CN101418215B

CN101418215B - 一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针及合成方法

Info

Publication number: CN101418215B
Application number: CN2008102437775A
Authority: CN
Inventors: 路建美; 戚裕
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2008-12-15
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2028-12-15
Also published as: CN101418215A

Abstract

本发明公开了一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针，其表达式如下：

Description

一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针及合成方法

技术领域

本发明涉及一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针及合成方法。

背景技术

罗丹明(Rhodamine)类化合物是一类具有较强摩尔吸收系数和较高荧光量子产率的荧光染料，常作为荧光探针标记生物分子。

目前多数用于标记活细胞的荧光探针为小分子，而高分子荧光探针报道非常少，高分子荧光探针和小分子荧光探针相比具有显著不同的特征及优势。其最主要的一点在于高分子能接上其他功能小分子基团却基本不改变本身性质，而小分子一般不具有该能力。因此，高分子荧光探针能进一步修饰连接上其他功能基团，即使得这种探针作为一种能够整合多种功能的载体以研究和解决各种问题，这在生物学、医药学等领域具有重要的意义。

其中，人工合成的高分子比生物大分子更稳定，更易修饰，更易控制其物理化学性能，且成本一般较低。和小分子完全不同，高分子进入细胞采用胞吞作用的方式进行，这一过程一般需要高分子上有能与细胞受体结合的结构。

因此，国内外报道的一些高分子荧光探针一般都接有胆固醇之类的能被细胞识别的基团，或者经过表面修饰改性来赋予其进入细胞的能力(参见：LaetitiaDe Jong，Xavier Moreau，Alain Thiéry，and etc.Bioconjugate Chem，2008，19，891-898；Linyong Zhu，Wuwei Wu，Ming-Qiang Zhu，and etc.J.Am.Chem.Soc.2007，129，3524-3526.)；而完全人工合成的、不含有任何生物特征基团、无需做改性处理的高分子荧光探针能在进入活细胞这一方面往往遇到困难。

发明内容

本发明目的是提供一种完全人工合成、不含有任何生物特征基团的高分子荧光探针，以克服现有技术的缺陷。

为达到上述目的，本发明的基本思路是：将3-位含羧基的罗丹明酰氯化后，和含有羟基的烯酸酯类物质反应形成单体，再和含有羟基的烯酸酯类物质共聚合成具有强烈红色荧光且能进入活细胞并在细胞内富集的高分子荧光探针。

本发明具体技术方案是，一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针，其结构式如下所示：

式中，R¹、R²、R³、R⁴各自选自氢、不含有活泼氢的取代或未取代的烷基或芳基中的一种；R⁵、R⁶、R⁷、R⁸各自选自氢、不含有活泼氢的取代或未取代的烷基或芳基中的一种、烷氧基、卤素、氨基；R⁹、R¹⁰、R¹¹各自选自氢、不含有活泼H的取代或未取代的烷基中的一种；

n、x、y为自然数，其中1≤n≤9，1≤x≤10，100＜(y∶x)＜200；An^-为任意在水溶液中稳定的阴离子，选自氯离子、溴离子、硫酸根或高氯酸根中的一种。y∶x的值影响到聚合物在水中的颗粒大小，低了聚合物在水中的颗粒会过大，过大又会使得分子太大，导致无法适用于探针。

上述高分子荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)利用二氯亚砜将3-位带有羧基的罗丹明酰氯化，即得到罗丹明酰氯粗产品；加入有机溶剂A，搅拌使罗丹明酰氯溶解完全，在室温下缓慢加入含有羟基的烯酸酯类物质，溶液搅拌15小时以上，得到含有罗丹明基团的单体粗产物，用硅胶层析柱分离得含有罗丹明基团的单体(I)，其结构式如下：

