互作用を有する基を有するラジカル重合性化合物との重合物を提供するものである。
また、本発明は、前記重合物を含有する診断用マーカーを提供するものである。
また、本発明は、前記重合物を含有する診断用マーカーを提供するものである。
本発明の効果は、加水分解安定性に優れ、スチレン化合物との共重合成に優れ、水分散性が良好であり、診断用マーカーとして有用な新規のクマリン化合物を提供したことにある。
以下、本願発明について好ましい実施形態に基づき詳細に説明する。
先ず、本発明の前記一般式（１）で表される新規クマリン化合物について説明する。
前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基又はクマリン骨格の６位及び８位の炭素と結合して環状構造を形成するプロピレン基を表わす。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、イソペンチル基等が挙げられる。本発明において、プロピレン基とは１，３−プロパンジイル基をいう。また、クマリン骨格の６位及び８位の炭素と結合して環状構造を形成するプロピレン基とは、例えば、Ｒ1及びＲ2がそのような基である場合、下記一般式（１ａ）で表される化合物となる基をいう。
先ず、本発明の前記一般式（１）で表される新規クマリン化合物について説明する。
前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基又はクマリン骨格の６位及び８位の炭素と結合して環状構造を形成するプロピレン基を表わす。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、イソペンチル基等が挙げられる。本発明において、プロピレン基とは１，３−プロパンジイル基をいう。また、クマリン骨格の６位及び８位の炭素と結合して環状構造を形成するプロピレン基とは、例えば、Ｒ1及びＲ2がそのような基である場合、下記一般式（１ａ）で表される化合物となる基をいう。
Ｒ1及びＲ2としては、高い蛍光強度が得られ、工業的な原料の入手も容易であることから、メチル基、エチル基、クマリン骨格の６位及び９位の炭素と結合して環状構造を形成するプロピレン基が好ましく、エチル基が更に好ましい。
Ｒ3は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、トリフルオロメチル基又はシアノ基を表わす。炭素数１〜５のアルキル基としては、Ｒ1及びＲ2で例示したアルキル基が挙げられる。Ｒ3としては、高い蛍光強度が得られ、工業的な原料の入手も容易であることから、水素原子、メチル基が好ましく、水素原子が更に好ましい。
Ｒ4は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を表わす。炭素数１〜５のアルキル基としては、Ｒ1及びＲ2で例示したアルキル基が挙げられる。Ｒ4としては、製造が容易であり、工業的な原料の入手も容易であることから、水素原子が好ましい。
Ｒ5は直接結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表わす。炭素数１〜３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、メチルメチレン基、プロピレン基、１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、エチルメチレン基等が挙げられる。Ｒ5としては、工業的な原料の入手が容易であり、副反応が少ないことから、直接結合又はメチレン基が好ましい。
Ｘは硫黄原子、酸素原子、ＮＨ基又はＮＣＨ3基を表わす。Ｘとしては、高い蛍光強度が得られることから硫黄原子、ＮＨ基が好ましく、硫黄原子が更に好ましい。
本発明の化合物は、前記一般式（１）中のベンゼン環に、重合性基であるビニル基を有するが、この重合性基であるビニル基の位置は、重合性が良好であり、工業な原料の入手も容易であることからＲ5に対してパラ位であることが好ましい。
次に、本発明のクマリン化合物の製造方法について説明する。
前記一般式（１）で表されるクマリン化合物は、下記の反応式で示すように下記一般式（２）で表わされるクマリン化合物を濃硫酸や発煙硫酸でスルホン化して、下記一般式（３）で表わされるスルホン酸化合物とし、このスルホン酸化合物が有するスルホン酸基を塩化チオニル、３塩化リン等でスルホン酸クロライド基に変換して下記一般式（４）で表わされる化合物とし、下記一般式（４）で表わされる化合物と下記一般式（５）で表わされるアミン化合物とを反応させることにより得ることができる。
前記一般式（１）で表されるクマリン化合物は、下記の反応式で示すように下記一般式（２）で表わされるクマリン化合物を濃硫酸や発煙硫酸でスルホン化して、下記一般式（３）で表わされるスルホン酸化合物とし、このスルホン酸化合物が有するスルホン酸基を塩化チオニル、３塩化リン等でスルホン酸クロライド基に変換して下記一般式（４）で表わされる化合物とし、下記一般式（４）で表わされる化合物と下記一般式（５）で表わされるアミン化合物とを反応させることにより得ることができる。
本発明のクマリン化合物の製造方法の製造過程において、前記一般式（２）で表わされるクマリン化合物のスルホン化の反応温度が、あまりに低い場合には反応速度が遅く、あまりに高い場合には異常反応が起こることから、−１０〜５０℃が好ましく、１０〜４０℃が更に好ましい。また前記一般式（３）で表わされるスルホン酸化合物のスルホン酸基のスルホン酸クロライド基への変換反応、及び前記一般式（４）で表わされる化合物と前記一般式（５）で表わされるアミン化合物との反応は、ピリジン、ピリミジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の塩基性溶媒中で反応させることが好ましい。
本発明のクマリン化合物は、上述の如く、重合性基を有しており、本発明のクマリン化合物以外の種々のラジカル反応性化合物（以下、他のラジカル重合性化合物ともいう）とラジカル重合して重合物（本発明の重合物）として用いることができる。
