CN105646511A - 一种基于罗丹明6g的汞离子检测荧光探针分子、制备方法及用途 - Google Patents

一种基于罗丹明6g的汞离子检测荧光探针分子、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子，该荧光探针分子具有如下所示结构。本发明还公开了所述基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的制备方法以及用于汞离子检测的用途。

Description

一种基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子、制备方法及用途
技术领域
本发明属于有机功能材料领域，具体涉及一种基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子和制备方法及其用于汞离子检测的用途。
背景技术
汞在自然界分布较广，其广泛的使用对生态造成破坏，在环境中造成污染，并对人体健康造成很大的威胁及影响。汞是一种可以在生物体内积累的毒物，无机汞易转化成为有机汞，两者均能在生物体内富集，通过生物体内和食物链累积可以大大提高汞对人体的危害性。当汞进入人体后，即集聚于肝、肾、大脑、心脏和骨髓等部位，造成神经性中毒和深部组织病变，引起疲倦、头晕、颤抖、牙龈出血、秃发、手脚麻痹、神经衰弱等症状，甚至会出现精神混乱，进而疯狂痉挛致死。目前，很多关于汞离子的测试方法，虽然灵敏度较高，但是普遍存在检测费用高、样品制备复杂、测试耗时长等问题。因此，发明一种简单、快速、灵敏的检测方法，对环境水体、烟叶及相关制品中汞离子的检测具有重要意义。罗丹明衍生物作为典型的开/关型荧光探针，与特定的金属离子结合后，由于五元环中氮原子的电荷密度变化，导致C-N键断开，从而产生颜色及荧光的变化。在不同的测试体系中，由于罗丹明衍生物与不同的金属离子结合力不同，导致化合物发光及颜色变化也不尽相同，因而赋予该系列化合物作为分子荧光探针测试重金属离子的能力。分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、易于调节发光颜色从而实现可视化观测的特点，可以较好地满足简单、快速、灵敏度高的检测要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高选择性的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子和制备方法及其用于汞离子检测的用途。
本发明第一方面涉及一种基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子，该汞离子检测荧光探针分子具有如下结构：
本发明第二方面涉及所述基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗丹明6G和水合肼在甲醇中加热回流4～6小时，得到的絮状沉淀经抽滤后，经硅胶层析柱用第一洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G酰肼化合物；
(2)将步骤(1)得到的罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉溶解到沸腾的乙醇中，加入冰醋酸，在氮气的保护下加热回流6～10小时，得到的沉淀物质经溶剂洗涤过滤后，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物质即为基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子。
优选地，所述步骤(1)中罗丹明6G、水合肼和甲醇的比例为3g:1mL:50mL，所述第一洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇体积比为10:4:1的混合物。
优选地，所述步骤(2)中罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉以及冰醋酸的摩尔比为3:2:0.1，所述溶剂为乙醇:乙醚体积比为1:1的混合物，所述第二洗脱剂为二氯甲烷。
本发明第三方面涉及罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用于水体样品、烟草样品、活细胞内汞离子检测的用途。
优选地，所述活细胞为Spill2活细胞(斜纹夜蛾细胞)及活线虫体细胞。
本发明的有益效果：
1、本发明的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子合成方法简单、收率高；
2、本发明的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，对溶剂极性不敏感，并且化学稳定性好；
3、本发明的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子含有多个可与汞离子发生络合作用的胺基基团，可以形成多个氢键进而实现络合识别作用，对汞离子有很好的选择性，对Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+等常见金属离子及其阴离子具有很好的抗干扰能力；
4、本发明的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子络合汞离子前后荧光发射约有300倍的增长，检测灵敏度高，且分辨时间短，可应用于环境水体样品、烟草样品、活细胞内的汞离子检测，具有广泛应用前景；
5、本发明基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，可以实现活细胞内特别是Spill2活细胞(斜纹夜蛾细胞)及活线虫体细胞内汞离子的检测。
附图说明
图1为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的合成路线；
图2为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的1H-NMR谱图；
图3为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的13C-NMR谱图；
图4为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的HRMS(ESI)谱图；
