JP2008511743A - オリゴマー合成のための高分子ビーズ - Google Patents

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Abstract

本発明は、オリゴマー合成に使用する固体サポート媒体、該媒体を製造する方法、および該媒体を使用する方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、(a)オレフィン単量体、架橋単量体、機能性単量体および開始剤を含む有機相を準備する方法と、(b)高分子ビーズを形成するために有効な時間、温度条件下において、有機相を水相と接触させる方法を含む。

Description

本発明は、オリゴマー合成に使用する固体サポート媒体、該媒体を製造する方法、および該媒体を使用する方法に関するものである。
固体合成は、核酸塩基含有高分子（例えばオリゴヌクレオチドおよびその類似物）や、アミノ酸含有高分子（例えばタンパク質、ペプチド、およびその類似物）などの様々な高分子化合物の調製に適用することができる。固体合成は、コンビナトリアル手法による化合物の調製にも適用することができる。
オリゴヌクレオチドは、各種生物学的および生化学的応用に使用されている。オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用のプライマーおよびプローブとして、標的の検証、創薬および薬剤開発で使用するアンチセンス剤として、リボザイムとして、アプタマーとして、および免疫システムの一般刺激因子として使用されている。オリゴヌクレオチドの使用が拡大するにつれて、より大きなサイズのバッチ、より多くの数の小サイズのバッチを生産する必要性が着実に増加している。更に、オリゴヌクレオチド合成コスト削減や、純度向上および、オリゴヌクレオチド生成物の歩留まり増加が重視されつつある。
オリゴヌクレオチド合成技術には数多くの革新技術が導入されている。該革新技術のなかには、卓越したオルトゴナルな保護基、活性剤、試薬、および合成条件の開発がある。オリゴヌクレオチド自体はさまざまな修飾や改良を行ってきた。該改良点のなかには、特定の標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させ、オリゴヌクレオチドの生体内での安定性を向上させ、オリゴヌクレチドの薬物動態（PK）および毒物学的（Tox）特性を高める化学的性質がある。該新規化学的性質は一般に、オリゴヌクレオチドの1つ以上の成分の化学的修飾を必要とする。
“オリゴヌクレオチド”の用語は、修飾オリゴヌクレオチドのみならず、天然オリゴヌクレオチドを含む化合物類を包含する。天然および修飾オリゴヌクレオチドは共に様々な状況で役立つことが実証されており、採用した特定の修飾を勘案するための適切な修飾を行って同様な方法により両オリゴヌクレオチドを作ることができる。天然オリゴヌクレオチド、すなわち短鎖DNAまたはRNAは、各々オリゴRNAおよびオリゴDNAと命名した以下の一般的化学式の1つとみなすことができる：
Figure 2008511743
ここで、mは1から約100までの整数であり、Bxは天然核酸塩基の1つである。
生理学的pHでは、オリゴヌクレオチドはアニオンとして生じ、中性pHではリン酸塩が容易に解離し、オリゴヌクレオチドは一般に、非晶質または結晶質のいずれでも、固相では塩として生じる。したがって、別段の変更がない限り、“オリゴヌクレオチド”の用語には、上記のアニオン、塩および遊離酸の各形態を含む。
本質的に、天然に生成するオリゴヌクレオチドは、以下のヌクレオチドにより表されるｍ個の単量体サブユニットのオリゴマーと考えることができる。
Figure 2008511743
ここで、各Bxは核酸塩基であり、最後の残基はヌクレオシド（すなわち、3‘リン酸基のないヌクレオチド）である。
上記の通り、親和性、安定性、PK、Tox、および他の特性を改善するために、オリゴヌクレオチドに対して各種の化学修飾をしてきた。一般に、技術上現在使用しているオリゴヌクレオチドの用語には、とりわけ以下の化学式の化合物を含む：
Figure 2008511743
ここで、ｍは1から約100までの整数、各G1はOまたはS、各G2はOHまたはSH、各G3はO、S、CH2、またはNH、各G5はO、S、CH2、CFH、CF2、-CH=CH-等のような2価の部分、各R2’はH、OH、O-rg、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基、またはR4’と共に架橋を形成し、各R3’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成し、各R4’はH、置換基、R2’と共に架橋を形成、R3’と共に架橋を形成、またはR5’と共に架橋を形成し、各qは0または1であり、各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成し、各G6はO、S、CH2、またはNHであり、および各G7はH、PO3H2、または接合基であり、各Bxは本書に述べるように核酸塩基（すなわち、天然または修飾）である。
オリゴヌクレオチドの標準的合成方法として、Caruthers（カルーサーズ）他が最初に述べた固相法が挙げられる（例えば、本書に参考として組み込んであるUSP5,750,666の、特に3-58コラム、オリゴヌクレオチドを作る出発物質および一般的方法、および特にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示していて、本書に参考として特別に組み込んである部分参照）。該方法は後にKoster（ケスター）他が改良した（例えば、USP RE 34,069の、特に開示してあるコラムで、参考として本書に特別に組み込んである部分参照）。該方法は、以下にさらに詳細に記述するように、さまざまな発明者によって更に改良されている。RNA合成方法は、特にUSP 6,111,086、6,008,400、および5,889,136（各々は本書に全文が組み込んである）に開示してある。特に関連しているのはUSP 6,008,400の7-20コラムであり、本書に参考として特別に組み込んである。
Koster他の方法によりオリゴヌクレオチドの一般的製造方法については以下のように記述することができる：
まず、適したヌクレオシドを、リンカーにより、固体サポート媒体（SS）に共有結合させて合成サポートを調製する。該合成サポートは以下の通りである：
Figure 2008511743
ここで、SSは固体サポート媒体、LLはヌクレオシドをG3を介してサポートと連結する連結基である。連結基は、一般に、合成中に最終3’-ヌクレオシド（したがって新生オリゴヌクレオチド）を固体サポート媒体と共有結合する二重官能基であるが、5’-保護基、および該当する場合にはすべての2’-保護基を外す条件とオルトゴナルな条件で開裂する。T’は着脱可能な保護基であり、残りの変数はすでに定義され、本書のなかでもっと詳しく記述する。適した合成サポートはPrimer Support 200TMという商標でアマーシャムバイオサイエンスから入手することができる。連結した合成サポートを有する固体サポート媒体は、例えばアセトニトリルなどの適した溶媒のなかで膨張させることができ、アマーシャムバイオサイエンスから入手可能なシンセサイザーの1つで、AKTAoligopilotTMまたはOligoProcessTMブランドのDNA/RNAシンセサイザーなどの適した固相合成機器のカラムに入れることができる。
上記の方法では、合成は、オリゴマーの3’-から5’-末端で行う。各サイクルでは、以下のステップを実行する：（1）T’の取外し、（2）カップリング、（3）酸化、（4）キャッピング。ステップ（1）−（4）の各々は、一般に1つ以上の洗浄ステップが続き、きれいな溶剤をカラムに入れて、カラムから可溶性物質を洗浄し、カラムに試薬および/または活性剤、または両方を押し入れる。ステップ（1）−（4）は以下のように表す：
Figure 2008511743
一般に、T’は、合成中に用いる他の保護基を外すために用いる条件と同様に、合成の終わりに固体サポート媒体からオリゴヌクレオチドを開裂するために用いる条件とオルトゴナルな条件下で外れるように選択される。オリゴヌクレオチド合成用の技術的に認められた保護基はDMT（4,4’-ジメトキシトリチル）である。DMT基は非常に有用であり、弱酸性条件下で取り外し可能である。したがって、許容できる取外し試薬は、アセトニトリルなどの適した溶剤中の3％DCAである。洗浄溶剤を使用する場合にはアセトニトリルが適切である。
サポートは、一般的に、制御細孔ガラスまたは高分子ビーズサポートである。幾つかの高分子サポートは以下の特許に開示されている：US 6,016,895、US 6,043,353、US 5,391,667およびUS 6,300,486、各々は参考のために本書に特別に組み込んである。
保護基T’を外した後の、合成サイクルの次のステップは、次のヌクレオシドシントンのカップリングである。これは、以下に示す活性剤の存在で、脱保護したサポート結合ヌクレオシドをヌクレオシドホスホロアミダイトと反応させて達成する。
Figure 2008511743
アミダイトは以下の構造を有する：
Figure 2008511743
ここで、pgはシアノエチル基などのリン保護基であり、NRN1RN2はジイソプロピルアミノなどのアミン離脱基である。アミダイトの製造に関する情報についてはKoster他（上記参照）参照。一般に使用する活性剤には、例えば、テトラゾール、ジシアノイミダゾール、またはピリジニウム塩などがある。他の適したアミダイト、およびアミダイトの製造方法は、以下の特許に公開してある：US 6,133,438、US 5,646,265、US 6,124,450、US 5,847,106、US 6,001,982、US 5,705,621、US 5,955,600、US 6,160,152、US 6,335,439、US 6,274,725、US 6,329,519、これらの特許の各々は、特にアミダイトの製造に関して、参考として特に本書に組み込んでいる。適した活性剤は、Caruther他の特許およびKoster他の特許に公開されている。特に適している活性剤は以下の特許に公開されている：US 6,031,092およびUS 6,476,216、各々は参考として特別に本書に組み込んである。
合成サイクルの次のステップは酸化であり、簡単に述べるとP(III)スピーシーズが適した酸化剤によりP(V)酸化状態に酸化される：
Figure 2008511743
ここでG1はOまたはSである。
酸化剤はG1を入れるための適した酸化剤である。G1が酸素の場合の適した酸化剤は、上記のCaruthers他の特許に公開されている。G2が硫黄の場合の酸化剤は、硫化剤(thiation剤)または硫黄トランスファー試薬とも言うことがある。適した硫化剤(thiation剤)には、いわゆるBeaucage試薬、3H-1,2-ベンゾチオール、二硫化フェニルアセチル（PADSとも言う；例えば、特許US 6,114,519および6,242,591参照、各々は参考として本書に組み入れてある）および二硫化チオウラム（例えば、N,N,N’,N’-テトタメチルチオウラム・ジスルフィド、USP 5,166,387により開示）がある。洗浄溶剤は、アセトニトリルなどの適した溶剤にすることができる。
酸化ステップの次にキャッピングステップがある。キャッピングステップについては本書に例証していないが、合成の重要なステップである。というのも、キャッピングステップは、ステップ1でカップリングを受けない遊離した5’-OH基が、以後の合成サイクルでカップリングされることを妨げるからである。適したキャッピング試薬についてはCaruthers他、Koster他、および本書に記述する他の特許で公開されている。適したキャッピング試薬には、無水酢酸とN-メチルイミダゾールの組合せがある。
合成サイクルのステップ（1）−（4）を（所望する場合には）n−1回繰り返して、サポート結合オリゴヌクレオチドを生成する：
Figure 2008511743
ここで各変数は本書に定義する通りである。
一般に、保護基pgは、上記のCaruthers他またはKoster他が記述した方法により外すことができる。pgがシアノエチル基である場合には、Koster他の方法、例えば塩基性溶液との反応などが、一般にリン保護基の取外しに適している。一部の場合では、N1-シアノエチル・チミジン基などの付加化合物の形成を避けることが望ましい。これらの場合には、USP 6,465,628（参考のために特に本書に組み込んである）に開示してあるトリエチルアミン（TEA）などの第3アミンを試薬のなかに含めることが望ましい。一般に、核酸塩基が保護されている場合には、塩基性条件のもとで脱保護される。脱保護されたオリゴヌクレオチドは、サポートからはがされて、以下の5’-保護オリゴヌクレオチドが得られる：
Figure 2008511743
次に、逆相液体クロマトグラフィーにより精製され、5’-末端を酢酸中で脱保護し、脱塩、凍結乾燥またはその他の方法で乾燥させ、必要になるまで不活性雰囲気のなかに保管することができる。G3H基は接合基で随意に誘導することができる。生成したオリゴヌクレオチドは以下の化学式を有するものとして可視化することができる：
Figure 2008511743
固相サポート媒体での合成が分かっている場合には、固体サポート媒体は特にローディング（固体サポート媒体1グラム当りの固体サポート媒体に結合した最初のヌクレオシドのmモル数で表すか、単にmモル/gで表す）、各種合成サイクル中の均一な膨潤特性、および合成中に製造した全長オリゴマーの品質などの特性に関して改良された特性を有する必要性がある。更に、該サポートは製造するのが容易べきである。本発明は、他の重要な末端のみならず、該重要な末端にも適用する。
幾つかの実施形態において、本発明は、有機相の準備および高分子ビーズを形成するために有効な時間、温度および圧力条件のもとで、該有機相を水相と接触させる方法を含む高分子ビーズを製造するための方法を規定する。
幾つかの実施形態では、有機相は、単量体、開始剤および有機溶剤を含み、水相は水および分散試薬を含む。好適な実施形態では、単量体は、オレフィン単量体、架橋単量体および機能性単量体を含む。他の好適な実施形態では、有機溶剤は1つ以上の液体炭化水素を含み、および/または5個から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。発明の別の好適な実施形態では、オレフィン単量体は、1つ以上のアリールビニル化合物を含み、スチレンおよび/またはエチルスチレンを含むことが好適である。別の好適な実施形態では、架橋単量体は、好適には芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、芳香族部分は5または6員の芳香族環、最も好適なものはジビニルベンゼンである。別の好適な実施形態では、機能性単量体は、保護官能基を有するオレフィン単量体であって、脱保護されると、酸または無水酸と反応してエステルまたはアミドを形成することができる官能基を生じるもの、または保護ヒドロキシル基を有するオレフィン単量体であって、アセトキシスチレンが好適である。別の好適な実施形態では、開始剤は安定化過酸化物またはアゾ化合物であって、最も好適なものは過酸化ベンゾイルである。別の好適な実施形態では、有機溶剤は、1つ以上の液体アルカン、ベンゼン、トルエン、キシレンおよび/または5個から12個の炭素原子を有するアルコールを含み、好適には有機溶剤が1つ以上のオクタンを含み、最も好適にはイソオクタン、および/または2-エチルヘキサノールを含む。別の好適な実施形態では、分散試薬が、ポリアルコール、好適にはポリビニルアルコールを含む。
本発明の幾つかの実施形態では、各種成分が以下の量で存在する。すなわち、単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約60％から約96％である。単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約3％から9.9％である。単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約1％から約20％である。有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントは約33％から約67％である。有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約33％から約67％である。有機溶剤のなかに存在する液体炭化水素の質量パーセントは約0％から約80％である。有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約20％から約100％である。および、水相に最初に存在する分散試薬の質量パーセントは約0.01％から約20％である。
他の好適な実施形態では、各種成分が以下の量で存在する。すなわち、単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約75％から約94％である。単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約4％から9.9％である。単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約2％から約10％である。有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントは約35％から約60％である。有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約40％から約65％である。有機溶剤のなかに存在する炭化水素の質量パーセントは約5％から約70％である。有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約30％から約95％である。
さらに他の好適な実施形態では、各種成分が以下の量で存在する。すなわち、単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約82％から約91.5％である。単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約5.5％から9.9％である。単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約3％から約8％である。有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントは約40％から約50％である。有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約50％から約60％である。有機溶剤のなかに存在する液体炭化水素の質量パーセントは約10％から約60％であり、有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約40％から約90％である。
本発明の幾つかの他の実施形態では、上記有機相の上記水相との接触は約25℃から約95℃の温度で行われ、さらに好適には約70℃から約85℃で行われ、最も好適には約75℃から約80℃で行われる。
本発明は予め定められた配列でポリヌクレオチドを合成するための方法も規定する。予め定められた配列は、架橋単量体を含む複数の単量体からできたポリスチレンサポートを用いて成るもので、上記の複数の単量体のなかに最初に存在する架橋単量体は質量で約3％から9.9％である。幾つかの好適な実施形態では、上記の複数の単量体のなかに最初に存在する架橋単量体は約5.5％から9.9％であり、最も好適には約7％である。他の好適な実施形態では、架橋単量体はジビニルベンゼンである。
本発明はさらに本書に述べるいずれかの方法により形成する高分子ビーズを規定する。幾つかの実施形態では、該ビーズは、ビーズ1グラムあたり約100μモルからビーズ1グラム当り約350μモルまでのローディング能力がある。幾つかの実施形態では、該ビーズは約5から約500μmまでの平均粒子サイズがあり、好適には約10から約300μmまでで、最も好適には約30から約150μmまでの平均粒子サイズがある。幾つかの実施形態では、該ビーズは約5から約500nmまでの平均細孔サイズがあり、好適には約10から約100nmまでで、最も好適には約20から約100nmまでの平均細孔サイズがある。幾つかの実施形態では、該ビーズは約5から約200m2/gまでの比表面積があり、好適には約10から約100 m2/gまでで、最も好適には約20から約70 m2/gまでの比表面積がある。
本発明は化学式Iまたは化学式IIの化合物も規定する：
Figure 2008511743
ここで：
G3はO、S、CH2またはNHであり;
G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-であり；
G6はO、S、CH2、またはNHである；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R3’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、R5’と共に架橋を形成する；
qは0または1である；
各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
Bxは核酸塩基である；
T’はHまたは着脱可能な保護基である；
LLは連結部分であり、および
SSは本書に述べる方法により製造したビーズである。
Figure 2008511743
ここで：
mは0から約100までの整数である；
各G1はOまたはSである；
各G2はOHまたはSHである；
各G3はO、S、CH2またはNHであり;
各G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-であり；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R3’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、R5’と共に架橋を形成する；
各qは0または1である；
各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各G6は、独立して、O、S、CH2またはNHである；
各Bxは核酸塩基である；
pgは着脱可能なリン保護基である；
T’は着脱可能な保護基である；
LLは連結部分であり、および
SSは本書に述べる方法により製造したビーズである。
他の実施形態では、本発明は、（a）オレフィン単量体、架橋単量体、機能性単量体および開始剤を含む有機相をもたらす方法と、（b）高分子ビーズを形成するために有効な時間、温度条件下において有機相を水相と接触させる方法とを含む高分子ビーズを作る方法を規定する。
幾つかの実施形態では、該水相は、水と分散試薬とを含み、分散試薬は、幾つかの実施形態では、ポリアルコール、例えばポリビニルアルコールを含む。
幾つかの実施形態では、該水相は、水と分散試薬とを含み、分散試薬は、幾つかの実施形態では、ポリアルコールを含み、有機相はさらに有機溶剤を含み、該有機溶剤は1つ以上の液体炭化水素および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。
幾つかの実施形態では、該オレフィン単量体は1つの非芳香族不飽和基を含む。さらに幾つかの実施形態では、オレフィン単量体はアリールビニル化合物、例えばスチレンなどである。
幾つかの実施形態では、該架橋単量体はオレフィン架橋単量体である。幾つかの実施形態では、該架橋単量体は2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体である。さらに幾つかの実施形態では、該架橋単量体は、芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環である。幾つかの実施形態では、架橋単量体はジビニルベンゼンである。
幾つかの実施形態では、機能性単量体は、保護官能基を有するオレフィン機能性単量体である。該保護官能基は、脱保護されると、エステルまたはアミドを形成するのに好適な酸または無水酸との反応に適した官能基を生じる。幾つかの実施形態では、機能性単量体は、保護ヒドロキシル基を有するオレフィン単量体である。幾つかの実施形態では、機能性単量体は1つ以上のプロパノイロキシスチレンまたはアセトキシスチレンであるが、アセトキシスチレンが最も好適である。
幾つかの実施形態では、該有機相はさらに有機溶剤を含み、該有機溶剤は、幾つかの実施形態では、1つ以上の液体炭化水素および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。幾つかの実施形態では、該有機溶剤は、1つ以上の液体炭化水素を含むが、例えば、1つ以上の液体アルカン、ベンゼン、トルエン、キシレンなどや、例えばオクタン、例えばイソオクタンおよび/または5から12個の炭素原子を有するアルコール、例えば2-エチルヘキサノールなどを含む。
幾つかの実施形態では、重合開始剤は安定化過酸化物、例えば過酸化ベンゾイルまたはアゾ化合物などである。
