CN108440386B - 一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用 - Google Patents

一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用，所述探针以双氰基二苯乙烯为母体制备，结构中包含咔唑基、双氰基、正辛基。该探针的分子结构中由于含有较长的柔性链，具有较强的亲脂性，能穿透细胞壁(或细胞膜)进入细胞，对细胞进行染色，从而检测细胞中的pH；并且属于D‑π‑A型分子，提高了双光子吸收截面(δ)，使探针具有较高的成像清晰度与分辨率；另外在标记过程中拥有超大斯托克斯位移，大大提高了成像准确度与精密度，并且本发明探针在溶剂中荧光量子产率(Φ)较高，双光子发射截面较大，则成像的亮度越高，自然越清晰、分辨率也越高。

Description

一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用
技术领域
本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用。
背景技术
细胞内的大多数活动都是pH敏感的，包括细胞体积调节、囊泡运输、细胞极化、纤维收缩以及支架的建立。细胞内的pH的改变会影响细胞内的信号传递分子，如Ca2+、cAMP的活动，因此影响细胞内信号的传导。细胞内pH值的测定方法主要有弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法，以及目前广泛应用的免疫荧光探针法等。
荧光探针技术经过不断的发展，目前趋于较为成熟，pH值荧光染料有很多种，每种染料又有不同的工作pH区间，广泛采用的有BCECF荧光黄探针和SNARF-1羧化半萘罗丹明类荧光探针。但BCECF法不能用于细胞膜电位的测定，且其在细胞质中更易螯合，增加了染料的浪费和增大了实验误差；SNARF法的实验精度还需要再进一步提高。
本发明人一直致力于对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究，在前期的研究过程中，专利CN200710010784.6、一类双氰基二苯乙烯双光子荧光染料公开了对通用的二苯乙烯类染料结构进行修饰改造合成新型双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料，具体表现为在通用的二苯乙烯染料的同一苯环上引入双氰基，并在说明书中针对双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料中代表性化合物的合成方法、使用方法进行了披露。但是，在当时的研究过程中，仅是对该类染料测定溶液粘度、温度、极性变化的方法，以及典型化合物D1-1、D3-1的上述测定结果进行了披露，但其他结构染料的性能及应用并未具体涉及，还需要进一步的验证；同时该专利也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面探测的应用。另外，论文《对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究》也是同一时期针对双氰基二苯乙烯类染料及探针研究的阶段性成果，文中公开了对D-π-A、A-π-A、A-A-A、D-A-D等结构的二苯乙烯类染料的双光子吸收截面、溶解性影响、光物理性质的影响等内容，但也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面检测探针的应用。
Figure BDA0001664410320000021
在现有技术中，CN201610801435.5(专利1)公开了一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，该探针基于双通道检测线粒体中的pH水平，并很好地穿透组织，定位于线粒体中；CN201310326493.3(专利2)公开了一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用，所述探针化合物的双光子吸收截面强，水溶性好，并具有较高的反应活性和很强的配位能力，可应用在银离子检测和pH检测中；
但是，专利1涉及的探针最大发射波长仅456nm，离理想的近红外成像窗口(650-900nm)差距较大，这会给细胞带来光致毒，还会诱导组织自发荧光干扰(短波长长的发射光成为组织中生物荧光分子的激发光)；此外，专利1涉及的探针的荧光量子产率才0.02，这会严重影响检测的灵敏度与成像的清晰度与分辨率。专利2涉及的探针分子体积较大，细胞渗透性严重受影响，专利内容亦未提及用于细胞成像，应该是细胞成像比较困难；另外专利2涉及的探针虽未测定双光子吸收截面，从分子结构可以估计双光子吸收截面不是很大，应该远小本发明的探针的双光子吸收截面；专利2涉及的探针还会受银离子的干扰。
