WO2013152687A1 - 一种近红外荧光染料的制备及应用 - Google Patents

一种近红外荧光染料的制备及应用 Download PDF

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WO2013152687A1
WO2013152687A1 PCT/CN2013/073600 CN2013073600W WO2013152687A1 WO 2013152687 A1 WO2013152687 A1 WO 2013152687A1 CN 2013073600 W CN2013073600 W CN 2013073600W WO 2013152687 A1 WO2013152687 A1 WO 2013152687A1
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group
substituted
carbon atoms
alkyl
substituted phenyl
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PCT/CN2013/073600
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汪鹏飞
刘卫敏
周炳江
陈建宏
庄晓青
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中国科学院理化技术研究所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/28—Pyronines ; Xanthon, thioxanthon, selenoxanthan, telluroxanthon dyes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to a kind of near-infrared fluorescent dye and a preparation method and application thereof, and provides a method for covalent or non-covalent labeling of a near-infrared bioluminescent dye in a biological macromolecule.
  • Fluorescent dyes currently used for covalent or non-covalent labeling mainly include fluorescein, rhodamine, naphthalimide, BODIPY and coumarin, which have high fluorescence quantum yields. Rate, but the maximum absorption wavelength and fluorescence emission wavelength are less than 650 nm. For biological samples, the sample matrix and some impurities will also absorb or fluoresce in this region. In addition, the effect of light scattering will often cause more serious background interference, which limits the sensitivity of fluorescence analysis.
  • the light absorption or fluorescence intensity of the biological sample matrix is small, so the background interference is greatly reduced, and due to the scattered light intensity and
  • the fourth power of the wavelength is inversely proportional.
  • the Raman scattering decreases rapidly, and the scattering interference is also greatly reduced. Therefore, near-infrared fluorescent dyes can be widely used in medical and biological fields as a safe and non-invasive imaging fluorescent probe. Designing and synthesizing novel near-infrared fluorescent dyes has become a hot issue in recent years.
  • the currently used near-infrared dyes are mainly cyanine dyes.
  • the maximum absorption and emission wavelength of cyanine dyes generally exceeds 600 nm.
  • the spectral properties of the cyanine dyes can be adjusted in a very wide range by adjusting the length of the intermediate conjugated carbon chain.
  • the synthesis method is simple and the water-soluble groups can be easily introduced.
  • Currently marketed to detect major varieties of fluorescent probes such as DNA, proteins, and nucleotides.
  • the disadvantage of such cyanine dyes is poor light stability, and the polymethine structure is easily oxidized and broken under illumination, resulting in decomposition of the dye.
  • the structure of the polymethine also causes the dye to accumulate easily, which affects the application of the dye in application.
  • Rhodamine and acridine orange dyes are basic dyes, and their aqueous solutions have a large molar absorptivity; molecular structure has a large rigid plane, and an aerobic bridge between the benzene rings is connected, which easily absorbs incident light. The energy emits long waves, so the aqueous monomer solution can generate strong fluorescence and has good redox ability.
  • the disadvantages of these two types of fluorescent dyes are mainly the small displacement of Stock, easy photo-fading, high light quenching rate and strong pH sensitivity.
  • the traditional coumarin fluorescent dye has many advantages such as large Stokes displacement, good light stability, relatively small molecular volume, good oil solubility, etc.
  • the wavelength of the shot is too short, and its application is very limited.
  • the structural modification of these dyes is mainly to increase the fluorescence efficiency and red-shift the fluorescence by increasing the molecular coplanarity, structural rigidity and electronic conjugate system.
  • the rhodamine and acridine oranges are not fundamentally improved. Disadvantages of dyes.
  • the invention combines these kinds of dyes organically, on the one hand, increases the Stokes displacement of the dye by the coumarin parenter, and improves the photostability; on the other hand, the introduction of the coumarin group increases the molecular conjugated system and the structure is more rigid. Therefore, the emission wavelength is greatly red-shifted to reach 650 nm or more.
  • the invention is based on a readily available coumarin derivative of the raw material, and a novel near-infrared fluorescent dye can be obtained by reacting with a corresponding substituted phenol/thiophenol/aniline derivative.
  • These dyes have good biocompatibility and light stability, low toxicity, long fluorescence emission and high fluorescence quantum yield, can avoid background fluorescence, and can be further reacted as a parent dye to obtain suitable fluorescence detection. Needle, used in chemical analysis and biomarkers and bioanalytical detection.
  • a first technical problem to be solved by the present invention is to provide a near-infrared fluorescent dye for use in the field of bionon-covalent labeling.
  • a second technical problem to be solved by the present invention is to provide a novel near-infrared fluorescent dye.
  • a third technical problem to be solved by the present invention is to provide a method for preparing a near-infrared fluorescent dye.
  • a fourth technical problem to be solved by the present invention is to provide a near-infrared fluorescent dye for use in the field of biomarker labeling.
  • a compound having a structure represented by the structural formula (I) (Compound I) is used for non-covalent fluorescent labeling of biomolecules in a cell, wherein the biomolecule in the cell is a nucleic acid or Organelles:
  • R 8 , R 9 , Ru and R 14 are each independently hydrogen, a hydrocarbyl group, an ether group, a substituted alkyl group, an acyl group or an aryl group; and R 3 , R 5 , R 6 and Rio Ri 2 R 13 are independently hydrogen and lower. Hydrocarbyl, lower alkoxy, cyano or halogen; R 4 is hydrogen, lower alkyl, ether, lower alkoxy, substituted alkyl, acyl, cyano, phenyl, substituted phenyl or halogen; ⁇ ⁇ is an anion .
  • Ri and R 3 , Ri and Ri3, R 2 and R 3 , R 2 and Ri 3 , R 7 and R 6 , R 7 and RIQ, RS and R 6 , R 8 and RKI, and 11 2 or R 7 And R 8 can form the following Ia-In structure:
  • hydrocarbon group of R 2 , R 7 , R 8 , R 9 , Rn R 14 is a linear, branched or cyclic hydrocarbon group; the hydrocarbon group is a hydrocarbon group of 1 to 20 carbon atoms;
  • the ether group of Ri, R 2 , F, R 7 , Rs R9, Ru, Ri4 has 4 to 20 carbon atoms and the number of oxygen atoms ⁇ 8; and R 2 , R 4 , R 7 , R 8
  • the substituted alkyl group of R 9 and R n R 14 is a straight chain or a branched chain; the substituted alkyl group is a benzyl group, the ⁇ -formic acid group is substituted with an alkyl group of 1 to 20 carbon atoms, and the ⁇ -formate group is substituted 1 - 20 carbon atom alkyl, ⁇ -formate group substituted 1-20 carbon atom alkyl, ⁇ -carboxamide substituted 1-20 carbon atom alkyl, ⁇ -formyl halide substituted 1-20 carbon An atomic alkyl group, an ⁇ -sulfonic acid group substituted with an alkyl group of 1 to 20 carbon atoms, an ⁇ -sulfonate group substituted with an alky
  • the halogen of R 6 , RIQ, Ri 2 , and R 13 is fluorine, chlorine, bromine or iodine; and the ⁇ ⁇ is any organic or inorganic anion having an equilibrium charge.
  • Z is NR 7 R 8 or OR 9 ;
  • Ri, R 2 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru, R 14 are respectively independent Is hydrogen, a hydrocarbyl group, an ether group, a substituted alkyl group, an acyl group or an aryl group;
  • R 3 , R 5 , and Rio Ri2 R 13 are each independently hydrogen, lower alkyl, lower alkoxy, cyano or halogen;
  • R 4 is hydrogen, lower alkyl, an ether group, a lower alkoxy, substituted alkyl, acyl, cyano or halogen; when ⁇ ⁇ is an anion, the compound Imaging of RA staining.
  • Ri, R 2 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru, R 14 are respectively independent Is hydrogen, a hydrocarbyl group, an ether group, a substituted alkyl group, an acyl group or an aryl group; R 3 , R 5 , and Rio Ri2 R 13 are each independently hydrogen, lower alkyl, lower alkoxy, cyano or halogen; R 4 Is a phenyl or substituted phenyl; when xe is an anion, the compound images the mitochondria.
  • the method of staining biomolecules in a cell comprises the following steps:
  • the near-infrared bioluminescent dye is formulated into a dye solution of 5 mM to 10 mM with dimethyl sulfoxide (DMSO);
  • step 3 Dyeing directly to the original cell culture solution, adding the dye solution obtained in step 2), shaking, and making the final concentration of the near-infrared bioluminescent dye 500 ⁇ 5 5 ⁇ , to obtain a mixture of the original cell culture solution and the dye solution at 37°. C, 5% C0 2 , incubate the cells for more than 10 minutes in saturated humidity, stain mitochondria or RA;
  • a novel near-infrared fluorescent dye structure I of the present invention is as follows:
  • Y is 0, S or NRu
  • Yi is O or S
  • Z is NR 7 R 8 or OR 9
  • X, Ri ⁇ R13 are as defined in claim 1.
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Rio Ri2, R13 are hydrogen, and Z is a hydroxyl group, R!
  • R 2 and R 2 are not ethyl at the same time; when Y is 0, R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Rio Ri2, R13 are hydrogen, when Z is methoxy, R!, R 2 are not methyl at the same time; when Y is 0, R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Rio Ri2, R13 is hydrogen, Z is dimethylamino, NR!R 2 is not dimethylamino or piperidinyl; when Y is 0, R 3 , R 5 , R 6 , Rio Ri2, R13 are hydrogen R 4 is 2-hydroxy-4 diethylaminophenyl, and when Z is a diethylamino group, NR!R 2 is not a diethylamino group.
  • the AND, and 3 , R 2 and R 3 , and 3 , R 7 and R 6 , R 7 and RKI, RS and Re, R 8 and RKI, and 11 2 or R 7 and R 8 may Form the following Ia-
  • R is hydrogen or lower alkyl
  • Y 2 is 0, S or NRu.
  • the hydrocarbon group of R 2 , R 7 , R 9 , Ru is a linear, branched or cyclic hydrocarbon group; the hydrocarbon group is a hydrocarbon group of 1 to 20 carbon atoms;
  • the ether group of Ri, R 2 , F, R7, Rs R9 and Rii has 4 to 20 carbon atoms and the number of oxygen atoms ⁇ 8; and R 2 , R 4 , R 7 , R 8 and R 9
  • the substituted alkyl group of Ru is a straight chain or a branched chain; the substituted alkyl group is a benzyl group, the ⁇ -formic acid group is substituted with an alkyl group of 1 to 20 carbon atoms, and the ⁇ -formate group is substituted for 1 to 20 carbon atoms.
  • a benzyl ester group or a quinone-succinimidyl ester group the ⁇ -carboxamide group substituted with a carboxamide group of 1-20 carbon atoms in the alkyl group of 2 to 40 carbon atoms, 2-40 carbonylcarboxamide groups Substituting a carbon atom for an alkylformamide group or a maleimide group; wherein the acyl group of R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , is an alkyl group of 2 to 6 carbon atoms, tert-butoxy a carbonyl group, a benzoyl group, a benzoic acid or a halogen-substituted benzoyl group of 1 to 6 carbon atoms; the substituent in the substituted phenyl group of R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru may be Is any position on the benzene ring; the substituted phenyl group of
  • the linear, branched or cyclic hydrocarbon group of 1 to 2 carbon atoms of R 2 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is methyl, trifluoromethyl, ethyl, Propyl, isopropyl, cyclopropyl, allyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-amyl, hexyl, 2-methylpentyl, Cyclohexyl, heptyl, 2-methylhexyl, octyl, 2 -methylheptyl, decyl, aryl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, fifteen An alkyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group or an octadecyl group; an ether group having 4
  • the ⁇ -carboxylic acid group in R!, R 2 , R 4 , R 7 , , R 9 , and the alkyl group having 1-20 carbon atoms is (CH 2 ) m COOH Wherein m is a natural number from 1 to 18; and the ⁇ -formate group in R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is substituted by an alkyl group of 1 to 20 carbon atoms (CH 2 ) mCOOM, wherein m is a natural number from 1 to 18, M is a balanced charge cation; when said Ri, R 2 , R 4 , R 7 , , R 9 , said ⁇ -formate group is substituted 1-20 When the formate group in the alkyl group of a carbon atom is a hydrocarbyl ester group of 2 to 20 carbon atoms, the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms substituted by
  • the ⁇ -carboxylate group substituted with 1-20 carbon atoms is (CH 2 ) m COO(CH 2 ) intuition CH2COOH , ( CH 2 ) m COO(CH 2 ) favor CH2COOM , ( CH 2 ) m COO(CH2) n CH 2 S0 3 H or (CH 2 ) m COO(CH2) n CH 2 S0 3 M, where m is a natural number from 1 to 18, and n is 0- a natural number of 18, M is a balanced charge cation; and the ⁇ -formic acid benzyl ester group in R 2 , R 4 , R 7 , , R 9 , and the alkyl group having 1-20 carbon atoms is (CH 2 ) m COOCH 2 C 6 H 5 , wherein m is a natural number from 1 to 18; the ⁇ -formic acid N-succinimidyl ester group in the R 2 , R 4 , R
  • n is a natural number from 1 to 18;
  • the carboxamide group is a hydrocarbyl formamide of 2 to 40 carbon atoms.
  • the alkyl group is (CH 2 ) m CONH(CH 2 ) n CH 3 , ( CH 2 ) m CON[(CH 2 ) n CH 3 ] 2 , wherein m is a natural number from 1 to 18, and n is a natural number from 0 to 18;
  • the alkane group is 2 to 40 carbon atoms.