幾つかの実施形態では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物であり、該架橋単量体は2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体である。他の実施例では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物であり、該架橋単量体は芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環である。さらに他の実施形態では、該オレフィン単量体がスチレンであり、該架橋単量体はジビニルベンゼンである。幾つかの他の実施例では、該オレフィン単量体がアリールビニル化合物であり、該機能性単量体が保護官能基を有するオレフィン単量体である。該保護官能基は、脱保護されると、酸または無水酸と反応してエステルまたはアミドを形成することのできる官能基を生じる。
幾つかの実施形態では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物であり、該機能性単量体は保護水酸基を有するオレフィン単量体である。他の実施例では、該オレフィン単量体はスチレンまたはエチルスチレンであり、該機能性単量体はアセトキシスチレンである。さらに他の実施形態では、該架橋単量体は芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環であり、該機能性単量体は保護官能基を有するオレフィン単量体である。該保護官能基は、脱保護されると、酸または無水酸と反応してエステルまたはアミドを形成することのできる官能基を生じる。さらに他の実施形態では、該架橋単量体は芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環であり、該機能性単量体は保護水酸基を有するオレフィン単量体である。さらに他の実施形態では、該架橋単量体がジビニルベンゼンであり、該機能性単量体がアセトキシスチレンである。
幾つかの実施形態では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物であり、該架橋単量体は芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環であり、該機能性単量体は保護官能基を有するオレフィン単量体である。該保護官能基は、脱保護されると、酸または無水酸と反応してエステルまたはアミドを形成することのできる官能基を生じる。
他の実施形態では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物であり、該架橋単量体は芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり、該芳香族部分は5または6員の芳香族環であり、該機能性単量体は保護水酸基を有するオレフィン単量体である。
他の実施形態では、該オレフィン単量体がスチレンであり、該架橋単量体がジビニルベンゼンであり、該機能性単量体がアセトキシスチレンである。
上記の実施形態の各々の幾つかでは、該水相は水と分散試薬を含み、該分散試薬は幾つかの実施形態ではポリビニルアルコールを含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、上記接触はさらに該水相および有機相の撹拌を含み、例えば該水相と有機相をかき混ぜることにより行う。他の実施形態では、本発明の方法はさらに、ビーズ洗浄ステップを含む。幾つかの実施形態では、ビーズは1つ以上の洗浄溶剤で洗浄し、洗浄溶剤の少なくとも1つはアセトン、水またはメタノールを含む。
上記方法の幾つかの実施形態では、該ジビニルベンゼンは、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約3から約20％の量が該有機相に最初に存在する。または、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約4から約15％、または、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約5.5から約10％の量が存在する。
上記方法の幾つかの実施形態では、該アセトキシスチレンは、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約1から20％の量が該有機相に最初に存在する。または、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約2から約10％、または該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントで約3から約8％の量が存在する。
該水相が水と分散試薬とを含む幾つかの実施形態において、該有機相はさらに有機溶剤を含み、該有機溶剤は、1つ以上の液体炭化水素および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。幾つかのこのような実施形態では、該有機相に最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約33％から約67％であり、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントは約33％から約67％であり、該全単量体に最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約60％から約96％であり、該単量体に最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約3％から約20％であり、該単量体に最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約1％から約20％であり、該有機溶剤に存在する炭化水素の質量パーセントは約0％から約80％であり、該有機溶剤に最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約20％から約100％である。他のこのような実施形態では、該有機相に最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約40％から約65％であり、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントは約35％から約60％であり、該単量体に最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約75％から約94％であり、該全単量体に最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約4％から約15％であり、該全単量体に最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約3％から約8％であり、該有機溶剤に存在する炭化水素の質量パーセントは約5％から約70％であり、該有機溶剤に最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約30％から約95％である。さらに他のこのような実施形態では、該有機相に最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは約50％から約60％であり、該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントは約40％から約50％であり、該全単量体に最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントは約82％から約91.5％であり、該全単量体に最初に存在する架橋単量体の質量パーセントは約5.5％から約10％であり、該単量体に最初に存在する機能性単量体の質量パーセントは約3％から約8％であり、該有機溶剤に存在する炭化水素の質量パーセントは約10％から約60％であり、該有機溶剤に最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントは約40％から約90％である。該実施形態では、該分散試薬はポリビニルアルコールを含む。他の該実施形態では、該オレフィン単量体はスチレンまたはエチルスチレンであり、該架橋単量体はジビニルベンゼンであり、該機能性単量体はアセトキシスチレンであり、該炭化水素はイソオクタンであり、5から12個の炭素原子を有するアルコールは2-エチルヘキサノールである。幾つかの該実施形態では、該水相に最初に存在する該分散試薬の質量パーセントは約0.01％から約20％である。
本書に記述する該方法の幾つかの実施形態では、該有機相および水相は約25℃から約95℃の温度に加熱するか、または約40℃から約90℃、または約70℃から約85℃、または約75℃から約80℃に加熱する。
本発明はさらにサポート結合ヌクレオシドを製造する方法を規定し、（a）本発明の方法により製造される高分子ビーズを規定し、上記ビーズを随意に活性試薬と反応させて活性高分子ビーズを供給する方法と、（b）上記の随意に活性化させた高分子ビーズを少なくとも1つの連結試薬と反応させてサポート結合リンカーを有するビーズを製造する方法と、（c）上記サポート結合リンカーをヌクレオシドと連結させてサポート結合ヌクレオシドを形成する方法とを含む。
本発明はさらにサポート結合ヌクレオシドを製造する方法を規定し、（a）本発明の方法により製造される高分子ビーズを規定し、上記ビーズを随意に活性化試薬と反応させて活性化高分子ビーズを供給する方法と、（b）上記の随意に活性化させた高分子ビーズを、リンカーを有するヌクレオシドと反応させてサポート結合ヌクレオシドを作成する方法とを含む。
本発明はさらにオリゴヌクレオチドを製造する方法を規定し、以下より成る。すなわち、（a)本書に述べる発明のいずれかの上記方法により製造するサポート結合ヌクレオシドを供給する方法であって、上記サポート結合ヌクレオシドが少なくとも1つの保護水酸基を有するものであり、（b）サポート結合ヌクレオシドの水酸基を脱保護する方法と、（c）サポート結合ヌクレオシドを活性化保護ヌクレオシドと接触させて亜リン酸エステル中間体を製造する方法と、（d）亜リン酸エステル中間体を酸化剤と接触させてリン酸トリエステル中間体を製造する方法と、（e）反応しないヌクレオシドを随意にキャッピングする方法と、（f）ステップ（b）から（e）を少なくとも一回随意に繰り返す方法と、（g）固体サポートからオリゴヌクレオチドを開裂する方法とを含む。幾つかの該実施形態では、ステップ（b）の脱保護ステップは酸に不安定な保護基の除去を含む。
本発明はさらにオリゴヌクレオチドを製造する方法を規定し、以下より成る。すなわち、（a)本書に述べる発明のいずれかの上記方法により製造するサポート結合ヌクレオシドを提供する方法であって、上記サポート結合ヌクレオシドが少なくとも1つの保護水酸基を有するものであり、（b）サポート結合ヌクレオシドの水酸基を脱保護する方法と、（c）サポート結合ヌクレオシドを活性化保護ヌクレオシドと接触させて亜リン酸エステル中間体を製造する方法と、（d）亜リン酸エステル中間体を酸化剤と接触させてリン酸トリエステル中間体を製造する方法と、（e）反応しないヌクレオシドを随意にキャッピングする方法と、（f）ステップ（b）から（e）を少なくとも一回随意に繰り返す方法と、（g）固体サポートからオリゴヌクレオチドを開裂する方法とを含む。幾つかの該実施形態では、ステップ（b）の脱保護ステップは酸に不安定な保護基の除去を含む。
本発明はさらに化学式Iの化合物を規定する：
Figure 2008511743
ここでLLは連結部分、SSは本書に述べる本発明のビーズであり、他の構成変数は後述する通りである。幾つかの実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。他の実施形態では、1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
本発明はさらに化学式IIの化合物を規定する：
Figure 2008511743
ここで構成変数は後述する通りである。幾つかの実施形態では、各G3、G5およびG6はOである。他の該実施形態では、近接R2’基の1つの各対はHであり、各R3’および各R4’はHである。
本発明はさらに上記化学式Iの化合物の調製方法を規定し、該方法は以下から成る：a) 化学式IIIの化合物を供給するステップと：
Figure 2008511743
およびb)化学式Iの化合物を形成するために有効な条件下で、化学式IIIの化合物を、本書に述べるように本発明のビーズと反応させるステップとを含む。幾つかの実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。他の実施形態では、1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
本発明はさらに上記化学式Iの化合物の調製方法を規定し、該方法は以下から成る：a) 本書に述べるように本発明のビーズを供給するステップと：b)二官能性リンカーLLの一端をビーズの官能基に取り付けるステップと；c)二官能性リンカーLLの他端を化学式IVの化合物と反応させるステップとを含み：
Figure 2008511743
化学式Iの化合物を形成するための構成である。幾つかの実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。他の実施形態では、1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
本発明はさらに化学式IIの化合物の調製方法を規定する：
Figure 2008511743
ここでLLは連結部分、SSは本書に述べる本発明のビーズであり、他の構成変数は後述する通りであり、該方法は下記から成る：a)上記の通りに化学式Iの化合物を供給するステップであって、：
Figure 2008511743
ここでT’は着脱可能な保護基である；b)脱保護サポート結合ヌクレオシドを形成するために保護基T’を除去するステップと；c)（b）ステップの脱保護サポート結合ヌクレオシドを保護ヌクレオシドアミダイトまたは化学式Vと反応させるステップとを含む：
Figure 2008511743
ここで構成変数は後述する通りであり、化学式VIの亜リン酸化合物を形成するためのものである：
Figure 2008511743
d)化学式IIの化合物を形成するために化学式VIのリン酸塩を酸化または硫化させるステップで、mは1である；e)反応しなかったヌクレオシドを随意にキャッピングするステップ；およびf)（b）から（e）ステップを随意に1回以上繰り返す。幾つかの実施形態では、各G3、G5およびG6はOである。他の実施形態では、近接R2’基の1つの各対はHであり、各R3’およびR4’はHである。
上記の合成方法の幾つかの実施形態では、該方法はさらに、固体サポートから生成するオリゴヌクレオチドを開裂するステップを含む。
本発明はさらに、アミノ酸単量体を含むオリゴマーを調製する方法を規定し、該方法は以下のステップを含む：（a）高分子基材を提供するステップであって、上記高分子基材は化学式SS-LL-ZZを有していて、SSは本発明の高分子ビーズ、LLは任意のリンカー、ZZはアミノ酸のカルボキシル基またはアミノ基と固定連鎖を形成することのできる化学基であり；（b）カルボキシル基またはそのアミノ基のいずれかにおいて保護基を有する第一アミノ酸シントンを高分子基材と連結するステップ；（c）遊離アミノ基またはカルボキシル基を生成するために、連結した第一アミノ酸から保護基を取り外すステップ；および（d）遊離アミノ基またはカルボキシル基を第二アミノ酸シントンと反応させてペプチド鎖を形成するステップを含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに以下のステップを含む：（e）第二アミノ酸シントンから保護基を取り外して、上記ペプチド鎖において末端遊離アミノ基またはカルボキシル基を生成するステップ；および（f）上記ペプチド鎖における上記遊離アミノ基またはカルボキシル基をさらに保護されたアミノ酸シントンと反応させて、上記ペプチド鎖を長くするステップを含む。他の実施形態では、eおよびfステップを複数回行う。幾つかの実施形態ではさらに、上記ペプチド鎖を実質的減成することなく上記固定連鎖を開裂するステップを含む。幾つかの実施形態では、該アミノ酸シントンは当然アミノ酸を生成している。他の実施形態では、アミノ酸シントンはペプチド核酸シントンである。
本発明はさらに化学式Xの化合物を調製する方法を規定する：
Figure 2008511743
ここで構成変数は以下に定義する通りであり、該方法は以下のステップを含む：（a）高分子基材を提供するステップであって、上記高分子基材は化学式SS-LL-ZZを有していて、SSは請求項67の高分子ビーズ、LLはリンカー、ZZはアミノ酸と固定連鎖を形成することのできる化学基であり；（b）上記高分子基材を上記固定連鎖を通じて第一アミノ酸と連結するステップであって、上記第一アミノ酸シントンは化学式（XX）を有する；
Figure 2008511743
ここで、構成変数は以下に定義する通りである（c）上記アミノ保護基を上記の連結した第一アミノ酸から取り外して、遊離アミノ基を生成するステップ；および（d）遊離アミノ基を、化学式（XX）を有する第二アミノ酸と反応させてペプチド鎖を形成するステップを含む。幾つかの実施形態では、該工程はさらに以下のステップを含む：（e）上記第二アミノ酸から上記アミノ保護基を取り外して、上記ペプチド鎖において末端遊離アミノ基を生成するステップ；および（f）上記ペプチド鎖における上記遊離アミノ基を、化学式（XX）を有する他のアミノ酸と反応させて、上記ペプチド鎖を長くするステップを含む。幾つかの実施形態では、eおよびfステップを複数回行う。幾つかの他の実施形態では、該ペプチド鎖の該アミノ酸部分に残っている少なくとも1つの保護基を除去するステップを含む。幾つかの実施形態ではさらに、上記ペプチド鎖を実質的に減成することなく該固定連鎖を開裂するステップを含む。幾つかの実施形態では、上記固定連鎖を形成することができる化学基は、クロロ基、ブロモ基およびヨード基置換アルキル、アミノ基置換アルキル、アミノ基およびアリール基置換アルキル、アミノ基およびアルキルアリール基置換アルキル、水酸基置換アルキル、または実質的に上記ポリペプチドを減成することなく開裂することのできるスペーサー基を有する水酸基置換アルキルの誘導体である。幾つかの実施形態では、クロロ基置換アルキルはクロロメチルであり、アミノ基置換アルキルはアミノメチルであり、アミノ基およびアルキル基置換アリールはアミノベンジルであり、アミノ基およびアルキルアリール基置換アルキルは“アミノ-3-および”-アミノ-4-メチルベンジルから成る基から選択したものであり、水酸基置換アルキルはヒドロキシメチルである。幾つかの実施形態では、該化学基は、アミノ基置換アルキル、アミノおよびアリール基置換アルキル、およびアミノ基およびアルキルアリール基置換アルキルから選択したアミノ基を含む部分から誘導し、また該化学基には、4−（ハロアルキル）アリール低級アルカン酸、Boc-アミノアシル−4−（オキシメチル）アリール低級アルカン酸、N-Boc-p-アシルベンズヒドリルアミン、N-Boc-4’-（低級アルキル）-p-アシルベンズヒドリルアミン、N-Boc-4’-（低級アルコキシ）-p-アシルベンズヒドリルアミン、および4-ヒドロキシメチルフェノキシ低級アルカン酸から成る基から誘導したスペーサー基を含む。
幾つかの実施形態では、化合物Xは以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで、構成変数は以下に定義する通りである。
他の実施形態では、該化合物Xは以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで、構成変数は以下に定義する通りである。
幾つかの実施形態では、化学式（XX）を有する該アミノ酸は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで、構成変数は以下に定義する通りである。
他の実施形態では、化学式（XX）を有する該アミノ酸は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで、構成変数は以下に定義する通りである。
幾つかの実施形態では、本発明の高分子ビーズは、ビーズ1グラム当り少なくとも約50μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約100μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約150μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約200μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約250μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約300μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約350μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約400μモル；ビーズ1グラム当り少なくとも約450μモルのローディング能力を有する。幾つかの実施形態では、該ビーズは、ビーズ1グラム当り約100μモルからビーズ1グラム当り約350μモルのローディング能力を有する。
本発明のビーズの有利な点は、製造及びさまざまなリンカーやヌクレオシドとの使用が比較的に容易なことである。さらに、本発明のビーズは、さまざまな自動化固相合成機器において使用することができる。本発明のビーズは優れたローディング能力があり、サポートの1グラム当りの第一ヌクレオシド/オリゴヌクレオチドを100mモル以上含むことができる。本発明のビーズは、さまざまな合成試薬および溶剤との適合性、多様な合成溶液の全体に渡る一貫した膨潤性、好適なバックプレッシャープロファイル、ビーズおよび細孔サイズの卓越した均一性、および結果として生じた優れた合成（オリゴマー全体）性能などの卓越した物理的特性も有している。
本発明のビーズを作る方法は容易に実現され、拡張可能であり、卓越したコスト側面がある。さらに、上記した比較的容易な製造および使用に関する利点として、本発明のビーズは、サポートに共有結合したヌクレオシド、アミノ酸、またはいずれかの誘導体に用いることのできるさまざまなリンカーを使用するのに適している。さらに、本発明のビーズは、高品質（全長）オリゴヌクレオチドおよび他の種類の高分子を効率的に製造することができる。
本発明は、オリゴマー合成のための架橋、機能性高分子ビーズと、該ビーズ製造方法と、オリゴマー合成やサポート結合ヌクレオシドに該ビーズを使用する方法と、該ビーズを製造して使用する方法と、同様にサポート結合オリゴヌクレオチドおよびアミド連結オリゴマーと、該ビーズ、および本発明に従う高分子ビーズを使用して製造するオリゴヌクレオチドおよびアミド連結オリゴマーの使用方法とを規定する。
幾つかの実施形態では、該ビーズを以下の方法により製造する：（a）オレフィン単量体、架橋単量体、機能性単量体および開始剤を含む有機相を供給するステップと、（b）高分子ビーズを形成するために有効な時間および温度条件下において、有機相を水相と接触させるステップとを含む方法。
幾つかの実施形態では、本発明のビーズは架橋ポリオレフィンを含む。幾つかの好適実施形態では、本発明のビーズは架橋ポリスチレンを含む。本書に述べる本発明の方法に依れば、該ビーズは、所望特性を有するビーズを形成するために適した条件下においてオレフィンおよび架橋剤を含む組成のフリーラジカル反応により形成される。好適オレフィンはスチレンである。
水相は一般に水と分散試薬とを含み、安定なビーズの形成を促進するものと考えられている。該分散試薬は、1つの化合物、または分散剤の混合物にすることができる。幾つかの実施形態では、該分際試薬には、1つ以上のポリアルコール、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、カルシウムカーバイド、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、ベントナイトを含む。幾つかの好適実施形態では、分散試薬はポリビニルアルコールを含むかポリビニルアルコールから成る。幾つかの実施形態では、分散剤は、水相の質量の約0.01％から約20％、または約0.1％から約10％の量が水相中に存在する。
有機相には、オレフィン単量体、架橋単量体、機能性単量体、および開始剤を含む。幾つかの実施形態では、該有機相はさらに1つ以上の有機溶剤を含む。
幾つかの実施形態では、オレフィン単量体は、1つの非芳香族不飽和基、例えばビニル基を含む。該オレフィン単量体は、アリール部分、例えばフェニル基も含んでいることも好適である。したがって、幾つかの好適実施形態では、該オレフィン単量体はアリールビニル化合物である。特に好適な実施形態では、該オレフィン単量体はスチレンまたはエチルスチレンである。
