CN104321332A - 组合物和缀合寡核苷酸的方法 - Google Patents

组合物和缀合寡核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种具有式(A)结构的寡核苷酸衍生物和制备该寡核苷酸衍生物的方法。其中R3为第一寡核苷酸；R1选自烷基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、和第二寡核苷酸；R2为接头或直连键；Z1为NR4、S、或O，且Z2为NR4或S，其中R4选自H、烷基、芳基、杂环基、或杂芳基。一种方法包括：合成包含氨基或硫醇基的寡核苷酸衍生物；和使3,4-二烷氧基环丁烯-1,2-二酮与该寡核苷酸衍生物反应产生寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物。

Description

组合物和缀合寡核苷酸的方法
优先权要求和相关的专利申请
本申请要求2012年5月21日提交的美国临时申请序号61/649,766的优先权的利益，其全部内容整体引入本申请中作为参考。
发明领域
本申请概括而言涉及寡核苷酸的试剂、合成和纯化领域。更具体地，本发明涉及寡核苷酸衍生物的组合物和缀合寡核苷酸的方法。
发明背景
可获得许多用于使寡核苷酸与其它分子缀合的方法。这些方法典型地包括在靶向实体上连接反应性部分以与寡核苷酸偶联。靶向实体与反应性部分通常分开制备，通常通过有机合成法制备，并在使用前纯化。
在各种情况下将寡核苷酸用合适的官能团修饰用于与靶向实体上的反应性部分反应。寡核苷酸的修饰通常通过制备特定的亚磷酰胺和/或修饰碱基、和将它们于期望的位点引入到寡核苷酸序列中来完成。这些酰亚胺试剂中许多试剂含有需要保护基团的用于将这些试剂与寡核苷酸偶联的官能团。这些保护基团必须在随后的缀合反应发生之前脱除。作为替代，靶向实体上的反应性部分可在与寡核苷酸缀合之前产生。
目前大部分偶联化学包括使用或产生缀合伴侣中至少一个的水解和/或氧化不稳定的物质(species)。在需要与寡核苷酸(或蛋白质、或任何有机不溶性/水溶性物质)缀合的条件下(典型地在含水溶液中)这是问题。
较新的缀合化学在反应时可能产生新颖结构。例如，授权给Pieken等的美国专利6,737,236，公开了用于生物分子缀合的环化加成反应。例如，在炔和叠氮化物之间的1,3-偶极环加成缀合(以后描述为点击化学(clickchemistry)，Sharpless等Angew.Chem.Int.Ed.40:2004(2001))产生作为缀合产物部分的取代三嗪。如果寡核苷酸缀合物应用于人，则这些新化学实体可能是问题，因为这些新化学实体可能产生与寡核苷酸产品无关的毒性。
发明概述
本发明的一方面涉及具有式(A)结构的寡核苷酸衍生物：
其中R3为第一寡核苷酸；R1选自烷基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、和第二寡核苷酸；R2为接头或直连键；Z1为NR4、S、或O，且Z2为NR4或S，其中R4选自H、烷基、芳基、杂环基、或杂芳基。
在本发明的一些实施方案中，R2为与第一寡核苷酸的核碱基上的5’羟基、3’羟基、或环外氨基连接的(C1-C12)接头。在本发明的一些实施方案中，Z2为NH。在本发明的一些实施方案中，R1为(C1-C12)烷基且Z1为O。
在本发明的一些实施方案中，R1为1K-40K聚乙二醇且Z1为NH。在本发明的一些实施方案中，R1为第二寡核苷酸且Z1为NH，其中第二寡核苷酸可与第一寡核苷酸互补。
本发明的另一方面涉及缀合寡核苷酸的方法。根据本发明的一个实施方案的方法包括：合成包含氨基或硫醇基的寡核苷酸衍生物；和使3,4-二烷氧基环丁烯-1,2-二酮与寡核苷酸衍生物反应产生寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物。
在本发明的一些实施方案中，方法还包括使寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物与靶向实体反应，其中靶向实体选自聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、或第二寡核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸衍生物中的第二位置上包含第二氨基或硫醇基团，该方法还包括形成产生环状结构的寡核苷酸内交联。
本发明的其它方面和优点根据以下的说明书和所附权利要求书将是显而易见的。
附图简述
图1显示方形酸和与方形酸的各种反应。
图2显示根据本发明的一个实施方案修饰的寡核苷酸和方形酸二酯之间的反应。
图3显示根据本发明的一个实施方案寡核苷酸-方形酸酯单加成物与靶向实体(例如，R-NH2)的缀合。
图4显示根据本发明的实施方案寡核苷酸-方形酸酯单加成物与靶向实体的缀合。
图5显示使用所描述的方形酸酯偶联程序的两个互补RNA链的缀合，其中一个RNA链具有5’氨基，另一个RNA链具有3’氨基。
