CN109946276B - 一种双光子荧光探针的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双光子荧光探针技术领域，具体地说，涉及一种双光子荧光探针的用途，所述双光子荧光探针应用于细胞与组织成像中，探测脂筏含量以及分布动态，该探针能够提高脂筏检测的准确度、精密度、灵敏度、成像分辨率，为进一步防控阿尔茨海默症和朊病毒病等神经退行性疾病提供新思路。

Description

一种双光子荧光探针的用途

技术领域

本发明涉及双光子荧光探针技术领域，具体地说涉及一种双光子荧光探针的用途。

背景技术

脂筏(lipid raft)(10―100nm的膜片)是细胞质膜中富含鞘脂(鞘糖脂和鞘磷脂)和胆固醇的微区，参与细胞转导和蛋白质转运等细胞过程，与阿尔茨海默症和朊病毒病等神经退行性疾病密切相关。具体的说，脂筏是刚性隔膜(有序液相：liquid-ordered phase,lo)，漂浮在甘油磷脂(无序液相：liquid-disordered phase,ld)的海洋中。其结构特点与组分适于蛋白质间的相互作用与构象转化，参与许多细胞过程，如信号传导、病原体侵入、胆固醇稳态、神经退行性疾病(阿尔茨海默症和朊病毒病等)等。甘油磷脂由与磷酸基团相结合的极性头部(亲水端)和两个非极性尾部(脂肪酸链，亲脂端)组成，鞘磷脂为鞘氨醇的衍生物，这两类脂极性较强；含有4个碳环且分子刚性很强的胆固醇带有一个亲水头部(含一个羟基)，极性很弱，粘度很大。因此脂筏的极性要比甘油磷脂的海洋小得多，且粘度相对较小。

现有技术中，如专利号CN201611180454.7公开了一种可以实时原位以两种荧光颜色清楚区分和同时成像细胞膜脂筏微区和非脂筏微区的单一荧光探针。该荧光探针是式(I)所述结构的化合物，其中R1表示2-乙氧乙基、氨基烷基、羟烷基或烷基；R2和R3表示烷基。该发明还公开了所述荧光探针在实时原位以红绿两种荧光颜色标记活细胞细胞膜上的脂筏和非脂筏微区中的应用。但该专利仅能够用红色荧光和绿色荧光对脂筏微区和非脂筏微区进行区分，但是对组织中脂筏的分布动态难以进行精准的表征。该发明所述荧光探针 (简称文献1探针)为吡啶盐化合物，属于离子型化合物，首先其荧光量子产率相当低；其次其荧光寿命比较短，一般不到200ps(1ps＝10^-12s)[参见文献：(1)王筱梅等，中国科学(E辑)，32(1)：20－27；(2)雷虹等，物理，2003，32(1)：19－26]；再次其离子化合物的本性(强极性)与脂筏(弱极性)相容性差、亲合力弱，依据为相似相溶原理；最后，其易于与核酸结合用作核酸探针[参见文献：(1)Liu Y,Meng F F,He L W,Yu X Q,Lin WY.Chem.communications,2016,52(57)：8838—8841；(2)Song G F,Miao F,Sun Y M,Yu XQ,Sun J Z,Wong W Y.Sensors and Actuators B Chemical,2012,173(10):329—337]，因此易受核酸的干扰，产生假阳性。

又如文献《区分成像细胞质膜内脂筏与非脂筏微畴以及专一检测细胞内微环境的新型荧光探针的研制》(田明刚发表)中描述，人们使用极性敏感的荧光染料改造为能够双色成像脂筏、非脂筏微区的荧光探针；用黏度敏感染料改造为成像脂筏微区的荧光探针；利用分子内电荷转移(Intromo1ecu1ar Charge Transfer,ICT)、光诱导的能量转移(Photo-induced Energy Transfer,PET)等原理设计了pH值探针；利用黏度敏感的转子型荧光染料对细胞内黏度进行了探测,等等。尽管人们已经做出了大量工作来开发、完善这些探针,但是它们在生物成像的应用中依旧均面临着各种限制。例如,目前用于双色成像细胞膜上脂筏、非脂筏微区的探针对两种微区的区分力不够,导致了它们在活细胞膜上很难清晰成像两种微区的精确分布。因此该文献针对脂筏、非脂筏微区在磷脂排布方式上的不同,开发了聚集/单体型的荧光探针，该探针能够以较高的区分度区分成像两种微区,在活细胞的细胞膜上对这两种微区进行了清晰双色区分成像,并揭示了癌细胞和正常细胞膜上脂筏、非脂筏微区分布的差异。但文献1探针为吡啶盐化合物，属于离子型化合物，具有强极性，与弱极性脂筏相容性差、亲合力弱；文献1探针易于与核酸结合用作核酸探针[参见文献：(1)LiuY,Meng F F,He L W,Yu X Q,Lin W Y.Chem.communications,2016,52(57)：8838—8841；(2)Song G F,Miao F,Sun Y M,Yu X Q,Sun J Z,Wong W Y.Sensors and Actuators BChemical,2012,173(10):329—337]，因此易受核酸的干扰，产生假阳性；并且文献1探针的荧光量子产率相当低(虽专利未公布此参数)，文献1探针的荧光寿命比较短，一般不到200ps(1ps＝10^-12s)[参见文献：(1)王筱梅等，中国科学(E辑)，32(1)：20－27；(2)雷虹等，物理，2003，32(1)：19－26]。