該有機相には、1つ以上の架橋単量体、すなわち重合した鎖を架橋する二官能性化合物を含む。幾つかの実施形態では、該架橋単量体はビスオレフィン架橋単量体、すなわち離れた結合を形成することのできる少なくとも2つの炭素―炭素二重結合を含む分子である。幾つかの実施形態では、該オレフィン架橋単量体は2つの非共役ビニル基を有する。幾つかの実施形態では、該オレフィン架橋単量体は、芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有し、一部の実施形態では5または6員の芳香族環、例えばフェニル環である。ある好適実施形態では、架橋単量体は1,2-,1,3-、または1,4-ジビニルベンゼン、またはその1つ以上の混合物である。もっと好適には、該架橋単量体は1,3-または1,4-ジビニルベンゼンを含むか構成される。
本発明のビーズはさらに1つ以上の種類の官能基を含む。該官能基は1つ以上の機能性単量体によりもたらされる。機能性単量体はリンカー部分とまたは直接にヌクレオシド、アミノ酸と共有結合を形成することができる官能基、またはコンビナトリアル合成の核となる部分の官能基をもたらす重合体または好ましくは単量体である。特に好適な実施形態では、該官能基は-OHである。該官能基は、重合中にスチレンおよび/または架橋単量体と反応する機能性単量体によりもたらすことができる。幾つかの実施形態では、該機能性単量体は、官能基に共有結合した少なくとも1つのオレフィン基を有する。幾つかの好適な実施形態では、該機能性基はアシルオキシル基である。
特に好適な実施形態では、該機能性剤は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここでRFは置換または非置換C1-C10アルキルから選択した。
特に好適な機能性単量体は、アセトキシスチレン、プロパノイルオキシスチレンであるが、アセトキシスチレンが特に最も好適である。
幾つかの実施形態では、該官能基は1つ以上の保護基により保護される。該保護基はオリゴマー合成前に除去しなければならない。該官能基には、アシル基、例えばアセチル基、プロパノール基、ベンゾイル基などや、他の官能基保護基がある。したがって、本発明の実施形態には、保護したものおよび脱保護したもの両方の機能性、架橋ポリオレフィン重合体を含む。幾つかの実施形態では、該官能基は、脱保護されると、エステルまたはアミドを形成するために好適な、酸または無水酸と反応するのに適した官能基を生じる。
該有機相はさらに1つ以上の有機溶剤を含む。適した溶剤には、1つ以上の液体炭化水素および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。幾つかの実施形態では、該有機溶剤は、1つ以上の液体炭化水素、好適には1つ以上の液体アルカン、ベンゼン、トルエン、キシレン、例えば1つ以上のオクタンおよび/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含む。好適な実施形態では、該有機溶剤は、イソオクタンと2-エチルヘキサノールとを含む。
該有機相はさらに1つ以上の開始剤を含む。適した開始剤には、フリーラジカル重合反応を開始することのできる化合物、例えば安定な過酸化物またはアゾ化合物を含む。幾つかの好適な実施形態では、該開始剤は、過酸化ベンゾイル、過酸化ジラウロイル、1,1-ジ（t-ブチルペルオキシ）-2-メチルシクロヘキサン、過酸化ジ-t-ブチル、過酸化ジステアロイル、過酸化ジ-t-ヘキシル、過酸化t-ブチルクミル、1,1-ジ（t-ヘキシルペルオキシ）-3,3,5-トリメチルシクロヘキサン、1,1-ジ（t-ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、1,1,3,3-テトラメチルブチルペルオキシ-2-ヘキサン酸エチル、t-ヘキシルペルオキシ-2-ヘキサン酸エチル、2,2’-アゾビスイソブチロニトリル、2,2’-アゾビス-2-メチルブチロニトリル、または2,2’-アゾビス-2,4-ジメチルバレロニトリルから選択する。ある好適実施形態では、該開始剤は、過酸化ベンゾイルを含むか過酸化ベンゾイルから成る。
幾つかの好適な実施形態では、該オレフィン単量体はスチレンまたはエチルスチレンであり、該架橋単量体はジビニルベンゼンであり、該機能性単量体はアセトキシスチレンである。幾つかの該実施形態では、該有機溶剤はイソオクタンおよび2-エチルヘキサノールであり、該開始剤は過酸化ベンゾイルである。
本発明に記載のある好適な実施形態では、オリゴヌクレオチドの合成に適した機能性、架橋ポリスチレンビーズを製造する方法を提供し、該方法は以下のステップを含む。すなわち、（a）水とポリビニルアルコール（PVA）を混合して水溶液を作るステップ、（b）イソオクタンおよび2-エチルヘキサノール溶剤、スチレン単量体、ジビニルベンゼン架橋単量体、過酸化ベンゾイル開始剤およびアセトキシスチレン機能性単量体を混合して有機溶液を作るステップ、および（c）該水溶液と該有機溶液とを混合してオリゴヌクレオチドの合成に適した機能性、架橋ポリスチレンビーズを作るステップ。
本発明の方法の幾つかの実施形態に依ると、該有機相と水相との接触は、該2つの相の撹拌、例えばかき混ぜることなどによるものを含む。幾つかの実施形態では、該2つの相は、最大5時間、7時間、10時間、12時間または15時間かそれ以上にわたり撹拌する。一般に、該有機相と該水相の該混合物を一定速度でかき混ぜることは、所望ビーズサイズの分布をもたらすのに有益である。幾つかの好適な実施形態では、該混合物は、パドル、アンカーパドル、プロペラまたはディスクタービンによって、250 rpmで所望時間だけかき混ぜた。
一般に、該有機相および水相は、撹拌中に、約25℃から約95℃、約40℃から約90℃、約70℃から約85℃、または約75℃から約80℃の温度に加熱する。
該有機相と水相の反応後に、該ビーズは1つ以上の洗浄溶剤で洗浄することが望ましい。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの洗浄溶剤はアセトン、水またはメタノールである。洗浄は、固体サポート媒体の洗浄のための幾つかの手法のいずれかにより達成することができる。例えば、反応混合物を濾過してフィルター上のビーズを通して洗浄溶剤で洗浄することにより達成できる。幾つかの実施形態では、該ビーズは、所望サイズのビーズを収集するために、サイズごとに分離することができる。例えば、アセトンなどの適した溶剤の中でビーズを分散させて、懸濁液をふるいにかけることにより行う。該ビーズは、次に、例えば真空中などで、乾燥させることができる。
幾つかの好適な実施形態では、例えばジビニルベンゼンなどの架橋単量体は、最初は、該有機相のなかに最初に存在した全単量体の質量パーセントで約3％から約20％、約4％から約15％、または約5.5％から約10％の量で該有機相に存在する。
他の好適な実施形態では、架橋単量体、例えばジビニルベンゼンなどの、有機相に最初に存在する全単量体に対するモル比は、約1：27から約1：8、約1：25から約1：10または約1：20から約1：13の範囲にある。
幾つかの他の好適な実施形態では、例えばアセトキシスチレンなどの機能性単量体は、最初は、該有機相のなかに最初に存在した全単量体の質量パーセントで約1％から約20％、約2％から約10％、または約3％から約8％の量で該有機相に存在する。
幾つかの他の好適な実施形態では、機能性単量体、例えばアセトキシスチレンなどの、有機相に最初に存在する単量体に対するモル比は、約1：99から約1：10または約1：62から約1：18の範囲にある。幾つかの他の好適な実施形態では、モル比は約1：46から約1：21である。
幾つかの好適な実施形態では、該有機相はさらに有機溶剤を含み、該有機溶剤は1つ以上の液体炭化水素および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールを含み、イソオクタンおよび２−エチルヘキサノールが望ましい。さらに、該有機相に最初に存在する有機溶剤の質量パーセントは、約33％から約67％、または約40％から約65％、または約50％から約60％である。
該有機相に最初に存在する全単量体の質量パーセントは、約33％から約67％、または約35％から約60％、または約40％から約50％である。
全単量体に最初に存在するオレフィン単量体は、スチレンまたはエチルスチレンが望ましく、その質量パーセントは、約60％から約96％、または約75％から約94％、または約82％から約91.5％である。
全単量体に最初に存在する架橋単量体は、1つ以上のジビニルベンゼンが望ましく、その質量パーセントは、約3％から約20％、または約4％から約15％、または約5.5％から約10％である。
全単量体に最初に存在する機能性単量体は、アセトキシスチレンが望ましく、その質量パーセントは、約1％から約20％、または約2％から約10％、または約3％から約8％である。
該有機溶剤に存在する炭化水素は、イソオクタンが望ましく、その質量パーセントは、約0％から約80％、または約5％から約70％、または約10％から約60％である。および
該有機溶剤に最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールは、2-エチルヘキサノールが望ましく、その質量パーセントは、約20％から約100％、または約30％から約95％、または約40％から約90％である。
幾つかの該実施形態では、該水相は、水および分散試薬を含み、ポリビニルアルコールなどのポリアルコールが望ましく、該分散試薬は、該水相の質量の約0.01％から約20％、または約0.1％から約10％の量で、該水相に存在する。
本書の方法の幾つかの実施形態では、該水相の量と該有機相の量との比は、約2：3から約50：1、または約1：1から約20：1、または約3：2から約10：1である。
本発明は、（a）本発明の方法により製造する高分子ビーズを供給して、上記ビーズを活性試薬と随意に反応させて活性化高分子ビーズを供給するステップと、（b）該活性化高分子ビーズを少なくとも1つの架橋試薬と反応させてサポート結合リンカーを有するビーズを製造するステップと、（c）上記サポート結合リンカーをヌクレオシドと連結してサポート結合ヌクレオシドを形成するステップとを含むサポート結合ヌクレオシドを製造する方法も規定する。
さらなる実施形態では、（a）本発明の方法により製造する高分子ビーズを供給して、上記ビーズを活性試薬と随意に反応させて活性化高分子ビーズを供給するステップと、（b）上記活性化高分子ビーズを、リンカーを有するヌクレオシドと反応させてサポート結合ヌクレオシドを調製するステップとを含むサポート結合ヌクレオシドを製造する方法も規定する。
他の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドを製造する方法についても定め、（a）本発明の方法により製造するサポート結合ヌクレオチドを供給するステップと、（b）例えば酸に不安定な保護基を除去することにより、サポート結合ヌクレオシドのヒドロキシ基を脱保護するステップと、（c）該サポート結合ヌクレオシドを活性化保護ヌクレオシドと接触させて亜リン酸エステル中間体を製造するステップと、（d）該亜リン酸エステル中間体を酸化剤と接触させてリン酸トリエステル中間体を製造するステップと、（e）未反応ヌクレオシドを随意にキャッピングするステップと、（f）（b）から（e）ステップを少なくとも１回随意に繰り返すステップと、（g）オリゴヌクレオチドを固体サポートから開裂するステップとを含む。
幾つかの実施形態では、本発明は化学式Iの化合物を規定する：
Figure 2008511743
ここで：
G3はO、S、CH2、またはNHである；
G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-である；
G6はO、S、CH2、またはNHである；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する。
各R3’はH、置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基であり、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、またはR5’と共に架橋を形成する；
qは0または1である；
R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
Bxは核酸塩基である；
T’はHまたは着脱可能な保護基である；
LLは連結部分または単結合であり；および
SSは本書に述べる本発明のビーズである。
化学式Iの化合物の幾つかの好適な実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。化学式Iの化合物の幾つかの他の好適な実施形態では、少なくとも1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
化学式IIの化合物も本発明に従って規定されている：
Figure 2008511743
ここで：
mは0から約100の整数である；
各G1はOまたはSである；
各G2はOHまたはSHである；
各G3はO、S、CH2、またはNHである；
各G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-である；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する。
各R3’はH、置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基であり、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、またはR5’と共に架橋を形成する；
各qは0または1である；
各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各G6はそれぞれO、S、CH2またはNHである；
各Bxは核酸塩基である；
T’は着脱可能な保護基である；
LLは連結部分であり；および
SSは本書に述べる本発明のビーズである。
化学式IIの化合物の幾つかの好適な実施形態では、各G3、G5およびG6はOである。化学式IIの化合物の幾つかの他の好適な実施形態では、近接R2’基の各対の少なくとも1つはHであり、各R3’および各R4’はHである。
他の実施形態では、本発明は化学式Iの化合物の調製方法を規定している：
Figure 2008511743
ここで：
G3はO、S、CH2、またはNHである；
G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-である；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する。
各R3’はH、置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基であり、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、またはR5’と共に架橋を形成する；
qは0または1である；
R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
Bxは核酸塩基である；
pgは着脱可能なリン保護基である；
T’は着脱可能な保護基である；
LLは連結部分または単結合であり；および
SSは本書に述べる本発明のビーズである。
該方法は以下のステップを含む：
a)化学式IIIの化合物を供給するステップ：
Figure 2008511743
および；
b)化学式Iの化合物を形成するために有効な状態下で、化学式IIIの化合物を本発明のビーズと反応させるステップ。該方法の幾つかの実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。幾つかの他の実施形態では、少なくとも1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
他の実施形態では、本発明は、化学式Iの化合物の調製方法を規定する：
Figure 2008511743
ここで：
G3はO、S、またはNHである；
G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-である；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する。
各R3’はH、置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基であり、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、またはR5’と共に架橋を形成する；
qは0または1である；
R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
Bxは核酸塩基である；
T’は着脱可能な保護基である；
LLは連結部分であり；および
SSは本書に述べる本発明のビーズである。
該方法は以下のステップを含む：
a)本発明のビーズを供給するステップ；
b)二官能性リンカーLLの一端をビーズの官能基と連結するステップ；および
c)二官能性リンカーLLの他端を化学式IVの化合物と反応させるステップであり：
Figure 2008511743
化学式Iの化合物を形成するためのステップ。いくつかの実施形態では、G3、G5およびG6は各々Oである。他の実施形態では、少なくとも1つのR2’はHであり、R3’およびR4’は各々Hである。
化学式IIの化合物の調製方法も、本発明に従って規定されている：
Figure 2008511743
ここで：
mは1から約100の整数である；
各G1はOまたはSである；
各G2はOHまたはSHである；
各G3はO、S、CH2、またはNHである；
各G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-である；
各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する。
各R3’はH、置換基であり、またはR4’と共に架橋を形成する；
各R4’はH、置換基であり、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、またはR5’と共に架橋を形成する；
各qは0または1である；
各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
各G6はそれぞれO、S、CH2またはNHである；
各Bxは核酸塩基である；
T’はHまたは着脱可能な保護基である；
LLは連結部分または単結合であり；および
SSは本書に述べる本発明のビーズである；該方法は以下のステップを含む：
a)化学式Iの化合物を供給するステップ：
Figure 2008511743
ここでT’は着脱可能な保護基である；
b)該保護基T’を除去して脱保護サポート結合ヌクレオシドを形成するステップ；
c)ステップ（b）の脱保護サポート結合ヌクレオシドを、保護ヌクレオシドアミダイトと反応させるステップ、または化学式V：
Figure 2008511743
ここで、RN1およびRN2は、1から6個の炭素原子を有するアルキルであり、化学式VIの亜リン酸塩化合物を形成する：
Figure 2008511743
d)化学式VIのリン酸塩を酸化または硫化して、化学式IIの化合物を形成するステップで、mは1である；
e)未反応ヌクレオシドを随意にキャッピングするステップ；および
f)ステップ(b)から（c)を1回以上随意に繰り返すステップ。
幾つかの実施形態では、各G3、G5およびG6はOである。他の実施形態では、近接R2’基の各対のうちの少なくとも1つはHであり、各R3’および各R4’はHである。幾つかのほかの実施様態では、該方法に、固体サポートから生成オリゴヌクレオチドを開裂するステップをさらに含む。
本発明の高分子ビーズは、例えばたんぱく質、ペプチド、およびその類似物などのアミド結合オリゴマーや、ペプチド核酸などのアミド結合核酸塩基または核酸塩基類似物を有するオリゴマーの調製にも有効である。本書に使用しているように、“アミノ酸”の用語は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する種類の単量体のことを言う。したがって、“アミノ酸”には、ペプチドやタンパク質で生じるような天然に存在するα-アミノ酸、その類似物、γ-アミノ酪酸などの、他の天然に存在するアミノ酸、およびオリゴマー化合物を調製することのできる他の天然に存在しないアミノ酸がある。したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、アミノ酸単量体を含むオリゴマーを調製するための方法を規定し、該方法は以下のステップを含む：
（a）高分子基材を準備するステップであって、該高分子基材はSS-LL-ZZの化学式を有し、SSは本発明の高分子ビーズであり、LLはオプションのリンカーであり、ZZはアミノ酸のカルボキシル基またはアミノ基との固定連鎖を形成することのできる化学基である；
（b）第一アミノ酸シントンを、アミノ酸のカルボキシル基またはアミノ基を介して、上記基材と連結するステップであって、上記シントンは未連結カルボキシル基またはそのアミノ基において保護基を有する；
（c）連結した第一アミノ酸から保護基を除去して、遊離アミノ基またはカルボキシル基を生成するステップ；および
（d）遊離アミノ基またはカルボキシル基を第二アミノ酸シントンと反応させてペプチド鎖を形成するステップ。他の実施形態では、該方法はさらに以下のステップを含む：
（e）保護基を該第二アミノ酸シントンから除去して、上記ペプチド鎖で末端遊離アミノ基またはカルボキシル基を生成するステップ；および
（f）上記ペプチド鎖の上記遊離アミノ基またはカルボキシル基を、他の保護アミノ酸シントンと反応させて、上記ペプチド鎖を長くするステップ。
より長い種類を所望する幾つかの実施形態では、ステップeおよびfを複数回行う。所望する配列に達したならば、該合成した鎖を実質的に劣化させることなく、該固定連鎖を開裂する。
幾つかの好適な実施形態では、該アミノ酸シントンは天然アミノ酸、その類似物、またはペプチド核酸を生じる。
幾つかの他の実施形態では、本発明は、化学式Xの化合物を調製する方法を規定する：
Figure 2008511743
ここで：
nは少なくとも2であり、
L1-Lnの各々は、水素、ヒドロキシ、（C1-C4）アルカノイル、天然生成核酸塩基、非天然生成核酸塩基、芳香族部分、DNAインターカレーター、非核酸塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドから成る基から独自に選択し、L1-Lnのうちの少なくとも1つは、天然生成核酸塩基、非天然生成核酸塩基、DNAインターカレーター、または核酸塩基結合基である；
C1-Cnの各々は（CR6R7)yであり、R6は水素で、R7は天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から選択し、またはR6およびR7は水素、（C2-C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1-C6）アルコキシ、（C1-C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5から成る基から独自に選択し、ここでR3およびR4は上記した通りであり、R5は水素、（C1-C6）アルキル、ヒドロキシ-、アルコキシ-、またはアルキルチオ-置換（C1-C6）アルキル、またはR6およびR7は合わせて脂環式または複素環系を構成している；
D1-Dnの各々は（CR6R7)zであり、R6およびR7は上記に定義した通りである；
yおよびzの各々はゼロまたは1から10の整数で、y+zの和は2よりも大きいが多くとも10である；
G1-Gn-1の各々は、いずれかの配向において-NR3CO-、-NR3CS-、-NR3SO-または-NR3SO2-であり、R3は上記に定義した通りである；
A1-AnおよびB1-Bnの各々は以下のように選択する：
（a’）Aは化学式（IIa）、（IIb）または（IIc）の基であり、BはNまたはR3N+であるが、少なくとも1つのAは化学式（IIc）の基という前提である；または
（b’）Aは化学式（IId）の基であり、BはCHである；または
（c’）Aは化学式（IIa）または（IIb）の基であり、BはNまたはR3N+であるが、少なくとも1つのyまたはzは1または2ではない；
Figure 2008511743

Figure 2008511743
ここで：
XはO、S、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2である；
Yは単結合、O、SまたはNR4である；
pおよびqの各々はゼロまたは1から5の整数であり、和p+qは多くて10である；
rおよびsの各々はゼロまたは1から5の整数であり、和r+sは多くて10である；