图6显示根据本发明实施方式的寡核苷酸-方形酸酯单加成物与各种第二胺靶向实体的缀合。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语为本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。本申请中使用的核酸化学、生物化学、遗传学、分子生物学的术语和符号遵循本领域中标准论文和文本的那些，例如Kornberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,NewYork,1992)；Lehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,NewYork,1975)；Strachan and Read,Human Molecular Genetics,Second Edition(Wiley-Liss,New York,1999)；Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogs:APractical Approach(Oxford University Press,New York,1991)；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2.sup.nd Edition(ColdSpring Harbor Laboratory,1989)等。还有，为清晰和便于参考对某些术语在下文进行了定义。
本申请中所使用的术语“核苷”，指修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷或核糖核苷或其任意化学修饰物。核苷的修饰包括但不限于，2'-、3'-和5'-位糖修饰，5-和6-位嘧啶修饰，2-、6-和8-位嘌呤修饰，在环外胺的修饰，5-溴-尿嘧啶的取代等。可对核苷进行适当地保护和衍生以使得能够通过本领域已知的方法进行寡核苷酸合成，诸如采用核苷亚磷酰胺单体、H-膦酸盐偶联或磷酸三酯偶联进行固相自动化合成。
本申请中所使用的术语“核苷酸”，指修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸为具有一个或几个连接在5'-、2'-或3'-位的磷酸酯或取代的磷酸酯的如上定义的核苷。核苷酸典型地包括嘌呤和嘧啶，其包括胸苷、胞苷、鸟苷、腺嘌呤和尿苷。
本申请中所使用的术语“寡核苷酸”，指由如上定义的多个连接的核苷酸单元形成的多聚核苷酸。核苷酸单元各自包括经磷酸酯连接基连接在一起的核苷单元。术语寡核苷酸也指经非磷酸酯连接基的连接基诸如硫代磷酸酯连接基连接在一起的多个核苷酸。寡核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。在优选的实施方案中本发明的寡核苷酸具有1-1,000个核苷酸。寡核苷酸可以合成或可以通过酶解制备，且在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以是10至20、21至30、31至40、41至50、51-60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200、200至500、或大于500个核苷酸。
本申请中所使用的术语“烷基”，指1至24个(即，(C1-C24)烷基)、典型地1-12个(即，(C1-C12)烷基)碳原子、更典型地1-6个碳原子(即，(C1-C6)烷基)的饱和直链、支化或环状烃基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、和2,3-二甲基丁基。术语“低级烷基”意指一至六个碳原子的烷基基团，包括，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、和2,3-二甲基丁基。术语“环烷基”指环烷基基团诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
本申请中所使用的“亚烷基”和“亚烷基链”，指直链或分支的二价烃链，使分子的其余部分与基团连接，仅仅由碳和氢构成，不含有不饱和度并具有一至十二个碳原子、优选具有一至八个碳，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链可通过链内的一个碳或通过链内的任意两个碳与分子的其余部分连接和与基团连接。
而且，术语“烷基”包括“修饰的烷基”，其指这样的烷基基团，具有一与二十四个(C1-C24)碳原子，且还具有诸如选自醚-、硫-、氨基-、磷-、氧-、酯-、和酰氨基-的一个或多个连接基的额外基团、和/或被一个或多个额外的基团包括低级烷基、芳基、烷氧基、烷硫基、羟基、氨基、磺酰基、硫基、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮、羧基、硫醚(sulfide)、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、和硼基取代。