  • the ⁇ -carboxamide group substituted with 1-20 carbon atoms is (CH 2 ) m CONH(CH 2 ) classroom CH2COOH, (CH 2 ) m CON[(CH 2 )nCH 2 COOH] 2 , (CH 2 ) m CONH(CH 2 ) dislike CH 2 COOM, ( CH 2 ) m CON[(CH 2 )nCH 2 COOM] 2 , ( CH 2 ) m CONH(CH 2 ) n CH 2 S0 3 H, (CH 2 ) m CON[(CH2) n CH2S0 3 H]2, (CH2) m CONH(CH2) n CH 2 S0 3 M or (CH 2 ) m CON[(CH2) n CH 2 S0 3 M]2
  • m is a natural number from 1 to 18, n is a natural number from 0 to 18, and M is a balanced charge cation;
  • ⁇ - A carboxamide group substituted with an alkyl group of 1-20 carbon atoms is wherein m is a natural number from 1 to 18; when the ⁇ -formyl halo group in the R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is substituted with 1-20 carbon atoms, the alkyl group is (CH 2 ) m COCl, (CH 2 ) m COBr, where m is a natural number from 1 to 18;
  • the ⁇ -sulfonate group in R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is substituted with 1-20 carbon atoms and the alkyl group is (CH 2 ) m S0 3 M, wherein m is a natural number from 1 to 18, M is a balanced charge cation; and the ⁇ -sulfonyl chloride group in R 2 , R 6 , R 7 , and the alkyl group having 1-20 carbon atoms is (CH 2 ) m S0 3 Cl , where m is a natural number from 1 to 18;
  • m is a natural number from 1 to 18; wherein R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , and 2 to 6 carbon atom alkyl acyl groups are acetyl, propionyl, butyryl or t-butyryl Said R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , wherein 1-6 carbon atoms are substituted for benzoyl are methyl substituted benzoyl, ethyl substituted benzoyl, propyl substituted benzoyl An acyl group, a butyl-substituted benzoyl group or a tert-butyl-substituted benzoyl group; wherein the halogen-substituted benzoyl group in R!, R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is a chloro-substituted benzoyl group a bromo substituted benzoyl group
  • the lower alkoxy-substituted phenyl group in the Ri, R 2 , R 4 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is a methoxy-substituted phenyl group, an ethoxy-substituted benzene group Base, propoxy substituted phenyl, butoxy substituted phenyl, pentoxy Phenyl, phenyl substituted with t-butoxy-substituted phenyl group or hexyl;
  • the Ri, R 2, R 4, R 7, R 8, R 9, Ru phenyl substituted with halogen-substituted phenyl group is a fluorine, chlorine a
  • a novel method for preparing a near-infrared dye of the present invention has the following steps: When Y in the structural formula (I) is 0, S or NRu, ⁇ 1 is 0 or S, Z is NR 7 R 8 or OR 9 ; Ri R 2 , R 7 , R 8 , R 9 and Ru are each independently hydrogen, hydrocarbyl, etheryl, substituted alkyl, acyl or aryl; R 3 , R 5 , , Rio Ri2 R 13 is independently hydrogen, lower alkyl, lower alkoxy, cyano or halogen; R 4 is hydrogen, lower alkyl, ether, lower alkoxy, substituted alkyl, acyl or halogen; ⁇ ⁇ When it is an anion, the specific steps are as follows: 1 mmol of the compound hydrazine is mixed with 1 mmol of the compound III in 5-20 ml of a solvent to form a mixed solution, and a concentrated acid having a volume
  • Ri R 2 , R 7 , R 8 , R 9 , Ru is independently hydrogen, a hydrocarbon group, an ether group, a substituted alkyl group, an acyl group or an aryl group; and R 3 , R 5 , R 6 and Rio Ri 2 R 13 are independently hydrogen, lower hydrocarbon group, lower alkoxy group, cyanogen Or a halogen; R 4 is a trifluoromethyl group, a cyano group, a phenyl group or a substituted phenyl group; when ⁇ ⁇ is an anion, the specific steps are as follows:
  • Compound IV having a substance amount of 1:1 is mixed with compound V and tetrachloroethane; the ratio of the compound IV to tetrachloroethane is Imol OL; phosphorus pentoxide is added in portions; the phosphorus pentoxide is added
  • the ratio of the amount of the substance to the compound IV is 5 to 10:1; a mixed solution is obtained; the reaction is carried out under reflux for 2-8 hours, and after cooling, water is added, and extraction is carried out; The solvent is imitation, the obtained product is dissolved in ethanol or methanol, 70% by weight of perchloric acid is added, distilled water is slowly added dropwise, solid is precipitated, filtered, vacuum dried, and purified by column chromatography to obtain product I.
  • the volume ratio of ethanol to perchloric acid is 5:1; the structural formula of the compounds IV and V is as follows:
  • the application of a novel near-infrared dye of the present invention is mainly used for covalent fluorescent labeling of biomolecules; the biomolecule is a nucleic acid or a protein.
  • Covalent fluorescent labeling applied to biological macromolecules mainly by carrying specific functional groups (such as carboxyl, amino, azide, isocyanate, isothiocyanate, N-succinimidyl ester)
  • Compound I of the group, maleimide group, etc. is covalently linked to the biomacromolecule by well-known chemical reactions.
  • a novel near-infrared dye compound I of the present invention organically combines coumarin with rhodamine or acridine orange dyes, and on the other hand, increases the Stokes shift of the dye by the coumarin precursor.
  • the present invention firstly uses the non-covalent action of the near-infrared fluorescent dye of this structure to locate mitochondria or R A , and to reduce the damage of the light source to cells and tissues, and to reduce the interference of autofluorescence.
  • the dye of the present invention has low cytotoxicity and phototoxicity, and good photostability, and can be used for studying the dynamic changes of R A or mitochondria in living cells.
  • Figure 1 is a diagram showing staining of A549 cells by fluorescent dye 1-5 in Example 4 of the present invention
  • Figure 2 is a diagram showing staining of A549 cells by the fluorescent dye 1-10 of Example 8 of the present invention
  • Figure 3 is a diagram showing the staining of A549 cells by fluorescent dye 1-11 of Example 9 of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the staining of A549 cells by the fluorescent dyes 1-12 of Example 10 of the present invention.
  • Figure 5 is a fluorescent diagram of the action of the compounds 1-18 and R A of Example 12 of the present invention.
  • Figure 6 is a circular dichroic chromatogram of the action of the compounds 1-18 and R A of Example 12 of the present invention.
  • Figure 1 is a diagram showing the comparison of the compound 1-18 with DNase and R A enzyme and the commercially available DNA and RNA dyes;
  • Figure 8 is a comparison chart showing the cell staining effect of the compound 1-18 of the present invention and the commercially available R A dye SYTO RNASelect;
  • Figure 9 is a diagram showing the staining dye 1-18 of Helocytes after staining with Hela cells
  • Figure 10 is a diagram showing the staining of A549 cells by fluorescent dye 1-39 of Example 17 of the present invention.
  • Figure 11 is a diagram showing the staining of L929 cells by fluorescent dye 1-40 of Example 17 of the present invention.
  • Figure 12 is a diagram showing the staining of A549 cells by the fluorescent dye 1-51 of Example 24 of the present invention.
  • Figure 13 is a comparison diagram of 24 fluorescent dye 1-51 and a commercially available mitochondrial dye according to an example of the present invention
  • Figure 14 is a diagram showing the staining dye 1-63 of the present invention, which stained Hela cells;
  • Figure 15 is a diagram showing the staining dye 1-68 of Hela cells in Example 37 of the present invention.
  • Figure 16 is a diagram showing an example of the present invention 45 fluorescent dye 1-100 staining Hela cells;
  • Figure 17 is a diagram showing the staining dye 1-103 of Example 46 of the present invention after staining A549 cells.
  • Figure 18 is a diagram showing the staining of Hela cells by 50 fluorescent dye 1-107;
  • Figure 19 is a diagram showing the staining dye 1-108 of the present invention staining Hela cells
  • Figure 20 is a diagram showing the staining of Hela cells by the fluorescent dye 1-109 of Example 52 of the present invention.
  • the cells were seeded in a confocal dish and cultured in a cell incubator at 37 ° C, 5% CO 2 , and saturated humidity for 12 to 24 hours;
  • the cell culture medium contains the corresponding medium, 10% by volume of fetal bovine serum, 10 ( ⁇ g/mL penicillin and 10 ( ⁇ g/mL streptomycin;
  • the near-infrared bioluminescent dye is formulated into a dye solution of 5 mM to 10 mM with dimethyl sulfoxide (DMSO);
  • the dye solution obtained in the step 2) is directly added to the original cell culture solution, and shaken to obtain a final concentration of the near-infrared bioluminescent dye of 500 ⁇ ⁇ 5 ⁇ ⁇ to obtain a mixed solution of the original cell culture solution and the dye solution at 37 ° C, 5 % C0 2, the cells were incubated in a saturated humidity for more than 10 minutes, stained mitochondria or RA;
  • step 3 Remove the mixture from step 3), rinse the cells twice with phosphate buffer solution (PBS buffer solution), then add fresh cell culture medium, maintain 37 ° C, 5% C0 2 , saturated humidity in the living cell workstation. Imaging with a laser confocal microscope with an excitation wavelength of 640 nm.
  • the compound ⁇ -4 was prepared from 8-hydroxyzuridine ⁇ -7 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888), with a total yield of 72%.
  • Compound III-8 was prepared from Compound III-2 according to the literature (Chem. Eur. J. 2008, 14, 1786 - 1792;), with a total yield of 60%.
  • the compound ⁇ -5 was prepared from 3-hydroxytriphenylamine oxime-10 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888). Preparation, the total yield of 41%.
  • the compound ⁇ -11 was prepared from the aminophenol of the compound and 1-bromo-n-octane according to the literature (Fine Chemicals, 2003, 20 (12), 761-765).
  • the compound ⁇ -6 is based on the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888; J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) from 7-hydroxy-2,2,4-tri Preparation of methyl-1-ethyl-1,2-dihydroquinolin-12, total yield 52%.
  • the compound ⁇ -13 was prepared from the aminophenol of the compound and 2-bromoethoxy-2-ethoxydiethanol according to the literature (Fine Chemicals, 2003, 20 (12), 761-765).
  • the compounds 1-14, 1-15, 1-16, and 1-17 were separately obtained, and the yields were 32.1%, 30.5%, 28.5%, and 29.3%, respectively, and the ESI MS were: m/z, respectively. 433.2 440.2, 482.2, 495.2.
  • compound 1 can be prepared by reacting 1 mmol of compound ⁇ -2 with 1 mmol of compound m-4, m-7, m-i2, and piperidinol ( ⁇ -15), respectively. -18, 1-19, 1-20, 1-21, the yields were 26.1%, 25.5%, 24.5% 20.6%, respectively, and the ESI MS were: m/z, 361.2, 413.2, 441.2, 401.2.
  • Figure 5 is a fluorescence diagram of the interaction of compounds 1-18 with RA; it can be seen that the fluorescence of Example 3 is enhanced with the addition of RA (200 ⁇ ⁇ / ⁇ ).
  • Fig. 6 is a circular dichroism diagram of the interaction of the compounds 1-18 and R A; in the R A solution, as the concentration of the compound increases, the circular dichroism changes, and thus the mode of action of the R A and 1-18 structures is semi-embedded.
  • Figure 7 is a comparison of the compound 1-18 plus DNase and R A enzymes and comparison with commercially available DNA and RNA dyes, demonstrating that the compound 1-18 enters the nucleus and is infected with RNA (control is used as a control, which is a blank).
  • Figure 8 is a graph showing the contrast dyeing effect of the compound 1-18 and the commercially available RA dye. It is apparent from the figure that the red color of the present invention can cover the green color of the commercially available dye, indicating that the dye of the present invention has clearer and more selective than the RNASelect dye. More intense staining effect (in the figure, 6A is the invention, 6B is RNASelect staining, and 6C is an overlay).
  • the staining position of the compound 1-18 can be seen: R A in the nucleus in the nucleus.
  • Compound 1 -39 was obtained by reacting 1 mmol of compound 1-2 with chlorine gas, yield 60.2%; 1 mmol of compound 1 according to the literature (J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 16174-16175) -39 and 1 mmol of n-butyl copper lithium reagent in tetrahydrofuran solvent, sub-78 degree reaction for 20 minutes, adding saturated aqueous ammonium chloride solution, extraction with dichloromethane, organic phase concentration, column chromatography separation of compound 1- 40, yield 58.2%.
  • Example 20 According to the method of Example 1, the compound 1-43 was obtained from the compound ⁇ -8 and the compound ⁇ -4, yield 20.6%.
  • Example 20 According to the method of Example 1, the compound 1-43 was obtained from the compound ⁇ -8 and the compound ⁇ -4, yield 20.6%.
  • Compound 1-7 is coupled to a thiol-containing amino acid:
  • Compound 1-13 is coupled to the nucleotide aminoallyl-dUTP:
  • Compound IV-2 was prepared from hydrazine-7 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888), with a total yield of 75%; Compound V-2 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) Prepared from ⁇ -7 with phthalic anhydride, yield 20%.
  • Compound IV-3 was prepared from hydrazine-2 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888), with a total yield of 85%; Compound V-3 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) Prepared from ⁇ -2 with phthalic anhydride, yield 25%.
  • Figure 13 is a comparison of the compound 1-51 with a commercially available mitochondrial dye, demonstrating that the compound 1-51 is mitochondria dyed into the cytoplasm, and the dyeing effect of 1-51 is stronger (the commercially available dye is green, the dye of the present invention is Red, green is completely covered by red after superimposing).
  • Compound IV-4 was prepared from 111-12 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888) in a total yield of 83%; Compound ⁇ -4 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) Prepared from 111-12 with phthalic anhydride in 22% yield.
  • Compound V-5 was prepared from hydrazine-1 and tetrachlorophthalic anhydride according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) in a yield of 30%.
  • the compound ⁇ -6 was prepared from ⁇ -4 and phthalic anhydride according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.), yield 24%.