使用两个近红外光子激发的双光子显微镜(TPM)可以实现对微观客体的实时动态三维(3D)成像，为脂筏的生物研究提供了锐利的工具。本发明人长期致力于染料和探针的研究，此前报道了两个溶剂生色(极性)探针(供体-桥-受体，D-π-A)(Huang C.,Pan Q.,Chen H.,Liang X.,Lv G.,Chem.J.Chinese Universities,2018,39(3),646—653(黄池宝，潘淇，陈华仕，梁兴，吕国岭.高等学校化学学报,2018,39(8),1676—1682)和Huang C.,Peng X.,Yi D.,Qu J.,Niu H.,Sensors and Actuators B:Chemical,2013,182(1),521—529)，其宽的溶剂生色范围与高的双光子发射截面(Φδ)成为脂筏成像的首选锐器。宽的溶剂生色范围表明探针对溶剂极性极为敏感，从而增加对脂筏检测的灵敏度、准确度与成像的清晰度和分辨率。也是本领域研究人员需要不断去探索、研究和改进的问题。在近期的研究中，本发明人通过对双氰基二苯乙烯为母体的现有探针的结构进行改造与修饰，用稠环咔唑替换苯环，并在咔唑基上引入一个亲脂性长碳链(C₈H₇)从而获得了一种新的双光子荧光探针，并发现其能用于细胞内pH水平检测，故而进行了专利申请(申请号CN2018104756764)，在其中披露了探针结构、合成方法以及细胞内pH水平检测的应用。但是在结合脂筏动态生理过程及其作用的机制研究过程中，我们意外的发现，该发明申请中探针D1能够特异性识别脂筏、成像脂筏在细胞与组织中的分布动态，在报道的脂筏探针中具有显著的优越性，在脂筏检测与成像中更加具有检测的灵敏度、准确性和成像的清晰度、分辨率，对细胞质膜显示了高度的相容性。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种双光子荧光探针的新用途，该探针以双氰基二苯乙烯为母体制备，结构中包含咔唑基、双氰基、正辛基，并在咔唑基上引入一个亲脂性长碳链(C₈H₇)。

具体来说，本发明提供了如下的技术方案：

一种双光子荧光探针在脂筏检测中的应用，所述双光子荧光探针应用于细胞与组织成像中，探测脂筏含量以及分布动态。

所述双光子荧光探针DLR的结构式：

所述双光子荧光探针DLR的合成路线如下所示：

所述双光子荧光探针用于探测脂筏含量时，方法是：将DLR溶于工作液中，然后再用含有DLR的工作液孵化细胞，取出细胞在显微镜下观察荧光强度，根据荧光强度并结合标准工作曲线计算出脂筏含量。

所述工作液是按照HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲生理盐水/EtOH/DMSO/CrEL(聚氧乙烯蓖麻油)＝20/35/30/15的体积比配制而成。

所述双光子荧光探针用于探测脂筏分布动态时，方法是：用DLR孵化组织切片，将切片置于显微镜下观察荧光强度，在双光子荧光假彩照片中，颜色由蓝至红，表示脂筏浓度逐渐增大。

在此前的专利申请CN2018104756764中记载了：

1、探针D1(即本发明所述的DLR)含有共轭性比较大的咔唑基(平面性基团)，又含有两个氰基(C≡N)(同苯环高度共轭)，是一个D-π-A(donor-π-acceptor，供体-桥-受体)型分子。氰基中的碳原子是sp杂化，碳原子与氮原子间形成叁键，这个叁键由一个σ键与两个π键组成，σ键位于键轴的方向，两个π键相互垂直且都垂直于键轴，其中的一个π键与苯环上的六电子大π键从侧面交盖重叠形成一个更大的π键，这样拓展了整个分子的共轭面，提高了双光子吸收截面；另外，氰基是一个强拉电子基，可以增加分子激发态的偶极，加剧激发态分子内的电荷迁移，增大分子的倍频效应，大大提高双光子吸收。咔唑基、氰基与D-π-A分子构造共同造就分子具有相当大的双光子吸收截面(δ)。这决定了DLR具有较高的成像清晰度与分辨率。