类似地，术语“低级烷基”包括“修饰的低级烷基”，其指具有一至八个碳原子且还具有诸如选自醚-、硫-、氨基-、磷-、酮-、酯-、和酰氨基-的一个或多个连接的额外基团、和/或被一个或多个基团包括低级烷基；芳基、烷氧基、烷硫基、羟基、氨基、磺酰基、硫基、巯基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮、羧基、硫醚、砜、硫氧基、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、和硼基取代的基团。本申请中所使用的术语“烷氧基”指取代基-O-R，其中R为如上定义的烷基。术语“低级烷氧基”指其中R为低级烷基的这种基团。本申请中所使用的术语“烷硫基”指取代基-S-R，其中R为如上定义的烷基。
本申请中所使用的术语“芳基”，指仅由氢和碳构成的且含有6至19个碳原子(表示为(C6-C19)芳基)、优选6至10个碳原子(表示为(C6-C10)芳基)的芳族单环或多环(其中一些可以稠合在一起)烃环系，其中环系可以部分或全饱和的。芳基基团包括但不限于诸如芴基、苯基和萘基的基团。除非说明书中另有明确说明，术语“芳基”指包括任选地被选自以下的一个或多个取代基取代的芳基基团：(C1-C12)烃基，–O–R”,–O-CO–R”,–CO-O–R”,–NR’–R”,–NR’-CO–R”,–CO-NR’–R”,–CO–R”,–R–O–R”,–R–O-CO–R”,–R–CO-O–R”,–R–NR’–R”,–R–NR’-CO–R”,–R–CO-NR’–R”,–R–CO–R”,–CN,卤素，或它们的组合，其中R'和R”独立地为H或(C1-C12)烃基，且R为(C1-C12)烃基。
本申请中所使用的术语“杂芳基”，指由碳原子和一至五个选自氮、氧和硫的杂原子构成的5至18元的单环-或双环-或稠合多环-环系。优选地杂芳基为5-至12-或5-至9-元的环系。就本发明而言，杂芳基基团可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可包括稠合或桥连环系；且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。实例包括但不限于，氮杂卓基，吖啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并吲哚基，苯并噻二唑基，苯并萘并呋喃基，苯并噁唑基，苯并二氧杂环戊烯基，苯并二氧芑基(benzodioxinyl)，苯并吡喃基，苯并吡喃酮基，苯并呋喃基，苯并呋喃酮基，苯并噻吩基，苯并三唑基，苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基，咔唑基，噌啉基，二苯并呋喃基，呋喃基，呋喃酮基，异噻唑基，咪唑基，吲哚基，吲唑基，异吲哚基，二氢吲哚基，异二氢吲哚基，吲嗪基，异噁唑基，萘啶基，噁二唑基，2-氧代氮杂卓基(oxoazepinyl)，噁唑基，氧杂环丙基，吩嗪基，吩噻嗪基，吩噁嗪基，酞嗪基，蝶啶基，嘌呤基，吡咯基，吡唑基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，哒嗪基，喹唑啉基，喹喔啉基，喹啉基，奎宁环基，异喹啉基，噻唑基，噻二唑基，三唑基，四唑基，三嗪基，和噻吩基。除非说明书中另有明确说明，术语“杂芳基”指包括如上定义的杂芳基基团，其任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：(C1-C12)烃基，–O–R”,–O-CO–R”,–CO-O–R”,–NR’–R”,–NR’-CO–R”,–CO-NR’–R”,–CO–R”,–R–O–R”,–R–O-CO–R”,–R–CO-O–R”,–R–NR’–R”,–R–NR’-CO–R”,–R–CO-NR’–R”,–R–CO–R”,–CN,卤素，或它们的组合，其中R'和R”独立地为H或(C1-C12)烃基，且R为(C1-C12)烃基。
术语“杂芳基”还指其中杂芳环与一个或多个芳基、环脂族环、或杂环基环稠合的基团，其中残基(radical)或连接点在杂芳环上。非限制性实例包括但不限于1-、2-、3-、5-、6-、7-、或8-吲嗪基，1-、3-、4-、5-、6-、或7-异吲哚基，2-、3-、4-、5-、6-、或7-吲哚基，2-、3-、4-、5-、6-、或7-吲唑基，2-、4-、5-、6-、7-、或8-嘌呤基，1-、2-、3-、4-、6-、7-、8-、或9-喹嗪基，2-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-喹啉基(quinoliyl)，1-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-异喹啉基(isoquinoliyl)，1-、4-、5-、6-、7-、或8-酞嗪基，2-、3-、4-、5-、或6-二氮杂萘基，2-、3-、5-、6-、7-、或8-喹唑啉基，3-、4-、5-、6-、7-、或8-噌啉基，2-、4-、6-、或7-蝶啶基，1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-4aH咔唑基，1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-咔唑基(carbzaolyl)，1-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、或9-咔啉基，1-、2-、3-、4-、6-、7-、8-、9