图5为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同常见金属离子响应的紫外光谱图；
图6为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同常见金属离子响应的荧光光谱图；
图7为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随Hg2+浓度变化的紫外光谱图；
图8为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在含Hg2+的水溶液体系中，在紫外光谱为533nm处的吸光度与相应汞离子浓度的拟合曲线图；
图9为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随Hg2+浓度变化的荧光光谱图；
图10为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在含Hg2+的水溶液体系中，荧光光谱556nm处的荧光强度与相应汞离子浓度数据拟合曲线图；
图11为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对汞离子识别的干扰实验之荧光光谱图；其横坐标表示不同离子存在条件下，分别加入汞离子后的样品瓶编号，其中横坐标分别对应：a:空白对照,b:Ag+,c:Al3+,d:Cd2+,e:Co2+,f:Cr3+,g:Cu2+,h:Fe3+,i:Na+,j:Ni2+,k:Pb2+,l:Zn2+离子存在条件下，分别加入汞离子后在556nm处的荧光强度；
图12为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在活细胞Spill2内对汞离子识别图片：(a)探针化合物(20μmol/L)自身荧光照片；(b)探针化合物(20μmol/L)加入Hg2+(300μmol/L)后荧光照片；(c)探针化合物(20μmol/L)加入Hg2+(600μmol/L)后荧光照片；(d)，(e)，(f)分别为(a)，(b)，(c)对应明场照片；
图13为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在活线虫体内对汞离子识别图片：(a)探针化合物(20μmol/L)自身荧光照片；(b)用300μmol/LHg2+预处理5小时后，再加入20μmol/L探针化合物处理1小时后荧光照片；(c)用600μmol/LHg2+预处理5小时后，再加入20μmol/L探针化合物处理1小时后荧光照片；(d)，(e)，(f)分别为(a)，(b)，(c)对应明场照片。
具体实施方式
实施例1：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的合成
具体合成路线见图1。
(1)2-醛基-8-羟基喹啉的制备：取0.32g的2-甲基-8-羟基喹啉(2mmol)溶解到20mL的二恶烷中。加热到60℃，再称取0.27g的SeO2加入到上述溶液中，然后将温度升至80℃，将反应混合物在氮气的保护下加热回流10小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，所得沉淀用8mL的二恶烷和8mL的二氯甲烷清洗、过滤，并真空干燥。所得粗产物通过硅胶层析柱，用石油醚：乙酸乙酯＝9:1(v:v)洗脱，洗脱液经浓缩得到0.14g的浅黄色化合物。产率40.5％。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ10.2(s,1H),8.31-8.33(d,1H),8.15(s,1H),8.05-8.06(d,1H),7.6-7.64(m,1H),7.42-7.44(m,1H),δ7.2-7.3(m,1H)。
(2)罗丹明6G酰肼化合物的制备：称取0.3g罗丹明6G(0.63mmol)，溶解到5mL的甲醇中，再加入0.1mL水合肼。回流4～6小时，得到絮状沉淀。所得沉淀抽滤后，经硅胶层析柱，用正己烷：二氯甲烷：甲醇＝10:4:1(v:v:v)洗脱。洗脱液经浓缩、干燥得罗丹明6G酰肼化合物。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.96-7.94(m,1H),7.46-7.44(m,2H),7.06-7.05(m,1H),6.39(s,2H),6.26(s,2H),3.57(s,4H),3.23-3.20(m,4H),1.96-1.88(s,6H),1.36-1.25(m,6H)。
(3)基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的合成：称取0.21g2-醛基-8-羟基喹啉(1.2mmol)和0.307g罗丹明6G酰肼化合物(0.8mmol)溶解到沸腾的乙醇中，加入3滴冰醋酸，将反应混合物在氮气的保护下加热回流8小时。所得黄色沉淀用乙醇：乙醚＝1:1(v:v)的溶剂清洗并过滤，然后经硅胶层析柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩洗脱液得0.23g橙黄色化合物。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.87(s,1H),8.69(s,1H),8.24-8.22(d,1H),7.98-7.96(d,1H),7.87-7.85(d,1H),7.62-7.57(m,2H),7.40-7.38(d,2H),7.33-7.31(d,1H),7.09-7.05(t,2H),6.40(s,2H),6.27(s,2H),5.10(s,2H),3.17-3.12(m,4H),1.85(s,6H),1.23-1.19(t,6H)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.87,153.90,152.51,152.39,151.26,148.35,145.98,138.54,137.00,134.80,129.29,129.24,128.71,127.96,126.93,124.16,123.82,118.86,118.26,117.46,112.79,105.10,96.58,66.02,32.00,17.44,14.64.HRMS(ESI):calcdforC36H33N5O3[M+H]+＝584.2583,foundm/z584.2650；[M+Na]+＝606.2476,foundm/z606.2477.其中，DMSO-d6为氘代二甲基亚砜。相关谱图见图2～4。
