CN108358914B - 一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，特征是将6‑氨基‑2‑甲基喹啉溶于乙腈中，加入N‑溴代琥珀酰亚胺反应，得到中间体1；将其溶于水、乙醇和甲苯混合溶液中，加入3‑(N,N‑二甲氨基)苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碳酸钠，氮气保护下回流反应得到中间体2；用盐酸溶解中间体2，在冰水浴条件下将亚硝酸钠加入至上述溶液，用氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，分离提纯即得到3‑甲基‑11‑(N,N‑二甲氨基)噌啉并[3,4‑e]喹啉，即AzosD；其具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核的靶向性高，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色。在细胞核形态的长时间监测和细胞生理过程中细胞核形态变化的观测领域具有广泛的应用前景。

Description

一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞核荧光探针技术领域，具体涉及一种用于细胞核染色的核酸荧光探针3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉(AzosD)及其制备方法。
背景技术
随着科学技术的发展，人类对细胞核的认识越来越深刻。细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。细胞核是细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。核酸是与生命活动和疾病密切相关的生物大分子。因此，细胞核的染色、追踪及形态观察对于了解整个细胞的生命过程具有重要的意义。
对细胞核的成像通常采用荧光靶向成像的方法[J.Yan,W.He,N.Li,M.Yu,Y.Du,B.Lei,P.X.Ma,Biomaterials 2015,59,21-29.]。目前已经商业化的细胞核靶向荧光染料包括溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst等。这些荧光染料对细胞核具有特异性的染色作用。然而，这些荧光染料在溶液状态，通常面临着易于发生光漂白、生物毒性大、抗生物代谢能力低等问题。因此，期待开发具有较高的荧光量子产量、良好的生物相容性、高的光稳定性及抗酶解代谢、且长时间稳定定位于细胞核的荧光染料。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法，以克服现有技术的上述缺陷。
本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，其特征在于是结构式为
Figure BDA0001575857930000011
的3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉(AzosD)。
其核磁共振氢谱是：1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS):δ＝9.36(d,J＝8.7Hz,1H),8.68(d,J＝9.1Hz,1H),8.56(d,J＝9.4Hz,1H),8.25(d,J＝9.1Hz,1H),7.70(d,J＝2.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,1H),7.43(d,J1＝2.6,J2＝9.4Hz,1H),3.28(s,6H),2.85(s,3H)ppm；
其核磁共振碳谱是：13C NMR(100MHz,CDCl3,TMS):δ＝159.4,151.7,149.2,144.3,142.6,134.9,132.7,131.6,131.0,123.9,122.3,121.7,117.6,116.9,101.3,40.5,25.0ppm；
其高分辨质谱是：HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd.for C18H17N4:289.1448；found289.1449。
本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，其特征在于：
先将1.26mmol 6-氨基-2-甲基喹啉溶于100ml乙腈中，加入1.33mmol NBS和催化量的硅胶，反应12-18h，经旋干、硅胶柱色谱提纯，得到中间体1；所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯；
再将90mg上述中间体1溶于10ml的由水、乙醇和甲苯按体积比1:1:3-4配制的混合溶液中，然后依次加入63mg 3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下60-100℃回流反应24h，萃取真空减压除去有机相，柱色谱分离得到淡黄色固体状产物中间体2；
用30ml浓度为6M的盐酸溶解42mg的中间体2，并冷却到-5-10℃；把1-5倍当量亚硝酸钠溶解到另一份30ml浓度为6M的盐酸中，缓慢滴加至中间体2的盐酸溶液中，搅拌反应30min后，用10％的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯，即得到细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD。
上述荧光探针化合物AzosD的合成路线可表示为：
Figure BDA0001575857930000021
本发明的荧光探针化合物AzosD在500-600nm波段有较强的荧光发射。在含有该染料的培养基中培养细胞1h后，即可在激光共聚焦显微镜下观测到明显的细胞内荧光。本发明的荧光探针AzosD基本细胞毒性很小，在正常染色浓度下处理细胞24h，细胞存活率均高于72％。