-、或10-菲啶基，1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、或9-吖啶基，1-、2-、4-、5-、6-、7-、8-、或9-白啶基，2-、3-、4-、5-、6-、8-、9-、或10-邻二氮杂菲基，1-、2-、3-、4-、6-、7-、8-、或9-吩嗪基，1-、2-、3-、4-、6-、7-、8-、9-、或10-吩噻嗪基，1-、2-、3-、4-、6-、7-、8-、9-、或10-吩噁嗪基，2-、3-、4-、5-、6-、或1-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、或10-苯并异喹啉基(benzisoqinolinyl)，2-、3-、4-、或噻吩并[2,3-b]呋喃基，2-、3-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、或11-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基，2-、3-、5-、6-、或7-2H-呋喃并[3,2-b]-吡喃基，2-、3-、4-、5-、7-、或8-5H-吡啶并[2,3-d]-邻噁嗪基，1-、3-、或5-1H-吡唑并[4,3-d]-噁唑基，2-、4-、或54H-咪唑并[4,5-d]噻唑基，3-、5-、或8-吡嗪并[2,3-d]哒嗪基，2-、3-、5-、或6-咪唑并[2,1-b]噻唑基，1-、3-、6-、7-、8-、或9-呋喃并[3,4-c]噌啉基，1-、2-、3-、4-、5-、6-、8-、9-、10、或11-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基，2-、3-、6-、或7-咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基，7-苯并[b]噻吩基，2-、4-、5-、6-、或7-苯并噁唑基，2-、4-、5-、6-、或7-苯并咪唑基，2-、4-、4-、5-、6-、或7-苯并噻唑基，1-、2-、4-、5-、6-、7-、8-、或9-苯并氧杂卓基(benzoxapinyl)，2-、4-、5-、6-、7-、或8-苯并噁嗪基，1-、2-、3-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、或11-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮杂卓基(benzazapinyl)。典型的稠合杂芳基团包括但不限于2-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-喹啉基，1-、3-、4-、5-、6-、7-、或8-异喹啉基，2-、3-、4-、5-、6-、或7-吲哚基，2-、3-、4-、5-、6-、或7-苯并[b]噻吩基，2-、4-、5-、6-、或7-苯并噁唑基，2-、4-、5-、6-、或7-苯并咪唑基，2-、4-、5-、6-、或7-苯并噻唑基。
本申请中所使用的术语“环烷基”，指仅由碳和氢原子构成的稳定的非芳香单环或双环烃基团，其具有三至十五个碳原子，优选具有三至十二个碳原子，(C3-C12)环烷基，并且它是饱和或不饱和的并通过单键与分子的其余部分连接，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、萘烷基等。除非说明书中另有明确说明，术语“环烷基”指包括任选地被一个或多个选自以下的取代基取代的环烷基基团：–O–R”,–O-CO–R”,–CO-O–R”,–NR’–R”,–NR’-CO–R”,–CO-NR’–R”,–CO–R”,–CN,卤素，或其组合，其中R'和R”独立地为H或(C1-C12)烃基。
本申请中所使用的术语“杂环基”或“杂环”，指任选取代的、饱和的或部分不饱和的、非芳香环状基团，例如其为4-至7-元单环、7-至12-元双环或10-至15-元三环环系，其在含有至少一个碳原子的环中具有至少一个杂原子。含有杂原子的杂环基团的各环可具有1、2、3、或4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，其中氮和硫杂原子还可任选地被氧化。杂环基团可在杂原子或碳原子上连接。如果所得到的化合物稳定，那么本文中描述的杂环可在碳上或在氮原子上被取代。如果特别指出，则杂环中的氮可任选地被季铵化。优选当杂环中的S和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。双环(bicyciic)和三环杂环基基团可以是稠合环或螺环或环基团。优选地杂环基为4-至12-元环系。还优选杂环基为4-至9-元环系。