2、探针显示了绿色荧光，拥有较大的Stokes shift(斯托克斯位移)(CH₂Cl₂:124nm；H₂O:156nm)，表明可避免入射光对发射光(荧光)的干扰，增加成像的准确度与精密度。

由于该探针具有分子响应时间极短，检测灵敏度较高，细胞渗透性良好，双光子吸收截面大且对荧光的干扰低，对细胞的毒副作用小，因此，有助于提高脂筏检测的准确度、精密度、灵敏度、成像分辨率,为进一步防控阿尔茨海默症和朊病毒病等神经退行性疾病提供新思路。具体是：

1、本发明双光子荧光探针由于具有长柔性基团，故而具有较强的亲脂性，能够提高探针与细胞质膜(双脂分子层)的相容性，进而有助于提高成像清晰度与分辨率、准确度与精密度。尤其是，本发明在咔唑基的9号氮原子上含有正辛基(n-C₈H₁₇)，能有效穿透细胞壁、细胞质膜，引入亲脂性柔性正辛基(C₈H₇)，提高探针与细胞质膜(双脂分子层)的相容性，有利于与脂筏的亲合，从而提高探针对脂筏的特异性识别。

2、本发明双光子荧光探针具有稠环咔唑基，增大了分子平面刚性，进而提高了双光子吸收截面(δ_TPA)，能够发出较强的应该，增加灵敏度，还降低了水溶液极性(或细胞液极性)对探针荧光的影响，进而有助于增强检测的准确度。

3、本发明的双光子荧光探针由于具有分子体积小、细胞渗透性优良、双光子吸收截面(δ_TPA)大、能避免入射光对发射荧光的干扰、化学/光稳定性好的特点，使探针在进行脂筏含量以及分布动态检测时能提高成像的清晰度、分辨率、准确度和精密度。

4、本发明的双光子荧光探针属于推-拉电子结构(供体-桥-受体，D-π-A)，探针的最大发射波长随介质极性递增而其荧光强度随极性递减；DLR在DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)中的发射强度是DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)中的20倍，在DPPC中的荧光寿命是DOPC中的2倍多，所以该探针能很好地区分DPPC与DOPC；本发明的双光子荧光探针在DPPC和DOPC中的双光子发射截面(Φδ)分别为1350和67GM，所以该探针能够很好地识别脂筏，成像脂筏在细胞与组织中的分布动态。

5、本发明探针属于分子型化合物，在脂筏混合物中高达0.205，甚至在四氢呋喃中达0.847，荧光寿命达到ns(10^-9s)级，并且探针极性很弱，与弱极性脂筏相容性优良，探针难与核酸结合，只与脂筏结合，具有高度的特异性亲合脂筏。

附图说明

图1是本发明的探针DLR的氢核磁共振谱1(¹HNMR)；

图2是本发明的探针DLR的碳核磁共振谱(¹³CNMR)；

图3是本发明的探针DLR在各种溶剂cHex、THF、DMF和DMSO里的双光子激发谱。DLR的浓度为c＝1μmol/L，横坐标为波长(nm)，纵坐标为双光子发射截面；

图4是本发明的探针DLR的细胞成像图(a:未加MβCD；b:加MβCD；c:加胆固醇)；

图5是本发明的探针DLR的组织成像图(a:未加MβCD；b:加MβCD；c:加胆固醇)。

图6是本发明的探针DLR在各种溶剂cHex、THF、DMF和DMSO里的双光子激发谱；DLR的浓度为c＝10μmol/L；

图7是本发明的探针DLR在各种溶剂中的标准化发射光谱，以增加的π^*值(cHex，THF，DMF，DMSO＝0.00,0.58,0.88,1.00)的顺序排列，作为溶剂极性的经验参数；

图8是本发明的探针DLR在各种溶剂中的相对发射光谱，以增加的π^*值(cHex，THF，DMF，DMSO＝0.00,0.58,0.88,1.00)的顺序排列，作为溶剂极性的经验参数；

图9是本发明的探针DLR(c＝1μmol·L-1)在cHex，THF，DMF和DMSO中的双光子作用光谱；DLR的浓度为c＝1μmol/L，测试温度为25±0.5℃；