各R1およびR2は、水素、(C1-C4)アルキル（ヒドロキシまたはアルコキシまたはアルキルチオ置換にすることができる）、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから成る基から独自に選択したもの；および
各R3およびR4は、水素、(C1-C4)アルキル、ヒドロキシ-またはアルコキシ-またはアルキルチオ-置換(C1-C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノから成る基から独自に選択したもの；
Qは-CO2H、-CONR’R”、-SO3Hまたは-SO2NR’R”または-CO2Hや-SO3Hの活性化誘導体である；および
Iは-NHR’’’R’’’’または-NR’’’C(O)R’’’’であり、R’、R’’、R’’’およびR’’’’は、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガント、インターカレーター、キレート剤、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドおよび可溶性および非可溶性ポリマーから成る基から独自に選択した；
該方法は以下のステップを含む：
（a）高分子基材を供給するステップであって、該高分子基材は化学式SS-LL-ZZを有し、SSは本書に述べる本発明の高分子ビーズであり、LLはリンカーであり、ZZはアミノ酸との固定連鎖を形成することのできる化学基である；
（b）上記高分子基材を上記固定連鎖を通して第一アミノ酸と結合するステップであって、上記第一アミノ酸は化学式（XX）を有する：
Figure 2008511743
ここで：
Lは、天然生成核酸塩基、非天然生成核酸塩基、芳香族部分、DNAインターカレーター、核酸塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドから成る基から選択し、アミノ基はアミノ保護基により随意に保護する；
各Cは（CR6R7)yであり、R6は水素で、R7は天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から選択し、またはR6およびR7は水素、（C2-C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1-C6）アルコキシ、（C1-C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5から成る基から独自に選択し、ここでR3およびR4は上記した通りであり、R5は水素、（C1-C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、またはアルキルチオ置換（C1-C6）アルキル、またはR6およびR7は合わせて脂環式または複素環系を構成している；
各Dは（CR6R7)zであり、R6およびR7は上記に定義した通りである；
yおよびzの各々はゼロまたは1から10の整数で、y+zの和は2よりも大きいが多くとも10である；
AおよびBは以下のように選択する：
（a’）Aは化学式（IIc）の基であり、BはNまたはR3N+である；または
（b’）Aは化学式（IId）の基であり、BはCHである；または
（c’） Aは化学式（IIa）または（IIb）の基であり、BはNまたはR3N+であるが、yまたはzの少なくとも1つは1または2ではない；
Figure 2008511743
Figure 2008511743
ここで：
XはO、S、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2である；
Yは単結合、O、SまたはNR4である；
pおよびqの各々はゼロまたは1から5の整数であり、和p+qは多くて10である；
rおよびsの各々はゼロまたは1から5の整数であり、和r+sは多くて10である；
各R1およびR2は、水素、(C1-C4)アルキル（ヒドロキシ-またはアルコキシ-またはアルキルチオ-置換にすることができる）、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから成る基から独自に選択したもの；および
各R3およびR4は、水素、(C1-C4)アルキル、ヒドロキシ-またはアルコキシ-またはアルキルチオ-置換(C1-C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノから成る基から独自に選択したもの；
各EはCOOH、CSOH、SOOH、SO2OHまたはその活性化または保護誘導体である；および
各Fは、NHR3またはNPgR3であり、R3は上記に定義した通りであり、Pgはアミノ保護基である；
（c）上記の連結した第一アミノ酸から上記アミノ保護基を除去して、遊離アミノ基を生成するステップ；および
（d）上記の遊離アミノ基を、化学式（XX）を有する第二アミノ酸と反応させてペプチド鎖を形成するステップ。幾つかの実施形態では、該方法はさらに以下のステップを含む：
（e）上記のアミノ保護基を該第二アミノ酸から除去して、上記ペプチド鎖で末端遊離アミノ基を生成するステップ；および
（f）上記ペプチド鎖の上記遊離アミノ基を、化学式（XX）を有する他のアミノ酸と反応させて、上記ペプチド鎖を長くするステップ。幾つかの実施形態では、ステップeおよびfを複数回行う。
幾つかの他の実施形態には、さらに、該ペプチド鎖の該アミノ酸部分に残っている少なくとも1つの保護基を除去するステップを含む。所望シーケンスの合成が完了したときに、上記の合成した鎖を実質的に劣化させることなく、該固定連鎖を該サポートから開裂することが好適である。
上記方法の幾つかの実施形態では、上記固定連鎖を形成することのできる化学基は、クロロ-、ブロモ-およびヨード-置換アルキル、アミノ置換アルキル、アミノおよびアリール置換アルキル、アミノおよびアルキルアリール置換アルキル、ヒドロキシ置換アルキル、または上記ポリペプチドを劣化することなく実質的に開裂することのできるスペーサー基を有する上記の誘導体である。幾つかの実施形態では、クロロ置換アルキルはクロロメチルであり、アミノ置換アルキルはアミノメチルであり、アミノおよびアルキル置換アリールはαアミノベンジルであり、アミノおよびアルキルアリール置換アルキルはαアミノ-3-およびαアミノ-4-メチルベンジルから成る基から選択し、ヒドロキシ置換アルキルはヒドロキシメチルである。幾つかの他の実施形態では、該化学基は、アミノ置換アルキル、アミノおよびアリール置換アルキル、およびアミノおよびアルキルアリール置換アルキルから選択したアミノ含有部分から誘導する。さらに、該化学基には、4-(ハロアルキル)アリール低級アルカン酸、Boc-アミノアシル−4−（オキシメチル）アリール低級アルカン酸、N-Boc-p-アシルベンズヒドリルアミン、N-Boc-4’-（低級アルキル）-p-アシルベンズヒドリルアミン、N-Boc-4’-（低級アルコキシ）-p-アシルベンズヒドリルアミン、および4-ヒドロキシメチルフェノキシ低級アルカン酸から成る基から誘導したスペーサー基を含む。
幾つかの実施形態では、該化合物Xは以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで：
各Lは、水素、フェニル、複素環部分、天然生成核酸塩基、および非天然生成核酸塩基から成る基から独自に選択する；
各R7’は、水素および天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から独自に選択する；
nは1から60の整数であり、
各k、l、およびmは、独自に、ゼロまたは1から5の整数である；
各pはゼロまたは1である：
RhはOH、NH2または-NHLysNH2である；および
RiはHまたはCOCH3である。
他の実施形態では、該化合物Xは以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで：
各Lは、水素、フェニル、複素環部分、天然生成核酸塩基、および非天然生成核酸塩基から成る基から独自に選択する；
各R7’は、水素および天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から独自に選択する；
nは1から60の整数であり、
各k、l、およびmは、独自に、ゼロまたは1から5の整数である；
各pはゼロまたは1である：
RhはOH、NH2または-NHLysNH2である；および
RiはHまたはCOCH3である。
他の実施形態では、化学式（XX）を有する上記アミノ酸は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで：
各Lは、水素、フェニル、複素環部分、天然生成核酸塩基、および非天然生成核酸塩基から成る基から独自に選択する；
各R7’は、水素および天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から独自に選択する；
各k、l、およびmは、独自に、ゼロまたは1から5の整数である；
さらに他の実施形態では、化学式（XX）を有する上記アミノ酸は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで：
各Lは、水素、フェニル、複素環部分、天然生成核酸塩基、および非天然生成核酸塩基から成る基から独自に選択する；
各R7’は、水素および天然生成αアミノ酸の側鎖から成る基から独自に選択する；
各k、l、およびmは、独自に、ゼロまたは1から5の整数である；
ある実施形態では、本発明は、ビーズのサイズ分布、細孔の大きさ、密度、膨潤性の優れた均一性および/またはオリゴマー合成において一般に使用する溶剤および試薬に対する耐性などの優れた特性を有する架橋、機能性ポリスチレンビーズを規定する。幾つかの好適な実施形態では、該ビーズは優れたローディング特性を有する。幾つかの好適な実施形態では、該ビーズは、ビーズ1グラム当り約50μモル；ビーズ1グラム当り約100μモル；ビーズ1グラム当り約150μモル；ビーズ1グラム当り約200μモル；ビーズ1グラム当り約250μモル；ビーズ1グラム当り約300μモル；ビーズ1グラム当り約350μモル；ビーズ1グラム当り約400μモル；またはビーズ1グラム当り約450μモルのローディング能力を有する。幾つかの実施形態では、該ビーズは、ビーズ1グラム当り約100μモルから約350μモルのローディング能力を有する。
幾つかの実施形態では、本発明のビーズは、約1μmから約1000μmの範囲の平均粒子サイズを有する。好適な実施形態では、本発明のビーズは、約5μmから約500μmの範囲の平均粒子サイズを有する。特に好適な実施形態では、本発明のビーズは、約10μmから約300μmの範囲の平均粒子サイズを有する。
本発明の高分子ビーズサポートは、コンビナトリアル法により合成する非常にさまざまな単量体およびオリゴマー分子のどれでも調製に適している。コンビナトリアルライブラリーそれ自体が役に立つこと、および該ライブラリーとそれを構成する化合物に大きな商業的重要性のあることは現在広く正当に評価されている。実際、化学の1つの部門が育成され、コンビナトリアルライブラリーの多くの商業的側面を活用している。各古典的コンビナトリアルアプローチの利点を最大限にするために、コンビナトリアル解析の新戦略が幾つかのグループにより独自に開発されている。ペプチド（Geysen他、J. Immun. Meth.、1987、102,259；Houghten他、Nature、1991、354,84；Owens他、Biochem. Biophys. Res. Commun.、1991、181,402；Doyle, PCT WO 94/28424; Brennan, PCT WO 94/27719）;核酸（Wyatt他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1994、91,1356；Ecker他、Nucleic Acids Res.、1993、21,1853）；非ペプチドおよび小さい分子（Simon他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1992、89,9367；Zuckermann他、J. Am. Chem. Soc.、1992、114,10646；Bartlett他、WO 91/19735; Ohlmeyer他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1993、90,10922；DeWitt他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1993、90,6909；Cody他、USP5,324,483；Houghten他、PCT WO 94/26775; Ellman、USP 5,288,514; Still他、WO 94/08051; Kauffman他、PCT WO 94/24314; Carell他、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、1994、33,2059；Carell他、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、1994、33,2061；Lebl他、WO 94/28028）のライブラリーで選択手法を用いている。上記の各々をそのまま参考として本書に組み込んだ。上記参考を精査すると、当該手法のなかで最も先端的なものは、ペプチドおよび核酸の選択手法である。
今日までに報告された手法の大多数は、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどのオリゴマーのますます簡略化されたサブセットの反復合成およびスクリーニングに関連している。利用されている単量体またはサブモノマーには、アミノ酸、アミノ酸様の分子、すなわちカルバメート前駆物質、およびヌクレオチド（両方とも二官能性）などがある。これらの手法やライブラリーの利用は、セルベースドアッセイでの活性、または精製タンパク質標的の結合および/または抑制を分析している。
幾つかのコンビナトリアルアプローチは、多数の多様性部位を有し、かつ、さまざまな小さな分子の化合物のライブラリーを形成するために、該部位をさまざまなビルディングブロックで誘導した多官能性骨格を利用する。各個々の化合物を別々に合成して単離するか、または幾つかの望ましい化合物の混合物として合成して使用することができるようなライブラリーを作成することができる。化合物の混合物は、骨格および/またはビルディングブロックの混合物を用いて得ることができる。
コンビナトリアルライブラリーの多様性は、使用する各骨格およびビルディングブロックの固有の物理的および化学的特性、各誘導ステップ中に使用するさまざまなビルディングブロックの数、誘導作用から生じる化学結合の物理的および化学的特性、および該骨格およびビルディングブロックの作用の相互影響により表される。これらの相互作用が一緒になって、コンビナトリアルライブラリーの各個々の化合物に独特の形態をもたらす。
本発明の高分子ビーズサポートは、該コンビナトリアル方法により合成するすべての非常にさまざまな単量体およびオリゴマー分子の調製に適している。これらには、従来の小さい分子の薬物、およびオリゴマーペプチド模倣物、ペプトイド、およびヌクレオチドなどの大きな種とともに、他の事前有機性または剛骨格から誘導したオリゴマー分子を含む。
例えば、酸、アミンおよびアミノ酸は、さまざまな官能基とのその反応性および商用供給元からの非常に多くの多様な構造の該化合物を入手できるという点により、コンビナトリアルケミストリーにおいて驚異的効用のあることが認められているビルディングブロックの部類である。例えばアミノ酸は、小分子コンビナトリアルライブラリーの合成において広範囲にわたって使用されている。置換複素環ライブラリーの構成における重要なビルディングブロックとしてのアミノ酸の使用は、環状尿素および‘有望ライブラリー’における既知活性基を探求するための幾つかのグループにより実践されている（BuninおよびEllman、J. Am. Chem. Soc.、1992、114,10997；Dewitt他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1993、90,6909；Nefzi他、Tetrahedron Lett.、1997、38,931；Bartlett他、Book of Abstracts、第213回米国化学会学会、サンフランシスコ、1997、米国化学会、ワシントンD.C.、ORGN-273）。
幾つかのコンビナトリアル手順では、該骨格は複数のマスクをした（すなわち、保護した）官能基（多様性部位）を有する。本質的に保護および脱保護方式はオルトゴナルである。すなわち他のいかなるマスキング基の完全な状態に影響を及ぼすことなく選択的に脱保護するというようなやり方においては、多様性部位はすべて保護またはマスクされる。これは、オリゴマーまたは単量体化合物の合成中に該骨格を結合するか構成しているので、個々の多様性部位の選択的機能性が考慮してある。その代わりに、所望する場合には、多数の多様性部位の同時反応も考慮してある。
多様性部位は、多様なビルディングブロックと組み合わせることができる。組合せに利用できる部位には、反応性アミノ基およびヒドロキシ基がある。多様性部位における骨格の誘導は、カルボン酸、酸ハロゲン化物、無水物、スルホン酸、ハロゲン化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、ケトン、アルデヒド、アミン、およびアミノ酸などであるが、これらの限定されないさまざまなビルディングブロックを用いて達成される。
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の固体サポートに結合された単環式または二環式骨格への官能基の付加を規定する。コンビナトリアルライブラリーの作成は、固体サポートに直接、または合成条件に安定したリンカーを介して、結合した単環式または二環式骨格から始めるが、該骨格は、合成終了時に化合物を溶液中に放出するために開烈することができる。好適リンカーには、エステルがあり、特にコハク酸から誘導したエステルを含む。また、該骨格は、DMT、エチレングリコールまたは同様なジオールなどの、該サポートに結合した固定部分に連結することができる。
該骨格は、均一、または構造的に多様な組の単環および/または二環系にすることができる。該単環および/または二環系は、官能基およびペンダント、多様な置換基のさまざまな相対的配向をもたらす。他のコンビナトリアル部位は、所望する場合にはビルディングブロックと選択的に反応することのできる保護ヒドロキシまたはアミノ基または他のマスクした官能基の形をして、該骨格上に存在することがある。
該コンビナトリアルライブラリーで使用する該骨格およびビルディングブロックは、さまざまな官能基を有していて、該さまざまな官能基は、生成するライブラリー要素にさまざまな特性（“多様性”）をもたらす。該官能基には、水素結合ドナーおよびアクセプタ、イオン部分、極性部分、疎水性部分、芳香族核、および電子ドナーおよびアクセプタがある。個々の骨格およびビルディングブロックの特性は、一緒になって、それらが見出された個々の化合物の独自性に寄与する。したがって、該化合物のライブラリーは、無数の特性、すなわち“多様性”がある。個々の骨格およびビルディングブロックの特性は、一緒になって個々のライブラリー化合物を形成しており、ひとまとめにして、該化合物の独自性に寄与し、細胞、酵素または核酸標的サイトとの相互作用のための、特定の特性を該化合物に与えている。
本書では、オリゴヌクレオチドの用語は、化学式の角括弧[ ]の中に包含するm個のサブユニットを有するオリゴマーを意味している：
Figure 2008511743
ここで他の変数はこれまでに定義してあり、以下で更に詳細に記述する。製造するオリゴヌクレオチドを一本鎖立体構造で表してあるが、オリゴヌクレオチドは二本鎖立体構造のものを使用することが一般的であるということが知られている。例えば、siRNAと一般的に称されるアンチセンス法では、2本のRNAまたはRNA様オリゴヌクレオチド鎖を用意してアニールするが、しばしば両端において2つのヌクレオチドを重ね合わされる。したがって、本発明は、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド両方の製造を意図している。
核酸塩基
核酸塩基Bxは同じものであるか異なるものであることがあり、天然生成核酸塩基アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、ウラシル(U)およびシトシン(C)のほかに、修飾核酸塩基も含まれる。修飾核酸塩基には、天然生成核酸塩基と構造的に関連している複素環部分であり、化学的に部分変更されて、天然生成核酸塩基には有しない修飾核酸塩基に何らかの特性を与える複素環部分を含む。本書で用いる“核酸塩基”という用語は、“核酸塩基またはその模倣物”と同義であることが意図されている。一般に、核酸塩基は、オリゴヌクレオチドの塩基と水素結合することのできる１つ以上の原子または原子団を含むすべての基礎構造である。
本書で用いる“非修飾”または“天然”核酸塩基には、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾核酸塩基には、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンを含む。他の修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾオチアジン-2(3H)-オン）などの三環ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例、9-(2-アミノエトキシル)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾシアジン-2(3H)-オン）、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン）などのG-クランプを含む。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基を、他の複素環、例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンなどと置換したものを含むこともある。他の核酸塩基には、USP No.3,687,808に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages、858-859頁、Kroschwitz、J.I., ed. John Wiley & Sons、1990に開示されたもの、Englisch他により、Angewandte Chemie、国際版、1991、30,613に開示されたもの、およびSanghvi, Y.S.、15章、Antisense Research and Applications、289-302頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B., ed., CRCプレス、1993により開示されたものを含む。
これらの若干の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和力を増大させるのに特に役立つ。これらには、２−アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンなどの、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを含む。5-メチルシトシン置換基は、核酸の二本鎖の安定性を0.6−1.2℃だけ増加させることが実証されており（Sanghvi, Y.S.、Crooke, S.T.およびLebleu, B., eds.、Antisense Research and Applications、CRCプレス、Boca Raton、1993、276-278頁）、および現在好適な塩基置換基であり、2’-O-メトキシエチル糖修飾と結合したときに更に特に好適である。
上記の若干の修飾核酸塩基のみならず他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的なUSPには以下のものを含むが、それらに限定されない：上記のUSP 3,687,808のみならず次のUSP; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; および5,681,941、そのいくつかは当該出願と共有され、その各々は参考の為に本書に組み込んであり、USP 5,750,692は当該出願と共有され、参考の為に本書に組み込んである。