实施例2：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子紫外检测的选择性
采用DMSO(二甲基亚砜)：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用DMSO:HEPES＝6:4(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的DMSO：HEPES(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液，再分别加入25μL浓度为0.1mol/L的Al3+,Na+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Cd2+,Ag+,Fe3+,Hg2+和Cr3+的高氯酸盐水溶液。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。
基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子的紫外选择性检测如图5所示。结果表明基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子仅对汞离子在533nm处出现明显的紫外吸收峰。该结果表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子表现出高度的紫外选择性。
实施例3：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子荧光检测的选择性
采用DMSO(二甲基亚砜)：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用DMSO:HEPES＝6:4(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的DMSO：HEPES(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液，再分别加入30μL浓度为0.1mol/L的Al3+,Na+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Cd2+,Ag+,Fe3+,Hg2+和Cr3+的高氯酸盐水溶液。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为525nm，发射波长为556nm。基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子荧光选择性检测如图6所示。可见基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在556nm处仅对Hg2+有明显的荧光增强现象(约300倍增强)，表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子表现出高度的荧光选择性。
实施例4：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子的定量紫外检测
采用DMSO(二甲基亚砜)：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用DMSO:HEPES＝6:4(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
称取0.9071gHg(ClO)2·3H2O，用20mL去离子水溶解，配制成浓度为0.1mol/L的Hg2+水溶液。()
将样品瓶分为11组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的DMSO：HEPES(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液，再分别加入0.5μL～25μL浓度为0.1mol/L的Hg2+水溶液，使测试体系中汞离子浓度为10μmol/L～500μmol/L，测定其紫外可见光谱。
本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随汞离子浓度变化的紫外光谱见图7。将紫外光谱533nm处的吸光度与相应汞离子浓度进行拟合，在汞离子浓度为10μmol/L～500μmol/L范围内可得到一拟合曲线(图8)。结果表明，本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测汞离子浓度。
实施例5：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子对汞离子的定量荧光检测
采用DMSO(二甲基亚砜)：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用DMSO:HEPES＝6:4(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
称取0.9071gHg(ClO)2·3H2O，用20ml去离子水溶解，配制成成浓度为0.1mol/L的Hg2+水溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的DMSO：HEPES(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液，再分别加入0.5μL～30μL浓度为0.1mol/L的Hg2+水溶液，使测试体系中汞离子浓度为10μmol/L～600μmol/L。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为2.5×2.5nm。图9为本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随汞离子浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱556nm处的荧光强度与相应汞离子浓度进行拟合，在汞离子浓度为10μmol/L～600μmol/L范围内得到一拟合曲线(图10)，表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测汞离子浓度。