  • Example 28 Compound V-7 was prepared from hydrazine-1 and 4-nitrophthalic anhydride according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) in a yield of 22%.
  • Compound V-8 was prepared from 3-N,N-dibutylaminophenol ( ⁇ -19) and phthalic anhydride according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) , yield 20%.
  • Compound V-9 was prepared from hydrazine-4 and 2-sulfobenzoic anhydride according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) in a yield of 15%.
  • Compound V-10 was prepared according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) from 1,3-substituted phthalic anhydride with a yield of 18%.
  • Compound V-1 was prepared according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) from III-7 and tetrabromo 2-sulfobenzoic anhydride in a yield of 15%.
  • Compound IV-6 was prepared from 111-15 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888) in a total yield of 80%; Compound V-14 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) Prepared from ⁇ -15 with phthalic anhydride, yield 22%.
  • Compound IV-7 was prepared from ⁇ -17 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888) in a total yield of 70%; Compound V-15 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) Prepared from III-17 with phthalic anhydride in 17% yield.
  • Compound IV-8 was prepared from 111-16 according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888) in a total yield of 82%; Compound V-16 according to the literature (J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) Prepared from III-16 with phthalic anhydride, yield 24%.
  • Example 38 Compound IV-9 was prepared from 3-ethylaminophenol ( ⁇ -22) according to the literature (Chem. Commun., 2006, 3886-3888) in a total yield of 70%; Compound V-17 according to the literature (J. Arden-Jacob) , Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachea 1993. ) Prepared from ⁇ -22 with phthalic anhydride, yield 22%.
  • Example 1 According to the method of Example 1, 1 mmol of the compound IV-1 was reacted with 1 mmol of the compound V-2, V-3, V-4, V-5, V-14, respectively, to prepare a compound 1-70. , 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, yields were 35.1%, 32.5%, 28.7% 33.3%, 27.3%, respectively, ESI MS were: m/z, 535.2, 509.2, 563.2, 483.2, 523.2.
  • a compound 1-75, 1 can be obtained by reacting 1 mmol of the compound IV-2 with 1 mmol of the compound V1, V-3, V-4, V-5, V-15, respectively. -76, 1-77, 1-78, 1-79, the yield was 35.6%, 31.5%, 28.9%, 31.3%, 26.3%, ESI MS are: m/z, 535.2, 533.2, 587.2, 507.2, 549.2.
  • a compound 1-80, 1 can be obtained by reacting 1 mmol of the compound IV-3 with 1 mmol of the compound V1, V-3, V-4, V-14, V-16, respectively.
  • -81, 1-82, 1-83, 1-84, yields were 34.7%, 30.7%, 30.7%, 29.3%, 27.1%, respectively, and ESI MS were: m/z, 509.2, 507.2, 561.2, 521.2 522.2.
  • a compound 1-85, 1 can be obtained by reacting 1 mmol of the compound IV-4 with 1 mmol of the compound V1, V-3, V-4, V-5, V-14, respectively.
  • -86, 1-87, 1-88, 1-89, yields were 32.4%, 33.5%, 30.9%, 34.3%, 27.8%, respectively, ESI MS were: m/z, 563.2, 561.2, 615.2, 535.2, 575.2 .
  • 1 mmol of the compound IV-5 was reacted with 1 mmol of the compound V1, V-3, V-4, V-5, V-15, respectively, to obtain a compound 1-90, 1 separately.
  • Compound V-18 was prepared according to the literature (J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) from 111-18 with phthalic anhydride in a yield of 15%.
  • Compound V-20 was prepared from III-4 and 4-methylbenzoic anhydride according to the literature (J. Arden-J., Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993.) in a yield of 12%.
  • 0.23 lg (0.001 mol) of compound IV-3 was mixed with 0.255 g (0.001 mol) of compound V-20 in 10 ml of tetrachloroethane, 0.71 g (0.005 mol) of phosphorus pentoxide was added in portions, and reflux reaction was carried out for 5 hours. After cooling, 20 ml of water was added, and extracted with 20 ml of chloroform three times. After the chloroform phase was dried, the solvent was evaporated under reduced pressure. The obtained product was dissolved in 10 ml of ethanol, and 2 ml of perchloric acid (70%) was added and slowly added dropwise.
  • the staining position can be seen from the compound 1-103: mitochondria in the cytoplasm.
  • Compound 1-47 is coupled to the nucleotide aminoallyl-dUTP:
  • Compound 1-58 is coupled to the nucleotide aminoallyl-dUTP:
  • Compound 1-64 is coupled to a thiol-containing amino acid:

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Abstract

提供了一种具有如下结构式（I）的近红外荧光染料：其中Y为O、S或NR11；Y1为O、S或NR14；Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11、R14分别独立地为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立地为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基、苯基、取代苯基或卤素；ΧΘ为阴离子；还提供了该类染料的制备方法。这类染料有良好的生物相容性和光稳定性、较低的毒性、较长的荧光发射和较高的荧光量子产率，用于生物大分子的共价及非共价荧光标记。

Description

一种近红外荧光染料的制备及应用
技术领域
本发明涉及一类近红外荧光染料及其制备方法与应用， 提供一种近红外生物荧光染料 在生物大分子中共价或者非共价标记的应用。
背景技术
近年来， 荧光染料伴随着生命科学的发展发挥着越来越重要的作用， 尤其在细胞免疫 学、 分子生物学、 分子遗传学等方面应用越来越广泛， 已经成为生命科学研究的重要工具 之一。 目前用于共价或者非共价标记的荧光染料主要有荧光素类、罗丹明类， 萘酰亚胺类、 BODIPY类及香豆素等化合物， 它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率， 但最大吸 收波长和荧光发射波长多小于 650 nm。 而对生物样品而言， 其样品基体和一些杂质在此区 域也会有吸收或荧光， 再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰， 限制了荧光 分析法灵敏度的提高。相对于常规荧光 ( m <600 nm)检测而言，在近红外荧光 ( m >650 nm) 光区， 生物样品基体光吸收或荧光强度很小， 因而背景干扰大大降低， 并且由于散射光强 度与波长的四次方成反比， 随波长的增加， 拉曼散射迅速减小， 使散射干扰也大为减少。 因此， 近红外荧光染料可以作为一种安全、 非侵入性的成像荧光探针广泛应用于医学和生 物学领域， 设计合成新颖的近红外荧光染料已经成为近几年研究的热点问题。 目前常用的近红外染料主要是菁染料。 菁染料的最大吸收和发射波长一般都超过了 600 nm, 可以通过调节中间共轭碳链的长短在极为广泛的范围内调节其光谱性质， 合成方 法简单并且可以方便的引入水溶性基团， 是目前市场化的检测 DNA、 蛋白质、 核苷酸等荧 光探针的的主要品种。 然而这类菁染料的缺点是光稳定性差， 多甲川结构容易在光照下氧 化断裂， 导致染料分解， 另外多甲川的结构也导致了染料容易聚积， 影响了染料在应用方 面的推广。 因此， 合成化学和光学性质更加稳定、 量子产率更高、 毒性小、 易于修饰的新 型近红外荧光染料具有重大的理论意义和应用价值。 罗丹明类和吖啶橙类染料是一种碱性染料， 其水溶液具有较大的摩尔吸光系数； 分子 结构有较大的刚性平面， 且苯环间有氧桥相联， 容易吸收入射光的能量而发射长波， 因此 单体水溶液能产生很强的荧光， 且具有很好的氧化还原能力。 这两类荧光染料的缺点主要 是 Stock位移小， 容易光致褪色， 光猝灭率高， pH敏感性强等。 而传统的香豆素荧光染料 具有 Stokes位移大， 光稳定性较好， 分子体积比较小、 油溶性好等诸多优点， 然而吸收发 射波长过短， 对其的应用有很大的限制。 对于这几种染料结构上的改性主要是通过增加分 子共平面性、 结构刚性以及电子共扼体系来提高荧光效率并使荧光红移， 然而并没有从根 本上改进罗丹明类和吖啶橙类染料的缺点。 本发明将这几种染料有机结合， 一方面通过香 豆素母体增大染料的 Stokes位移， 提高光稳定性； 另一方面香豆素基团的引入使得分子共 轭体系增大， 结构更加刚性， 从而使得发射波长大大红移， 达到 650nm以上。 本发明基于 原料易得的香豆素类衍生物， 通过其与相应的取代苯酚 /硫酚 /苯胺等衍生物反应可以得到 一种新型的近红外荧光染料。 这类染料具有良好的生物相容性和光稳定性、 较低的毒性、 较长的荧光发射和较高的荧光量子产率， 可以避免背景荧光， 可以作为母体染料进一步反 应制得合适的荧光探针， 用于化学分析检测以及生物标记和生物分析检测等领域。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种近红外荧光染料在生物非共价标记领 域应用。
本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种新型的近红外荧光染料。
本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种近红外荧光染料的制备方法。
本发明要解决的第四个技术问题在于提供一种近红外荧光染料在生物共价标记领域 应用。
为解决第一个技术问题， 具有如结构通式 （I) 所示结构的化合物 （化合物 I ) 用于细 胞中生物分子的非共价荧光标记的用途， 其中所述细胞中生物分子为核酸或细胞器：
Figure imgf000004_0001
式中， Y为 0、 S或 NRii ; Yi为 0、 S或 NRi4; Z为 NR7R8或 OR9 ; Ri、 R2 R7
R8、 R9、 Ru、 R14分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 R6、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、低级烃基、 低级烷氧基、氰基或卤素； R4为氢、低级烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、 酰基、 氰基、 苯基、 取代苯基或卤素； Χ Θ为阴离子。 进一步地， 所述的 Ri与 R3、 Ri与 Ri3、 R2与 R3、 R2与 Ri3、 R7与 R6、 R7与 RIQ、 RS 与 R6、 R8与 RKI、 与112或 R7与 R8可形成如下 Ia-In结构：
Figure imgf000005_0001
la lb Ic Id
Figure imgf000005_0002
Ie 、 If 、 Ig Ih
Figure imgf000005_0003
Ii 、 Ij 、 Ik 、 II
Figure imgf000005_0004
Im 、 In ； 其中， R为氢或者低级烷基； Y2为 0、 S或者 NRu。
进一步地， 所述 、 R2、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的烃基为直链、 支链或环状烃基； 所 述烃基为 1-20个碳原子烃基；
所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Ru、 Ri4的醚基中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代烷基为直链或支链； 所述取代烷基为 苄基、 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸酯 基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰卤基取代 1-20个 碳原子烷基、 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω- 磺酰氯基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基、 ω-羟基取代 1-20个碳 原子烷基、 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-巯基取代 1-20个碳原子烷基或 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基；其中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20 个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯 基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基； 所述的 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺基 为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的酰基为 2-6个碳原子烷基酰基、 叔丁氧羰 基、 苯甲酰基、 1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代苯基中取代基可以是苯环上任意位置； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代苯基为低级烷基取代苯基、 低级取代 烷基苯基、 低级烷氧基取代苯基、 卤素取代苯基、 硝基取代苯基、 甲酸基取代苯基、 甲酸 盐基取代苯基、 甲酸酯基取代苯基、 甲酰胺基取代苯基、 甲酰^基取代苯基、 磺酸基取代 苯基、 磺酸盐基取代苯基、 磺酰氯基取代苯基、 羟基取代苯基、 氨基取代苯基、 胺基取代 苯基、 氰基取代苯基、 异氰酸酯基取代苯基或异硫氰酸酯基取代苯基； 其中所述的甲酸酯 基取代苯基中酯基为 2-20个碳原子烃基酯基、 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 N- 琥珀酰亚胺酯基;所述的甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40 个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述胺基取代苯基中的胺基为 NR7R8 ; 所述 R3、 F 、 R5、 、 RlQ、 Rl2、 Rl3的低级烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、异 丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基或己基； 所述 R3、 R4、 R5、 、 Rio Ri2 R13的低级烷氧基为甲氧基、 三氟甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 环丙氧基、 烯丙氧基、 丁氧基、 异丁氧基、 叔丁氧基、 戊氧基、 异戊 氧基、 新戊氧基、 叔戊氧基或己氧基； 所述 R3、 F 、 R5、 R6、 RIQ、 Ri2、 R13的卤素为氟、 氯、 溴或碘； 所述 Χ θ为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。 进一步地， 当 Υ为 0、 S或 NRii， Yi为 0、 S或 NRi4， Z为 NR7R8或OR9; Ri、 R2、 R7、 R8、 R9、 Ru、 R14分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为氢、 低级 烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、 酰基、 氰基或卤素； Χ Θ为阴离子时， 所述化合物 对 R A染色成像。 进一步地， 当 Y为 0、 S或 NRii， Yi为 0、 S或 NRi4， Z为 NR7R8或OR9; Ri、 R2、 R7、 R8、 R9、 Ru、 R14分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为苯基或取 代苯基； x e为阴离子时， 所述化合物对线粒体染色成像。 进一步地， 对细胞中生物分子染色的方法包括以下步骤：