因此，研究出适合于细胞内pH水平检测，并且探针使用量少、毒性极低、实现对细胞酸碱度分布的监测并进一步辅助相应疾病和病理的研究，是本领域人员需要不断去探索和创造的内容。而本发明研究人员此前在对双氰基二苯代乙烯双光子荧光染料的研究过程中，侧重于代号为D1-1、D3-1的化合物探针在溶剂极性测定、微粘度测定、环境温度测定、固体硬度检测方面的研究(见发明专利申请CN200710010784.6)，对该类双氰基二苯代乙烯双光子荧光探针的研究过程中，针对细胞内汞离子、锌离子、银离子的检测，细胞内糖链抗原的活性检测以及温度传感检测等方面均进行了研究和报道，但基于双氰基二苯代乙烯的含有长柔性集团的D1化合物，用于细胞内pH检测与成像的发明未见报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种适用于细胞pH水平检测用的双光子荧光探针，该探针拥有大的双光子吸收截面(δ)和长柔性基团，故而具有较强的亲脂性，较高的成像清晰度与分辨率、准确度与精密度，并且能提高探针的使用效率。
具体来说，本发明提供了如下的技术方案：
一种双光子荧光pH探针D1，具有以下分子结构：
Figure BDA0001664410320000041
所述的双光子荧光pH探针D1的合成路线如下所示：
Figure BDA0001664410320000042
进一步的，所述探针D1的制备方法包括以下步骤：
(1)按常规方法合成中间体2、3、4、5和6；
(2)中间体7的合成：称取5g咔唑、3g氢氧化钾，加入盛有30mL DMSO的干燥单口烧瓶中，量取4mL 1－溴辛烷置于恒压滴液漏斗中，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；将烧瓶置于80～85℃的油浴中，搅拌下滴入1－溴辛烷，反应2.5-3.5h，冷却后加入100～120mL蒸馏水混合；静置后析出淡黄色固体，过滤，干燥；用无水乙醇重结晶，得白色针状晶体，即中间体7备用；
(3)中间体8的合成：量取6mL干燥的DMF置于干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，再将5mL三氯氧磷滴入单口烧瓶；称取9-辛基咔唑4g溶于40ml氯苯，置于恒压滴液漏斗，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；0.5～1h后，将9-辛基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在70～75℃的油浴中搅拌反应5～8h；反应完毕后，冷却，用碳酸氢钠调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇重结晶，得白色晶体，即中间体8备用；
(4)目标化合物D1的合成：称取446mg步骤(2)获得的中间体8和30mg氢化钠置于干燥单口烧瓶中，称取292mg中间体5溶于10mL四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光的条件下，将中间体5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中，滴加时间40～50min；滴加完毕后，室温搅拌反应24h，反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提3～4次，每次15mL，然后水洗2～3次每次10mL，加无水硫酸镁干燥；干燥后过滤，真空脱除溶剂，粗品经硅胶柱色谱分离，其中洗脱液：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12:1，得黄色粉末即为D1。
如前所述的双光子荧光标记探针D1，应用于探测细胞内pH水平、细胞异常信息。
所述的细胞为成纤维细胞。
所述的双光子荧光pH探针，其应用方法是：将D1溶于生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油组成的混合溶液(简称MIS溶液)中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在培养小鼠成纤维细胞后的培养基中加入1μmol·L-1荧光探针，并在30-40℃、含2-10％CO2的细胞培养箱中孵化20-50min，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，并于无色血清游离介质中再孵化10-20min，然后用共聚焦激光扫描显微镜(λex＝800nm,～1.5W)、20倍目镜将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞pH水平，实现对细胞是否异常的监测。
其中，所述生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油(CrEL)的体积比为20：35：30：15。
其中，小鼠成纤维细胞的培养方法如下：
将10％FBS、青霉素(100units/mL)和链霉素(100μg/mL)补加到细胞培养基DMEM中并混合均匀，于此溶液中培养小鼠成纤维细胞，于成像前两天进行细胞筛选处理。
进一步的，为了便于染色标记，在获得的成纤维细胞培养基中先除去培养介质，再换上不含FBS的DMEM介质。