实施例6：其它金属离子对基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子检测汞离子的干扰实验
采用DMSO(二甲基亚砜)：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液)(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用DMSO:HEPES＝6:4(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的DMSO：HEPES(0.02mol/L,pH＝7.4)＝6:4(v:v)溶液。其中一组样品作为空白对照。往其它11组样品瓶中分别加入60μL浓度为0.1mol/L的Al3+,Na+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Cd2+,Ag+,Fe3+,Hg2+和Cr3+的高氯酸盐水溶液，测定其对探针荧光光谱的影响。然后再分别依次向这12组溶液中加入30μL浓度为0.1mol/L的Hg2+，放置3分钟后，依次测定该系列溶液荧光光谱。激发波长为525nm，发射波长为556nm。将记录的荧光强度与对应金属离子作柱状图，如图11所示。图11中横坐标分别对应：a:空白对照,b:Ag+,c:Al3+,d:Cd2+,e:Co2+,f:Cr3+,g:Cu2+,h:Fe3+,i:Na+,j:Ni2+,k:Pb2+,l:Zn2+离子存在条件下，分别加入Hg2+离子后在556nm处的荧光强度。图11表明其它常见金属离子对本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子检测汞离子基本无显著干扰。
实施例7：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在活细胞Spill2内对汞离子的荧光识别
在37℃下，将向Spill2细胞(斜纹夜蛾细胞)种在96孔板上，加入1mL细胞悬液，然后分别加入浓度为0.01mol/L的汞离子溶液0μL、3μL、6μL，孵育2小时后，再分别加入浓度为2mmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子1mL，孵育1小时。分别对空白对照组及测试组进行荧光成像实验，结果见图12。图12a中可以见到基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在细胞内基本无荧光发射，随着汞离子浓度的增加荧光强度逐渐增强。当汞离子浓度达到600μmol/L时，细胞发射明亮的黄绿色荧光(图12c)。该实验证明本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子可以在活细胞Spill2内对汞离子进行荧光识别。实验所用仪器为OlympusIX71。
实施例8：基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子在活线虫体内对汞离子荧光识别
将培养皿中的线虫用M9缓冲液(每升缓冲液中含有15.12克Na2HPO4·12H2O；3克KH2PO4；5克NaCl；0.25克MgSO4·7H2O)洗出来，分三组装到离心管中。再向这三组离心管中加入1mLM9溶液，然后分别向这三组离心管中加入浓度为0.01mol/L的汞离子溶液0μL、30μL、60μL，在室温条件下孵育2小时。线虫用M9缓冲液洗涤3次，在2500r/min速度下离心2分钟，之后向装有线虫的离心管内加入浓度为2mmol/L的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子10μL，并在20℃孵育1小时。线虫再次用M9溶液洗涤3次，在2500r/min速度下离心2分钟后转移到载玻片上进行荧光成像实验。结果见图13。图13a中可以看到基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子自身在线虫内基本无荧光发射，当汞离子浓度达到600μmol/L时，线虫体内发射出黄绿色荧光(图13c)。该实验表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子可以在线虫体内对汞离子进行荧光识别。实验所用仪器为OlympusBX51倒置荧光显微镜。

Claims (6)

1.一种基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子，其特征在于具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗丹明6G和水合肼在甲醇中加热回流4～6小时，得到的絮状沉淀经抽滤后，经硅胶层析柱用第一洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G酰肼化合物；
(2)将步骤(1)得到的罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉溶解到沸腾的乙醇中，加入冰醋酸，在氮气的保护下加热回流6～10小时，得到的沉淀物质经溶剂洗涤过滤后，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物质即为基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中罗丹明6G、水合肼和甲醇的比例为3g:1mL:50mL，所述第一洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇体积比为10:4:1的混合物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉以及冰醋酸的摩尔比为3:2:0.1，所述溶剂为乙醇：乙醚积比为1:1的混合物，所述第二洗脱剂为二氯甲烷。
5.一种根据权利要求1所述的基于罗丹明6G的汞离子检测荧光探针分子用于水体样品、烟草样品或活细胞内汞离子检测的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其所述活细胞为斜纹夜蛾细胞及活线虫体细胞。
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