所述有机溶剂A选自乙腈或二氯甲烷中的一种；

(2)将步骤(1)所得单体(I)、含羟基的烯酸酯类物质和偶氮二异丁腈溶解在有机溶剂B中，在惰性气体C保护下于60～70℃恒温反应10～14小时；

反应完后将溶液冷却，滴入二氯甲烷中，沉析出聚合物，将该聚合物溶解于有机易挥发溶剂D中，该沉析步骤重复3遍，最后经过真空干燥即得到含有罗丹明基团的高分子荧光探针；

所述有机溶剂B选自环己酮或N，N-二甲基甲酰胺中的一种；所述惰性气体C选自氮气、氦气、氖气、氩气或氪气中的一种；有机易挥发溶剂D选自甲醇或乙醇中的一种。

反应过程如下式所示：

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明合成的含有罗丹明基团的高分子荧光探针具有罗丹明类物质的强烈的红色荧光，并能迅速进入活细胞，并在细胞质内富集；并且，其红色荧光能显著降低背景荧光的干扰，荧光强度稳定，耐光漂白性较高。

2.本发明合成的含有罗丹明基团的高分子荧光探针完全人工合成、不含有任何生物特征基团更易修饰，更易控制其物理化学性能，且成本一般较低，通过在高分子链上进一步连接其他功能基团，该探针还可考虑作为一种能整合多种功能的生物载体应用于生物、医药学各领域。

附图说明

图1是实施例二中高分子荧光探针水溶液和罗丹明B水溶液的荧光激发谱；

图2是实施例二中高分子荧光探针在不同浓度下水溶液的荧光发射光谱；

图3是实施例二中高分子荧光探针在激光连续照射下荧光强度和时间的关系曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

(1)含罗丹明B基团单体的合成：

将1g罗丹明B(2.1mmol)溶于1，2-二氯乙烷中，在室温下缓慢滴入二氯亚砜0.9ml。将反应体系搅拌并回流6小时，反应完成后减压除去溶剂，即得到罗丹明B酰氯粗产品。加入二氯甲烷，搅拌使罗丹明B酰氯溶解完全。在室温下缓慢滴入丙烯酸羟乙酯1.0ml(9.6mmol)，溶液搅拌24小时。反应完毕后减压除去溶剂，得到含有罗丹明B基团的单体粗产物。用硅胶层析柱分离得含有罗丹明B基团的单体纯产品(I)，该单体为绿色粉末，其结构如下：

核磁共振测定：1H NMR(CDCl₃)：δ8.32(d，1H)，7.85(t，1H)，7.76(T，1H)，7.33(d，1H)，7.07(d，2H)，6.94(d，2H)，6.81(s，2H)，6.36(m，1H)，6.05(m，1H).5.88(m，1H)，4.30(m，2H)，4.18(m，2H)，3.66(m，8H)，1.34(t，12H)。

(2)将50mg含有罗丹明B基团的单体(I)、丙烯酸羟乙酯25mmol、偶氮二异丁腈30mg溶解在环己酮中。在氮气保护下于60℃恒温反应12小时。反应完后将溶液冷却，滴入二氯甲烷中，沉析出聚合物。将该聚合物溶解于乙醇中，再重复沉析3遍。最后经过真空干燥即得到含有罗丹明B基团的高分子荧光探针PRH1。

(3)按照步骤(2)的方法制备PRH2和PRH3，其中对于PRH2和PRH3，含罗丹明B基团单体的投料量分别为120mg和300mg。

对于PRH1、PRH2和PRH3，经GPC测定数均分子量分别为21413、23439、23538。经元素分析测定N含量分别为0.13％、0.16％、0.22％，经计算x∶y平均值为1∶178、1∶131、1∶107。其结构式如下所示：

实施例二

(1)绘制实施例一所得的高分子荧光探针PRH1的0.15mg/ml水溶液和罗丹明B 5.0×10^-4mg/ml的水溶液的荧光激发谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，得图1；