由于本发明的细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，采取了先将6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中，加入N-溴代琥珀酰亚胺和硅胶反应，得到中间体1；再将中间体1溶于水、乙醇和甲苯混合溶液中，加入3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碳酸钠，氮气保护下回流反应得到中间体2；用盐酸溶解中间体2，在冰水浴条件下将亚硝酸钠固体加入至上述溶液，用氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，分离提纯后得到荧光探针染料AzosD。该细胞核荧光探针AzosD具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核靶向性高、可长时间监控活体细胞内细胞核形态变化等优点，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色。本发明原料易得，反应条件温和，操作简单，成本低。
经研究表明，本发明的荧光探针AzosD在500-600nm范围具有良好的荧光性质，能够对细胞(如RAW264.7)中的细胞核激光共聚焦成像。RAW264.7细胞被荧光探针AzosD染色后，可清晰地观察到化合物AzosD对RAW264.7细胞的细胞核具有较高的成像能力，可为跟踪细胞核在细胞内的变化提供有效的可视化工具，它的光稳定性好、荧光量子产量高、生物毒性低。
本发明的核酸荧光探针AzosD，是具有细胞核靶向功能的荧光探针。该荧光探针的化学性质稳定，细胞毒性低，可与DNA相互作用，呈现出荧光增强的效果，具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核靶向性高、可长时间监测活体细胞内细胞核形态变化等优点，对细胞无损伤，细胞核定位能力强，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色，进行活体细胞检测。在细胞核形态长时间监测、细胞生理过程中细胞核形态变化的观测领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD在乙腈中的可见紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。
图2是本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD在不同浓度DNA存在下的荧光光谱图。
图3是本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD荧光强度随DNA浓度的变化的关系图。
图4是本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD的不同浓度对细胞存活率(培养24h)的影响。
图5是本发明的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD与商用细胞核染色剂DAPI对细胞荧光共聚焦显微成像。其中图5a是商用细胞核染色剂DAPI着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5b是采用本发明的核酸荧光探针AzosD着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5c是明场图片；图5d是叠合的照片图；
图6是图5a和5b划线区域的荧光强度变化曲线；图7是本发明的细胞核的荧光探针AzosD与商品细胞核染色剂DAPI间的共染色轮廓图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法。
实施例1：
A、中间体1的制备
室温条件下，将1.26mmol 6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中加入到250ml烧瓶中，然后缓慢加入1.33mmol N-溴代琥珀酰亚胺和催化量的硅胶，继续搅拌，15min后瓶中液体变为深棕色，薄层色谱法判定反应有新点生成，原料未反应完全，继续反应12h。反应结束后，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，残余物经色谱柱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:6)分离提纯，得到207mg黄色固体状的产物即中间体1，产率为69％。
1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS):δ＝8.23(d,J＝8.6Hz,quinoline-H,1H),7.81(d,J＝9.0Hz,quinoline-H,1H),7.28(d,J＝8.6Hz,quinoline-H,1H),7.20(d,J＝9.0Hz,quinoline-H,1H),4.40(s,2H,NH2),2.70(s,3H,CH3)。TOFMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC10H10N2Br:237.0022,found 237.0028.
B、中间体2的制备
向圆底烧瓶中加入90mg上述制备的中间体1，用16ml由水：乙醇：甲苯按体积比3:3:10的混合溶液溶解后，依次加入63mg 3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下60℃加热回流反应24小时。反应结束后，萃取真空减压除去有机相，柱色谱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:5)分离得到40mg淡黄色固体状产物，即中间体2，产率为38％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.86(d,J＝9.0Hz,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.40(td,J＝0.8,8.4Hz,1H),7.21(d,J＝8.3Hz,1H),7.06(d,J＝8.6Hz,1H),6.81(m,1H),6.66(m,2H),3.82(br,2H),2.98(s,6H),2.66(s,3H)。TOFMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC18H20N3:278.1657,found 278.1655.