本発明のクマリン化合物とラジカル重合可能な他のラジカル重合性化合物としては、例えば、スチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，５−ジメチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｐ−ブロモスチレン、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン等のビニル芳香族類；（メタ）アクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、イタコン酸等の不飽和カルボン酸類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、グリセロールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ソルビトールペンタ（メタ）アクリレート、ソルビトールヘキサ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアルデヒド、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリルアミド等の不飽和カルボン酸誘導体類；Ｎ−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物類；蟻酸ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；塩化ビニル、臭化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニル化合物類、アリルアルコール、アリルメチルエーテル、アリルエチルエーテル、アリルメチルケトン、アリル酢酸、アリルフェノール等のアリル化合物類；Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、Ｎ−プロパノールアクリルアミド、Ｎ−メチロールマレインアミド酸、Ｎ−メチロールマレインアミド酸エステル、Ｎ−メチロールマレイミド、Ｎ−エチロールマレイミド等のＮ−置換不飽和アミド類；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエン類；ジビニルシクロヘキサン等の多官能ビニル化合物類等が挙げられ、共重合性に優れている点から、特に、ビニル芳香族類が好ましい。
本発明のクマリン化合物とラジカル重合可能な他のラジカル重合性化合物としては、例えば、スチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，５−ジメチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｐ−ブロモスチレン、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン等のビニル芳香族類；（メタ）アクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、イタコン酸等の不飽和カルボン酸類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、グリセロールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ソルビトールペンタ（メタ）アクリレート、ソルビトールヘキサ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアルデヒド、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリルアミド等の不飽和カルボン酸誘導体類；Ｎ−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物類；蟻酸ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；塩化ビニル、臭化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニル化合物類、アリルアルコール、アリルメチルエーテル、アリルエチルエーテル、アリルメチルケトン、アリル酢酸、アリルフェノール等のアリル化合物類；Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、Ｎ−プロパノールアクリルアミド、Ｎ−メチロールマレインアミド酸、Ｎ−メチロールマレインアミド酸エステル、Ｎ−メチロールマレイミド、Ｎ−エチロールマレイミド等のＮ−置換不飽和アミド類；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエン類；ジビニルシクロヘキサン等の多官能ビニル化合物類等が挙げられ、共重合性に優れている点から、特に、ビニル芳香族類が好ましい。
本発明のクマリン化合物と他のラジカル重合性化合物とから、ラジカル重合により得られる本発明の重合物は、蛍光を有するポリマーとして用いることができる。蛍光を有するポリマーは、蛍光塗料、蛍光繊維、蛍光性マーキング材料、蛍光ビーズ等として利用することが可能である。特に、本発明のクマリン化合物を使用した本発明の重合物からなる蛍光ビーズは、他のラジカル重合性化合物として、生体の特定部位や特定細胞に、特異的に特異的な結合性や相互作用を有するラジカル重合性化合物を用いることにより、診断マーカーとして好適に使用できる。このようなラジカル重合性化合物としては、例えば、上記の特許文献１や特許文献２には、分岐鎖に消化器ガンに特異的な相互作用を有する化合物であるピーナツレクチンを導入した診断マーカーが開示されているが、診断マーカーの製造時に、本発明のクマリン化合物を共重合させれば、消化器ガン用の診断マーカーとして好適に使用できる。
この他、本発明のクマリン化合物は、波長補正フィルタ用の色素、色素レーザ用の色素、色素増感型太陽電池における増感色素、各種ディスプレイにおける色変換フィルタ、発光デバイスといった用途に使用することもできる。
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。尚、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。
〔製造例１〕中間体Ａの合成