图10是本发明的探针DLR在DPPC、Raft Mix(即模拟脂筏，按照DOPC/鞘磷脂/胆固醇＝1:1:1制成)、DOPC、小鼠成纤维细胞中的时间分辨荧光光谱。

具体实施方式

为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1分子结构及合成路线

一种双光子荧光标记探针DLR，具有下列分子结构：

合成路线为：

其中，中间体2、3、4、5、6均根据以下文献合成：

[1]H.Huang,Q.He,H.Lin,F.Bai,Z.Sun and Q.Li,Polym.Adv.Technol.,2004,15:84—88

[2]Huang C.,Fan J.,Peng X.,Lin Z.,Guo B.,Ren A.,Cui J.,Sun S.,J.Photochem.Photobio.A:Chem.,2008,199(2–3):144—149

实施例2双光子荧光脂筏探针检测过程的研究

2.1试剂与仪器

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC，西安瑞禧生物科技有限公司)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，西安瑞禧生物科技有限公司)，胆固醇(cholesterol，西安瑞禧生物科技有限公司)，鞘磷脂(sphingomyelin，西安瑞禧生物科技有限公司)，甲基-β-环糊精(MβCD，淄博千汇生物科技有限公司])。

Mira 900-F锁模飞秒钛蓝宝石激光器(美国Coherent公司)

2.2实验过程

2.1双光子荧光探针DLR的制备按照专利申请CN2018104756764进行制备。

2.2细胞中脂筏含量检测

用于探测脂筏含量时:将DLR溶于工作液中，然后再用含有DLR的工作液孵化细胞，取出细胞在显微镜下观察荧光强度，根据荧光强度并结合标准工作曲线计算出脂筏含量。

所述工作液是按照HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲生理盐水/EtOH/DMSO/CrEL(聚氧乙烯蓖麻油)＝20/35/30/15的体积比配制而成。

所述双光子荧光探针用于探测脂筏分布动态时，方法是：用DLR孵化组织切片，将切片置于显微镜下观察荧光强度，在双光子荧光假彩照片中，颜色由蓝至红，表示脂筏浓度逐渐增大。

实施例3双光子荧光探针对脂筏含量状况的研究

1)小鼠成纤维细胞的培养按照文献(Huang C.,Qu J.,Qi J.,Yan M.,Xu G.,Org.Lett.,2011,13(6),1462—1465)制成：

2)工作液配制：按照氯仿与甲醇的体积比为9:1配制而成；

3)将DLR溶于工作液中，然后在用含有DLR的工作液孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞在显微镜下观察荧光强度，荧光强度越大的细胞区域则脂筏含量越高；

4)加入甲基-β-环糊精(即MβCD)后，孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞在显微镜下观察到荧光强度变弱，说明MβCD能破坏细胞中的脂筏，脂筏含量显著减小；

5)再加入50μmol/L的胆固醇后，孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞在显微镜下观察。

结果显示：观察到荧光强度恢复，说明DLR能够用于检测细胞质膜中的脂筏。

实施例4双光子荧光探针对脂筏分布动态测定的研究

1)小鼠脑组织切片的制备按照文献[4](Kim H.M.,Seo M.S.,An M.J.,HongJ.H.,Tian Y.S.,Choi J.H.,Kwon O.,Lee K.J.,Cho,B.R.,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,5167—5170)制成；

2)用DLR孵化小鼠脑组织切片，将切片置于显微镜下观察荧光强度，在双光子荧光假彩照片中，颜色由蓝至红，表示脂筏浓度逐渐增大；

3)加入甲基-β-环糊精(即MβCD)后，孵化小鼠脑组织切片，将切片置于显微镜下观察到荧光强度减弱，说明脂筏被破坏；

4)再加入50μmol/L的胆固醇后，孵化小鼠脑组织切片，将切片置于显微镜下观察。

结果显示：到荧光强度增强，说明DLR能成像组织中脂筏的分布动态。

实施例5探针DLR的性能研究

探针DLR的光物理性质见表1

表1

注：a)单光子吸收最大波长(nm)；b)单光子发射最大波长(nm)；c)荧光量子产率；d)最大双光子激发波长(nm)；e)斯托克斯位移(nm)；f)最大双光子吸收截面(GM)。

在DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、模拟脂筏(DOPC、鞘磷脂、胆固醇按摩尔比1：1：1配制而成)、DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)中，DLR的时间分辨荧光谱性能(脂质与探针的摩尔比为200：1)见表2