1 ) 细胞培养 将细胞接种于共聚焦皿中， 在 37°C、 5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养 12〜24h; 其中， 细胞培养液中含相应的培养基、 10%体积百分数的胎牛血清、 10(^g/mL青霉素和 10(^g/mL链霉素；
2) 染料溶液的配制 将近红外生物荧光染料用二甲亚砜 （DMSO) 配成 5mM〜10mM的染料溶液；
3 ) 染色 直接向原细胞培养液中加入步骤 2) 得到的染料溶液， 摇匀， 使近红外生物荧光染料 的最终浓度为 500ηΜ〜5μΜ， 得到原细胞培养液和染料溶液的混合液， 在 37°C、 5% C02、 饱和湿度中孵育细胞 10分钟以上， 将线粒体或 R A染色；
4) 成像
移去步骤 3 ) 的混合液， 用磷酸盐缓冲溶液 （PBS缓冲溶液） 冲洗细胞 2次以上， 之 后加入新鲜的细胞培养液， 在活细胞工作站中保持 37°C、 5% C02、 饱和湿度， 用激光共 聚焦显微镜进行拍摄成像， 激发波长为 640nm; 为解决第二个技术问题， 本发明的一种新型的近红外荧光染料结构式 I如下：
Figure imgf000007_0001
式中 Y为 0、 S或 NRu， Yi为 O或 S， Z为 NR7R8或 OR9， X、 Ri~ R13同权利要求 1所述。 其中当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 R6、 Rio Ri2、 R13为氢， Z为羟基时， R!、 R2不同 时为乙基； 当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 R6、 Rio Ri2、 R13为氢， Z为甲氧基时， R!、 R2不同 时为甲基； 当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 R6、 Rio Ri2、 R13为氢， Z为二甲胺基时， NR!R2不 为二甲胺基或哌啶基； 当 Y为 0， R3、 R5、 R6、 Rio Ri2、 R13为氢， R4为 2-羟基 -4二乙 胺基苯基， Z为二乙甲胺基时， NR!R2不为二乙胺基。 进一步地， 所述的 与 、 与 3、 R2与 R3、 与 3、 R7与 R6、 R7与 RKI、 RS 与 Re、 R8与 RKI、 与112或 R7与 R8可形成如下 Ia-In结构：
Figure imgf000008_0001
la lb Ic Id
Figure imgf000008_0002
Ie 、 If 、 Ig Ih
Figure imgf000008_0003
、 II
Figure imgf000008_0004
其中， R为氢或者低级烷基； Y2为 0、 S或者 NRu。
进一步地， 所述 、 R2、 R7、 、 R9、 Ru的烃基为直链、 支链或环状烃基； 所述烃 基为 1-20个碳原子烃基； 所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Rii的醚基中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代烷基为直链或支链； 所述取代烷基为苄基、 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰卤基取代 1-20个碳原子 烷基、 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酰氯 基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基、 ω-羟基取代 1-20个碳原子烷 基、 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-巯基取代 1-20个 碳原子烷基或 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基； 其中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳 原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基;所述的 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺基为 2-40 个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 的酰基为 2-6个碳原子烷基酰基、 叔丁氧羰基、 苯甲酰基、 1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代苯基中取代基可以是苯环上任意位置； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代苯基为低级烷基取代苯基、 低级取代烷基 苯基、 低级烷氧基取代苯基、 卤素取代苯基、 硝基取代苯基、 甲酸基取代苯基、 甲酸盐基 取代苯基、 甲酸酯基取代苯基、 甲酰胺基取代苯基、 甲酰^基取代苯基、磺酸基取代苯基、 磺酸盐基取代苯基、 磺酰氯基取代苯基、 羟基取代苯基、 氨基取代苯基、 胺基取代苯基、 氰基取代苯基、 异氰酸酯基取代苯基或异硫氰酸酯基取代苯基； 其中所述的甲酸酯基取代 苯基中酯基为 2-20个碳原子烃基酯基、 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 N-琥珀酰 亚胺酯基；所述的甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳 原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述胺基取代苯基中的胺基为 NR7R8 ; 所述 R3、 R4、 R5、 、 Rio Ri2 R13的低级烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、异 丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基或己基； 所述 R3、 F 、 R5、 、 RlQ、 Rl2、 Rl3的低级烷氧基为甲氧基、 三氟甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 环丙氧基、 烯丙氧基、 丁氧基、 异丁氧基、 叔丁氧基、 戊氧基、 异戊 氧基、 新戊氧基、 叔戊氧基或己氧基； 所述 R3、 F 、 R5、 R6、 RIQ、 Ri2、 R13的卤素为氟、 氯、 溴或碘； 所述 χ Θ为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。 进一步地， 所述 、 R2、 R7、 R8、 R9、 Ru的直链、 支链或环状的包含 1-20个碳原子 的烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁 基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 己基、 2-甲基戊基、 环己基、 庚基、 2-甲基己基、 辛基、 2一甲基庚基、 壬基、 葵基、 十一烷基、 十二烷基、 十三烷基、 十四烷基、 十五烷 基、 十六烷基、 十七烷基或十八烷基； 所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Rii中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8的醚基为 CH2CH2OCH2CH3 、 CH2CH2OCH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)2CH2C¾ 、 CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH3 、
CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH3 或
CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH2OH； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中的 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2 ) mCOOH， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCOOM, 其中 m为 1-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基中甲 酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基时，所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2 ) mCOO(CH2)nCH3、 ( CH2 ) mCOOC(CH3)3或 ( CH2 ) mCOOCH2CH=CH2， 其中 m为 1-18的 自然数， n为 0-18的自然数； 当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基中甲 酸酯基为甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基时， 所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基为 ( CH2 ) mCOO(CH2)„ CH2COOH 、 ( CH2 ) mCOO(CH2)„ CH2COOM 、 ( CH2 ) mCOO(CH2)nCH2S03H或（CH2 ) mCOO(CH2)nCH2S03M，其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18 的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中的 ω-甲酸苄酯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mCOOCH2C6H5， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酸 N-琥珀酰亚胺酯基取代 1-20个碳原子 院基为
Figure imgf000011_0001
其中 m为 1-18的自然数;
当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中的甲酰 胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCONH(CH2)nCH3、 ( CH2) mCON[(CH2)nCH3]2， 其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18的自 然数；
当所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中的甲酰 胺基为 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCONH(CH2)„ CH2COOH、 ( CH2 ) mCON[(CH2)nCH2COOH]2、 ( CH2 ) mCONH(CH2)„ CH2COOM、 ( CH2 ) mCON[(CH2)nCH2COOM]2、 ( CH2) mCONH(CH2)nCH2S03H、 ( CH2) mCON[(CH2)nCH2S03H]2、（CH2)mCONH(CH2)nCH2S03M或（CH2)mCON[(CH2)nCH2S03M]2， 其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子；
当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺 基为马来酰亚胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为
Figure imgf000011_0002
其中 m为 1-18的自然数； 当所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酰卤基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mCOCl， (CH2) mCOBr， 其中 m为 1-18的自然数；
所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中的 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03H, 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03M， 其中 m为 1-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R6、 R7、 中的 ω-磺酰氯基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03Cl， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Rii中的 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mF， ( CH2) mCl, ( CH2) mBr， ( CH2) mI， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 ω-羟基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mOH， 其中 m为 1-18; 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2 ) mCN， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mNH2， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-巯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mSH， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 Ru中的 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基为
Figure imgf000012_0001
其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 2-6个碳原子烷基酰基为乙酰基、 丙酰基、 丁 酰基或叔丁酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 1-6个碳原子取代苯甲酰基为甲基取代苯甲酰 基、 乙基取代苯甲酰基、 丙基取代苯甲酰基、 丁基取代苯甲酰基或叔丁基取代苯甲酰基； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中卤素取代苯甲酰基为氯取代苯甲酰基、 溴取代 苯甲酰基或碘取代苯甲酰基； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中低级烷基取代苯基为甲基取代苯基、 乙基取代 苯基、 丙基取代苯基、 异丙基取代苯基、 丁基取代苯基、 异丁基取代苯基、 戊基取代苯基、 叔丁基取代苯基或己基取代苯基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 的低级取代烷基苯基为 ω-甲酸基取代 1-6个碳原子 烷基苯基、 ω-甲酸盐基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-甲酸酯基取代 1-6个碳原子烷基苯 基、 ω-甲酰胺基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-甲酰^基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω- 磺酸基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-磺酸盐基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-磺酰氯基 取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-卤素取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-羟基取代 1-6个碳原 子烷基苯基、 ω-氰基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-氨基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω- 巯基取代 1-6个碳原子烷基苯基或 ω-马来酰亚胺取代 1-6个碳原子烷基苯基； 其中所述 ω- 甲酸酯基取代 1-6个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-8个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-8个碳 原子取代烷基酯基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基； 所述的 ω-甲酰胺基取代 1-8个碳原子烷 基中甲酰胺基为 2-20个碳原子烃基甲酰胺基、 2-20个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚 胺基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中低级烷氧基取代苯基为甲氧基取代苯基、 乙氧 基取代苯基、 丙氧基取代苯基、 丁氧基取代苯基、 戊氧基取代苯基、 叔丁氧基取代苯基或 己氧基取代苯基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中卤素取代苯基为氟取代苯基、 氯取代苯基、 溴 取代苯基或碘取代苯基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的甲酸 2-20个碳原子烃基酯基取代苯基为 C6H4COO(CH2)nCH3或 C6H4COOCH2CH=CH2， 其中 n为 0-18; 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基取代苯基为 C6H4COO(CH2)„ CH2COOH、 C6H4COO(CH2)„ CH2COOM、 C6H4COO(CH2)nCH2S03H或 C6H4COO(CH2)nCH2S03M， 其中 n为 0-18， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 2-40个碳原子烃基甲酰胺基取代苯基为 C6H4CONH(CH2)nCH3或 C6H4CON[(CH2)nCH3]2， 其中 n为 0-18; 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基取代苯基为 C6H4CONH(CH2)n CH2COOH、 C6H4CON[(CH2)nCH2COOH]2、 C6H4CONH(CH2)n CH2COOM、 C6H4CON[(CH2)nCH2COOM]2、 C6H4CONH(CH2)n CH2S03H、 C6H4CON[(CH2)nCH2S03H]2、 C6H4CONH(CH2)„ CH2S03M C6H4CON[(CH2)n CH2S03M]2， 其中 n为 0-18， M为平衡电 荷的阳离子； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的胺基取代苯基为 C6H4NH(CH2)nCH3、 C6H4N[(CH2)nCH3]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2COOH 、 C6H4N[(CH2)nCH2COOH]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2COOM 、 C6H4N[(CH2)nCH2COOM]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2S03H 、 C6H4N[(CH2)nCH2S03H]2 C6H4NH(CH2)nCH2S03M、 C6H4N[(CH2)nCH2S03M]2、 乙酰基胺基 取代苯基、 叔丁氧羰基胺基取代苯基、 苯甲酰基胺基取代苯基、 甲基取代苯甲酰基胺基取 代苯基、 乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、 氯取代苯甲酰基胺基取代苯基、 溴取代苯甲酰 基胺基取代苯基或马来酰亚胺基取代苯基， 其中 n为 0-18。 为解决第三个技术问题， 本发明的一种新型的近红外染料的制备方法， 步骤如下： 当所述结构通式 （I) 中 Y为 0、 S或 NRu， 丫1为0或 S， Z为 NR7R8或 OR9; Ri R2、 R7、 R8、 R9、 Ru分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为氢、 低级 烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、 酰基或卤素； ΧΘ为阴离子时， 具体步骤如下： 将 1毫摩尔化合物 Π与 1毫摩尔化合物 III混合在 5-20毫升溶剂中形成混合溶液， 加 入体积占混合溶液 0.01-1的浓酸， 在加热条件下反应 1-8小时， 冷却后再加入 0.01-1倍体 积的质量百分浓度为 70%的高氯酸， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析分离得产物 I； 所述的溶剂是甲醇、 乙醇或者乙酸； 所述的浓酸是浓硫酸、 浓盐酸 或者 70%高氯酸； 所述的加热温度为 60-150°C ; 所述化合物 Π和 III的结构式如下:
Figure imgf000014_0001
( II■)： ( III ): 其中， X'为卤素； Y'为羟基、 巯基或者 NHRu。
进一步地， 当所述结构通式 （I) 中 Y为 0、 S或 NRu， 丫1为0或 S， Z为 NR7R8或 OR9; Ri R2、 R7、 R8、 R9、 Ru分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 R6、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4 为三氟甲基、 氰基、 苯基或取代苯基； ΧΘ为阴离子时， 具体步骤如下：
将物质的量为 1 :1的化合物 IV与化合物 V与四氯乙烷混合； 所述化合物 IV与四氯乙 烷的比值为 Imo lOL; 分批加入五氧化二磷； 所述五氧化二磷与化合物 IV的物质的量的 比值为 5〜10:1； 得到混合溶液； 在回流条件下反应 2-8小时， 冷却后加水， 萃取； 去除氯 仿相的溶剂， 将所得产物溶于乙醇或甲醇中， 加入质量百分浓度为 70%的高氯酸， 慢慢滴 加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到产物 I； 所述乙醇和高氯酸 的体积比为 5:1 ; 所述化合物 IV和 V的结构式如下：
Figure imgf000015_0001
CIV); ( V): 其中， Y'为羟基或巯基。
为解决第四个技术问题， 本发明一种新型近红外染料的应用， 主要用于生物分子的共 价荧光标记； 所述生物分子为核酸或蛋白。
应用于生物大分子 （核酸或蛋白） 的共价荧光标记， 主要是通过带有特定官能团 （如 羧基、 氨基、 叠氮基、 异氰酸酯基、 异硫氰酸酯基、 N-琥珀酰亚胺酯基、 马来酰亚胺基等） 的化合物 I通过公知的化学反应与生物大分子共价相连。 本发明的有益效果： 本发明的一种新型近红外的染料化合物 I， 将香豆素与罗丹明或吖啶橙两类染料有机 结合， 一方面通过香豆素母体增大染料的 Stokes位移， 提高光稳定性； 另一方面香豆素基 团的引入使得分子共轭体系增大，结构更加刚性，从而使得发射波长大大红移，达到 650nm 以上。 这类染料具有良好的生物相容性和光稳定性、 较低的毒性、 较长的荧光发射和较高 的荧光量子产率， 可以避免背景荧光， 用于荧光探针的荧光团以及生物大分子如核酸或蛋 白质的共价荧光标记。 本发明首次将这种结构的近红外荧光染料通过非共价作用来定位线 粒体或 R A， 且以减少光源对细胞及组织的损伤， 降低自发荧光的干扰。本发明的染料具 有有较低的细胞毒性与光毒性， 及较好的光稳定性， 可用于研究活细胞中 R A或线粒体 的动态变化过程。 附图说明
图 1为本发明实例 4中荧光染料 1-5将 A549细胞染色后的图； 图 2为本发明实例 8荧光染料 1-10将 A549细胞染色后的图；
图 3为本发明实例 9荧光染料 1-11将 A549细胞染色后的图；
图 4为本发明实例 10荧光染料 1-12将 A549细胞染色后的图；
图 5为本发明实例 12化合物 1-18与 R A作用的荧光图；
图 6为本发明实例 12化合物 1-18与 R A作用的圆二色谱图；
图 1为本发明实例 12化合物 1-18加 DNA酶与 R A酶消化并与市售的 DNA、 RNA 染料对比图；
图 8为本发明实例 12化合物 1-18与市售 R A染料 SYTO RNASelect的细胞染色效果 对比图；
图 9为本发明实例 12荧光染料 1-18将 Hela细胞染色后的图；
图 10为本发明实例 17荧光染料 1-39将 A549细胞染色后的图；
图 11为本发明实例 17荧光染料 1-40将 L929细胞染色后的图；
图 12为本发明实例 24荧光染料 1-51将 A549细胞染色后的图；
图 13为本发明实例 24荧光染料 1-51与市售线粒体染料对比图；
图 14为本发明实例 33荧光染料 1-63将 Hela细胞染色后的图；
图 15为本发明实例 37荧光染料 1-68将 Hela细胞染色后的图；
图 16为本发明实例 45荧光染料 1-100将 Hela细胞染色后的图；
图 17为本发明实例 46荧光染料 1-103将 A549细胞染色后的图。
图 18为本发明实例 50荧光染料 1-107将 Hela细胞染色后的图；
图 19为本发明实例 51荧光染料 1-108将 Hela细胞染色后的图；
图 20为本发明实例 52荧光染料 1-109将 Hela细胞染色后的图；
具体实施方式
下面结合实施方式和附图对本发明进行进一步说明。
一种近红外荧光染料活细胞中非共价标记生物分子的应用包括以下步骤：
1 ) 细胞培养
将细胞接种于共聚焦皿中， 在 37°C、 5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养 12〜24h; 其中， 细胞培养液中含相应的培养基、 10%体积百分数的胎牛血清、 10(^g/mL青霉素和 10(^g/mL链霉素；
2) 染料溶液的配制
将近红外生物荧光染料用二甲亚砜 （DMSO) 配成 5mM〜10mM的染料溶液；
3 ) 染色
直接向原细胞培养液中加入步骤 2) 得到的染料溶液， 摇匀， 使近红外生物荧光染料 的最终浓度为 500ηΜ〜5μΜ， 得到原细胞培养液和染料溶液的混合液， 在 37°C、 5% C02、 饱和湿度中孵育细胞 10分钟以上， 将线粒体或 R A染色；
4) 成像
移去步骤 3 ) 的混合液， 用磷酸盐缓冲溶液 （PBS缓冲溶液） 冲洗细胞 2次以上， 之 后加入新鲜的细胞培养液， 在活细胞工作站中保持 37°C、 5% C02、 饱和湿度， 用激光共 聚焦显微镜进行拍摄成像， 激发波长为 640nm。
Figure imgf000017_0001
7-二乙胺基 -4-氯 -3-甲酰基香豆素 Π-1根据文献 （Chem. Commun., 2006, 3886-3888 ) 由间 N， N-二乙基-氨基苯酚 ΙΠ-1制备， 总产率 70%。
将 0.28 g (0.001 mol) 的化合物 Π-l和 0.165 g ( 0.001 mol) 的化合物 ΙΠ-l溶于 5 毫 升的乙酸中， 加入 0.1毫升高氯酸（70%)， 加热至 150°C， 反应 2 h。 冷却后加入 2毫升高 氯酸（70%)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到 0.15 g化合物 1-1， 产率 31.5%。 ESI MS: m/z， 377.2。 λΛ max/nm = 590nm， em max/nm = 648nm， <Df = 0.62。
实施例 2
Figure imgf000017_0002
化合物 Π-2根据文献 ( Chem. Eur. J. 2008, 14 1786 - 1792 Chem. Commun., 2006, 3886-3888) 由 7-氨基小甲基 -1 2 2 4-四氢喹啉 ΙΠ-2制备， 总产率 50%; 化合物 ΙΠ-3根据 文献 ( J. Org. Chem. 2006, 71, 7835- 7839) 由间氨基苯酚制备， 总产率 48%
将 0.277 g (0.001 mol)的化合物 Π-2和 0.303 g (0.001 mol)的化合物 ΠΙ-3溶于 20 毫 升的乙醇中，加入 2毫升浓硫酸，加热至 90°C，反应 3 h。冷却后加入 0.2 毫升高氯酸 (70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.12 g化合物 1-2，产 率 19.2% ESI MS: m/z 527.2 λ /nm = 597nm em max/nm = 656nm <Df = 0.45
Figure imgf000018_0001
7-二甲胺基 -4-氯 -3-甲酰基香豆素 Π-3根据文献 （Chem. Commun., 2006, 3886-3888 ) 由间 N N-二甲基-氨基苯酚 ΙΠ-4制备， 总产率 70%
将 0.251 g (0.001 mol) 的化合物 Π-3和 0.153 g (0.001 mol) 的化合物 ΠΙ-5溶于 5 毫 升的乙酸中，加入 1毫升浓硫酸，加热至 100°C，反应 l h。冷却后加入 2毫升高氯酸（70%)， 然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到 0.16 g化合物 1-3 产率 35.5% ESI MS: m/z 351.1 ab max/nm = 595nm em max/nm = 652nm <Df = 0.25
施例 4
Figure imgf000018_0002
将 0.277 g (0.001 mol) 的化合物 Π-2和 0.162 g (0.001 mol) 的化合物 ΙΠ-6溶于 5 毫 升的乙酸中，加入 5毫升浓盐酸，加热至 100°C，反应 8 h。冷却后加入 2毫升高氯酸（70%)， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.175 g化合物 1-4, 产率 36.1% ESI MS: m/z 386.2 ab max/nm = 550nm em max/nm = 602nm <Df = 0.41 将化合物 1-4与 1-溴代正己烷反应可得化合物 1-5， 产率 65% ESI MS: m/z 470.3 如图 1中所示， 可以看出化合物 1-5染色位置： 细胞核内为核仁中 R A
Figure imgf000019_0001
化合物 Π-4根据文献 （Chem. Commun., 2006, 3886-3888) 由 8-羟基久洛里定 ΙΠ-7制 备，总产率 72%。化合物 III-8由化合物 III-2根据文献（Chem. Eur. J. 2008, 14， 1786 - 1792； ) 制备， 总产率 60%。
将 0.303 g (0.001 mol)的化合物 Π-4和 0.206 g (0.001 mol)的化合物 ΠΙ-8溶于 20 毫 升的甲醇中，加入 0.2毫升高氯酸，加热至 60°C，反应 8 h。冷却后加入 1 毫升高氯酸 (70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.12 g化合物 1-6，产 率 21.6%。 ESI MS: m/z， 456.2。
将化合物 1-6与 5倍量顺丁烯二酸酐反应在 DMSO中反应 24小时， 即可得到化合物 1-7, 产率 62.8%。 ESI MS: m/z， 536.2。
Figure imgf000019_0002
将 0.277 g (0.001 mol) 的化合物 II-2禾 B 0.11 g (0.001 mol) 的化合物 ΠΙ-9溶于 20 毫 升的甲醇中，加入 2毫升浓硫酸，加热至 60°C，反应 1 h。冷却后加入 1 毫升高氯酸（70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.13 g化合物 1-8，产 率 39.4%。 ESI MS: m/z， 333.1。
实施例 7
Figure imgf000019_0003
化合物 Π-5根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888) 由 3-羟基三苯基胺 ΙΠ-10制 备， 总产率 41%。
将 0.375 g (0.001 mol)的化合物 II-5和 0.189 g (0.001 mol)的化合物 III-3溶于 20 毫 升的乙醇中，加入 2毫升浓硫酸，加热至 90°C，反应 3 h。冷却后加入 1 毫升高氯酸（70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.11 g化合物 1-9，产 率 18.0%。 ESI MS: m/z, 511.2。 ab max/nm = 595nm, em max/nm = 655nm, = 0.59。
实施例 8
Figure imgf000020_0001
化合物 ΙΠ-11是由化合物间氨基苯酚与 1-溴代正辛烷根据文献制备 (精细化工， 2003,20 (12), 761-765)。
将 0.251 g (0.001 mol)的化合物 II-3和 0.333 g (0.001 mol)的化合物 III- 11溶于 10 毫 升的乙酸中， 加入 0.1毫升浓高氯酸（70%)， 加热至 100°C， 反应 3h。 冷却后加入 2毫升 高氯酸（70%)， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.172 g化合物 1-10，产率 22.7%。ESI MS: m/z, 531.4。 ab max/nm = 590nm, em max/nm = 651nm, <Df=0.45。
如图 2中所示， 可以看出化合物 1-10染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
实施例 9
Figure imgf000020_0002
化合物 Π-6根据文献 （ Chem. Commun., 2006, 3886-3888； J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993.) 由 7-羟基 -2，2，4-三甲基 -1-乙基 -1,2-二氢喹啉 ΙΠ-12制 备， 总产率 52%。 化合物 ΙΠ-13由化合物间氨基苯酚与 2-溴乙氧基 -2-乙氧基二乙醇根据文 献制备 （精细化工， 2003,20 (12), 761-765)。
将 0.331 g (0.001 mol)的化合物 Π-6和 0.341 g (0.001 mol)的化合物 ΙΠ-13溶于 5 毫 升的乙酸中， 加入 0.1毫升浓高氯酸（70%)， 加热至 100°C， 反应 5h。 冷却后加入 5毫升 高氯酸（70%)， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.175 g化合物 1-11，产率 24.4%。ESI MS: m/z， 619.3 <Aab max/nm = 599nm， em max/nm = 658nm, <¾= 0.48。
如图 3中所示， 可以看出化合物 1-11染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
Figure imgf000021_0001
化合物 Π-7和化合物 4- (7-羟基 -2，2，4-三甲基 -1,2-二氢喹啉小） 正葵酸 ΙΠ-14根据文 献 （J. Arden-Jacob，Ph. D. Thesis，Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 制备。
将 0.291 g (0.001 mol)的化合物 II-7和 0.359 g (0.001 mol)的化合物 III- 14溶于 5 毫 升的乙酸中， 加入 0.1毫升浓高氯酸（70%)， 加热至 100°C， 反应 3 h。 冷却后加入 2毫升 高氯酸（70%)， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到 0.165 g化合物 I -12, 产率 17.0%。 ESI MS: m/z, 597.3。
将 0.2g (0.33 mmol) 化合物 1-12、 0.038g (0.33 mmol) N-羟基丁二酰亚胺、 二环己 基碳二亚胺溶于 5 毫升干燥的 DMF， 氮气保护下 80°C反应 2小时， 冷却、 过滤， 滤液蒸 干溶剂柱层析分离得到 0.1 lg化合物 1-13， 产率 42.0%。 ESI MS: m/z, 694.3。
如图 4中所示， 可以看出化合物 1-12染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
Figure imgf000021_0002
按照实施例 1的方法，由 1毫摩尔化合物 π-6分别与 1毫摩尔化合物 πι-ΐ、 m-2、m-7、
III- 12反应，可以分别制得化合物 1-14、 1-15、 1-16、 1-17,产率分别为 32.1%、 30.5% 28.5%、 29.3%, ESI MS分别为： m/z, 433.2 440.2、 482.2、 495.2。
实施例 12
Figure imgf000022_0001
按照实施例 2的方法，由 1毫摩尔化合物 π-2分别与 1毫摩尔化合物 m-4、m-7、m-i2、 间哌啶苯酚（ΠΙ-15 )反应，可以分别制得化合物 1-18、 1-19、 1-20、 1-21 ,产率分别为 26.1%、 25.5%、 24.5% 20.6%, ESI MS分别为： m/z， 361.2、 413.2、 441.2、 401.2。 图 5为化合物 1-18与 R A作用的荧光图；可以看出，随着 R A的加入（200μ§/ηΛ)， 实例 3的荧光增强。
图 6为化合物 1-18与 R A作用的圆二色谱图； R A溶液中随着化合物浓度的增大圆 二色谱的变化情况， 由此可以推出 R A与 1-18结构的作用模式为半嵌入。
图 7为化合物 1-18加 DNA酶与 R A酶消化并与市售的 DNA、 RNA染料对比图，证 明化合物 1-18进入细胞核中所染的为 RNA (control是用作对照， 就是空白）。 图 8为化合物 1-18与市售 R A染料对比染色效果图， 从图中可以明显看出本发明的 红色可以覆盖住市售染料的绿色， 说明本发明的染料具有比 RNASelect染料更清晰、 选择 性更强的染色效果 （图中， 6A为本发明， 6B为 RNASelect染色， 6C为叠加图）。
如图 9中所示， 可以看出化合物 1-18染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
Figure imgf000022_0002
按照实施例 1的方法，由 1毫摩尔化合物 π-1分别与 1毫摩尔化合物 m-2、m-7、m-i2、
3-G-哌嗪)苯酚 （ΠΙ-16) 反应， 可以分别制得化合物 1-22、 1-23、 1-24、 1-25， 产率分别为 36.2%、 35.8%、 34.5% 31.2%, ESI MS分别为： m/z， 389.2、 415.2、 443.2、 404.2。
实施例 14
Figure imgf000023_0001
按照实施例 l的方法，由 1毫摩尔化合物 π-11分别与 1毫摩尔化合物 m-2、m-7、m-i2、
3-(4-吗啉基)苯酚 （ΠΙ-17) 反应， 可以分别制得化合物 1-26、 1-27、 1-28、 1-29, 产率分别 为 34.7%、 33.6%、 32.4%, 29.0%, ESI MS分别为： m/z， 361.2、 387.2、 415.2、 377.2。 施例 15
Figure imgf000023_0002
按照实施例 2的方法，由 1毫摩尔化合物 π-4分别与 1毫摩尔化合物 m-i、m-2、m-4、
111-7、 111-12反应， 可以分别制得化合物 1-30、 1-31、 1-32、 1-33、 1-34， 产率分别为 26.7%、 23.6%、 25.4%、 24.8% 23.4%, ESI MS分别为： m/z， 415.2、 413.2、 387.2、 439.2、 467.2。
16
Figure imgf000023_0003
按照实施例 6的方法， 由 1毫摩尔化合物 ΠΙ-9分别与 1毫摩尔化合物 Π-6、 II-4反应， 可以分别制得化合物 1-35、 1-36, 产率分别为 38.7%、 39.6%； 按照实施例 6的方法， 由 1 毫摩尔间甲氧基苯酚 （化合物 ΠΙ-18) 分别与 1毫摩尔化合物 Π-4、 Π-2反应， 可以分别制 得化合物 1-37、 1-38,产率分别为 40.7%、 39.8%, ESI MS分别为： m/z, 360.1、 374.1、 348.1、 374.1 ο