他の修飾基は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に3’末端ヌクレオチドでの糖の3’位および5’末端ヌクレオチドの5’位でも作ることができる。例えば、本発明のリガンド結合オリゴヌクレオチドの1つの他の修飾基には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞摂取を高める、1つ以上の他の非リガンド部分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。該部分には以下を含むが限定はしない：コレステロール成分などの脂質部分（Letsinger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1989、86,6553）、コール酸（Manoharan他、Bioorg. Med. Chem. Lett.、1994、4,1053）、チオエーテル、例、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan他、Ann. N.Y. Acad. Sci.、1992、660,306; Manoharan他、Bioorg. Med. Chem. Let.、1993、3,2765）、チオコレステロール（Oberhauser他、Nucl. Acids Res.、1992、20,533）、脂肪族鎖、例、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras他、EMBO J.、1991、10,111； Kabanov他、FEBS Lett.、1990、259,327； Svinarchuk他、Biochimie、1993、75、49）、リン脂質、例、ジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸塩（Manoharan他、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651；Shea他、Nucl. Acids Res.、1990、18、3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan他、Nucleosides＆Nucleotides、1995、14、969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan他、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651）、パルミチル部分（Mishra他、Biochim. Biophys. Acta、1995、1264,229）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke他、J. Pharmacol. Exp. Ther.、1996、277、923）。
該オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的なUSPは以下を含むが限定はしない：USP No.4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928および5,688,941、これらの若干は共有され、その各々は参考の為に本書に組み込んである。
本発明の幾つかの実施形態では、オリゴマー化合物、例えば、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の複素環塩基部分の代わりに、多環式複素環化合物を有して調製される。多くの三環性複素環化合物が以前に報告されている。これらの化合物は、修飾鎖の標的鎖との結合特性を増大させるために、アンチセンス用途で日常的に使用する。最も研究された修飾基はグアノシンを標的としたので、G-クランプまたはシチジン類似物と呼ばれている。これらの多環式複素環化合物の多くは以下の一般的化学式を有する：
Figure 2008511743
第二鎖でグアノシンと3水素結合する代表的なシトシン類似物には、1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン（R10=O、R11-R14=H）[Kurchavov他、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、1997、16,1837-1846]、1,3-ジアザフェノチアジン-2-オン（R10＝S，R11-R14=H）[Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,3873-3874]および6,7,8,9-テトラフルオロ-1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン（R10=O、R11-Ｒ14=F）[Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39,8385-8388]を含む。オリゴヌクレオチドに取り込まれてこれらの塩基修飾基が相補的グアシンとハイブリダイズされることも実証されており、後者はアデニンとハイブリダイズされ、拡張スタッキング相互作用によりらせん状熱安定性を高めることも実証された（“修飾ペプチド核酸”という表題のUSP特許出願、2002年5月24日出願、出願番号10/155,920；および“ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド”という表題のUSP特許出願、2002年5月24日出願、出願番号10/013,295も参照、両方とも当該出願で共有され、その全体を参考の為に本書に組み込んである）。
シトシン類似物/置換基が剛性1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン骨格（R10=O、R11=-O-(CH2)2-NH2、R12-14=H）[Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,8531-8532]に結合したアミノエトキシ部分を有するときには、更にヘリックス安定化特性が観察される。結合の研究は、1つの取り込みが、モデルオリゴヌクレオチドのその相補的標的DNAまたはRNAへの結合親和力を、5-メチルシトシン（dC5me）に関して18°までのΔＴmで高めることができることを立証した。これは1つの修飾基において最も高い公知の親和力向上である。他方、ヘリカル安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの特異性に影響しない。Tmデータは、dC5meと比べて、完全一致と不一致配列との間のさらに大きな相違点を示している。係留したアミノ基が、Hoogsteen面（すなわち相補グアニンのO6で、それにより4水素結合を形成している）と相互作用するための付加的な水素結合ドナーとして役に立つことが示唆されていた。これは、G-クランプの増加した親和力が、拡張塩基スタッキングおよび付加的特異水素結合の組合せにより調停されることを意味している。
更に、三環性複素環化合物および本発明に従うそれら化合物を使用する方法は、USP出願番号6,028,183（2000年5月22日発行）、およびUSP出願番号6,007,992（1999年12月28日発行）に開示され、両内容は本出願とともに一般に列挙され、その全体が本書に組み込まれている。該化合物には以下の化学式を有するものを含む：
Figure 2008511743
ここで、R11は、(CH3)2N-(CH2)2-O-; H2N-(CH2)3-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)- (CH2)3-; H2N-; フルオレニル-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-; フタルイミジル-CH2-O-
C(=O)-N(H)-(CH2)3-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)2-O-; Ph-CH2-O-C(=O)-N(H)-
(CH2)3-O-; (CH3)2N-N(H)-(CH2)2-O-; フルオレニル-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)2-O-; フルオレニル-CH2-O-C(=O)-N(H)-(CH2)3-O-; H2N-(CH2)2-O-CH2-; N3-(CH2)2-O-CH2-; H2N-(CH2)2-O-、およびNH2C(=NH)NH-。
また以下の化学式の三環性複素環化合物も開示されている：
Figure 2008511743
ここで：
R10aはO、SまたはN-CH3である；R11aはA(Z)x1であり、ここでAはスペーサーで、Zは検出可能なラベルに随意に結合した独立のラベル結合基であるが、R11aは、アミン、保護アミン、ニトロまたはシアノ基ではない；X1は1,2または3である；およびRbは独立した-CH=、-N=、-C(C1-8アルキル)=または-C(ハロゲン)=であるが、隣接するRbは両方とも-N=ではなく、または2つの隣接するRbは一緒に用いて以下の構造を有する環を形成する：
Figure 2008511743
ここでRcは独立した-CH=、-N=、-C(C1-8アルキル)=または-C(ハロゲン)=であるが、隣接するRbは両方とも-N=ではない。
フェノキサジン誘導体の強化された結合親和力は、その妥協しない配列特異性とともに、もっと強いアンチセンスベースの薬物の開発のための貴重な核酸塩基類似物にする。実際、in vitro実験から有望なデータが得られて、フェノキサジン置換基を含むヘプタヌクレオチドが、RNaseHを活性化させ、細胞摂取を高め、アンチセンス活性増加を呈することができることを実証した[Lin, K.-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,8531-8532]。活性増強はG-クランプの場合に更にもっと断言された。というのも、1つの置換基が20mer2’-デオキシホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドのin vitroの可能性を著しく向上させることが明らかにされたからである[Flanagan, W. M.; Wolf, J.J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 1999, 96,3513-3518]。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド設計を最適化し、これらの複素環修飾基の生物活性に及ぼす影響をより良く理解するためには、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に及ぼす影響を評価する必要がある。
本発明に従う他の三環および四環性ヘテロアリール化合物は、以下の化学式を有するものを含む：
Figure 2008511743
ここで、R14はNO2であるか、またはR14およびR12が両方とも独立した-CH3である。これらの化合物の合成は、USP出願番号5,434,257（1995年７月18日発行）、USP出願番号5,502,177（1996年3月26日発行）、USP出願番号5,646,269（1997年７月8日発行）に開示してあり、その内容は、本出願とともに一般に列挙され、その全体は本書に組み込まれている。
“257,177および269”特許にも開示されている本発明に従う他の三環性複素環化合物は、以下の化学式を有するものを含む：
Figure 2008511743
ここで、aおよびbは、aおよびbの合計が0または1であるときに、独立して0または1である；AはN、CまたはCHである；XはS、O、C=O、NHまたはNCH2、R6である；YはC=Oである；ZはAと一緒に用いて5または6個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造を形成し、ここで該ヘテロアリール環は1個のO環ヘテロ原子、1個のN環ヘテロ原子、1個のS環ヘテロ原子、炭素原子1つにより分離された1個のOおよび1個のN環ヘテロ原子、C原子1つにより分離された1個のSおよび1個のN環ヘテロ原子、炭素原子1つにより分離された2個のN環ヘテロ原子、または少なくとも2個が炭素原子1つにより分離された3個のN環ヘテロ原子、および該アリールまたはヘテロアリール環炭素原子がH以外で置換されないかまたは少なくとも1つの非架橋環炭素原子がR20または=Oで置換されている；またはZはAと一緒に用いて6つの環原子を含むアリール環構造を形成し、ここで該アリール環炭素原子はH以外で置換されないかまたは少なくとも1つの非架橋環炭素原子がR6または=Oで置換される；R6は独立したH、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、NO2、N(R3) 2、CNまたはハロ基であるか、またはR6を、隣接するZ基R6と一緒に用いてフェニル環を完成させる；R20は独立したH、C1-6アルキル、C2-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、NO2、N(R21)2、CN、またはハロ基であるか、またはR20を、隣接するR20と一緒に用いて5または6個の環原子を含む環を完成する、および互変異性体、溶媒和物およびその塩；R21は独立してHまたは保護基である；R3は保護基またはHである；および互変異性体、溶媒和物およびその塩である。
“257,177および269”特許に含まれた塩基のもっと具体例は、以下の化学式の化合物である：
Figure 2008511743
Figure 2008511743
ここで各R16は独立して水素および各種置換基から選択した。他の多環性塩基部分は以下の化学式を有する：
Figure 2008511743
ここで：A6はOまたはSである；A7はCH2、N-CH3、OまたはSである；各A8およびA9は水素またはA8およびA9の1つが水素で他のA8およびA9は以下から成る基から選択する：
Figure 2008511743
ここで：Gは-CN、-OA10、-SA10、-N(H)A10、ON(H)A10または-C(=NH)N(H)A10である；Q1はH、-NHA10、-C(=O)N(H)A10、-C(=S)N(H)A10または-C(=NH)N(H)A10である；各Q2は独立してHまたはPgである；A10はH、Pg、置換または非置換C1-C10アルキル、アセチル、ベンジル、-(CH2)p3NH2、-(CH2)p3N(H)Pg、DまたはLαアミノ酸、またはD、Lまたはラセミαアミノ酸から誘導したペプチドである；Pgは窒素、酸素またはチオール保護基である；各p1は独立して2から約6である；p2は1から約3である；およびp3は1から約4である；これらはUSP特許出願の出願番号09/996,292（2001年11月28日出願）に開示され、当該出願と共有され、参考の為に本書に組み込んである。
糖および糖置換基
糖成分：
Figure 2008511743
ここで各破線（----）は、隣接するリン原子との結合箇所を示してあり、本発明に採用してある一般ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部を表している。
[61] R’2に対応する適した2’-置換基には以下のものを含む：OH、F、O-アルキル（例、O-メチル）、S-アルキル、N-アルキル、O-アルケニル、S-アルケニル、N-アルケニル；O-アルキニル、S-アルキニル、N-アルキニル；O-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、各々置換したかまたは置換していないC1からC10アルキルまたはC2からC10アルケニルまたはアルキニルである。特に好適なのは、O[(CH2)gO]hCH3、O(CH2)gOCH3、O(CH2)gNH2、O(CH2)gCH3、O(CH2)gONH2、およびO(CH2)gON[(CH2)gCH3]2であり、ここでgおよびhは1から約10である。他の好適なオリゴヌクレオチドは、2’位において以下のうちの1つを含む：C1からC10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、複素環アルキル、複素環アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、オリゴヌクレオチドの薬理特性を向上させるための基、および類似特性を有する他の置換基。好適な2’-修飾基には2’-メトキシエトキシ（2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-(MOE)としても知られている）を含む（Martin他、Helv. Chim. Acta、1995、78,486-504）。他の好適な修飾基には2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、また2’-DMAOEとしても知られており、以下の例で記述する通り、および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ（また2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても当業者に公知されている）、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2、以下の例で記述する通りのものを含む。
他の好適な修飾基には2’-メトキシ（2'-O-CH3）、2’-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）、2’-アリル（2'-CH2-CH=CH2）、2’-O-アリル（2’-O-CH2-CH=CH2）および2’-フルオロ（2’-F）を含む。2’-修飾基はアラビノ（上）位置またはリボ（下）位置に置くことがある。好適な2’-アラビノ修飾基は2’-Fである。類似の修飾基は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位または2’-5’ 連結オリゴヌクレオチド、および5’末端ヌクレオチドの5’位、にも作ることができる。
他の代表的な置換基には化学式IaまたはIIaの基を含む。
Figure 2008511743
ここで、RbはO、SまたはNHである；Rdは単結合、OまたはC(=O)であり、ReはC1-C10アルキル、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N=C(Rp)(Rq)、N=C(Rp)(Rr)であるか、または化学式IIIaを有する。
Figure 2008511743
各Rs、Rt、RuおよびRvは独立して水素、C(O)Rw、置換または非置換C1-C10アルキル、置換または非置換C2-C10アルケニル、置換または非置換C2-C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル基、化学官能基または接合基であり、ここで置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル基から選択する；または、随意に、RuおよびRｖはそれらが結合した窒素原子と一緒にフタルイミド部分を形成する；各Rwは、独立して、置換または非置換C1-C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t-ブトキシ、アリルオキシ、9-フルオレニルメトキシ、2-(トリメチルシリル)-エトキシ、2,2,2-トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ-ブチリル、フェニルまたはアリール基である；Rkは水素、窒素保護基または-Rx-Ryである；Rpは水素、窒素保護基または-Rx-Ryである；Rxは結合または連結部分である；Ryは化学官能基、接合基または固体サポート媒体である；各RmおよびＲnは、独立して、H、窒素保護基、置換または非置換C1-C10アルキル、置換または非置換C2-C10アルケニル、置換または非置換C2-C10アルキニル基であり、ここで置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル基から選択する；NH3 +、N(Ru)(Rv)、グアニジノおよびアシル、ここで上記アシルは酸アミドまたはエステルである；またはRmおよびRnは、共に、窒素保護基であり、NおよびOから選択した追加ヘテロ原子を随意に含む環構造で結合されているか、または化学官能基である；RiはORz、SRz、またはN(Rz)2である；各Rzは、独立して、H、C1-C8アルキル、C1-C8ハロアルキル、C(=NH)N(H)Ru、C(=O)N(H)RuまたはOC(=O)N(H)Ruである；Rf、RgおよびRhは、約4から約７個の炭素原子を有するか約3個から約6個の炭素原子および1または2個のヘテロ原子を有する環系を含み、ここで上記ヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択し、上記環系は脂肪族化合物、不飽和脂肪族化合物、芳香族化合物、または飽和または不飽和複素環である。
Rjは1から約10個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル基、2から約10個の炭素原子を有するアルケニル基、2から約10個の炭素原子を有するアルキニル基、6から約14個の炭素原子を有するアリール基、N(Rk)(Rm) ORk、ハロ、SRkまたはCN基である；maは1から約10である；各mbは、独立して、0または1である；mcは0または1から10の整数である；mdは1から10の整数である；meは0、1または2である；およびmcが0である場合に、mdは1よりも大きい。
化学式Iの代表的な置換基は、USP No.6,172,209に開示されている。化学式IIの代表的な置換基は、USP No.6,271,358に開示されている。
特に役立つ糖置換基には、O[(CH2)gO]hCH3、O(CH2)gOCH3、O(CH2)gNH2、O(CH2)gCH3、O(CH2)gONH2、およびO(CH2)gON[(CH2)gCH3]]2があり、ここでgおよびhは1から約10である。
幾つかの特に役立つ本発明のオリゴマー化合物には、以下の置換基のうちの1つを有する少なくとも1つのヌクレオシドを含む：C1からC10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、複素環アルキル、複素環アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴマー化合物の薬物動態特性を向上させるための基、オリゴマー化合物の薬理特性を向上させるための基、および類似特性を有する他の置換基。好適な修飾基には2’-メトキシエトキシ（2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-(MOE)としても知られている）を含む（Martin他、Helv. Chim. Acta、1995、78,486）、すなわちアルコキシアルコキシ基。他の好適な修飾基には2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、また2’-DMAOEとしても知られている。代表的なアミノオキシ置換基は、共有USP特許出願の出願番号09/344,260（1999年６月25日出願）で、“アミノオキシ-機能性オリゴマー”という表題のもの；およびUSP特許出願出願番号09／370,541（1999年8月9日出願）で、“アミノオキシ-機能性オリゴマーおよびその製造方法”という表題の特許出願に記載してあり、その全体は参考の為に本書に組み込んである。
他の特に好適な2’-修飾基には2’-メトキシ（2'-O-CH3）、2’-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）および2’-フルオロ（2’-F）を含む。類似修飾基は、ヌクレオシドおよびオリゴマー上の他の位置、特に3’末端ヌクレオシド上の糖の3’位、または2’-5’ 連結オリゴマーなどの2’位からの連鎖を有するヌクレオシドの3’位、および5’末端ヌクレオシドの5’位にも作ることができる。オリゴマーは、ペントフラノシル糖に代わり、シクロブチル部分などの擬態糖を有することもある。該変性糖構造の調製を教示してある代表的なUSPには以下のものを含むが、それらに限定しない：USP 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,0531 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; および5,700,920、若干数のUSPは共有され、その各々は参考のために本書に組み込んであり、および共有USP特許出願08/468,037（1995年６月5日出願）は参考の為に本書に組み込んである。
化学式IIIおよびIVに示された代表的なグアニジン置換基は、共有USP09／349,040（“機能性オリゴマー”という表題で、1999年7月7日に出願、特許証発行費用は2002年10月23日に支払われた）に開示されている。