示例性的单环杂环基团包括氧杂环丁基，硫杂环丁基(thiatanyl)，吖丁啶基，二氢呋喃基，四氢呋喃基，二氢噻吩基，四氢噻吩基，吡咯烷基，二氢吡唑基，四氢吡唑基，二氢吡啶基，四氢吡啶基，二氢噻喃基，四氢噻喃基(tetrahydrothipyranyl)，吡喃基，二氢吡喃基，四氢吡喃基，噻喃基，二氢噻喃基，四氢噻喃基，哌啶基(ptperidinyl)，哌嗪基，吗啉基(morphoiinyl)，氮杂卓基，二氢氮杂卓基，四氢氮杂卓基，2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，2-氧代氮杂卓基(oxoazepinyl)，氧杂环庚基(oxepanyl)，硫杂环庚基(thiepanyl)，二氢硫杂环庚三烯基(dihyrothiepinyl)，四氢硫杂环庚三烯基(tetrahydrothiepinyl)，二氢氧杂环庚三烯基(dihydrooxepinyl)，四氢氧杂环庚三烯基(tetrahydrooxepinyl)，1,4-二噁烷基，1,4-氧杂硫杂环己基(1,4-oxathianyl)，吗啉基(morphoiinyl)，噁唑基，噁唑烷基，异噁唑啉基(isoxazolinyi)，4-哌啶酮基(A-ptperidony！)，异噁唑啉基(isoxazoiinyi)，异噁唑基，1,4-氮杂硫杂环己基(1,4-azathianyl)，1,4-氧杂硫杂环庚基(1,4-oxathiepanyl)，1,4-氧杂氮杂环庚基(oxaazepanyl)，1,4-二硫杂环庚基(1,4-dithiepanyl)，1,4-硫杂氮杂环庚基(1,4-thieaxepanyl)，1,4-二氮杂环庚烷基，托烷基(tropanyl)，3,4-二氢-2H-吡喃基，5,6-二氢-2H～吡喃基，噻唑烷基，硫吗啉基，硫吗啉基亚砜，硫吗啉基砜(thiamorphoiinyl suifone)，1,3-二氧杂环戊烷和四氢-1,1-二氧代噻吩基(dioxothienyl)，1,1,4-三氧代-1,2,5-噻二唑-2-基，吡唑啉基等。
示例性的双环杂环基团包括但不限于，二氢吲哚基，奎宁环基(quinuctidinyl)，四氢喹啉基，十氢喹啉基，2-氧杂-6-氮杂螺[3,3]庚-6-基，四氢异喹啉基(tetrahydroisoquinoiinyl)，十氢异喹啉基(decahydroisoquinoiinyl)，二氢异吲哚基，二氢吲哚基(indoiinyl)，降冰片烷基(norboranyl)，金刚烷基等。
除非明书中另有明确说明，术语“杂环基”指包括如上定义的杂环基基团，其任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：–O–R”,–O-CO–R”,–CO-O–R”,–NR’–R”,–NR’-CO–R”,–CO-NR’–R”,–CO–R”,–CN,卤素，或其组合，其中R'和R”独立地为H或(C1-C12)烃基。
本申请中所使用的术语“直连键”，指通过“直连键”连接的两个实体相互直接连接。例如，直连键可以是单键或双键。
本申请中所使用的术语“DNA”、或“脱氧核糖核酸”，指包含至少一个脱氧核糖核苷酸残基的多聚核苷酸或寡核苷酸。
本申请中所使用的术语“RNA”、或“核糖核酸”，指包含至少一个核糖核苷酸残基的多聚核苷酸或寡核苷酸。
本申请中所使用的“接头”将分子中的两个部分桥连。“接头”可以是烃基链(例如，(C1-C12)亚烷基、(C2-C12)亚烷基)，任选地被取代基团取代，或者接头可以是穿插其它原子的烃基链，其以–(CHR’)a–Wb–(CHR’)c–Vd–(CHR’)e–表示，其中W和V独立地为–O–、–S–、或–NR’–；R'为H或(C1-C6)烷基；且a、b、c、d和e独立地为0至10的整数，优选为0至6，或优选0至3，且a、b、c、d和e的总和优选为2至6的整数。任选的取代基可以是–O–R”,–O-CO–R”,–NR’–R”,–NR’-CO–R”,–CO-NR’–R”,–CO–R”,–CN,卤素，或其组合，其中R'和R”独立地为H或(C1-C6)烃基。
本申请中所使用的术语“聚乙二醇”，指具有式R-(O-CH2-CH2)n-O-R’的聚醚化合物，其中R和R'独立地为H或烷基。“聚乙二醇衍生物”指具有式R-(O-CH2-CH2)n-X-R’的聚醚化合物，其中R和R'独立地为H或烷基，且X为O或NH。
本申请中所使用的术语“多肽”，指含有通过肽键连接的多个氨基酸的分子。多肽可由天然的蛋白质或化学合成产生。
本申请中所使用的术语“蛋白质”，指含有一个或多个多肽的分子。蛋白质通常为天然的来源，但可包括由天然的蛋白质经修饰的那些。
本申请中所使用的术语“多糖”或“多聚碳水化合物”，指具有通过糖苷键连接的多个糖基团的碳水化合物分子。
“任选的”或“任选地”指随后描述的情况可发生或可不发生，以致该描述包括该情况发生的例子和它不发生的例子。例如，短语“任选取代的”指非氢取代基可或可不存在，因此该描述包括其中非氢取代基存在的结构和其中非氢取代基不存在的结构。
发明详述
本发明的实施方案涉及使寡核苷酸与其它分子或靶向实体缀合的方法。寡核苷酸可包括DNA、RNA、或嵌合DNA/RNA。靶向实体可以是任意的期望的靶标，诸如其它寡核苷酸、蛋白质/肽、碳水化合物、或载体(supports)(其可包括可溶性聚合物或固体载体，诸如树脂、玻璃珠、磁珠、基质表面等)。
本发明的实施方案基于以下事实：方形酸及其衍生物能在温和的条件下容易与氨基基团偶联。这些缀合方法提供简易的基于水的制备寡核苷酸缀合物的方法。由这些反应得到的产物是稳定的且能容易地分离和储存。另外，方形酸衍生物已用于药物的修饰并被发现是无毒的。