表2

试验例1

研究过程中我们发现：双光子荧光探针DLR的最大吸收波长几乎不随溶剂变化(如图6所示)，DLR的发射最大波长(λ_EM)与溶剂极性呈正相关(423nm(环己烷，cHex)和581nm(DMSO))(如图7所示)，即随溶剂极性经验参数π^*递增。cHex只有400―480nm处的定域激发(locally excited state,LE)，DMF与DMSO在400―480nm处的定域发射强度远小于480nm处的离域激发(delocally excited state,DE)的发射强度，而THF则没有显示LE峰。DLR的发射强度依DPPC、Raft Mix和DOPC的顺序逐渐减弱(20:12.8:1)，且有稍许的红移(如图8所示)。DPPC与DOPC分别类似于脂筏(l_o)和甘油磷脂(l_d)，这表明DLR在lo中的荧光强度应该远远大于ld中的，脂相容性强的DLR可用于脂筏的检测。

DLR属于D-π-A(D为电子供体，A为电子受体)型分子，在激发态时伴随分子的供体端与分子主体间的扭转，发生电荷分离，即电子从供体端咔唑氮原子上迁移至氰基端，形成部分的偶极，极性介质有利于偶极电荷分散，稳定偶极状态，亦即偶极激发态能量降低，相应发出能量较低的荧光，表现为发射波长红移。由于非偶极激发态跃迁至偶极激发态是一个非辐射跃迁，发生能量衰减甚至坍陷，因此荧光强度自然减弱。

试验例2

依据文献[Huang C.,Ren A.,Li H.,Yang N.,Chem.J.Chinese Universities,2010,31(11),2222—2227(黄池宝，任安祥,李海渤,阳年发.高等学校化学学报,2010,31(11),2222—2227)]和文献[Huang C.,Ren A.,Acta Chimica Sinica,2007,65(23),2765—2770(黄池宝，任安祥.化学学报,2007,65(23),2765—2770)]方法进行测定，结果如图9所示，Φδ依DPPC、Raft Mix、DOPC的顺序递减(1350(DPPC)、975(Raft Mix)和67GM(DOPC))，最大双光子激发波长(λEMTP)分别为780、790与800nm。可以看出，当介质极性增大，Φδ则减小，DPPC中的Φδ是DOPPC中的20倍多，因此DLR足以区分l_o(类似于DPPC)与l_d(类似于DOPC)。这归功于激发态分子在较极性介质中发生分子内扭转，分子共平面性减弱，Φδ自然减小。

试验例3

时间分辨荧光谱(TRFs)根据文献[Kim H.M.,Jeong B.H.,Hyon J.-Y.,An M.J.,Seo M.S.,Hong J.H.,Lee K.J.,Kim C.H.,Joo T.,Hong S.-C.,Cho B.R.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(13),4246—4247]介绍的方法进行测定。结果如图10所示。探针DLR在DPPC和细胞中的荧光寿命(3.3―4.5ns)大于在DOPC中的(1.7―1.9ns)；在DOPC中的LE态的时间衰减常数是65ps，而DE态的则为21ps，前者是后者的3倍多。数据表明DLR在DOPC中的荧光很弱，且强度衰减迅速。因此，无论是荧光强度，抑或是荧光寿命，都随介质极性递减。显然，在细胞中的TRFs与Raft Mix中的很相似。这表明DLR的荧光能清晰地将凝胶相(脂筏l_o)和流体相(甘油磷脂l_d)区分开，源于DLR对凝胶相的亲和力远大于对流体相的，且极性介质中的荧光更弱。

Claims (5)

1.一种双光子荧光探针的用途，其特征在于：所述双光子荧光探针应用于细胞与组织成像中，探测脂筏含量以及分布动态；

所述双光子荧光探针DLR的结构式：

2.如权利要求1所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于，所述双光子荧光探针DLR的合成路线如下所示：

3.如权利要求1所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于：所述双光子荧光探针用于探测脂筏含量时，方法是：将DLR溶于工作液中，然后再用含有DLR的工作液孵化细胞，取出细胞在显微镜下观察荧光强度，根据荧光强度并结合标准工作曲线计算出脂筏含量。

4.如权利要求3所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于：所述工作液是按照HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲生理盐水/EtOH/DMSO/CrEL(聚氧乙烯蓖麻油)＝20/35/30/15的体积比配制而成。

5.如权利要求1所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于：所述双光子荧光探针用于探测脂筏分布动态时，方法是：用DLR孵化组织切片，将切片置于显微镜下观察荧光强度，在双光子荧光假彩照片中，颜色由蓝至红，表示脂筏浓度逐渐增大。

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