代表的なアセトアミド置換基は、USP6,147,200に開示され、その全体は参考の為に本書に組み込まれている。代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、国際特許出願PCT/US99/17895（“2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル-修飾オリゴヌクレオチド”という表題で、1999年8月6日に出願され、その全体が参考の為に本書に組み込まれている）に開示されている。ペントフラノシル糖を含む該ヌクレオシドでは、該糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分にリン酸基を連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、該リン酸基は隣接するヌクレオシドをお互いに共有結合して、線状高分子化合物を形成する。この線状高分子構造の各端は、ハイブリダイゼーションまたは共有結合の形成により円形構造を形成して結合することはできるが、オープンリニア構造が一般的に推奨される。該オリゴヌクレオチド構造のなかでは、該リン酸基は一般的に該オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシドを形成する基であると言われている。RNAおよびDNAの通常のインターヌクレオシドは3’から5’ホスホジエステル結合である。
本発明はいずれかの所望の最終用途（例、ポリメラーゼ連鎖反応で使用するためのプローブなど）のためにオリゴヌクレオチドを製造するように適応させることができるが、オリゴヌクレオチドの1つの推奨用途はアンチセンス治療におけるものである。アンチセンス治療でしばしば用いる1つの作用形態は、いわゆるRNAse Hメカニズムであり、それによりDNAの鎖を細胞のなかに導入して、細胞の中でDNAはRNAの鎖とハイブリダイズする。DNA-RNAハイブリッドは、RNA鎖を開裂するエンドヌクレアーゼ、RNAse Hにより認識される。通常の場合には、該DNA鎖はメッセンジャーRNA(mRNA)であり、開裂された後では、リボソーム中で対応するペプチドまたはタンパク質配列に変換することができない。このように、DNAは、特定遺伝子の発現を調節するための作用物質として用いることができる。
DNAの短いストレッチをオリゴヌクレオチドに組み込むことにより、該RNAse Hメカニズムを有効利用して、標的ペプチドまたはタンパク質の発現を調節することができる。本発明の幾つかの実施形態では、DNAのストレッチおよびRNAまたは2’-修飾RNAのストレッチを組み込んだオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を有効に調節することができる。好適な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’-修飾RNAの2つのストレッチにより側面に配列したDNAのストレッチからなる。好適な2’-修飾基には、本書に記述する2’MOEを含む。
リボシル糖部分は、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドの特性に及ぼすその修飾の影響を評価するためにも、広範囲に研究されている。該糖部分の2’位は、修飾に関して最も研究されたサイトの1つである。一部の2’-置換基は、脂溶性を増加させて、標的RNAとの結合親和力、化学的安定性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性などの特性を高めることが明らかにされている。結合親和力を高めることが明らかにされた2’位での修飾の多くは、また、糖環を強制的にC3エンド立体構造にする。
RNAは“A型”と呼ばれる形状で存在し、DNAは“B型”と呼ばれる形状で存在する。一般に、RNA:RNA二本鎖はもっと安定しているか、またはDNA:DNA二本鎖よりも高い融解温度(Tm)を有する（Sanger他、核酸構造の原理、1984、Springer-Verlag; ニューヨーク、ニューヨーク州； Lesnik他、生化学、1995、34,10807-10815；Conte他、Nucleic Acids Res.、1997、25,2627-2634）。RNAの安定性増大は、幾つかの構造的特徴にあり、最も顕著な特徴はA-型形状から生じる向上した塩基スタッキング相互作用である（Searle他、Nucleic Acids Res.、1993、21,2051-2056）。RNAの2’ヒドロキシル基の存在は、糖をC3’エンドパッカーの方に偏らせている。すなわち、C3’エンドパッカーは、該二本鎖をA-型形状になるように有利に働くノーザンパッカーとも称されている。他方、デオキシ核酸はC2’エンド糖パッカーを選ぶ。すなわち、C2’エンド糖パッカーは、不安定なB-型形状を分与するものと考えられるサザンパッカーとしても知られている（Sanger, W.(1984)核酸構造原理、Springer-Verlag、ニューヨーク、ニューヨーク州）。さらに、RNAの2’ヒドロキシル基は、該RNA二本鎖を安定化させる一助となる水媒介水素結合ネットワークを形成することができる（Egli他、生化学、1996、35,8489-8494）。
しかし、DNA:RNAハイブリッド二本鎖は通常純粋RNA:RNA二本鎖よりも不安定であり、その配列によってはDNA:DNA二本鎖よりも大体安定していることがある（Searle他、Nucleic Acids Res.、1993、21,2051-2056）。ハイブリッド二本鎖構造はA-およびB-型形状の中間であり、スタッキング相互作用が不十分な結果になることがある（Lane他、Eur. J. Biochem、1993、215,297-306；Fedoroff他、J. Mol. Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez他、Biochemistry、1995、34,4969-4982；Horton他、J.Mol. Biol.、1996、264,521-533）。DNA:RNAハイブリッドの安定性はアンチセンス治療の中核をなしている、何故ならば該メカニズムでは修飾DNA鎖のmRNA鎖との結合を必要とするからである。mRNAを効果的に抑制するためには、該アンチセンスDNAが、mRNAとの非常に大きな結合親和力を有しているべきである。そうでなければ、該DNAと標的mRNA鎖との間の所望相互作用はまれにしか生じないので、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果が減少する。
ヌクレアーゼ耐性を増大させるか、アンチセンス・鎖の、その標的mRNAに対する親和力を高めるために、各種合成修飾を提示している（Crooke他、Med. Res. Rev.、1996、16,319-344；De Mesmaeker他、Acc. Chem. Res.、1995、28,366-374）。さまざまな修飾リン含有結合を、オリゴヌクレオチドの天然の、容易に開裂するリン酸ジエステル結合の代わりとして研究している。一般に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホネートおよびホスホロジチオエートなどの、その大部分はすべて、オリゴヌクレオチドに相補的標的との結合減少およびハイブリッド安定性低下をもたらす。
RNAは“A型”と呼ばれる形状で存在し、DNAは“B型”と呼ばれる形状で存在する。一般に、RNA:RNA二本鎖はもっと安定しているか、またはDNA:DNA二本鎖よりも高い融解温度(Tm)を有する（Sanger他、核酸構造の原理、1984、Springer-Verlag; ニューヨーク、ニューヨーク州； Lesnik他、生化学、1995、34,10807-10815；Conte他、Nucleic Acids Res.、1997、25,2627-2634）。RNAの安定性増大は、幾つかの構造的特徴にあり、最も顕著な特徴はA-型形状から生じる向上した塩基スタッキング相互作用である（Searle他、Nucleic Acids Res.、1993、21,2051-2056）。RNAの2＝ヒドロキシル基の存在は、糖をC3＝エンドパッカーの方に偏らせている。すなわち、C3＝エンドパッカーは、該二本鎖にA-型形状になるように有利に働くノーザンパッカーとも称されている。他方、デオキシ核酸はC2’エンド糖パッカーを選ぶ。すなわち、C2’エンド糖パッカーは、不安定なB-型形状を分与するものと考えられるサザンパッカーとしても知られている（Sanger, W.(1984)核酸構造原理、Springer-Verlag、ニューヨーク、ニューヨーク州）。さらに、RNAの2＝ヒドロキシル基は、該RNA二本鎖を安定化させる一助となる水媒介水素結合ネットワークを形成することができる（Egli他、生化学、1996、35,8489-8494）。
しかし、DNA:RNAハイブリダイズ二本鎖は通常純粋RNA:RNA二本鎖よりも不安定であり、その配列によってはDNA:DNA二本鎖よりも大体安定していることがある（Searle他、Nucleic Acids Res.、1993、21,2051-2056）。ハイブリッド二本鎖構造はA-およびB-型形状の中間であり、スタッキング相互作用が不十分な結果になることがある（Lane他、Eur. J. Biochem、1993、215,297-306；Fedoroff他、J. Mol. Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez他、Biochemistry、1995、34,4969-4982；Horton他、J.Mol. Biol.、1996、264,521-533）。DNA:RNAハイブリッドの安定性はアンチセンス治療の重要な側面である、何故ならば提示メカニズムでは修飾DNA鎖のmRNA鎖との結合を必要とするからである。理想的には、該アンチセンスDNAが、mRNAとの非常に大きな結合親和力を有しているべきである。そうでなければ、該DNAと標的mRNA鎖との間の所望相互作用はまれにしか生じないので、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果が減少する。
増大するヌクレアーゼ耐性およびヌクレオチドとの非常に大きな結合親和力を与える1つの合成2’-修飾は、2’-メトキシエトキシ（MOE, 2’-OCH2CH2OCH3）側鎖である（Baker他、J. Biol. Chem.、1997、272,11944-12000; Freier他、Nucleic Acids Res.、1997、25,4429-4443）。該MOE置換基の直接の利点の1つは、結合親和力の向上であり、結合親和力はO-メチル、O-プロピル、およびO-アミノプロピルなどの多くの類似2’修飾のものよりも大きい（FreierおよびAltmam、Nucleic Acids Research、（1997）25：4429-4443）。2’-Oメトキシエチル置換オリゴヌクレオシドは、in vivo用のための有望な特徴の、遺伝子発現のアンチセンス抑制剤であることも実証されている（Martin, P., Helv. Chim. Acta、1995、78,486-504；Altmann他、Chimia、1996、50,168-176；Altmann他、Biochem. Soc. Trans.、1996、24,630-637；およびAltmann他、Nucleosides Nucleotides、1997、16,917-926）。DNAと比較して、それらは向上したRNA親和力および大きなヌクレアーゼ耐性を呈する。2’-O-メトキシエチル-リボヌクレオシドウィングおよびセントラルDNA-ホスホロチオエート・ウィンドウを有するキメラオリゴヌクレオチドは、低用量で動物モデルにおける腫瘍の成長を効果的に減少させることも実証されている。MOE置換オリゴヌクレオチドは、幾つかの病状におけるアンチセンス薬剤として卓越した有望性が実証されている。該MOE置換オリゴヌクレオチドの1つが、現在、CMV網膜炎の治療についての臨床試験で調べているところである。
LNA（2’および4’位が架橋により連結されているオリゴヌクレオチド）も、大きな熱親和力のある相補的DNA、RNAまたはLNAと二本鎖を形成する。円二色性（CD）スペクトルは、完全修飾LNA（特に、LNA:RNA）がA-型RNA:RNA二本鎖と構造的に似ていることを明らかにした。LNA:DNA二本鎖の核磁気共鳴（NMR）実験で、LNA単量体の3’-エンド立体構造を確認した。二本鎖DNAの認識も実証され、LNAによる鎖浸入を示唆している。不適正配列の研究により、LNAが、対応する非修飾基準鎖と比べて、一般的に改善された選択性を有していて、Watson-Crick塩基対合則に従っていることを明らかにした。
2’-ヒドロキシル基が糖環の4’炭素原子と連結してあるLNAは、それにより2’-C,4’-C-オキシメチレン結合を形成し、二環式糖部分を形成している。該結合は、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋しているメチレン(-CH2-)n基にすることができる（ここで、nは1または2である）（Singh他、Chem. Commun.、1998、4、455-456）。LNAおよびLNA類似物は、相補的DNAおよびRNA（Tm=+3から+10C）とともに非常に高い二本鎖熱安定性、3’-外部核酸分解に対する安定性および優れた溶解特性を呈する。他の好適な架橋基には2’-デオキシ-2’-CH2OCH2-4’架橋を含む。
代替リンカー
リン酸ジエステルおよびホスホロチオエートジエステル結合の他に、他のリンカーが技術的に知られている。本発明の第一の関心はリン酸ジエステルおよびホスホロチオエートジエステルオリゴヌクレオチドに関与している一方で、複数の種類の結合を有するキメラ化合物は、以下に更に詳述する非リン酸/ホスホロチオエートジエステル結合を有するオリゴマーとともに、本発明の範囲内で、その全体または一部が意図されている。
当該技術範囲内で意図されている典型的な非リン酸/ホスホロチオエートジエステル結合には以下のものを含む：ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-ホスホン酸アルキレン、5’-ホスホン酸アルキレンおよびホスホン酸キラルなどのメチルおよび他のホスホン酸アルキル、ホスフィン酸塩、3’-アミノホスホロアミダイト、及びアミノアルキルホスホロアミダイトを含むホスホロアミダイト、チオホスホロアミダイト、ホスホン酸チオノアルキル、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸セレノおよびホスホン酸ボラノ。以下の付加的結合を含む：チオジエステル（-O-C(O)-S-）、チオノカルバメート（-O-C(O)(NJ)-S-）、シロキサン（-O-Si(J)2-O-）、カルバメート（-O-C(O)-NH-および-NH-C(O)-O-）、スルファミン酸塩（-O-S(O)(O)-N-および-N-S(O)(O)-N-）、モルホリノスルファミド（-O-S(O)(N(モルホリノ)-)、スルホンアミド（-O-SO2-NH-）、硫化物（-CH2-S-CH2-）、スルホン酸塩（-O-SO2-CH2-）、N,N’-ジメチルヒドラジン（-CH2-N(CH3)-N(CH3)-）、チオフォルムアセタール（-S-CH2-O-）、フォルムアセタール（-O-CH2-O-）、チオケタール（-S-C(J)2-O-）、ケタール（-O-C(J)2-O-）、アミン（-NH-CH2-CH2-）、ヒドロキシルアミン（-CH2-N(J)-O-）、ヒドロキシルイミン（-CH=N-O-）、およびヒドラジニル（-CH2-N(H)-N(H)-）。
インターヌクレオシド結合に関する上記の基礎構造の各々で、Jは、一般的に水素またはアルキル基または1つの種類の結合から別の種類の結合に変わるもっと複雑な基である置換基を示す。
天然生成結合の-O-P-O-原子の修飾または置換基を含む上記の連結基の他に、1つ以上の-O-P-O-原子のみならず5’-メチレン基の修飾を含む連結基が、本発明の範囲内に含まれる。この種類の結合は、先行技術で十分文書化されており、以下の基を含むがそれらに限定されない：アミド（-CH2-CH2-N(H)-C(O)および-CH2-O-N=CH-）；およびアルキルリン（-C(J)2-P(=O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-）。Jは上記した通りである。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、一般に、上記したように、サポート媒体、例えば固体サポート媒体上で調製される。一般に、第一シントン（例、ヌクレオシドなどの単量体）がまずサポート媒体に結合され、続いて単量体を該サポート結合シントンに連結することによりオリゴヌクレオチドを合成する。この反復伸長が最終的に最終オリゴマー化合物またはポリペプチドなどの他のポリマーをもたらす。適したサポート媒体は、可溶性または不溶性にすることができ、さまざまな溶媒で可変溶解度を有していて、増大するサポート連結ポリマーを溶液中または溶液外の所望するようにすることができる。固体サポート媒体などの従来のサポート媒体は、大部分が不溶性であり通常、反応容器に入れられ、試薬および溶剤は、オリゴマーが目標長に達するまで成長する鎖と反応し、および/または成長する鎖を洗浄し、その後、サポートから開裂され、必要であればさらに加工されて最終高分子化合物を作る。最新アプローチでは、可溶性ポリマーサポートなどの可溶性サポートを導入して、合成の所望のポイントで反復合成製品を沈殿および溶解させることができる（Gravert他、Chem. Rev.、1997、97,489-510）。
サポート媒体の用語は、オリゴマー化合物およびペプチドなどの関連化合物の合成のための当業者に公知のすべての形態のサポートを含むことを意味する。本発明の方法に従う幾つかの代表的なサポート媒体を以下に含めるがそれらに限定されない：制御細孔ガラス（CPG）；オキサリル制御細孔ガラス（例えば、Alul他、Nucleic Acids Research、1991、19,1527参照）；多孔質ガラスビーズなどのシリカ含有粒子、およびトリクロロ-[3-(4-クロロメチル)フェニル]プロピルシランと多孔質ガラスビーズとの反応により形成されたものなどのシリカゲル（ParrおよびGrohmann, Angew. Chem. Internal. Ed. 1972, 11, 314、参照、 Waters Associates(フラミンハム、マサチューセッツ州、米国)により”PORASIL E”の商標で販売）；1,4-ジヒドロキシメチルベンゼンとシリカのモノエステル（BayerおよびJung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503参照、Waters Associatesにより”BIOPAK”の商標で販売）；TENTAGEL（例えば、Wright他、Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373参照）；架橋スチレン/ジビニルベンゼン共重合体ビーズマトリックスまたはPOROS、ポリスチレン/ジビニルベンゼン共重合体（Perceptive Biosystemsから入手可能）；可溶性サポート媒体、ポリエチレン・グリコールPEG’s（Bonora他、Organic Process Research & Development, 2000, 4,225-231）。
本発明に従う他のサポート媒体には、PEPSサポート（ペンダント長鎖ポリスチレン（PS）グラフトを有するポリエチレン（PE）膜）（分子量約106、（Berg他、J. Am. Chem. Soc., 1989,111,8024および国際特許出願WO 90/02749参照））を含むがそれに限定されない。該膜のローディング能力は、多数の合成に同時に適応させるための更なる柔軟性をもつビーズマトリックスのものと同じように高い。該PEPS膜は、個別の、標識シート状に創り出すことができ、各々が個々のコンパートメントとして用いられる。合成サイクルのすべての同一ステップ中に、該シートを1つの反応容器のなかに一緒に入れて、従来の方法による単一ペプチドの速度に近い速さで多数のペプチドを同時に調製することができる。また、例えば、不織布、ニット網織物、スティックまたはマイクロウェル・プレートなどのPEPSポリマーの他の形状での実験では、合成効果の限界を示唆していない。
本発明に従う他のサポート媒体は、既知量のN-tert-ブトキシカルボニル-ベータ-アラニル-N’-アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含んだ、N,N’-ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋したジメチルアクリルアミドの共重合体に基づく粒子を含むがそれに限定されない。幾つかのスペーサー分子は、通常は、ベーターアラニル基を介して付加され、その後、アミノ酸残基サブユニットが続いて付加される。また、ベーターアラニル含有モノマーは、樹脂ビーズを形成するための重合中に、アクリロイルサフコシン単量体で置き換えることができる。該重合に続いて、ビーズとエチレンジアミンとの反応があり、共有結合機能性として1級アミンを含む樹脂粒子を形成する。ポリアクリルアミドを主成分とするサポートは、ポリスチレンを主成分とするサポートよりも比較的大きな親水性があり、たいてい、ジメチルフォルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドンなどの極性非プロトン性溶媒とともに使用する（Atherton他、J. Am. Chem. Soc.、1975,97,6584, Bioorg. Chem. 1979,8,351、およびJ. C. S. Perkin I 538(1981)参照）。
本発明に従う他のサポート媒体は、樹脂と、使用する有機合成反応条件と実質的に不活性である別の物質との混合物を含むがそれに限定されない。1つの典型的な混合物（Scott他、J. Chrom. Sci., 1971,9,577）は、反応性クロロメチル基を含む疎水性の架橋スチレンポリマーで被覆したガラス粒子を利用しており、Northgate Laboratories社（ハムデン、コネチカット州、米国）から供給される。別の典型的な混合物は、ポリスチレンがグラフトされているフッ素化エチレンポリマーのコアを含む（KentおよびMerrifield、Israel J. Chem. 1978,17,243およびvan Rietschoten in Peptides 1974,Y. Wolman, Ed., WileyおよびSons、ニューヨーク、1975、113-116頁参照）。PEPS以外の次の固体サポート媒体、コットンシーツ（LeblおよびEichler、Peptide Res. 1989, 2, 232）およびヒドロキシプロピルアクリレート被覆ポリプロピレン膜（Daniels他、Tetrahedron Lett. 1989, 4345）など。成長するペプチド鎖を固定化して、コンパートメント化した合成を行うための、アクリル酸グラフト化ポリエチレンロッドおよび96-マイクロタイター・ウェル（Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. 米国、1984、81,3998）。従来から使用しているポリマービーズを入れた“ティーバッグ”（Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. 米国、1985、82,5131）。異なる密度の2つの異なるサポートの同時使用（Tregear、Chemistry and Biology of Peptides、J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sci. Publ., Ann Arbor, 1972 175-178頁）。マニホールドを介する反応容器の結合（Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136,397）。多層カラム固相合成（例、Krchnak他、Int. J. Peptide Protein Res., 1989,33,209、およびHolmおよびMeldal、“第20回欧州ペプチドシンポジウムの議事録”、G. JungおよびE. Bayer, eds., Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989、208-210頁）。セルロース紙（Eicher他、Collect. Czech. Chem. Commun., 1989,54,1746）。ペプチドのサポート媒体合成についても報告されている（Synthetic Peptides参照：ユーザーズガイド、Gregory A. Grant, Ed. オックスフォード大学プレス1992；US-A-4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; 5,132,418; 4,725,677およびRe-34,069）。
サポート結合オリゴヌクレオチド合成は、成長する鎖の一端にヌクレオチドを逐次的に付加する方法に依存している。通常、第一ヌクレオシド（環外アミン官能基上に保護基を有する）は適切なガラスビーズサポートに結合され、活性化された亜リン酸化合物（通常はヌクレオチド・ホスホロアミダイトでありこれもまた、適した保護基を有する）が段階を追って付加され、成長するオリゴヌクレオチドを伸長させる。固相合成の別の方法はCaruthersのUSP No. 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; および5,132,418; およびKosterのUSP No. 4,725,677およびRe.34,069に見出すことができる。