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、７７０ｇの３０％発煙硫酸を仕込み、２５℃で撹拌しながら、３５ｇのクマリン６（１００ｍｍｏｌ）を３分割し、１５分ごとに、添加した。すべてのクマリン６を添加した後、更に２５℃で３時間撹拌することにより反応を完結させた。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、１ｋｇの蒸留水を仕込み、撹拌しながら、先の反応液を５〜１０℃で滴下した。反応液を滴下終了後、２０％水酸化ナトリウム水溶液で中和し、エチルエーテルで抽出し、抽出液を減圧し乾燥することにより２８ｇの中間体Ａ（収率６５％）を得た。中間体Ａは、前記一般式（３）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3が水素原子、及びＸがイオウ原子である化合物である。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、７７０ｇの３０％発煙硫酸を仕込み、２５℃で撹拌しながら、３５ｇのクマリン６（１００ｍｍｏｌ）を３分割し、１５分ごとに、添加した。すべてのクマリン６を添加した後、更に２５℃で３時間撹拌することにより反応を完結させた。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、１ｋｇの蒸留水を仕込み、撹拌しながら、先の反応液を５〜１０℃で滴下した。反応液を滴下終了後、２０％水酸化ナトリウム水溶液で中和し、エチルエーテルで抽出し、抽出液を減圧し乾燥することにより２８ｇの中間体Ａ（収率６５％）を得た。中間体Ａは、前記一般式（３）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3が水素原子、及びＸがイオウ原子である化合物である。
〔実施例１〕化合物Ａ１の合成
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１０ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。前記反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、４．８ｇの４−アミノスチレン（４０ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。前記反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、３．８ｇの本発明のクマリン化合物Ａ１を得た（収率７２％）。化合物Ａ１は、前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3及びＲ4が水素原子、Ｒ5が直接結合、並びにＸがイオウ原子の化合物である。化合物Ａ１の同定は、1H-NMR及び光吸収特性（λｍａｘ、及びλｍａｘにおけるε）]を測定することにより行った。これらの同定結果を下記に示す。
＜同定結果＞
1H NMR(DMF-d7):9.02(S,1H), 8.61(S,1H), 8.06(d,1H), 7.83(d,1H), 7.78(d,1H), 7.32(d,2H), 7.09(d,2H), 7.02(S,1H), 6.85(d,1H), 6.67(S,1H), 6.60-6.54(m,1H), 5.66(d,1H), 5.13(d,1H), 3.50(q,4H), 1.15(t,6H)
λmax=475 nm, ε=6.31 X 104
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１０ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。前記反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、４．８ｇの４−アミノスチレン（４０ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。前記反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、３．８ｇの本発明のクマリン化合物Ａ１を得た（収率７２％）。化合物Ａ１は、前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3及びＲ4が水素原子、Ｒ5が直接結合、並びにＸがイオウ原子の化合物である。化合物Ａ１の同定は、1H-NMR及び光吸収特性（λｍａｘ、及びλｍａｘにおけるε）]を測定することにより行った。これらの同定結果を下記に示す。
＜同定結果＞
1H NMR(DMF-d7):9.02(S,1H), 8.61(S,1H), 8.06(d,1H), 7.83(d,1H), 7.78(d,1H), 7.32(d,2H), 7.09(d,2H), 7.02(S,1H), 6.85(d,1H), 6.67(S,1H), 6.60-6.54(m,1H), 5.66(d,1H), 5.13(d,1H), 3.50(q,4H), 1.15(t,6H)
λmax=475 nm, ε=6.31 X 104
〔実施例２〕化合物Ａ２の合成
実施例１において、４−アミノスチレンの代わりに、４−ビニルベンジルアミンを使用した以外は同様の操作を行い、４．２ｇの本発明のクマリン化合物Ａ２を得た（収率７７％）。化合物Ａ２は、前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3及びＲ4が水素原子、及びＲ5がメチレン基、Ｘがイオウ原子の化合物である。
＜同定結果＞
1H NMR(DMF-d7):9.06(S,1H), 8.56(S,1H), 8.21(br,1H), 8.08(d,1H), 7.88(d,1H), 7.81(d,1H), 7.33(d,2H), 7.20(d,2H), 6.88(d,1H), 6.70(s,1H), 6.67-6.60(m,1H), 5.74(d,1H), 5.18(d,1H), 4.03(S,2H), 3.52(q,4H), 1.17(t,6H)
λmax = 476 nm, ε = 5.94 X 104
実施例１において、４−アミノスチレンの代わりに、４−ビニルベンジルアミンを使用した以外は同様の操作を行い、４．２ｇの本発明のクマリン化合物Ａ２を得た（収率７７％）。化合物Ａ２は、前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3及びＲ4が水素原子、及びＲ5がメチレン基、Ｘがイオウ原子の化合物である。
＜同定結果＞
1H NMR(DMF-d7):9.06(S,1H), 8.56(S,1H), 8.21(br,1H), 8.08(d,1H), 7.88(d,1H), 7.81(d,1H), 7.33(d,2H), 7.20(d,2H), 6.88(d,1H), 6.70(s,1H), 6.67-6.60(m,1H), 5.74(d,1H), 5.18(d,1H), 4.03(S,2H), 3.52(q,4H), 1.17(t,6H)