本发明以双氰基二苯代乙烯(DCS)为双光子荧光母体，通过特定的合成方法获得能快速、简便、灵敏的用于细胞pH水平测定的双光子荧光探针(D1)。该探针分子响应时间极短，检测灵敏度较高，细胞渗透性良好，双光子吸收截面大且对荧光的干扰低，对细胞的毒副作用小，使得该探针作为细胞pH水平测定的试剂是极其有用的。本发明的探针具有如下特点：
1、本发明双光子荧光pH探针具有分子体积小、细胞渗透性优良、双光子吸收截面(δTPA)大、能避免入射光对发射荧光的干扰、化学/光稳定性好的优点，使探针在进行pH水平测定的过程中显著地提高成像的清晰度、分辨率、准确度和精密度。
2、本发明探针在咔唑基的9号氮原子上含有正辛基(n-C8H17)，正辛基是个较长的柔性链，具有较强的亲脂性，能穿透细胞壁(或细胞膜)进入细胞，对细胞进行染色，从而检测细胞中的pH。
3、本发明探针含有共轭性比较大的咔唑基(平面性基团)，又含有两个氰基(C≡N)(同苯环高度共轭)，是一个D-π-A(donor-π-acceptor，供体-桥-受体)型分子。氰基中的碳原子是sp杂化，碳原子与氮原子间形成叁键，这个叁键由一个σ键与两个π键组成，σ键位于键轴的方向，两个π键相互垂直且都垂直于键轴，其中的一个π键与苯环上的六电子大π键从侧面交盖重叠形成一个更大的π键，这样拓展了整个分子的共轭面，提高了双光子吸收截面；另外，氰基是一个强拉电子基，可以增加分子激发态的偶极，加剧激发态分子内的电荷迁移，增大分子的倍频效应，大大提高双光子吸收。咔唑基、氰基与D-π-A分子构造共同造就分子具有相当大的双光子吸收截面(δ)。所以D1在CH2Cl2与H2O中的δ分别高达3000与1540GM。这决定了D1具有较高的成像清晰度与分辨率。
4、本发明探针D1是个比较理想的用于细胞中pH检测的pH探针，显示了绿色荧光，拥有较大的Stokes shift(斯托克斯位移)(CH2Cl2:124nm；H2O:156nm)，表明可避免入射光对发射光(荧光)的干扰，增加成像的准确度与精密度。
5、本发明探针D1无论是在二氯甲烷，还是水中，荧光量子产率(Φ)都比较高，表明在使用过程中，双光子发射截面(荧光量子产率与双光子吸收截面的乘积，δΦ)较大，则成像的亮度越高，自然越清晰、分辨率也越高。
因此，本发明探针具有染色效果明显、细胞pH水平监测灵敏度高等优点，在生物、医药领域具有极大的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的探针D1在水相中的吸收与发射曲线图；
图2是本发明的探针D1在水相中的双光子吸收截面图；
图3是本发明的探针D1在水相中的pH滴定曲线图；
图4是本发明的探针D1在水相中的荧光强度对pH的Sigmoidal拟合曲线图；
图5是本发明的探针D1在水相中的荧光强度对pH(3.65～7.4)的线性拟合曲线图；
图6是本发明的探针D1(1μmol·L-1)标记的小鼠成纤维细胞的双光子成像照片((a)空白图像；(b)D1标记的双光子显微照片)。
具体实施方式
为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1分子结构及合成路线
一种双光子荧光标记探针D1，具有下列分子结构：
Figure BDA0001664410320000081
合成路线为：
Figure BDA0001664410320000091
其中，中间体2、3、4、5、6均根据以下文献合成：
[1]H.Huang,Q.He,H.Lin,F.Bai,Z.Sun and Q.Li,Polym.Adv.Technol.,2004,15():84—88
[2]Huang C.,Fan J.,Peng X.,Lin Z.,Guo B.,Ren A.,Cui J.,SunS.,J.Photochem.Photobio.A:Chem.,2008,199(2–3):144—149
实施例2中间体7、8和目标化合物D1的制备
制备方法：(1)按常规方法合成中间体2、3、4、5和6；
(2)中间体7的合成：准确称取咔唑(5g，30mmol)、氢氧化钾(3g，53.6mmol)加到盛有30mL DMSO的100mL干燥的单口烧瓶中，移液管准确量取4mL 1－溴辛烷置于恒压滴液漏斗中，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；将烧瓶置于80～85℃的油浴中，搅拌下滴入1－溴辛烷，反应3h，冷却后加入100mL蒸馏水混合；静置后有淡黄色固体析出，过滤，干燥；用无水乙醇重结晶，得白色针状晶体，收率68％(5.7g)，熔点68-70℃；
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:8.074(d,J＝7.6Hz,2H),7.428(t,J1＝J2＝7.6Hz,2H),7.354(d,J＝8.0Hz,2H),7.197(t,J1＝J2＝7.6Hz,2H),4.218(t,J1＝J2＝7.2Hz,2H),1.811(m,2H),1.212(m,10H),0.849(t,J1＝J2＝6.4Hz,3H).13C NMR(400MHz，CDCl3)δ:140.591,125.705，122.988，120.483，118.843，108.801，43.186，31.974，29.545，29.347，29.112，27.473，22.781，14.249。MS，m/z:C20H25N1(M+)的计算值(实测值):279.1987(279.1987)