C、目标产物AzosD的制备
向圆底烧瓶中加入42mg中间体2，用30ml浓度为6M盐酸溶解，在冰水浴条件下将其冷却到-5℃。将30mg亚硝酸钠固体溶解在另一份30ml浓度为6M盐酸中，以每秒1滴的速度滴入上述溶液中。置于磁力搅拌器搅拌10min，用质量比10％浓度的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯得到26mg姜黄色固体状的产物，即为目标化合物AzosD，产率为62％。
图1给出了本发明的细胞核的荧光探针AzosD在乙腈中的可见紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图，其测试体系为0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液/DMSO体积比＝100:1。
本实施例中所制备得到的姜黄色固体产物其核磁共振氢谱是：1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS):δ＝9.36(d,J＝8.7Hz,1H),8.68(d,J＝9.1Hz,1H),8.56(d,J＝9.4Hz,1H),8.25(d,J＝9.1Hz,1H),7.70(d,J＝2.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,1H),7.43(d,J1＝2.6,J2＝9.4Hz,1H),3.28(s,6H),2.85(s,3H)ppm；
其核磁共振碳谱是：13C NMR(100MHz,CDCl3,TMS):δ＝159.4,151.7,149.2,144.3,142.6,134.9,132.7,131.6,131.0,123.9,122.3,121.7,117.6,116.9,101.3,40.5,25.0ppm；
其高分辨质谱是：TOFMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd.for C18H17N4:289.1448,found289.1449。
由此证明了按照上述合成方法所得到的姜黄色固体产物是结构式为
Figure BDA0001575857930000051
的3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉(AzosD)。
实施例2：
A、中间体1的制备
室温条件下，将1.26mmol 6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中加入到250ml烧瓶中，然后缓慢加入1.33mmol N-溴代琥珀酰亚胺和催化量的硅胶，继续搅拌，15min后瓶中液体变为深棕色，薄层色谱法判定反应有新点生成，原料未反应完全，继续反应16h。反应结束后，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，残余物经色谱柱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:6)分离提纯，得到222mg黄色固体状的产物，即中间体1，产率为74％。
B、中间体2的制备
向圆底烧瓶中加入90mg中间体1，用16ml由水：乙醇：甲苯按体积比3:3:10的混合溶液溶解后，然后依次加入63mg 3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下80℃加热回流反应24小时。反应结束后，萃取真空减压除去有机相，柱色谱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:5)分离得到淡黄色固体状产物，即中间体2，产率为43％；
C、目标产物AzosD的制备
向圆底烧瓶中加入42mg中间体2，用30ml浓度为6M盐酸溶解，在冰水浴条件下将其冷却到0℃。将30mg亚硝酸钠固体溶解在另一份30ml浓度为6M盐酸中，以每秒1滴的速度滴入上述溶液中。置于磁力搅拌器搅拌10min，用质量比10％浓度的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯得到27mg姜黄色固体状的产物，即为目标化合物AzosD，产率为64％。
实施例3：
A、中间体1的制备
室温条件下，将1.26mmol 6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中加入到250ml烧瓶中，然后缓慢加入1.33mmol N-溴代琥珀酰亚胺和催化量的硅胶，继续搅拌，15min后瓶中液体变为深棕色，薄层色谱法判定反应有新点生成，原料未反应完全，继续反应18h。反应结束后，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，残余物经色谱柱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:6)分离提纯，得到216mg黄色固体状的产物，即中间体1，产率为72％。
B、中间体2的制备
向圆底烧瓶中加入90mg中间体1，用16ml由水：乙醇：甲苯按体积比3:3:10的混合溶液溶解后，然后依次加入63mg 3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下100℃加热回流反应24小时。反应结束后，萃取真空减压除去有机相，柱色谱(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:5)分离得到43mg淡黄色固体状产物，即中间体2，产率为41％；
C、目标产物AzosD的制备
向圆底烧瓶中加入42mg中间体2，用30ml浓度为6M盐酸溶解，在冰水浴条件下将其冷却到10℃。将30mg亚硝酸钠固体溶解在另一份30ml浓度为6M盐酸中，以每秒1滴的速度滴入至上述溶液。置于磁力搅拌器搅拌10min，用质量比10％浓度的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯得到20mg姜黄色固体状的产物，即为目标化合物AzosD，产率为47％。
实施例4：
1、目标化合物AzosD的光谱性质
对本发明上述实施例中制备的得到的荧光探针AzosD的紫外吸收和荧光强度进行测试，如图1所示，紫外吸收峰位于350-500nm，荧光发射峰位于450-650nm。其测试体系为0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液/DMSO体积比＝100:1。
2、目标产物AzosD与DNA相互作用的测试