图1显示方形酸的结构(即，环丁烯3,4二酮)，其能与醇反应得到方形酸二酯。该酯化可在常规羧酸的酯化中的酸催化剂的存在下容易地发生。方形酸酯的亲核取代可容易地发生，例如与作为亲核试剂的胺发生得到相应的单酰胺或二酰胺。这些性质可用于许多应用中，包括修饰生物分子以改变它们的性质。
除酯之外，其它也可用于与亲核试剂(例如，氨基基团或硫醇基团)反应的方形酸衍生物包括方形酸卤化物、方形酸酯卤化物、和方形酸咪唑类。所有的这些方形酸衍生物都可用于本发明的实施方案，且所有的这些试剂都可与具有氨基或硫醇官能团的寡核苷酸反应。本发明的实施方案优选使用方形酸二酯作为该试剂。
已经描述了方形酸衍生物用于与小分子缀合、和用于将小分子与蛋白质或碳水化合物缀合的用途。它还用于将大分子诸如20K多糖与蛋白质偶联。另外，授权给Glüsenkamp等的美国专利6,602,692公开了方形酸衍生物将肽与固体载体缀合的用途，其中固体载体已经用方形酸衍生物修饰。该‘692专利的公开完整引入作为参考。
本发明的实施方案可使用以上任意的方形酸衍生物。本发明的优选实施方案使用方形酸酯(squaric acid esters)，其可通常称为方形酸酯(squarate)。方形酸酯为二酯，其中两个酯基(-OR基团)可以相同或不同。
尽管方形酸酯缀合多种分子的应用是已知的，还没有报道采用该技术用于与DNA或RNA缀合的应用。相当大的努力针对寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为诊断/研究试剂或作为潜在治疗的应用寡核苷酸作为药物的潜在应用的实例可包括能与一定的编码区结合以阻碍蛋白质表达或阻断多种细胞功能的反义寡核苷酸。此外，SELEX技术的发展(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，配体指数级系统进化)(Tuerk and Gold,Science,249:505(1990))使得鉴定与几乎任何生物学感兴趣的靶标结合的寡核苷酸成为可能。
寡核苷酸作为药物治疗剂的潜在应用已经导致目的在于增加它们的治疗活性和稳定性的各种化学修饰的进一步发展。这种修饰可增加寡核苷酸的细胞渗透或它们对核酸酶的抵抗。另外，这些修饰可增强寡核苷酸与它们的靶标的结合或可改进寡核苷酸的药代动力学性质。因此，能容易修饰寡核苷酸以用于各种应用的方法是期望的。
本发明的实施方案提供在很温和的条件下修饰寡核苷酸的方法且这些方法适合应用于寡核苷酸药物的修饰。根据本发明的实施方案，可用任何合适的方法制备寡核苷酸衍生物(含有用于与方形酸衍生物偶联的反应性官能团)。例如，可合成含用于与方形酸衍生物偶联的反应性官能团(例如，氨基基团)的寡核苷酸。反应性官能团，例如，可以是氨基基团或硫醇基团。作为替代，技术人员可使用核碱基上的环外氨基用于偶联。
多种使官能团与寡核苷酸连接的方法是已知的。(关于综述，参见Goodchild,Bioconjugate Chemistry,1:165-187(1990))。一旦化学反应性官能团与寡核苷酸连接(例如，在5'-端和/或3’-端)，这些反应性官能团就可用于与多种缀合物偶联。例如，脂肪族伯胺基基团可在寡核苷酸合成的最后步骤中在寡核苷酸的5'-端引入。连接寡核苷酸的5'端的试剂可商购获得。例如，各种用于连接寡核苷酸5'端的具有不同长度的–(CH2)n–连接头的接头是可获得的。一个实例为5'-氨基-改性剂C6，其可得自Glen Research Corp.(Sterling,Va.)。用于寡核苷酸的3’-端的氨基改性剂也是易于获得的，或者作为亚磷酰胺或者已经连接于合成固体载体。
用于修饰寡核苷酸以提供反应性官能团的试剂可以是亚磷酰胺的形式，当其与固体载体连接时其可与全长寡核苷酸的游离5’-羟基基团偶联。这种偶联如同连接另一个核苷酸单体。(参见，例如，Theison等，Tetrahedron Lett.,33:5033-5036(1992).)
根据本发明的一些实施方案，可采用修饰的核苷酸将反应基团(例如，氨基或硫醇基团)与寡核苷酸连接。在这种情况下，反应基团不必与5’或3’端连接。相反，技术人员可使用这些修饰的核苷酸类似物在内部的位置引入反应基团。这种修饰的核苷酸的一些实例如下所示：
在以上实例中，R1为H或OH。式(I)代表天然的核苷或脱氧核苷(R为H或OH)，而式(II)–(IV)(其中n为大于0的整数)代表在糖环上具有反应性氨基基团修饰的多种类似物。这些氨基基团将在这些类似物引入到寡核苷酸中的过程中被保护。这些试剂中的一些试剂可商购获得或可根据本领域已知的方法制备。
其它修饰的核苷酸类似物可在嘌呤或嘧啶环上具有修饰，诸如如下所示的那些：
以上式(V)–(X)(其中n为大于0的整数)显示了含有反应性氨基基团的核苷酸类似物的实例。这些类似物可用于在这些氨基基团已被保护后引入到寡核苷酸中。这些试剂中的一些试剂可商购获得或可根据本领域已知的方法制备。
一旦寡核苷酸以反应性官能团(例如，氨基或硫醇基团)衍生化，它们就可用于与方形酸衍生物偶联。以下实施例举例说明本发明的一些实施方案。
根据本发明的一些实施方案，寡核苷酸-方形酸酯单缀合物可用于使寡核苷酸与其它靶向实体连接，其中其它靶向实体，诸如肽、蛋白质、寡糖、固体表面、聚合材料、纳米粒子、水凝胶和小分子。