(3)中间体8的合成：准确量取6mL干燥的DMF置于100mL干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，将5mL三氯氧磷滴入单口烧瓶；分析天平准确称取9-辛基咔唑(4g，14.3mmol)溶于40ml氯苯置于恒压滴液漏斗，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；0.5h后，将9-辛基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在70～75℃的油浴中搅拌反应6h。反应完毕后，冷却，用碳酸氢钠调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇重结晶，得白色晶体，收率95％(4.17g)；
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:10.059(s,1H),8.554(s,1H)，8.114(d，J＝8Hz，1H)，7.907(d，J＝8.4Hz，1H)，7.508(t，J1＝J2＝8Hz，1H)，7.414(d，J＝8.4Hz，2H)，7.278(t，J1＝J2＝7.6Hz，1H)，4.260(t，J1＝J2＝7.6Hz，2H)，1.842(m，2H)，1.221(m,10H)，0.850(t，J1＝J2＝6.4Hz，3H)。13C NMR(400MHz，CDCl3)δ:191.927,144.227，141.342，128.666，127.292，126.882，124.134，123.223，123.170，120.900，120.460，109.590，109.112，43.572，31.959，29.507，29.332，29.104，27.442，22.796，14.272。MS，m/z:C21H25NO(M+)的计算值(实测值):307.1936(307.1938)
(4)2-甲基-5-[2-(3-(9-正辛基)咔唑基)乙烯基]对苯二甲腈(D1)的合成：准确称取8(446mg，1mmol)和氢化钠(30mg，1.25mmol)置于25mL干燥单口烧瓶中，准确称取5(292mg，1mmol)溶于10mL四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护。将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光的条件下，将5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中(滴加时间40～-50min)。滴加完毕后，室温搅拌反应24h。反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提(3×15mL)，水洗(3×10mL)，加无水硫酸镁干燥。干燥，过滤，真空脱除溶剂。粗品经硅胶柱色谱分离〔洗脱液：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12:1〕。得黄色粉末，产率68％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.260(s,1H),8.139(d,J＝7.2Hz,1H),8.025(s,1H),7.724(d,J＝8.8Hz,1H),7.555(s,1H),7.494(t,J1＝J2＝7.2Hz,2H),7.439(d,J＝11.6Hz,1H),7.388(d,J＝10.4Hz,1H),7.315(d,J＝16.4Hz,1H),7.256(d,J＝16.4Hz,1H),4.304(t,J1＝J2＝7.2Hz,1H),2.556(s,J＝7.2Hz,2H),1.880(m,2H),1.356(m,2H),1.255(m,8H),0.862(s,3H)。13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:141.115,140.469,139.839,139.581,136.219,134.488,129.053,126.723,126.366,125.136,123.512,121.417,120.764,120.270,119.648,118.919,117.583,117.082,114.228,109.377,43.482,31.966,29.537,29.347,29.180,27.480,23.700,22.781,20.117,14.249。MS,m/z:C31H31N3(M+)的计算值(实测值)：445.2518(445.2507)
实施例3探针D1的性能研究
探针D1的光物理性质见下表1。