λmax = 476 nm, ε = 5.94 X 104
〔製造例２〕中間体Ｂの合成
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１０ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、６．８ｇの２５％アンモニア水溶液（１００ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、中間体Ｂを得た。
中間体Ｂは、前記一般式（４）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3が水素原子、Ｘが硫黄原子であり、塩素原子がアミノ基で置換された化合物である。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１０ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、６．８ｇの２５％アンモニア水溶液（１００ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、中間体Ｂを得た。
中間体Ｂは、前記一般式（４）において、Ｒ1及びＲ2がエチル基、Ｒ3が水素原子、Ｘが硫黄原子であり、塩素原子がアミノ基で置換された化合物である。
〔比較例１〕比較化合物Ｂ１の合成
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、中間体Ｂ、１．８ｇのアクリル酸クロライド（２ｍｍｏｌ）、及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、４．１ｇの比較例のクマリン化合物Ｂ１を得た（収率８２％）。化合物Ｂ１は下記の構造を有する化合物である。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、中間体Ｂ、１．８ｇのアクリル酸クロライド（２ｍｍｏｌ）、及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、４．１ｇの比較例のクマリン化合物Ｂ１を得た（収率８２％）。化合物Ｂ１は下記の構造を有する化合物である。
〔比較例２〕比較化合物Ｂ２の合成
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、６．８ｇのジアリルアミン（２ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、４．２ｇの比較例のクマリン化合物Ｂ２を得た（収率８２％）。化合物Ｂ２は下記の構造を有する化合物である。
撹拌装置及び温度計を備えたガラス製反応容器に、４．３ｇの中間体Ａ（１ｍｍｏｌ）、１２ｇの塩化チオニル（１００ｍｍｏｌ）及び溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、２５℃で４時間撹拌して反応させた後、６０℃で減圧してピリジン及び未反応の塩化チオニルを除いた。反応容器に、溶媒として１００ｇのピリジンを仕込み、容器内の固形物を溶解、分散させた後、６．８ｇのジアリルアミン（２ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応容器に水とエチルエーテルを仕込み、エチルエーテル抽出を行い、エチルエーテルを減圧除去した後、減圧乾燥を行うことにより、４．２ｇの比較例のクマリン化合物Ｂ２を得た（収率８２％）。化合物Ｂ２は下記の構造を有する化合物である。
〔加水分解安定性試験〕
化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２について、６２．５容量％イソプロパノール水溶液の１％溶液を調製し、０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液又は０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を使用し、ｐＨ６．５〜７．５に調整した。この溶液をスクリュー栓付ガラス容器に入れて２５℃で７日間保存後し、ｐＨを測定した。ｐＨが低いほど、化合物の加水分解安定性が低いことになる。
化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２について、６２．５容量％イソプロパノール水溶液の１％溶液を調製し、０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液又は０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を使用し、ｐＨ６．５〜７．５に調整した。この溶液をスクリュー栓付ガラス容器に入れて２５℃で７日間保存後し、ｐＨを測定した。ｐＨが低いほど、化合物の加水分解安定性が低いことになる。
〔共重合性試験〕
０．０２ｇの化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１又はＢ、２、２ｇのスチレン及び１５ｍｇのＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリルを、１５ｇのトルエンに溶解し、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することにより重合させた。この重合物溶液を２００ｇのメタノールに滴下して析出した重合物を除去し、メタノールに溶解する未反応のクマリン化合物を液体クロマトグラフィーにより定量することにより、化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２の反応率を求めた。結果を〔表１〕に示す。
０．０２ｇの化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１又はＢ、２、２ｇのスチレン及び１５ｍｇのＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリルを、１５ｇのトルエンに溶解し、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することにより重合させた。この重合物溶液を２００ｇのメタノールに滴下して析出した重合物を除去し、メタノールに溶解する未反応のクマリン化合物を液体クロマトグラフィーにより定量することにより、化合物Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２の反応率を求めた。結果を〔表１〕に示す。