根据本发明的一些实施方案，这些单缀合物可用于与为了特定目的可选择来的其它柄(handles)偶联。这种应用的一个实例是使二烯部分(例如，呋喃)与寡核苷酸-方形酸酯单加成物连接以便此寡核苷酸-方形酸酯单加成物参与与亲二烯体-连接的分子(例如，N-乙基马来酰亚胺)的狄尔斯阿尔德反应(Diels Alder reaction)，其公开于同一天提交的一同等待审批的申请。
应当注意尽管本申请中描述的实施例使用氨基基团与方形酸酯缀合，但也可使用其它亲核基团(例如，硫醇)。
用有限量的含超过一个氨基的物质(例如二胺、三胺至多胺)处理寡核苷酸单方形酸酯将提供制备多聚体寡核苷酸结构的方法。
这种缀合的另一应用可以是将两个氨基标记的寡核苷酸偶联在一起以形成环状或发夹-型的寡核苷酸结构。寡核苷酸可以是互补序列，其中3’氨基标记在一条链上而5’氨基标记在另一条链上。这将生成发夹样的二聚体。
本发明的优点可包括以下中的一个或多个。本发明的实施方案提供用于寡核苷酸与各种靶向实体缀合的简易和高效的方法。与方形酸酯的反应可在水溶液中以高产率进行且产物能容易纯化(例如，通过超滤或通过尺寸排阻色谱法)。该单方形酸酯加合物是稳定的且可纯化和储存用于以后的应用。
与DNA/RNA的单缀合物的稳定性可允许第二氨基标记的寡核苷酸的偶联，其中所述氨基标记的寡核苷酸与寡核苷酸-单方形酸酯物质的序列不互补。两个非互补的寡核苷酸的偶联很难以非酶解方式进行。本发明的方法提供了这些分子的入口。方形酸衍生物是小的且将不引起不当的(illicit)免疫原性反应，当将该官能团引入到药物中时导致较少的不良反应。
实施例
寡核苷酸-方形酸酯单缀合物的合成
采用本领域已知的任何方法用与所连接的氨基接头合成寡核苷酸(参见上面的讨论)。图2中所示的实例使用TFA-保护的胺C6接头亚磷酰胺(即，CF3-CO-NH-(CH2)6-O-P((O-CH(CH3)2)2(O-CH2-CH2-CN),其采用合适的合成条件与固体载体上的寡核苷酸的5’-OH端偶联。该偶联可在与核苷酸单体偶联相似的条件下进行并且可在寡核苷酸还与固体载体连接的同时完成。在按照通常的合成和脱保护(用于RNA的标准的氨和TEA 3HF)之后，可将混合物对着NaCl超滤以除去所有的氨和铵盐。最后，将滞留物用水洗涤以除去所有过量的盐。然后可将寡核苷酸溶液浓缩。浓缩液可冻干或就地使用。
一旦获得氨基-标记的寡核苷酸，就可将其与方形酸衍生物偶联。例如，制备氨基-标记的寡核苷酸的溶液，大约在500μL的300mM磷酸钠中10mg，pH 7-8。向此溶液中加入过量的方形酸二甲酯(二甲氧环丁烯1,2二酮；向每mg的寡核苷酸加入约0.75mg)，如图2中所示。过量的方形酸酯用于促成单取代的方形酸酯衍生物的生成和抑制二取代的方形酸酯衍生物的生成。
将反应混合物保持25℃并用二碱基磷酸盐调节溶液的pH以维持反应pH在7至7.8之间，因为pH在缀合过程中倾向于降低。在约4小时之后，将反应溶液过滤并在3K超滤(UF)自旋筒中用水洗涤以除去剩余的小分子(例如，过量的方形酸酯和盐)。将UF滞留物冻干并通过LCMS分析，证实生成期望的产物–即，寡核苷酸-方形酸酯单加成物。所述加合物很稳定。例如，发现这些单取代的方形酸酯在pH＝7下在水溶液中至少两天是稳定的。
作为替代，可将反应溶液过滤并用水洗涤，之后用硼酸盐缓冲液(可用作下一步反应的缓冲液)洗涤，并在下一步缀合步骤中直接使用(例如，与下面显示的靶向实体缀合)。
以上描述的偶联反应非常高效。反应已经进行许多次，且发现这些反应进行至90–99％完成，根据在缀合之后剩余的起始物氨基标记的寡核苷酸的量判断。反应可通过LCMS分析容易监测。
寡核苷酸-方形酸酯单缀合物与靶向实体的反应
将冻干的方形酸酯单缀合物收纳在25mM pH＝9.2的硼酸钠缓冲液中，并用过量的(例如，10-40倍)含有氨基基团(例如，NH2-R)的靶向实体处理，其中靶向实体溶解于少量的DMSO中，如图3中所示。在25mM硼酸盐缓冲液中预超滤的单缀合物(参见上面)可用胺/DMSO混合物直接处理，不冻干和再溶解。
在此具体的实施例中，靶向实体为5-甲基糠胺(即，R＝5-甲基-糠基)。反应于室温进行2小时。将反应混合物再浓缩并在3K UF旋转筒(spin cartridge)中洗涤以除去过量的胺和盐。将滞留物冻干并将一部分固体通过LCMS进行分析，其显示期望的缀合物基于起始物单缀合物以约95％产率生成。
基于这些方案，各种靶向实体已经与寡核苷酸缀合。这些缀合的一些实例如图4所示。PEG-寡核苷酸缀合物的制备是已知的，参见例如，Goodchild等,Bioconjugate Chem.,1:165(1990)；and Zalipsky等,Bioconjugate Chem.,6:150(1995)。PEG缀合物可用于改进寡核苷酸的体内稳定性和/或降低寡核苷酸的免疫原性(immunogeneities)。
具有两个互补寡核苷酸的寡核苷酸双链体(duplex)的形成
使用标准寡核苷酸固相合成技术制备含有5’-五缩六乙二醇(HEG)间隔子接头之后是标准的六碳氨基接头的RNA 20聚体。将HEG和C6氨基接头(均是市售的)作为亚磷酰胺使用标准寡核苷酸合成/脱保护方案进行添加，参见如上实施例1。通过阴离子交换色谱纯化粗RNA，在2K Hydrosart膜上进行超滤，之后冻干。冻干产物的LCMS分析给出该经修饰寡核苷酸的预期分子量。取出150mg的该冻干氨基修饰的RNA，放入至3.0mL磷酸钠，得到pH范围为7-8的溶液。向该溶液中，添加溶解在300μL DMSO的100mg方形酸二甲酯。1小时后的LCMS分析显示氨基标记的RNA已经完全转变为期望的单方形酸酯，如图5所示。