オリゴマー化合物および関連化合物のサポート媒体ベース合成に通常使用する商用機器は、幾つかのメーカー、例えば、Applied Biosystems（フォスター市、カリフォルニア州）などにより販売されている。技術的に公知の該合成用の他の手段は、追加的または代替的に用いることができる。自動合成技術などの適した固相技術については、F. Eckstein (ed.)、オリゴヌクレオチドおよび類似体、実践的アプローチ、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク（1991）に記載してある。
一般に、リン保護基（pg）はアルコキシまたはアルキルチオ基または化学式-CH2CH2-Gwのβ-脱離可能な基を有するOまたはSであり、ここでGwは電子求引基である。本発明に関する使用に従うpgの適した例には、CaruthersのUSP No. 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; および5,132,418; およびKosterのUSP No. 4,725,677およびRe. 34,069に記述された例を含む。一般に、アルキルまたはシアノエチル求引基が好適であり、商用ホスホロアミダイトは一般にメチルまたはシアノエチル・リン保護基のいずれかを組み込んでいる。
pgの除去方法は、除去する特定pgにより異なる。Koster他の特許に開示されているようなβ-脱離可能な基は、一般に弱い塩基溶液中で除去し、それにより酸性β-水素が引き抜かれ、-CH2CH2-Gw基が転位により除去されて対応するアクリロ化合物CH2=CH-Gwを形成する。それと対照的に、アルキル基は一般に、アルキル基のα-炭素への求核攻撃により除去される。該PGについては、本書に引用してあるCaruthers他の特許のなかに記載してある。
当業者は、P(III)からP(V)の酸化がさまざまな試薬により実行できることを認識している。さらに、当業者は、該P(V)スピーシーズが、リン酸トリエステル、ホスホロチオエートジエステル、またはホスホロジチオエートジエステルとして存在できることを認識している。P(V)連結の各種類は、本書に述べるような用途および利点がある。したがって、“酸化剤”の用語は、P(III)スピーシーズ（例、亜リン酸）をP(V)スピーシーズに変換することのできるすべての試薬として広く理解すべきである。したがって、“酸化剤”の用語には“硫化剤”を含み、“硫化(Thiation)試薬”も同じ意味をもっているものとして考えられる。酸化とは、別段の変更なき場合には、酸素または硫黄の導入のことをいい、Pの酸化状態がIIIからVに同時に増加する。酸化剤が酸素をP(III)スピーシーズに導入してP(V)スピーシーズにすることを指すことが重要な場合には、本書で言うところの酸化剤は“酸素導入酸化剤”である。
ホスホロアミダイト手順のもとでリン酸ジエステル結合にするための酸化剤（すなわち、酸素導入酸化剤）は、本書に引用した通りに、例えば、Caruthers他およびKoster他により記述されている。ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを合成するために使用する硫化剤の例には、硫黄元素、ジベンゾイルテトラ硫化物、3-H-1,2-ベンジジチオール-3-オン 1,1-二酸化物（Beaucage試薬としても知られている）、テトラエチルチウラム・ジスルフィド（TETD）、およびビス(O,O-ジイソプロポキシホスフィノチオール)ジスルフィド（Stec試薬としても知られている）を含む。ホスホロチオエートジエステル結合にするための酸化剤は、USP No. 6,242,591のなかでCole他により記述されているフェニルアセチルジスルフィド（PADS）を含む。発明の幾つかの実施形態では、ホスホロチオエート・ジエステルおよびリン酸ジエステル結合は、糖サブユニット間で入れ替わることがある。本発明の他の実施形態では、ホスホロチオエート結合だけを使用することができる。幾らかの実施形態では、硫化(Thiation)試薬はジチウラムジスルフィドにすることができる。幾つかの適したジチウラムジスルフィドの開示についてはUSP 5,166,387参照。驚いたことには、あるジチウラムジスルフィドは標準キャッピング試薬と共に使用することができるので、キャッピングおよび酸化を同じ手順で実施できることが判明した。これは、キャッピングと酸化を別々の手順で行うことを要求するBeaucage試薬などの標準酸化剤とは対照的に、一般に、手順間にカラム洗浄を含んでいる。
5’-保護基bgまたはT’は、核酸塩基を保護するために使用する保護基とオルトゴナルな保護基であり、固体サポート媒体との3’-リンカーに対してと同様に、適切な場合には2’-O-保護基ともオルトゴナルである。発明の幾つかの実施形態では、5’-保護基は酸に不安定である。発明に記載の幾つかの実施形態では、5’-保護基は、随意に置換したトリチル基および随意に置換したピキシル基から選択する。幾つかの実施形態では、ピキシル基は、アルキル、アルコキシ、ハロ、アルケニルおよびアルキニル基から選択した1つ以上の置換基と置換する。幾つかの実施形態では、トリチル基は、約1から約3のアルコキシ基、特に約1から約3のメトキシ基と置換する。発明の特定実施形態では、トリチル基は、4-および（該当する場合には）4’位で1つまたは2つのメトキシ基と置換する。特定の許容トリチル基は4,4’-ジメトキシトリチル（DMTまたはDMTr）である。
本発明の内容では、“試薬投入”の用語は、実質的に活性化合物（すなわち、試薬、活性剤、副生成物、または溶剤以外の他の物質）の全くない多量の溶剤のことで、試料溶液を押し入れ、その後の試薬溶液よりも先に、カラムを通過させる目的、およびその効果を果たすために、該多量の溶剤がカラムに投入されることを意味している。幾つかの場合には1つ以上のカラム容積を含むことはあるが、試薬投入が全カラム容積であることは必要としない。幾つかの実施形態では、試薬投入が、すぐ後の合成段階に使用する試薬溶液により形成されたフロント直前のカラムの断面から、試薬、副生成物および/または活性剤を実質的に除去するために必要な少なくとも最小量を含む。試薬、副生成物または活性剤のいずれかの活性化合物は、以下の試薬溶液フロントがあるカラムの断面の化合物の濃度が、以下の試薬溶液の活性に実質的な影響を及ぼさないほど十分に低い場合に、活性化合物は実質的に除去されるものとみなされる。“試薬投入”に要求される溶剤の量が、カラムにある溶剤、試薬の溶剤中の溶解度、活性剤、副生成物などや、カラムから除去される試薬、活性剤、副生成物などの量により異なることを、当業者は認識することができる。各試薬投入のための、特に以下の例において、適切な量を選択することは、技術者の技術の範囲内であるものとみなされている。
本書で用いている、“カラム洗浄”は、別段の変更なき場合には、“試薬投入”と同じ意味である。発明の幾つかの実施形態では、カラム洗浄は、以後の試薬溶液をカラムに入れる前に、少なくとも1カラム容量がカラムに通すことが許容されることを意味することがある。該カラム洗浄のカラム容量（CV）を指定した場合には、中を空にしたカラムの内部容積に等しい溶剤量をカラム洗浄に用いることを指示している。
本発明に関連して、洗浄溶剤は、合成手順間にカラムに用いられる、実質的に活性化合物を全く含まない溶剤である。“洗浄手順”は洗浄溶剤をカラムに用いる手順である。“試薬投入”および“カラム洗浄”は両方とも、“洗浄手順”のこの定義の範囲内に含まれている。
洗浄溶剤は純粋な化合物または化合物の混合物にすることができ、溶剤は活性化合物を溶解することができる。
本発明に記載の幾つかの実施形態では、該洗浄手順の1つで用いる洗浄溶剤は、50％v/vを超えないで、アセトニトリルを何パーセントか含むことができる。
キャッピングおよび酸化手順の順番は、所望する場合、逆にすることができる。すなわち、キャッピングを酸化よりも前または後で行うことができる。また、適した硫化(Thiation)試薬を選択すると、酸化およびキャッピング手順を1つの手順に結合することができる。例えば、驚くべきことに、無水酢酸でのキャッピングをN,N’-ジメチルジチウラム・ジスルフィドの存在下で行うことができることが判明した。
各種溶剤を酸化反応で用いることができる。適した溶剤は、本書に引用したCaruthers他およびKoster他の特許のなかに明らかにされている。Cole他の特許には、フェニルアセチルジスルフィド用の溶剤としてアセトニトリルが記載してある。他の適した溶剤にはトルエン、キサンテン、ジクロロメタンなどがある。
オリゴヌクレオチドをサポートから開裂するための試薬については、例えば、本書に引用したCaruthers他およびKoster他の特許に記述してある。リン保護基がO-CH2CH2CNであるときに、チミジン（T）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをトリエチルアミンなどのアルキル化アミンの存在下で開裂することは優れた実施であるとみなされている。何故ならば、この実施は、シアノ-エチル化チミジン・ヌクレオチド（CNET）の場合に生成を避けるために現在公知になっているからである。CNET付加化合物を回避する点については、一般に、本書に参考の為に組み込んであるUSP No. 6,465,628に記述してあり、特に参考の為に特に組み込んである20-30コラムに例示してある。
オリゴヌクレオチドは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（例、逆相HPLC）、分別沈殿などによる技術的に公知の標準的手順により加工することができる。本発明に記載の幾つかの実施形態では、5’-OH保護基がまだ最終ヌクレオシドにあるときに、該オリゴヌクレオチドが、固体サポート媒体から開裂される。このいわゆるDMT-on（またはトリチル-on）オリゴヌクレオチドは次にクロマトグラフィーにかけられる。その後、DMT基は有機酸のなかでの処理により除去され、その後、オリゴヌクレオチドは脱塩され、さらに精製されて最終生産物を生成する。
5’-ヒドロキシル保護基は、適した条件下で選択的に除去されるすべての基である。特に、4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル（DMT）基は5’-位で保護するための好適な基である。何故ならば、酸性条件（例、ジクロロ酢酸（DCA）、トリクロロ酢酸（TCA）、または酢酸の存在下）で容易に開裂されるからである。サポート結合オリゴヌクレオチドからのDMTの除去は、一般に、適した溶剤中のDCA（例、約3から約10％DCA(v/v)）で行う。サポートから開裂後のオリゴヌクレオチドの除去は、一般に酢酸を用いて行う。
上記のように、オリゴヌクレオチドは、他のオリゴマー部分とともにキメラとして調製することができる。本発明に関連して、“オリゴマー化合物”の用語は、核酸分子部分と、該オリゴマー化合物の一部である“オリゴマー部分”とをハイブリダイズすることができる高分子構造のことを言う。オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似物、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似物がある。オリゴマー化合物は線形または円形にすることができ、分岐を含むことがある。オリゴマー化合物は一本鎖または二本鎖にすることができ、二本鎖にしたときには、オーバーハングを含むことがある。一般に、オリゴマー化合物は、連結した単量体サブユニットの骨格を含み、各連結単量体サブユニットは複素環塩基部分に直接的または間接的に結合している。単量体サブユニット、単量体サブユニットおよび複素環塩基部分を接合している結合は、ヘミマー、ギャップマーおよびキメラなどの、生成するオリゴマー化合物のための複数のモチーフを生じる構造を可変にすることができる。技術的に公知であるように、ヌクレオシドは塩基と糖の化合物である。ヌクレオシドの塩基部は通常は複素環塩基部分である。該複素環塩基の2つの最も一般的な部類は、プリンおよびピリミジンである。本発明に関連して、“オリゴヌクレオシド”の用語は、リン原子を有しないインターヌクレオシド結合により接合したヌクレオシドのことを言う。この種類のインターヌクレオシド結合には、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、1つ以上の短鎖ヘテロ原子および1つ以上の短鎖複素環を含む。これらのインターヌクレオシド結合には、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、フォルムアセチル、チオフォルムアセチル、メチレン、フォルムアセチル、チオフォルムアセチル、アルケネイル、スルファメートを含むがこれらに限定されない。さらに、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホン酸塩、スルホンアミド、アミドおよび他の混合N、O、SおよびCH2構成部を有する化合物を含むがこれらに限定されない。
上記の置換インターヌクレオシド結合の合成における合成方式については以下に開示してある：USP No. 5,466,677; 5,034,506; 5,124,047; 5,278,302; 5,321,131; 5,519,126; 4,469,863; 5,455,233; 5,214,134; 5,470,967; 5,434,257。ヌクレオシド間結合に関する特別背景情報は以下のなかに見出すことができる：WO 91/08213; WO 90/15065; WO 91/15500; WO 92/20822; WO 92/20823; WO 91/15500; WO 89/12060; EP 216860; PCT/US 92/04294; PCT/US 90/03138; PCT/US 91/06855; PCT/US 92/03385; PCT/US 91/03680; USP出願番号 07/990,848; 07,892,902; 07/806,710; 07/763,130; 17/690,786; Stirchak, E.P.他、核酸Res.、1989、17、6129-6141；Hewitt, J.M.,他、1992、11、1661-1666；Sood, A.,他、J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 9000-9001; Vaseur, J.J.他、J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 4006-4007; Musichi, B.、他、J. Org. Chem., 1990, 55, 4231-4233; Reynokds, R.C..、他、J. Org. Chem,. 1992, 57, 2983-2985; Mertes, M.P.、他、J. Med. Chem., 1969, 12, 154-157; Mungall, W.S., 他、J.Org. Chem., 1977, 42, 703-706; Stirchak, E.P., 他、J. Org. Chem., 1987, 52, 4202-4206; Coull, J.M.、他、Tet. Lett., 1987, 28, 745; およびWang, H.、他、Tet. Lett, 1991, 32, 7385-7388。
オリゴヌクレオチドの合成で使用するホスホロアミダイトは、さまざまな商業的出所から入手できる（以下を含む：Glen Research, スターリング、バージニア州；Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ピスカタウェイ、ニュージャージー州；Cruachem Inc.、アストン、ペンシルベニア州；Chemgenes Corporation、ウォルサム、マサチューセッツ州；Proligo LLC、ボールダー、コロラド州；PE Biosystems、フォスター市、カリフォルニア州；Beckman Coulter Inc.、フラートン、カリフォルニア州）。これらの商業的出所では、一般に純度が98％よりも高い高純度ホスホロアミダイトを販売している。販売されるすべてのアミダイトの純度を一律に示さない商業的出所は、大部分の場合には、少なくとも購入した特定ホスホロアミダイトの純度を示す各購入ロットに関する分析を含める。市販ホスホロアミダイトは大部分が自動DNA合成用に調製され、それ自体は所望配列のオリゴヌクレオチドの合成用に直接使用するために調製されている。ホスホロアミダイトは、例えばCaruthers他（US 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679; および5,132,418）およびKoster他（US RE 34,069）により開示された方法により調製することがある。
二本鎖RNAなどの二本鎖オリゴヌクレオチドは、本書に記述するように、本発明による方法に従って製造することができる。RNA合成の場合は、アミダイト試薬の2’-OHを適した着脱可能な保護基で保護する必要がある。2’-OHに適した保護基については、USP No. 6,008,400, 6,111,086および5,889,136に記載してある。RNA合成用の特に適した2’-保護基は、US 6,111,086に記載してあるようにACE保護基である。幾つかの実施形態では、RNA合成に使用するアミダイトに異なる5’-保護基を使用することが好都合であるとみなされている。適した5’-保護基についてはUS 6,008,400に記述してある。特に適した5’-保護基は、US 6,008,400に教示してあるようなトリメチルシリロキシ（TMSO）基である。特に例1、10-13コラム参照。二本鎖RNAの個々の鎖は、別々に合成してからアニールして、二本鎖（デュプレックス）オリゴヌクレオチドを形成することができる。
オリゴヌクレオチドの用途
典型的な好適アンチセンス化合物には、実例の好適アンチセンス化合物の1つの5’-末端からの少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列を含む（残りの核酸塩基は、標的核酸と特にハイブリダイズすることのできるアンチセンス化合物の5’-末端のすぐ上流から始まる同じDNAまたはRNAの連続ストレッチであり、DNAまたはRNAが約8から約80の核酸塩基を含むまで続いている）。同様に好適なアンチセンス化合物は、実例の好適アンチセンス化合物の1つの3’-末端からの少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列により表される（残りの核酸塩基は、標的核酸と特にハイブリダイズすることのできるアンチセンス化合物の3’-末端のすぐ下流から始まる同じDNAまたはRNAの連続ストレッチであり、DNAまたはRNAが約8から約80の核酸塩基を含むまで続いている）。当業者は、本書に例示する実験的に誘導した好適なアンチセンス化合物を備えたならば、必要以上の実験をすることなく、さらに好適なアンチセンス化合物を特定することができる。
標的とハイブリダイズして標的の発現を抑制する発明のアンチセンスおよび他の化合物は、実験により特定され、これらの化合物の代表的配列が、発明の好適な実施形態として本書に特定されている。該アンチセンス化合物の特定配列が本書に記述されているので、これらが、本発明の範囲内で特定実施形態を例証して記述するために役立つということを当業者は認識するであろう。付加的な好適アンチセンス化合物は、普通の技術を有する者が特定することができる。
本発明で使用可能な好適アンチセンス化合物の特定な例には、修飾骨格または非天然インターヌクレオシド結合を含んでいるオリゴヌクレオチドがある。本明細書に定義しているように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的では、時々技術上で参照するように、インターヌクレオシド骨格にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとみなすことができる。
RNAse H-依存アンチセンス
特定の遺伝子発現を抑制するためのある方法は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似物を“アンチセンス”剤として用いるものに関している。アンチセンス技術は、オリゴヌクレオチド、またはその類似物を、特定の標的メッセンジャーRNA(mRNA)配列に向けるものに関している。外因性“アンチセンス”分子と内因性mRNAとの相互作用は、さまざまな経路による転写を調節する。該経路には、転写停止、RNAseH採用、およびRNAi（例、siRNA）を含む。アンチセンス技術は、比較的予測できる方法で特定タンパク質の活性を調節することができる。
本発明は、一般的に上記した方法により実施することできる以下の、限定的ではない、説明に役立つ実例を参照して、さらに理解することができる。
実施例1
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。7時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例2
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。15時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例3
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。20時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例4
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を80℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例5
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を85℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例6
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（250 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例7
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（110 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例8
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（15 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例9
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（20 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例10
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（40 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（250 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例11
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（350 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例12
脱イオン水（1500 mL）およびポリビニルアルコール（40 g）を、機械式撹拌器、凝縮器および窒素吸気口を装備した反応容器（2 Ｌ）の中に入れる。反応は、全重合方法に渡って常に窒素雰囲気下で保つ。スチレン（190 g）、55％-ジビニルベンゼン（45%-エチルスチレン）（30 g）、アセトキシスチレン（10 g）、過酸化ベンゾイル（4 g）、イソオクタン（90 g）、2-エチルヘキサノール（200 g）からなる有機溶媒を反応容器に加える。この混合物を一定速度（450 rpm）で撹拌して、所望ビーズサイズ分布にする。次に反応装置を75℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止し、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。脱イオン水（300 mL）、エタノール（1000 mL）および乾燥させたビーズを、機械式撹拌器（200 rpm）および凝縮器を装備した反応容器（2 L）の中に入れる。次に反応装置を70℃で加熱する。12時間後に、モーターを停止させ、形成したビーズをろ過して、脱イオン水とアセトンで洗浄する。該ビーズはアセトンの中で分散させてからふるいにかけて、真空のもとで乾燥させる。