将化合物AzosD溶解在0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液/DMSO体积比＝100:1的溶液中，得到浓度为10μM的测试溶液，加入0-0.3g/L的同样溶解在上述磷酸盐缓冲液的小牛胸腺DNA(sigma-aldrich试剂公司生产)溶液，如图2、图3所示，通过测试其荧光强度，发现随着DNA浓度的增加会对化合物AzosD的荧光产生增强作用，位于516nm处的荧光发射峰增强21.4倍。
实施例5：
1、目标产物AzosD细胞核定位效果的测试
将清洗干净且灭菌的盖玻片放入24孔组织培养板中，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)5*104个/孔的密度接种在共聚焦显微镜专用玻底培养皿中，培养皿直径35mm，其中盖玻片厚度0.13-0.16mm，皿中心微孔直径10mm，并用DMEM作为细胞培养基进行细胞培养，贴壁生长24小时，细胞培养基中含有胎牛血清(体积比：10％)、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100ug/ml)。细胞培养基置于含体积比为5％CO2和体积比为95％O2的培养箱中维持温度37℃进行细胞培养24小时，用PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4，Gibco试剂公司生产)洗涤RAW264.7细胞三次，洗去培养基。然后分别加入10μl目标产物(1mM)的DMSO溶液培养1h，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗盖玻片6-7次，滴1ml 4％多聚甲醛/PBS溶液固定细胞10min，蒸馏水冲洗盖玻片6-7次。将盖玻片卡在洁净的载玻片上，置于激光共聚焦显微镜(LSM-710，Zeiss，德国)下观察细胞形态及荧光摄取情况。图4表明该化合物的细胞毒性很小，在0-50μM浓度下，培养24小时后，RAW264.7细胞的存活率均在72％以上。使用63倍油镜，用405nm作为激发光源，收集500-650nm范围内的荧光。图5给出了本发明的细胞核的荧光染料AzosD与细胞核的商品染色剂DAPI对细胞荧光共聚焦显微成像。其中图5a是商用细胞核染色剂DAPI着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5b是采用本发明的细胞核的荧光染料AzosD着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5c是明场图片；图5d是叠合的照片图；图6是图5a和5b划线区域的荧光强度曲线；图7是本发明的细胞核的荧光染料AzosD与细胞核的商品细胞核染色剂DAPI间的共染色轮廓图。
2、结果
(1)该化合物对RAW264.7贴壁细胞荧光成像图如图5a-5d所示。本发明的荧光探针能够对活细胞进行染色，在400-500nm范围光激发下观察，而且染色过后并不能影响到细胞的生理活动，细胞并没有表现出任何受损或者凋亡的现象，说明该化合物是性能优异的活细胞的细胞核染料。
(2)通过共染色实验证明，化合物AzosD与商用细胞核染料DAPI荧光共染色图如图6、图7所示。荧光化合物AzosD与商用细胞核染料DAPI荧光共染色系数达R＝0.98，证明该化合物具有高度细胞核的靶向性质，能快速准确地进行细胞核染色。
(3)从图5可以清楚地看到，目标化合物AzosD均透过RAW264.7细胞的细胞膜，进入到细胞核中，并对它完全均匀的着色，对目标产物的摄取率很高，说明目标产物对RAW264.7细胞的细胞核具有很高的识别能力。这种有机染料的制备对于细胞显影材料的遴选、制备，对于生命科学、材料科学等方面有着重要的意义。
上述本发明的一种用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD的制备，是先将6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中，加入N-溴代琥珀酰亚胺和硅胶反应，得到中间体1；再将中间体1溶于水、乙醇和甲苯混合溶液中，加入3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碳酸钠，氮气保护下回流反应得到中间体2；用盐酸溶解中间体2，在冰水浴条件下将亚硝酸钠固体加入至上述溶液，用氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，分离提纯，得到荧光探针染料AzosD。该细胞核荧光探针AzosD具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核靶向性高、可长时间监控活体细胞内细胞核形态变化等优点，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色。原料易得，反应条件温和，操作简单，成本低。

Claims (2)

1.一种用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，其特征在于是结构式为
Figure FDA0001575857920000011
的3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉。
2.权利要求1所述用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，其特征在于：
先将1.26mmol 6-氨基-2-甲基喹啉溶于100ml乙腈中，加入1.33mmol NBS和催化量的硅胶，反应12-18h，经旋干、硅胶柱色谱提纯，得到中间体1；所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯；
再将90mg上述中间体1溶于10ml的由水、乙醇和甲苯按体积比1:1:3-4配制的混合溶液中，然后依次加入63mg 3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下60-100℃回流反应24h，萃取真空减压除去有机相，柱色谱分离得到淡黄色固体状产物中间体2；
用30ml浓度为6M的盐酸溶解42mg的中间体2，并冷却到-5-10℃；把1-5倍当量亚硝酸钠溶解到另一份30ml浓度为6M的盐酸中，缓慢滴加至中间体2的盐酸溶液中，搅拌反应30min后，用10％的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯，即得到细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，即3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉。
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