〔表１〕の結果から、本発明のクマリン化合物は、従来の重合基を有するクマリン化合物と比較して、加水分解安定性や共重合性に優れていることがわかる。
〔診断用マーカーでの評価〕
特許文献１の実施例に準拠し下記のマクロモノマーＣ１及びＣ２を合成した。また、下記のＰＢＳ溶液、ピーナツレクチン溶液及び水溶性カルボジイミド溶液を用意した。
特許文献１の実施例に準拠し下記のマクロモノマーＣ１及びＣ２を合成した。また、下記のＰＢＳ溶液、ピーナツレクチン溶液及び水溶性カルボジイミド溶液を用意した。
・ＰＢＳ溶液：
リン酸緩衝食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製。商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７）
・ピーナツレクチン溶液：
ＰＢＳ溶液にピーナツレクチンが０．１質量％となるよう溶解させたもの
・水溶性カルボジイミド溶液
０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドが１質量％となるよう溶解させたもの
リン酸緩衝食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製。商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７）
・ピーナツレクチン溶液：
ＰＢＳ溶液にピーナツレクチンが０．１質量％となるよう溶解させたもの
・水溶性カルボジイミド溶液
０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドが１質量％となるよう溶解させたもの
次いで、引用文献１の実施例に準拠し、下記の方法で、診断用マーカーを調製した。得られた診断用マーカーについて、蛍光強度とピーナツレクチン固定化量（ピーナツレクチンが微粒子に結合・吸着した量）を求めた。尚、ピーナツレクチン固定化量はニンヒドリン法を用いた。結果を〔表２〕に示す。
〔診断用マーカーの調製〕
Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ、イオン交換水５ｇ、エタノール１０ｇ、マクロモノマーＣ１を０．７５ｇ、マクロモノマーＣ２を０．２５ｇ、スチレン１ｇ、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ及び〔表２〕に示す量のクマリン化合物を、試験管に仕込みに溶解して、窒素で３０分間バブリングした後に封をした。これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することにより反応させ、微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて微粒子を得た。
得られた微粒子１０ｍｇを、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００ｍｇに分散させ、前記水溶性カルボジイミド溶液２００ｍｇを加えて４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去した後、前記ピーナッツレクチン溶液１ｇを加えて攪拌して微粒子を再分散させ、４℃で２４時間震蕩させることにより、微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させた。その後、遠心分離と前記ＰＢＳ溶液への再分散を３回繰り返して未反応のピーナッツレクチンを除去して診断用マーカーを得た。
Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ、イオン交換水５ｇ、エタノール１０ｇ、マクロモノマーＣ１を０．７５ｇ、マクロモノマーＣ２を０．２５ｇ、スチレン１ｇ、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ及び〔表２〕に示す量のクマリン化合物を、試験管に仕込みに溶解して、窒素で３０分間バブリングした後に封をした。これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することにより反応させ、微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて微粒子を得た。
得られた微粒子１０ｍｇを、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００ｍｇに分散させ、前記水溶性カルボジイミド溶液２００ｍｇを加えて４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去した後、前記ピーナッツレクチン溶液１ｇを加えて攪拌して微粒子を再分散させ、４℃で２４時間震蕩させることにより、微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させた。その後、遠心分離と前記ＰＢＳ溶液への再分散を３回繰り返して未反応のピーナッツレクチンを除去して診断用マーカーを得た。
〔表２〕の結果から、本発明のクマリン化合物を使用した診断用マーカーは、従来のクマリン化合物を用いた診断用マーカーに比較して、クマリン化合物の使用量が少ないにもかかわらず高い蛍光強度を示していることがわかる。実施例と比較例のピーナツレクチン固定化量は同等であることから、本発明の診断用マーカーは同等の使用量で大きな発色を示すことが期待され、ガンの早期発見等に寄与するものと考えられる。
Claims (4)
- 下記一般式（１）で表されるクマリン化合物。
- 請求項１に記載のクマリン化合物と他のラジカル重合性化合物との重合物。
- 前記他のラジカル重合性化合物が、生体の特定部位や特定細胞に、特異的な結合性や相互作用を有する基を有するラジカル重合性化合物である、請求項２に記載の重合物。
- 請求項３に記載の重合物を含有する診断用マーカー。
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