实施例 17
Figure imgf000024_0001
将 1毫摩尔化合物 1-2与氯气反应可制得化合物 1-39， 产率 60.2%; 根据文献（J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 16174-16175 ),将 1毫摩尔化合物 1-39与 1毫摩尔正丁基铜锂试剂 在四氢呋喃溶剂中， 零下 78度反应 20分钟， 加入饱和氯化铵水溶液， 用二氯甲烷萃取， 有机相浓縮、 柱层析分离的化合物 1-40， 产率 58.2%。
如图 10中所示， 可以看出化合物 1-39染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
如图 11中所示， 可以看出化合物 1-40染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
Figure imgf000024_0002
根据文献 （ORGANIC LETTERS, 2004， 6， 3727-3730) 由化合物 1-39可以制得化合 物 1-41和 1-42, 产率分别为 62.6%、 85.6%。
Figure imgf000024_0003
按照实施例 1的方法，由化合物 Π-8和化合物 ΙΠ-4可以制得化合物 1-43，产率 20.6%。 实施例 20
化合物 1-7与带巯基氨基酸偶联：
Figure imgf000025_0001
将 0.127 g ( 0.0002 mol)化合物 I -7与 0.024 g ( 0.0002 mol)半胱氨酸溶于 10毫升乙 醇中， 室温下搅拌 1小时， 浓縮后柱层析纯化分离得到 0.11 g化合物 1-44， 产率 72.3%。 ESI MS: m/z， 657.2。
实施例 21
化合物 1-13与核苷酸氨基烯丙基 -dUTP偶联：
Figure imgf000025_0002
将 0.159 g ( 0.0002 mol)化合物 1-13的 DMF溶液加入到 0.103 g ( 0.0002 mol)烯丙基 -dUTP的缓冲溶液中 （pH=8)， 室温下搅拌 20小时， 浓縮后柱层析纯化分离得到 0.15 g化 合物 1-45， 产率 62.8%。 ESI MS: m/z， 1095.4。
实施例 22
IV-1 V-1 1-46 1-47
7-二甲胺基 -4-羟基香豆素 IV-1根据文献 （Chem. Commun., 2006, 3886-3888 ) 由 ΠΙ-1 制备， 总产率 80%。
将 0.233g ( 0.001 mol)化合物 IV-1与 0.313g ( 0.001 mol) 化合物 V-1混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.42g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.22g化合物 1-46， 产率 36.1%。 ESI MS : m/z， 511.2。 ab max/nm = 595nm， em m nm = 648nm, Of = 0.32。 将 0.194g ( 0.33 mmol) 化合物 1-46、 0.038g ( 0.33 mmol) N-羟基丁二酰亚胺、 二环 己基碳二亚胺溶于 5 毫升干燥的 DMF， 氮气保护下 80°C反应 2小时， 冷却、 过滤， 滤液 蒸干溶剂柱层析分离得到 O. lg化合物 1-47， 产率 42.5%。 ESI MS: m/z, 608.2。
实施例 23
Figure imgf000026_0001
化合物 IV-2根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888)由 ΠΙ-7制备， 总产率 75%; 化合物 V-2根据文献（ J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 ΙΠ-7与 邻苯二甲酸酐制备， 产率 20%。
将 0.257g ( 0.001 mol)化合物 IV-2与 0.337g ( 0.001 mol) 化合物 V-2混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 0.71g ( 0.005 mol) 五氧化二磷， 回流反应 8小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.25g化合物 1-48， 产率 36.1%。 ESI MS: m/z， 559.2。 ab max/nm = 598nm， Xem m n = 650nm, Of = 0.51。
将 0.329g ( 0.5 mmol) 化合物 1-48、 0.124g ( 0.5 mmol) 溴乙烷溶于 10 毫升干燥的 DMF， 氮气保护下室温反应 10小时后， 蒸干溶剂柱层析分离得到 0.20g化合物 1-49， 产率 58.3%。 ESI MS: m/z, 839.2。 ab max/nm = 597nm, em max/nm = 650nm, Of = 0.48。
实施例 24
Figure imgf000026_0002
化合物 IV-3根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888)由 ΠΙ-2制备， 总产率 85%; 化合物 V-3根据文献（ J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 ΙΠ-2与 邻苯二甲酸酐制备， 产率 25%。
将 0.23 lg ( 0.001 mol) 化合物 IV-3与 0.311g ( 0.001 mol) 化合物 V-3混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g (0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 2小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.21g化合物 1-50， 产率 34.7%。 ESI MS: m/z， 507.2。 ab max/nm = 598nm, em max/nm = 650nm, Of= 0.41。
将 0.303g (0.5mmol) 化合物 1-50、 0.124g (0.5mmol) 溴代十二烷溶于 10 毫升干 燥的 DMF，氮气保护下室温反应 10小时后，蒸干溶剂柱层析分离得到 0.19g化合物 1-51， 产 率 49.7%。 ESIMS: m/z, 665.3。
如图 12中所示， 可以看出化合物 1-51染色位置： 细胞质内为线粒体。
图 13为化合物 1-51与市售线粒体染料对比图， 证明化合物 1-51进入细胞质中所染的 为线粒体， 且 1-51的染料染色效果更强 （市售染料为绿色， 本发明染料为红色， 叠加后绿 色被红色完全覆盖）。
Figure imgf000027_0001
化合物 IV-4根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888)由 111-12制备，总产率 83%; 化合物 ΙΠ-4根据文献 （J.Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993.) 由 111-12 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 22%。
将 0.285g (0.001 mol)化合物 IV-4与 0.35 lg (0.001 mol) 化合物 V-4混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g (0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 3小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.29g化合物 1-52， 产率 41.4%。 ESIMS: m/z， 601.3。 ab max/nm = 615nm， em m nm = 668nm, Of= 0.49。
将 0.300g (0.5mmol) 化合物 1-52、 0.09g (0.5mmol) 十二烷基胺溶于 10 毫升干燥 的 DMF,氮气保护下室温反应 10小时后， 蒸干溶剂柱层析分离得到 0.18g化合物 1-53， 产 率 41.5%。 ESI MS: m/z, 768.5。
Figure imgf000028_0001
化合物 V-5根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. )由 ΙΠ-1 与四氯邻苯二甲酸酐制备， 产率 30%。
将 0.257g ( 0.001 mol) 化合物 IV-2与 0.449g ( 0.001 mol) 化合物 V-5混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.42g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 6小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.28g化合物 1-54， 产率 37.4%。 ESI MS: m/z， 649.1。 ab max/nm = 635nm， Xem m n = 690nm, <Df = 0.15。
Figure imgf000028_0002
化合物 ΠΙ-6根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. )由 ΙΠ-4 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 24%。
将 0.23 lg ( 0.001 mol) 化合物 IV-3与 0.285g ( 0.001 mol) 化合物 V-6混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.06g ( 0.0075 mol)五氧化二磷， 回流反应 4小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.21g化合物 1-55， 产率 36.2%。 ESI MS: m/z， 481.2。 ab max/nm = 596nm， em m nm = 650nm, Of = 0.45。
实施例 28
Figure imgf000029_0001
化合物 V-7根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. )由 ΙΠ-1 与 4-硝基邻苯二甲酸酐制备， 产率 22%。
将 0.466g ( 0.002 mol) 化合物 IV- 1与 0.716g ( 0.002 mol) 化合物 V-7混合在 15毫升 四氯乙烷中， 加入 2.84g ( 0.02 mol) 五氧化二磷， 150°C反应 5小时， 冷却后加入 30毫升 水， 用 30毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫升乙 醇， 加入 3毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯 化分离得到 0.45 g化合物 1-56， 产率 34.3%。 ESI MS: m/z， 556.2。
将化合物 1-56在水溶液中用 Na2S 和 NaSH 还原， 即可得到化合物 1-57， 产率 52%。 ESI MS: m/z， 526.2。
将化合物 1-57与 CS2反应即可得到化合物 1-58， 产率 32%。 ESI MS: m/z， 568.2。
29
Figure imgf000029_0002
化合物 V-8根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. )由 3-N， N-二丁氨基苯酚 （ΙΠ-19) 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 20%。
将 0.285g ( 0.001 mol) 化合物 IV-4与 0.369g ( 0.001 mol) 化合物 V-8混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.06g ( 0.0075 mol)五氧化二磷， 回流反应 7小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.25g化合物 1-59， 产率 34.2%。 ESI MS: m/z， 619.3。 ab max/nm = 606nm， em m nm = 660nm, Of = 0.42。
实施例 30
Figure imgf000030_0001
化合物 V-9根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. )由 ΙΠ-4 与 2-磺基苯甲酸酐制备， 产率 15%。
将 0.205g ( 0.001 mol) 化合物 IV-5与 0.32 lg ( 0.001 mol) 化合物 V-9混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.41g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.21g化合物 1-60， 产率 35.6%。 ESI MS: m/z， 591.1。 ab m nm = 590nm, em m nm = 650nm, <Df = 0.50。
实施例 31
Figure imgf000030_0002
化合物 V-10根据文献 （J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 III-l与羧基取代邻苯二甲酸酐制备， 产率 18%。
将 0.233g ( 0.001 mol)化合物 IV- 1与 0.373g ( 0.001 mol)化合物 V-10混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.06g ( 0.0075 mol)五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.20g化合物 1-61， 产率 28.8%。 ESI MS: m/z， 595.2。 ab max/nm = 595nm， em m nm = 650nm, Of = 0.45。
实施例 32
Figure imgf000031_0001
化合物 V-l l根据文献 （ J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 III-7与四溴 2-磺基苯甲酸酐制备， 产率 15%。
将 0.23 lg ( 0.001 mol)化合物 IV-3与 0.684g ( 0.001 mol)化合物 V-l l混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.41g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 3小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.31g化合物 1-62， 产率 31.6%。 ESI MS: m/z， 880.8。 ^ m m = 638nm, Xem m n = 692nm, <Df = 0.15。
Figure imgf000031_0002
化合物 V-12根据文献 （J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 7-羟基 -1- (4-正丁酸) -1，2，3，4-四氢喹啉 (111-20) 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 16%。
将 0.285g ( 0.001 mol)化合物 IV-4与 0.383g ( 0.001 mol)化合物 V-12混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.06g ( 0.0075 mol)五氧化二磷， 回流反应 8小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.22g化合物 1-63， 产率 30.1%。 ESI MS: m/z， 633.3。 ab max/nm = 606nm， Xem m n = 659nm, Of = 0.42。
将 0.244g ( 0.33 mmol) 化合物 1-63、 0.038g ( 0.33 mmol) N-羟基丁二酰亚胺、 二环 己基碳二亚胺溶于 5 毫升干燥的 DMF， 氮气保护下 80°C反应 2小时， 冷却、 过滤， 滤液 蒸干溶剂柱层析分离得到 0.12g化合物 1-64， 产率 44.4%。 ESI MS: m/z, 712.3。 如图 14中所示， 可以看出化合物 1-63染色位置： 细胞质内为线粒体。
实施例 34
Figure imgf000032_0001
化合物 V-13根据文献 （ J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 4-甲基 -3-N， N-二乙氨基苯酚 （ΙΠ-21 ) 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 21%。
将 0.233g ( 0.001 mol)化合物 IV-4与 0.327g ( 0.001 mol)化合物 V-13混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.06g ( 0.0075 mol)五氧化二磷， 回流反应 2小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.22g化合物 1-65， 产率 35.2%。 ESI MS: m/z， 525.2。 ab max/nm = 596nm， Xem m n = 648nm, Of = 0.62。
Figure imgf000032_0002
化合物 IV-6根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888 )由 111-15制备，总产率 80%; 化合物 V-14根据文献 （J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 ΠΙ-15 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 22%。
将 0.245g ( 0.001 mol) 化合物 IV-6与 0.325g ( 0.001 mol) 化合物 V-14混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 3小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.25g化合物 1-66， 产率 39.4%。 ESI MS: m/z， 535.2。 ab max/nm =589nm， em max/nm = 65 lnm, Of = 0.41。
实施例 36
Figure imgf000033_0001
化合物 IV-7根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888 )由 ΙΠ-17制备，总产率 70%; 化合物 V-15根据文献 （J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 III- 17 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 17%。
将 0.247g ( 0.001 mol) 化合物 IV-7与 0.327g ( 0.001 mol) 化合物 V-15混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 3小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.17g化合物 1-67， 产率 26.6%。 ESI MS: m/z, 539.2。 ab max/nm =587nm， Xem m n = 649nm, Of = 0.31。
实施例 37
Figure imgf000033_0002
化合物 IV-8根据文献（Chem. Commun., 2006, 3886-3888 )由 111-16制备，总产率 82%; 化合物 V-16根据文献 （J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 III- 16 与邻苯二甲酸酐制备， 产率 24%。