実施例13：5’-O-DMTチミジン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒ塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としてのDMT Tヌクレオシド・コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じ、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに追加し、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例14：5’-O-DMT-N4-ベンゾイル-2’-デオキシシチジン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N4-ベンゾイル-2’-デオキシシチジン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例15：5’-O-DMT-N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例16：5’-O-DMT-N2-イソブチリル-2’-デオキシグアノシン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N2-イソブチリル-2’-デオキシグアノシン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例17：5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例18：5’-O-DMT-N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチルシチジン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチルシチジン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例19：5’-O-DMT-N6-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチルアデノシン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N6-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチルアデノシン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例20：5’-O-DMT-N2-イソブチル-2’-O-メトキシエチルグアノシン-3’-O-コハク酸エステルの固体サポートへのローディング
保護ヌクレオシドのローディングは、実験1で得られた固体サポートを用いて標準条件下で行う。固体サポート、ヒューニッヒの塩基（12当量）、HBTU活性剤（4当量）、トリエチル・アンモニウム塩としての5’-O-DMT-N2-イソブチル-2’-O-メトキシエチルグアノシン-3’-O-コハク酸エステル（2.0当量）を丸底フラスコの中に入れて、閉じて、室温で10時間機械的に振動させた。該サポートを次にアセトニトリル（100 ml）で洗浄して乾燥させる。次に、オリゴマー化に使用したCap AおよびCap B溶液（各々20 ml）を固体サポートに加えて、続いて4-ジメチルアミノピリジンの触媒量を追加し、一晩中機械的に振動させる。該サポートは、アセトニトリル（200 ml）、メタノール（100 ml）および最後に無水エーテル（200 ml）で洗浄する。該サポートは最終的に完全に乾燥させて保管する。
実施例21：完全修飾5’-d(TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT)-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよびDMTチミジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを供給する。
実施例22：完全修飾5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中の10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中のフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを供給する。
実施例23：完全修飾5’-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例24：完全修飾5’-d(TCC-GTC-ATC-GCT-CCT-CAG-GG)-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよびDMT N2-イソブチル-2’-デオキシグアノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例25：完全修飾5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例26：完全修飾5’-[2’-O-メトキシエチル-(TGTG]-d(CTA-TTC-TGT-G-)-[2’-O-メトキシエチル-(AATT]-3’ホスホロチオエート18-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよび5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例27：完全修飾5’-[2’-O-メトキシエチル-(CAGC]-d(AGC-AGA-GTC-TTC-A-)-[2’-O-メトキシエチル-(TCAT]-3’ホスホロチオエート21-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチル・ホスホロアミダイトおよび5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを供給する。
実施例28：完全修飾5’-[2’-O-メトキシエチル-(GCTCC]-d(TTC-CAC-TGA-T)-[2’-O-メトキシエチル-(CCTGC]-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよび5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチル・ジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例29：完全修飾5’-[2’-O-メトキシエチル-(GCTCC]-d(TTC-CAC-TGA-T)-[2’-O-メトキシエチル-(CCTGC]-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよび5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例30：完全修飾5’-[2’-O-メトキシエチル-(GCCTC]-d(AGT-CTG-CTT-C)-[2’-O-メトキシエチル-(GCACC]-3’ホスホロチオエート20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよび5’-O-DMT-2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。硫化は、アセトニトリル：3-ピコリン（1:1 v/v）中でフェニルアセチルジスルフィドの0.2 M溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例31：5’-d(TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT)-3’リン酸ジエステル20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMTチミジン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中の10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。酸化は、標準ヨード溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望のリン酸オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例32：5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’リン酸ジエステル20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。酸化は、標準ヨード溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望リン酸オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例33：5’-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3’リン酸ジエステル20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。酸化は、標準ヨード溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望リン酸オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例34：5’-d(TCC-GTC-ATC-GCT-CCT-CAG-GG)-3’リン酸ジエステル20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT N2-イソブチル-2’-デオキシグアノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。酸化は、標準ヨード溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望リン酸オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例35：5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’リン酸ジエステル20-merの合成
上記配列の合成は、上記のように調製したシアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT N6-ベンゾイル-2’-デオキシアデノシン誘導体化固体サポートを用いて約420マイクロモルスケールでAmersham Bioscience Akta 100 DNA/RNA合成装置において行った。脱トリチル化は、トルエン中で10％ジクロロ酢酸を用いて行う（v/v%）。酸化は、標準ヨード溶液を用いて2分間行う。合成の終わりに、サポートをアセトニトリルで洗浄し、55℃で12時間水酸化アンモニウムを用いて開裂、脱保護する。原料を通常の方法で精製して所望リン酸オリゴヌクレオチドを供給する。
実施例36：オリゴヌクレオチドの合成の一般的手順
以下の手順に従って2.2mM合成を行う：
1. 200μmをロードしたサポートの11.0gを35mmのフロースルーカラムに送り出す。
2. 約150 mLのトルエンを該カラムに加えて、該サポートを数分間膨潤させる。膨潤されたサポートは、カラムの底板からサポートベッドの上部までを約5.2 cmの長さにすべきである。
3. 該カラム上部のネットアダプターを約7.2cmに下げて、サポートベッドとカラム上板との間に2 cmのすき間を作る。
4. カラムのロッキング装置を締める。
5. ヌクレオシドホスホロアミダイトを用いて固相オリゴヌクレオチド合成を行い、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを作る。
手順5の合成は、サポートが第一シントンを含むようにあらかじめ誘導体化されていない場合には、標準的な試薬を用いてリンカー（例えばユニリンカー）を介する第一ヌクレオシドのサポートとの結合を含むことができる。あるいは、サポートがあらかじめ誘導体化されている場合には、上記のように該誘導体化サポートをカラムにロードし、合成はホスホロアミダイト・シントンの付加へと続く。さらに、（誘導体化または非誘導体化）サポートがあらかじめ膨潤されてからカラムにロードされる場合には、該膨潤サポートがロードされて上記の2 cmすき間を作るようにする。
実施例37：高分子ビーズの合成
ビーズの特性に及ぼす各種の実験パラメータの影響を確認するために、さまざまな調製条件下において幾つかのビーズを作り、その物理的特性を調べた。その結果を以下の表に
要約する。
Figure 2008511743
本発明の好適実施形態に対して非常に多くの変更および修正を行うことができること、および本発明の精神から逸脱することなく該変更および修正を行うことができることを当業者は理解することができる。したがって、付記した特許請求の範囲は、該等価変動をすべて含んでおり、発明の真の精神および範囲内に入っていることが意図されている。
特許、明細書、および本特許文書に記載した本などの印刷した刊行物の各々は、それらの全体が参考の為に本書に組み込んであることが意図されている。
本出願は、2004年9月２日に出願した米国仮出願No. 60/606,873の利益を請求するものであり、その全開示内容を参考として本書に組み込んである。

Claims (32)

  1. (a)有機相の準備；および
    (b)高分子ビーズを形成するために有効な時間、温度および圧力条件のもとで、該有機相を水相と接触させる方法；
    を含む高分子ビーズを製造するための方法であって、
    上記有機相が、オレフィン単量体、架橋単量体、機能性単量体、開始剤、有機溶剤を含み；
    上記有機溶剤は1つ以上の液体炭化水素を含み；および/または5個から12個の炭素原子を有するアルコールを含み；
    上記水相は水および分散試薬を含み；
    単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントが60％から96％であり；
    単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントが3％から9.9％であり；
    単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントが1％から20％であり；
    有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントが33％から67％であり；
    有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントが33％から67％であり；
    有機溶剤のなかに存在する液体炭化水素の質量パーセントが0％から80％であり；
    有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントが20％から100％であり；および
    水相に最初に存在する分散試薬の質量パーセントが0.01％から20％であることを特徴とする高分子ビーズを製造するための方法。
  2. 単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントが75％から94％であり；
    単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントが4％から9.9％であり；
    単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントが2％から10％であり；
    有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントが35％から60％であり；
    有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントが40％から65％であり；
    有機溶剤のなかに存在する炭化水素の質量パーセントが5％から70％であり；
    有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントが30％から95％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 単量体のなかに最初に存在するオレフィン単量体の質量パーセントが82％から91.5％であり；
    単量体のなかに最初に存在する架橋単量体の質量パーセントが5.5％から9.9％であり；
    単量体のなかに最初に存在する機能性単量体の質量パーセントが3％から8％であり；
    有機相のなかに最初に存在する単量体の質量パーセントが40％から50％であり；
    有機相のなかに最初に存在する有機溶剤の質量パーセントが50％から60％であり；
    有機溶剤のなかに存在する液体炭化水素の質量パーセントが10％から60％であり；および
    有機溶剤のなかに最初に存在する5から12個の炭素原子を有するアルコールの質量パーセントが40％から90％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 該オレフィン単量体が1つ以上のアリールビニル化合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 該オレフィン単量体がスチレンおよび/またはエチルスチレンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 該架橋単量体が2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 該架橋単量体が芳香族部分に結合した2つの非共役ビニル基を有するオレフィン架橋単量体であり；該芳香族部分は5または6員の芳香族環であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 該架橋単量体がジビニルベンゼンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 該機能性単量体が保護官能基を有するオレフィン単量体であって、脱保護されると、エステルまたはアミドを形成するために酸または無水酸と反応することのできる官能基を生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 該機能性単量体が保護ヒドロキシル基を有するオレフィン単量体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 該機能性単量体がアセトキシスチレンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 該開始剤が安定化過酸化物またはアゾ化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 該安定化過酸化物が過酸化ベンゾイルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 該有機溶剤が、1つ以上の液体アルカン、ベンゼン、トルエン、キシレンおよび/または5個から12個の炭素原子を有するアルコールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  15. 該有機溶剤が1つ以上のオクタン、および/または5から12個の炭素原子を有するアルコールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  16. 該有機溶剤がイソオクタン、および/または2-エチルヘキサノールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  17. 該分散試薬がポリアルコールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  18. 該分散試薬がポリビニルアルコールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  19. 該有機相および水相を、25℃から95℃の温度に加熱することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  20. 該有機相および水相を、70℃から85℃に加熱することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  21. 該有機相および水相を、75℃から80℃に加熱することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  22. 請求項1に記載する通りの方法により形成されることを特徴とする高分子ビーズ。
  23. 該ビーズに、ビーズ1グラムあたり100μモルからビーズ1グラム当り350μモルまでのローディング能力があることを特徴とする、請求項２２に記載の高分子ビーズ。
  24. 該ビーズが10から300μmの平均粒子サイズを有することを特徴とする、請求項２２に記載の高分子ビーズ。
  25. 該ビーズが10から100nmの平均細孔サイズを有することを特徴とする、請求項２２に記載の高分子ビーズ。
  26. 該ビーズが10から100m2/gの比表面積を有することを特徴とする、請求項２２に記載の高分子ビーズ。
  27. 式Iの化合物：
    Figure 2008511743
     ここで：
    G3はO、S、CH2またはNHであり;
    G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-であり；
    G6はO、S、CH2、またはNHである；
    各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    各R3’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    各R4’はH、置換基、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、R5’と共に架橋を形成する；
    qは0または1である；
    各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    Bxは核酸塩基である；
    T’はHまたは着脱可能な保護基である；
    LLは連結部分であり、および
    SSは請求項２２に記載のビーズである。
  28. 式IIの化合物：
    Figure 2008511743
     ここで：
    mは0から100までの整数であり；
    各G1はOまたはSであり；
    各G2はOHまたはSHであり；
    各G3はO、S、CH2またはNHであり;
    各G5はO、S、CH2、CFH、CF2、または-CH=CH-であり；
    各R2’はH、OH、O-rgであり、ここでrgは着脱可能な保護基、2’-置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    各R3’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    各R4’はH、置換基、R2’と共に架橋を形成し、R3’と共に架橋を形成し、R5’と共に架橋を形成する；
    各qは0または1である；
    各R5’はH、置換基、またはR4’と共に架橋を形成する；
    各G6’は、独立して、O、S、CH2またはNHである；
    各Bxは核酸塩基である；
    pgは着脱可能なリン保護基である；
    T’は着脱可能な保護基である；
    LLは連結部分であり、および
    SSは請求項２２に記載のビーズである。
  29. 予め定められた配列のポリヌクレオチドを合成するための方法であり、架橋単量体を含む複数の単量体からできたポリスチレンサポートを用いて成るもので、上記の複数の単量体のなかに最初に存在する架橋単量体が質量で3％から9.9％であることを特徴とするポリヌクレオチドを合成する方法。
  30. 上記の複数の単量体のなかに最初に存在する該架橋単量体が質量で5.5％から9.9％であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
  31. 上記の複数の単量体のなかに最初に存在する該架橋単量体が質量で7％である、請求項２９に記載の方法。
  32. 該架橋単量体がジビニルベンゼンであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
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