表1 D1的光物理性质
Figure BDA0001664410320000121
注：a)单光子吸收最大波长(nm)；b)单光子发射最大波长(nm)；c)荧光量子产率；d)最大双光子激发波长(nm)；e)斯托克斯位移(nm)；f)最大双光子吸收截面(GM)。
如表1、附图1-2所示，D1具有相当大的双光子吸收截面(δ)，在CH2Cl2与H2O中的δ分别高达3000与1540GM。
结合附图3可知，探针D1的荧光强度随溶液pH的升高而增加，当溶液pH接近9时，荧光强度几乎不再增加。
依图5可知，探针D1的荧光强度对溶液pH的Sigmoidal拟合曲线为一条平滑S型曲线，pH接近1时，荧光强度降至0，而当pH升至9时，荧光强度几乎达至最高，且拟合得到了pKa＝4.99。
依图6可知，探针D1的荧光强度在pH 3.65～7.4范围内与pH的关系几乎成一直线，经线性拟合得到方程式为IF＝0.1993pH-0.4828，这里IF为荧光强度。因此在pH 3.65～7.4时，可直接根据直线方程求出荧光强度，或根据荧光强度求出溶液。
实施例4细胞染色研究
4.1小鼠成纤维细胞的培养：
将10％FBS、青霉素(100units/mL)和链霉素(100μg/mL)补加到细胞培养基DMEM(HyClone，Dulbecco's Modified Eagle's Medium，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)中并混合均匀，于此溶液中培养小鼠成纤维细胞。成像前两天进行细胞筛选处理。为了染色，先除去培养介质，再换上不含FBS的DMEM介质。
4.2细胞显微成像：
对于双光子体外成像，使用一个激光共聚焦显微镜(Zeiss 510LSM META)，配有飞秒脉冲钛蓝宝石激光器(Mira 900-F,Coherent)，激发光光源为飞秒脉冲激光，激光波长可调范围为700～980nm(λex＝800nm,～1.5W)，配有二色分光镜(HFT 650，Carl Zeiss,Inc.)的显微镜将射入的激光通过一个油浸物镜(NA 1.4)共聚焦于细胞上。激光条码扫描器(LSM510META NLO)采集数据窗口宽度在630nm处是10.7cm，600-650nm的旁路过滤用于收集样品的发射光。双光子激发波长为790nm，收集600～650nm通道的荧光。
将D1溶于由生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油(CrEL)(20：35：30：15,体积比)组成的混合溶液(简称MIS溶液)中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，用此溶液孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞并用缓冲溶液洗去多余的D1，在显微镜下能够看到均匀的绿色荧光，这表明D1能够透过细胞膜。
图6a)是白光下的成纤维细胞照片；图6b)是在成纤维细胞培养基中加入1μmol·L-1荧光探针D1并在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育30min，然后用PBS洗3次，并于无色血清游离介质中再孵化15min后成像照片。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜。
探针D1染色后的细胞发出强烈的绿色荧光。

Claims (4)

1.双光子荧光标记探针D1在制备用于探测细胞内pH水平、细胞异常信息的产品中的应用，所述双光子荧光标记探针D1具有以下分子结构：
Figure FDA0002717658120000011
2.根据权利要求1所述的双光子荧光标记探针D1的应用，其特征在于：所述的细胞为成纤维细胞。
3.根据权利要求1或2所述的双光子荧光标记探针D1的应用，其特征在于：将D1溶于生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯60蓖麻油组成的混合溶液中，简称MIS溶液，采用HEPES即4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液调节pH，在培养小鼠成纤维细胞后的培养基中加入1μmol﹒L-1荧光探针，并在30-40℃、含2-10％CO2的细胞培养箱中孵化20-50min，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，并于无色血清游离介质中再孵化10-20min，然后用共聚焦激光扫描显微镜：λex＝800nm,～1.5W、20倍目镜将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞pH水平，实现对细胞是否异常的监测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯60蓖麻油即CrEL的体积比为20：35：30：15。
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