将 0.246g ( 0.001 mol) 化合物 IV-8与 0.326g ( 0.001 mol) 化合物 V-16混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 3小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.26g化合物 1-68， 产率 40.9%。 ESI MS: m/z, 537.2。 ab max/nm =592nm， em max/nm = 651nm, Of = 0.39。
如图 15中所示， 可以看出化合物 1-68染色位置： 细胞质内为线粒体。
实施例 38
Figure imgf000034_0001
化合物 IV-9根据文献 （Chem. Commun., 2006， 3886-3888) 由 3-乙胺基苯酚 （ΙΠ-22) 制备，总产率 70%;化合物 V-17根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis, Verlag Shaker, Aachea 1993. ) 由 ΙΠ-22与邻苯二甲酸酐制备， 产率 22%。
将 0.205g ( 0.001 mol) 化合物 IV-9与 0.285g ( 0.001 mol) 化合物 V-17混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 0.71 g ( 0.005 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.20g化合物 1-69， 产率 36.2%。 ESI MS: m/z， 454.2。 ab max/nm =586nm, Xem m n = 648nm, Of = 0.31。
Figure imgf000034_0002
按照实施例 1的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-1分别与 1毫摩尔化合物 V-2、 V-3、 V-4、 V-5、 V-14反应， 可以分别制得化合物 1-70、 1-71、 1-72、 1-73、 1-74， 产率分别为 35.1%、 32.5%、 28.7% 33.3%、 27.3%, ESI MS分别为： m/z， 535.2、 509.2、 563.2、 483.2、 523.2。
Figure imgf000034_0003
按照实施例 2的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-2分别与 1毫摩尔化合物 V-l、 V-3、 V-4、 V-5、 V-15反应， 可以分别制得化合物 1-75、 1-76、 1-77、 1-78、 1-79， 产率分别为 35.6%、 31.5%、 28.9%、 31.3%、 26.3%, ESI MS分别为： m/z， 535.2、 533.2、 587.2、 507.2、 549.2。
Figure imgf000035_0001
按照实施例 3的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-3分别与 1毫摩尔化合物 V-l、 V-3、 V-4、 V-14、 V-16反应， 可以分别制得化合物 1-80、 1-81、 1-82、 1-83、 1-84, 产率分别为 34.7%、 30.7%、 30.7%、 29.3%、 27.1%, ESI MS分别为： m/z， 509.2、 507.2、 561.2、 521.2、 522.2。
Figure imgf000035_0002
按照实施例 4的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-4分别与 1毫摩尔化合物 V-l、 V-3、 V-4、 V-5、 V-14反应， 可以分别制得化合物 1-85、 1-86、 1-87、 1-88、 1-89， 产率分别为 32.4%、 33.5%、 30.9% 34.3% 27.8%, ESI MS分别为： m/z， 563.2、 561.2、 615.2、 535.2、 575.2。
Figure imgf000035_0003
按照实施例 9的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-5分别与 1毫摩尔化合物 V-l、 V-3、 V-4、 V-5、 V-15反应， 可以分别制得化合物 1-90、 1-91、 1-92、 1-93、 1-94， 产率分别为 34.5%、 31.6%、 32.7% 31.3%、 26.1%, ESI MS分别为： m/z， 483.2、 481.2、 535.2、 455.2、 497.2。
Figure imgf000035_0004
按照实施例 14或 15的方法，由 1毫摩尔化合物 IV-6、IV-7分别与 1毫摩尔化合物 V-l、 V-3反应， 可以分别制得化合物 1-95、 1-96、 1-97、 1-98, 产率分别为 25.6%、 22.5% 24.9%、 21.3%； 按照实施例 16的方法， 由 1毫摩尔化合物 IV-16与 1毫摩尔化合物 V-1反应， 可 以分别制得化合物 1-99， 产率为 24.3%， ESI MS分别为： m/z， 523.2、 521.2、 525.2、 523.2、 524.2
Figure imgf000036_0001
化合物 V-18根据文献 （ J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 111-18与邻苯二甲酸酐制备， 产率 15%。
将 0.233g ( 0.001 mol)化合物 IV- 1与 0.272g ( 0.001 mol)化合物 V-18混合在 10毫升 四氯乙烷中， 分批加入 1.42g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20 毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10毫 升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层 析纯化分离得到 0.18g化合物 1-100， 产率 31.6%。 ESI MS: m/z， 470.2。 ab max/nm = 560nm， Xem m n = 605nm, Of = 0.22。
如图 16中所示， 可以看出化合物 1-100染色位置： 细胞质内为线粒体。
Figure imgf000036_0002
化合物 IV-10根据文献 （Chem. Commun., 2006， 3886-3888 ) 由 7-氨基 -1- ( ω-磺酸基） 丙基 -1，2，2，4-四氢喹啉（ΙΠ-23 )制备， 总产率 53%; 化合物 V-19根据文献（J. Arden-Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 ΠΙ-4与三氟乙酸酐制备， 产率 32%。
将 0.339g ( 0.001 mol)化合物 IV-10与 0.233g ( 0.001 mol) 化合物 V-19混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 1.42 g ( 0.01 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.085g化合物 1-101，产率 13.4%。ESI MS: m/z, 537.1 Aab max/nm =590nm， em max/nm = 650nm, Of = 0.37。
实施例 47
Figure imgf000037_0001
化合物 V-20根据文献 （J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993. ) 由 III-4与 4-甲基苯甲酸酐制备， 产率 12%。
将 0.23 lg ( 0.001 mol) 化合物 IV-3与 0.255g ( 0.001 mol) 化合物 V-20混合在 10毫 升四氯乙烷中， 分批加入 0.71 g ( 0.005 mol) 五氧化二磷， 回流反应 5小时， 冷却后加入 20毫升水， 用 20毫升氯仿萃取三次， 氯仿相干燥后， 减压蒸干溶剂， 将所得产物溶于 10 毫升乙醇， 加入 2毫升高氯酸 （70%)， 慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥，柱 层析纯化分离得到 0.102g化合物 1-102，产率 19.0%。ESI MS: m/z, 437.2 ab max/nm =596nm, em max/nm = 648nm, Of = 0.41。
将化合物 1-102氯甲基化得到化合物 1-103， 产率 10%。 ESI MS: m/z, 485
如图 17中所示， 可以化合物 1-103看出染色位置： 细胞质内为线粒体。
实施例 47
化合物 1-47与核苷酸氨基烯丙基 -dUTP偶联：
Figure imgf000038_0001
将 0.353 g (0.0005 mol)化合物 1-47的 DMF溶液加入到 0.258 g (0.0005 mol)烯丙基 -dUTP的缓冲溶液中 （pH=8)， 室温下搅拌 20小时， 浓縮后柱层析纯化分离得到 0.25 g化 合物 1-104， 产率 45.1%。 ESI MS: m/z， 1009.2。
实施例 48
化合物 1-58与核苷酸氨基烯丙基 -dUTP偶联：
Figure imgf000038_0002
将 0.133 g (0.0002 mol)化合物 1-58的 DMF溶液加入到 0.103 g (0.0002 mol)烯丙基 -dUTP的缓冲溶液中 （pH=8)， 室温下搅拌 20小时， 浓縮后柱层析纯化分离得到 0.12 g化 合物 1-105， 产率 50.7%。 ESI MS: m/z， 1084.2。
实施例 49
化合物 1-64与带巯基氨基酸偶联：
Figure imgf000039_0001
将 0.162 g ( 0.0002 mol)化合物 1-64与 0.024 g (0.0002 mol)半胱氨酸溶于 10毫升乙 醇中， 室温下搅拌 1小时， 浓縮后柱层析纯化分离得到 0.15 g化合物 1-106， 产率 80.6%。 ESI MS: m/z， 833.3。
实施例 50
Figure imgf000039_0002
化合物 1-107的合成参见 J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993。 如图 18中所示， 可以看出化合物 1-107染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
实施例 51
Figure imgf000039_0003
化合物 1-108的合成参见 J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993。 如图 19中所示， 可以看出化合物 1-108染色位置： 细胞核内为核仁中 R A。
实施例 52
Figure imgf000039_0004
化合物 1-109的合成参见 J. Arden- Jacob, Ph. D. Thesis,Verlag Shaker, Aachen, 1993。 如图 20中所示， 可以看出化合物 1-109染色位置： 细胞质内为线粒体。 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 并非对本发明的实施方 式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做出其它不同 形式的变化或变动。 这里无法对所有的实施方式予以穷举。 凡是属于本发明的技术方案所 引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

权利要求书
1、 具有如结构通式 （I) 所示结构的化合物用于细胞中生物分子的非共价荧光标记的 用途， 其中所述细胞中生物分子为核酸或细胞器：
Figure imgf000041_0001
(I),
式中， Y为 0、 S或 NR11 ; 丫1为0、 S或 NR14; Z为 NR7R8或 0R9; Ri R2、 R7、
R8、 R9、 Ru、 R14分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 R6、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、低级烃基、 低级烷氧基、氰基或卤素； R4为氢、低级烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、 酰基、 氰基、 苯基、 取代苯基或卤素； ΧΘ为阴离子。
2、 根据权利要求 1所述的化合物的用途， 其特征在于， 所述的 1^与 、 与1 13、 R2与 R3、 R2与 Ri3、 R7与 、 R7与 RIQ、 Rs与 R6、 Rs与 RIQ、 与 R2或 R7与 R8可形成 如下 Ia-In结构：
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000041_0003
Figure imgf000041_0004
、 II
Figure imgf000042_0001
其中， R为氢或者低级烷基； Y2为 0、 S或者 NRu。
3、 根据权利要求 1或 2所述的化合物 I的用途， 其特征在于， 所述 Ri、 R2、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的烃基为直链、 支链或环状烃基； 所述烃基为 1-20个碳原子烃基； 所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Ru、 Ri4的醚基中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代烷基为直链或支链； 所述取代烷基为 苄基、 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸酯 基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰卤基取代 1-20个 碳原子烷基、 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω- 磺酰氯基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基、 ω-羟基取代 1-20个碳 原子烷基、 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-巯基取代 1-20个碳原子烷基或 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基；其中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20 个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯 基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基； 所述的 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺基 为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的酰基为 2-6个碳原子烷基酰基、 叔丁氧羰 基、 苯甲酰基、 1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代苯基中取代基可以是苯环上任意位置； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Rn R14的取代苯基为低级烷基取代苯基、 低级取代 烷基苯基、 低级烷氧基取代苯基、 卤素取代苯基、 硝基取代苯基、 甲酸基取代苯基、 甲酸 盐基取代苯基、 甲酸酯基取代苯基、 甲酰胺基取代苯基、 甲酰^基取代苯基、 磺酸基取代 苯基、 磺酸盐基取代苯基、 磺酰氯基取代苯基、 羟基取代苯基、 氨基取代苯基、 胺基取代 苯基、 氰基取代苯基、 异氰酸酯基取代苯基或异硫氰酸酯基取代苯基； 其中所述的甲酸酯 基取代苯基中酯基为 2-20个碳原子烃基酯基、 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 N- 琥珀酰亚胺酯基;所述的甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40 个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述胺基取代苯基中的胺基为 NR7R8 ; 所述 R3、 F 、 R5、 、 RlQ、 Rl2、 Rl3的低级烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、异 丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基或己基； 所述 R3、 F 、 R5、 、 RlQ、 Rl2、 Rl3的低级烷氧基为甲氧基、 三氟甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 环丙氧基、 烯丙氧基、 丁氧基、 异丁氧基、 叔丁氧基、 戊氧基、 异戊 氧基、 新戊氧基、 叔戊氧基或己氧基； 所述 R3、 F 、 R5、 R6、 RIQ、 Ri2、 R13的卤素为氟、 氯、 溴或碘； 所述 Χ Θ为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。
4、 根据权利要求 1-3所述的化合物的用途， 其特征在于， 当 Υ为 0、 S或 NR„， Yi 为 0、 S或 NR14， Z为 NR7R8或 0R9; Ri R2、 R7、 R8、 R9、 Rn Ri4分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级 烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为氢、 低级烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、酰 基、 氰基或卤素； Χ Θ为阴离子时， 所述化合物对 R A染色成像。
5、 根据权利要求 1-3所述的化合物的用途， 其特征在于， 当 Υ为 0、 S或 NR„， Yi 为 0、 S或 NR14， Z为 NR7R8或 0R9; Ri R2、 R7、 Rs R9 Rii、 Ri4分别独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立的为氢、 低级 烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为苯基或取代苯基； Χ Θ为阴离子时， 所述化合物对 线粒体染色成像。
6、 具有结构通式 （I ) 所示结构的化合物：
Figure imgf000043_0001
( I ) , 式中 Y为 0、 S或 NRu， Y!为 0或 S， Z为 NR7R8或 0R9， X、 Ri~ R13同权利要求 1所述。 其中当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 Re、 Rio Ri2、 Ri3为氢， Z为羟基时， Ri、 R2不同 时为乙基； 当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 、 Rio Ri2、 Ri3为氢， Z为甲氧基时， 、 R2不同 时为甲基； 当 Y为 0， R3、 R4、 R5、 R6、 Rio Ri2、 R13为氢， Z为二甲胺基时， NR!R2不 为二甲胺基或哌啶基； 当 Y为 0， R3、 R5、 R6、 Rio Ri2、 Ri3为氢， R4为 2-羟基 -4二乙 胺基苯基， Z为二乙甲胺基时， NR!R2不为二乙胺基。
7、 根据权利要求 6所述的化合物， 其特征在于， 所述的 与 、 1^与 3、 R2与 R3、 R2与 R13、 R7与 Re、 R7与 R1()、 R8与 、 R8与 R1()、 R!与 R2或 R7与 R8可形成如下 Ia-In 结构：
Figure imgf000044_0001
la lb Ic Id
Figure imgf000044_0002
Ie 、 If 、 Ig Ih
Figure imgf000044_0003
、 II
Figure imgf000044_0004
其中， R为氢或者低级烷基； Y2为 0、 S或者 NRu。
8、 根据权利要求 6或 7所述的化合物， 其特征在于， 所述 、 R2、 R7、 R8、 R9、 Rn 的烃基为直链、 支链或环状烃基； 所述烃基为 1-20个碳原子烃基；