从图中可知该探针的最大激发峰位置和罗丹明B相似，在550nm左右。

(2)绘制实施例一所得的高分子荧光探针PRH1在不同浓度下水溶液的荧光发射光谱，得图2，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

从图中可知该探针的发射峰在600nm左右，且随着探针溶液浓度的增加，峰位置略向右偏移。在20mg/ml的浓度下，该探针溶液拥有最大荧光强度值。

(3)绘制实施例一所得高分子荧光探针PRH1在20mW、405nm激光连续照射下荧光强度和时间的关系曲线，得图3；

从图中可知该探针在长时间连续激光照射下(20mW、405nm)，荧光强度从10849(A.U.)下降并稳定在12122(A.U.)，即能够稳定在初始值的87.5％。其说明该探针具有良好的光稳定性。

实施例三

利用实施例一所得高分子荧光探针PRH1对人的鼻咽癌细胞(CNE-2Z)的激光共聚焦显微成像，得亮场照片、细胞自身荧光照片、本发明所述的高分子荧光探针标记后的荧光照片，以及分别在含荧光探针的培养液中培养时间为4.5分钟、6.6分钟、16.9分钟，25℃下探针标记细胞的实时荧光成像照片；

结果表明：CNE-2Z细胞自身拥有较强的绿色荧光，而该探针的红色荧光能较好地与之区别开。该探针在6.6分钟内已能够较明显地进入细胞并富集于细胞质中。可见，该探针能够在较短时间内进入细胞，并富集于细胞质中，形成较为清晰的激光荧光共聚焦图象。其红色荧光能够有效地与一些生物体系所具有的短波长荧光区分开。

Claims

1.一种含有罗丹明基团的高分子荧光探针，其特征在于：所述高分子荧

光探针结构式如下所示：

式中，R¹、R²、R³、R⁴各自选自氢、不含有活泼氢的烷基或芳基中的一种；R⁵、R⁶、R⁷、R⁸各自选自氢、不含有活泼氢的烷基或芳基中的一种、烷氧基、卤素、氨基；R⁹、R¹⁰、R¹¹各自选自氢、不含有活泼氢的烷基中的一种；

n、x、y为自然数，其中1≤n≤9，1≤x≤10，100＜(y：x)＜200；An^-选自氯离子、溴离子、硫酸根或高氯酸根中的一种。

2.根据权利要求1所述的含有罗丹明基团的高分子荧光探针，其特征在于：R¹、R²、R³、R⁴各自选自氢、C₁～C₃的烷基或芳基中的一种；R⁵、R⁶、R⁷、R⁸各自选自氢、C₁～C₃的烷基、芳基、卤素或氨基中的一种；R⁹、R¹⁰、R¹¹各自选自氢、C₁～C₃的烷基中的一种。

3.根据权利要求1所述的含有罗丹明基团的高分子荧光探针，其特征在于：R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹为氢；An^-为氯离子。

4.权利要求1所述高分子荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将3-位带有羧基的罗丹明酰氯化，得到罗丹明酰氯粗产品；加入有机溶剂A，搅拌使罗丹明酰氯溶解完全，在室温下缓慢加入含有羟基的烯酸酯类物质，溶液搅拌15小时以上，得到含有罗丹明基团的单体(I)，其结构式如下：

所述有机溶剂A选自乙腈或二氯甲烷中的一种；

(2)将步骤(1)所得单体(I)、含羟基的烯酸酯类物质和偶氮二异腈溶解在有机溶剂B中，在惰性气体C保护下于60～70℃恒温反应10～14小时，经沉析、干燥获得含有罗丹明基团的高分子荧光探针；

所述有机溶剂B选自环己酮或N，N-二甲基甲酰胺中的一种；

所述惰性气体C选自氮气、氦气、氖气、氩气或氪气中的一种。

5.根据权利要求4所述的高分子荧光探针的制备方法，其特征在于：含羟基的烯酸酯类物质为丙烯酸羟乙酯。