所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Rii的醚基中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代烷基为直链或支链； 所述取代烷基为苄基、 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-甲酰卤基取代 1-20个碳原子 烷基、 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-磺酰氯 基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基、 ω-羟基取代 1-20个碳原子烷 基、 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基、 ω-巯基取代 1-20个 碳原子烷基或 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基； 其中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳 原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基;所述的 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺基为 2-40 个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 的酰基为 2-6个碳原子烷基酰基、 叔丁氧羰基、 苯甲酰基、 1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代苯基中取代基可以是苯环上任意位置； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru的取代苯基为低级烷基取代苯基、 低级取代烷基 苯基、 低级烷氧基取代苯基、 卤素取代苯基、 硝基取代苯基、 甲酸基取代苯基、 甲酸盐基 取代苯基、 甲酸酯基取代苯基、 甲酰胺基取代苯基、 甲酰^基取代苯基、磺酸基取代苯基、 磺酸盐基取代苯基、 磺酰氯基取代苯基、 羟基取代苯基、 氨基取代苯基、 胺基取代苯基、 氰基取代苯基、 异氰酸酯基取代苯基或异硫氰酸酯基取代苯基； 其中所述的甲酸酯基取代 苯基中酯基为 2-20个碳原子烃基酯基、 2-20个碳原子取代烷基酯基、 苄酯基或 N-琥珀酰 亚胺酯基；所述的甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基、 2-40个碳 原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚胺基； 所述胺基取代苯基中的胺基为 NR7R8 ; 所述 R3、 F 、 R5、 、 RlQ、 Rl2、 Rl3的低级烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、异 丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基或己基； 所述 R3、 R4、 R5、 、 Rio Ri2 R13的低级烷氧基为甲氧基、 三氟甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 环丙氧基、 烯丙氧基、 丁氧基、 异丁氧基、 叔丁氧基、 戊氧基、 异戊 氧基、 新戊氧基、 叔戊氧基或己氧基； 所述 R3、 F 、 R5、 R6、 RIQ、 Ri2、 R13的卤素为氟、 氯、 溴或碘； 所述 Χ θ为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。
9、 根据权利要求 6-8所述的化合物， 其特征在于， 所述 、 R2、 R7、 R8、 R9、 Ru的 直链、 支链或环状的包含 1-20个碳原子的烃基为甲基、 三氟甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 环丙基、 烯丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 己基、 2-甲 基戊基、 环己基、 庚基、 2-甲基己基、 辛基、 2—甲基庚基、 壬基、 葵基、 十一烷基、 十二 烷基、 十三烷基、 十四烷基、 十五烷基、 十六烷基、 十七烷基或十八烷基；
所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 Rii中碳原子数为 4〜20， 氧原子数≤8的醚基为 CH2CH2OCH2CH3 、 CH2CH2OCH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)2CH2C¾ 、 CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH3 、
CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH2OH 、 CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH3 或
CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH2OH； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 ω-甲酸基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2 ) mCOOH， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酸盐基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCOOM, 其中 m为 1-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基中甲 酸酯基为甲酸 2-20个碳原子烃基酯基时，所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2 ) mCOO(CH2)nCH3、 ( CH2 ) mCOOC(CH3)3或 ( CH2 ) mCOOCH2CH=CH2， 其中 m为 1-18的 自然数， n为 0-18的自然数；
当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基中甲 酸酯基为甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基时， 所述 ω-甲酸酯基取代 1-20个碳原子烷基为 ( CH2 ) mCOO(CH2)„ CH2COOH 、 ( CH2 ) mCOO(CH2)„ CH2COOM 、 ( CH2 ) mCOO(CH2)nCH2S03H或（CH2 ) mCOO(CH2)nCH2S03M，其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18 的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 ω-甲酸苄酯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mCOOCH2C6H5， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酸 N-琥珀酰亚胺酯基取代 1-20个碳原子 院基为
Figure imgf000046_0001
其中 m为 1-18的自然数；
当所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中的甲酰 胺基为 2-40个碳原子烃基甲酰胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCONH(CH2)nCH3、 ( CH2) mCON[(CH2)nCH3]2， 其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18的自
当所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中的甲酰 胺基为 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mCONH(CH2)„ CH2COOH、 ( CH2 ) mCON[(CH2)„CH2COOH]2、 ( CH2 ) mCONH(CH2)„ CH2COOM、 ( CH2 ) mCON[(CH2)nCH2COOM]2、 ( CH2) mCONH(CH2)nCH2S03H、 ( CH2) mCON[(CH2)nCH2S03H]2、（CH2)mCONH(CH2)nCH2S03M或（CH2)mCON[(CH2)nCH2S03M]2， 其中 m为 1-18的自然数， n为 0-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子；
当所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基中甲酰胺 基为马来酰亚胺基时， ω-甲酰胺基取代 1-20个碳原子烷基为
Figure imgf000047_0001
其中 m为 1-18的自然数； 当所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-甲酰卤基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mCOCl， (CH2) mCOBr， 其中 m为 1-18的自然数；
所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 、 R9、 中的 ω-磺酸基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03H, 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-磺酸盐基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03M， 其中 m为 1-18的自然数， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R6、 R7、 R8中的 ω-磺酰氯基取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mS03Cl， 其中 m为 1-18的自然数；
所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-卤素取代 1-20个碳原子烷基为 （CH2) mF， (CH2) mCl， (CH2) mBr， (CH2) mI， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 Ri、 R2、 F 、 R7、 Rs R9、 R11中的 ω-羟基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mOH， 其中 m为 1-18; 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-氰基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mCN， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 ω-氨基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mNH2， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-巯基取代 1-20个碳原子烷基为（CH2) mSH， 其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 ω-马来酰亚胺取代 1-20个碳原子烷基为
Figure imgf000048_0001
其中 m为 1-18的自然数； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 2-6个碳原子烷基酰基为乙酰基、 丙酰基、 丁 酰基或叔丁酰基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中 1-6个碳原子取代苯甲酰基为甲基取代苯甲酰 基、 乙基取代苯甲酰基、 丙基取代苯甲酰基、 丁基取代苯甲酰基或叔丁基取代苯甲酰基； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中卤素取代苯甲酰基为氯取代苯甲酰基、 溴取代 苯甲酰基或碘取代苯甲酰基； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中低级烷基取代苯基为甲基取代苯基、 乙基取代 苯基、 丙基取代苯基、 异丙基取代苯基、 丁基取代苯基、 异丁基取代苯基、 戊基取代苯基、 叔丁基取代苯基或己基取代苯基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 的低级取代烷基苯基为 ω-甲酸基取代 1-6个碳原子 烷基苯基、 ω-甲酸盐基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-甲酸酯基取代 1-6个碳原子烷基苯 基、 ω-甲酰胺基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-甲酰^基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω- 磺酸基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-磺酸盐基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-磺酰氯基 取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-卤素取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-羟基取代 1-6个碳原 子烷基苯基、 ω-氰基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω-氨基取代 1-6个碳原子烷基苯基、 ω- 巯基取代 1-6个碳原子烷基苯基或 ω-马来酰亚胺取代 1-6个碳原子烷基苯基； 其中所述 ω- 甲酸酯基取代 1-6个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸 2-8个碳原子烃基酯基、 甲酸 2-8个碳 原子取代烷基酯基、 苄酯基或 Ν-琥珀酰亚胺酯基； 所述的 ω-甲酰胺基取代 1-8个碳原子烷 基中甲酰胺基为 2-20个碳原子烃基甲酰胺基、 2-20个碳原子取代烷基甲酰胺基或马来酰亚 胺基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中低级烷氧基取代苯基为甲氧基取代苯基、 乙氧 基取代苯基、 丙氧基取代苯基、 丁氧基取代苯基、 戊氧基取代苯基、 叔丁氧基取代苯基或 己氧基取代苯基； 所述 Ri、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中卤素取代苯基为氟取代苯基、 氯取代苯基、 溴 取代苯基或碘取代苯基； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的甲酸 2-20个碳原子烃基酯基取代苯基为 C6H4COO(CH2)nCH3或 C6H4COOCH2CH=CH2， 其中 n为 0-18; 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的甲酸 2-20个碳原子取代烷基酯基取代苯基为 C6H4COO(CH2)„ CH2COOH、 C6H4COO(CH2)„ CH2COOM、 C6H4COO(CH2)nCH2S03H或 C6H4COO(CH2)nCH2S03M， 其中 n为 0-18， M为平衡电荷的阳离子； 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 Ru中的 2-40个碳原子烃基甲酰胺基取代苯基为 C6H4CONH(CH2)nCH3或 C6H4CON[(CH2)nCH3]2， 其中 n为 0-18; 所述 、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的 2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基取代苯基为 C6H4CONH(CH2)n CH2COOH、 C6H4CON[(CH2)nCH2COOH]2、 C6H4CONH(CH2)n CH2COOM、 C6H4CON[(CH2)nCH2COOM]2、 C6H4CONH(CH2)n CH2S03H、 C6H4CON[(CH2)nCH2S03H]2、 C6H4CONH(CH2)„ CH2S03M C6H4CON[(CH2)n CH2S03M]2， 其中 n为 0-18， M为平衡电 荷的阳离子； 所述 R!、 R2、 R4、 R7、 R8、 R9、 中的胺基取代苯基为 C6H4NH(CH2)nCH3、 C6H4N[(CH2)nCH3]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2COOH 、 C6H4N[(CH2)nCH2COOH]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2COOM 、 C6H4N[(CH2)nCH2COOM]2 、 C6H4NH(CH2)nCH2S03H 、 C6H4N[(CH2)nCH2S03H]2 C6H4NH(CH2)nCH2S03M、 C6H4N[(CH2)nCH2S03M]2、 乙酰基胺基 取代苯基、 叔丁氧羰基胺基取代苯基、 苯甲酰基胺基取代苯基、 甲基取代苯甲酰基胺基取 代苯基、 乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、 氯取代苯甲酰基胺基取代苯基、 溴取代苯甲酰 基胺基取代苯基或马来酰亚胺基取代苯基， 其中 n为 0-18。
10、一种如权利要求 6-7所述的化合物的制备方法，其特征在于， 当所述结构通式（I ) 中 Y为 0、 S或 NRu， 丫1为0或 S， Z为 NR7R8或OR9; Ri R2、 R7、 R8 R9 Rii分别 独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立 的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为氢、 低级烃基、 醚基、 低级烷氧基、 取代烷基、 酰基或卤素； Χ Θ为阴离子时， 具体步骤如下：
将 1毫摩尔化合物 II与 1毫摩尔化合物 III混合在 5-20毫升溶剂中形成混合溶液， 加 入体积占混合溶液 0.01-1的浓酸， 在加热条件下反应 1-8小时， 冷却后再加入 0.01-1倍体 积的质量百分浓度为 70%的高氯酸， 然后慢慢滴加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析分离得产物 I； 所述的溶剂是甲醇、 乙醇或者乙酸； 所述的浓酸是浓硫酸、 浓盐酸 或者 70%高氯酸； 所述的加热温度为 60-150°C ; 所述化合物 Π和 III的结构式如下：
Figure imgf000050_0001
其中， X'为卤素； Y'为羟基、 巯基或者 NHR Yi Z、 Ri R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Rio Rii、 Ri2、 Ri3同权利要求 6所述。
11、 一种如权利要求 6-7所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 当所述结构通式（I ) 中 Y为 0、 S或 NRu， 丫1为0或 S， Z为 NR7R8或OR9; Ri R2、 R7、 R8 R9 Rii分别 独立的为氢、 烃基、 醚基、 取代烷基、 酰基或芳基； R3、 R5、 、 Rio Ri2 R13分别独立 的为氢、 低级烃基、 低级烷氧基、 氰基或卤素； R4为三氟甲基、 氰基、 苯基或取代苯基； Χ Θ为阴离子时， 具体步骤如下：
将物质的量为 1 : 1的化合物 IV与化合物 V与四氯乙烷混合； 所述化合物 IV与四氯乙 烷的比值为 Imo lOL; 分批加入五氧化二磷； 所述五氧化二磷与化合物 IV的物质的量的 比值为 5〜10: 1； 得到混合溶液； 在回流条件下反应 2-8小时， 冷却后加水， 萃取； 去除氯 仿相的溶剂， 将所得产物溶于乙醇或甲醇中， 加入质量百分浓度为 70%的高氯酸， 慢慢滴 加蒸馏水， 析出固体， 过滤、 真空干燥， 柱层析纯化分离得到产物 I： 所述乙醇和高氯酸 的体积比为 5:1 :
所述化合物 IV和 V的结构式如下：
Figure imgf000051_0001
i IV): ( V) 其中， Y'为羟基或巯基： Yi、 Z、 R] , R2、 R3、 R4、 Rs 、 Ri。、 Ru、 Ri2、 R13同权 利要求 6所述。
12、 如权利要求 6-9所述的化合物用于生物大分子的共价荧光标记的用途， 其中所述 生物大分子为核酸或蛋白。
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