使用所用的相同标准合成方案制备对于上面部分提及的序列的互补序列，在这种情形中具有连接的3’氨基接头，参见图5。使用如用于制备该5’氨基标记的RNA相同的程序，使经修饰RNA脱保护、纯化、超滤和冻干。将10mg冻干的5’氨基RNA溶解在400μL水中。将11mg(约1.2倍过量)的冻干3’氨基RNA互补物溶解在另外的400μL水中。将两个溶液合并，温热至50-60℃，保持约5分钟，使得溶液在30分钟内冷却至室温。然后，向该加入300μL 150mM硼酸钠，这使得溶液pH至约9(通过pH试纸)。将该混合物在室温静置3小时。该反应样品的LCMS分析显示，已经清楚地形成二聚体，并且没有观察到水解的RNA单方形酸酯。
两个寡核苷酸的缀合物
另外，方形酸酯与寡核苷酸(例如，DNA或RNA)的单缀合物的稳定性允许技术人员分离单-缀合物中间体和应用它们与第二寡核苷酸偶联，即使第二氨基-标记的寡核苷酸与该寡核苷酸-方形酸酯单加成物的序列不互补。两个非互补的寡核苷酸的偶联(特别是当一个寡核苷酸是DNA而另一个是RNA时)很难以非酶解进行。本发明的方法提供了这些分子的途径(access)。
环寡核苷酸的形成
如上所述，方形酸酯与寡核苷酸(例如，DNA或RNA)的单缀合物的稳定性允许技术人员分离单-缀合物中间体和在以后应用它们与第二寡核苷酸偶联。技术人员可利用此性质并应用这些单-缀合物与存在于寡核苷酸的另一端的第二氨基基团(其可在缀合的第一阶段过程中暂时被保护)缀合以形成环寡核苷酸。
与仲胺缀合
寡核苷酸单方形酸酯与肽缀合
向单甲氧基方形酸酯标记的RNA 20聚体(大约1μM)的100μL的100mM硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.2)中，加入过量的溶解于100μL的100mM硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.2)中的三肽，Leu-Gly-Gly。将此混合物放置在25℃经1.5小时。反应混合物的LCMS分析显示产生大约85％产率的肽缀合物，参见图6。
寡核苷酸单方形酸酯与脂质缀合
向75μL的单甲氧基方形酸酯标记的RNA 20聚合体(大约1μM)的100mM硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.2)中加入，少量过量的溶解于75μL异丙醇中的鞘氨醇(shpingosine)。将此混合物放置在25℃经30分钟。反应混合物的LCMS分析显示产生大约60％产率的脂质缀合物，参见图6。
寡核苷酸单方形酸酯与异丙胺缀合
向150μL的单甲氧基方形酸酯标记的RNA 20聚合体(大约1μM)的100mM硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.2)中加入，过量的溶解于20μL的DMSO中的异丙胺。在25℃经历4小时之后反应混合物的LCMS分析显示生成95％以上产率的异丙胺衍生物，参见图6。
应当注意，氨基/硫醇标记的寡核苷酸可以添加至已经衍生化的单方形酸酯中，颠倒添加的顺序。可以首先制备小分子胺/硫醇或肽、蛋白质等的单方形酸酯，然后用氨基/硫醇标记的寡核苷酸处理，形成方形酸酯寡核苷酸缀合物。
在本说明书和所附权利要求书中，单数形式的“a”、“an”和“the”包括其复数形式，除非上下文另有明确的规定。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本申请中描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可用于本申请公开的实施或试验中，但现在还是描述了优选的方法和材料。本申请所述的方法可以逻辑上可能的任何顺序进行，除了公开的特定顺序之外。
尽管就有限的实施方式已经描述了本发明，但本领域技术人员，在享有此公开内容的利益的情况下，将理解可以设计不背离本申请中公开的发明的范围的其它实施方式。因此，本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
参考引入
在本申请公开文本中已经参考和引用了其它文献，诸如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网络内容。所有这种文献为了所有的目的在此完整引入本申请作为参考。任何物质、或其部分，描述为引入本申请中作为参考，但与现有的定义、叙述、或本申请中明确阐述的其它公开材料相抵触，仅在所引入的材料和本申请的公开材料之间不发生抵触的程度上引入。如果发生矛盾，要以有利于本申请的公开作为优选的公开进行判断(resolved)。
同等物
本申请中公开的代表性实施例意图帮助举例说明本发明，而不意在，也不应当将它们解释为，限制本发明的范围。实际上，除本申请中显示和描述的那些之外，本发明的各种变化形式和其许多其它的实施方式，根据本文件的内容，包括随后的实施例和本申请中引用的科学和专利文献的参考，对本领域技术人员将变得显而易见。以下实施例包含重要的附加信息、例证和指导，它们可以其各种实施方式及其同等物用于实施本发明。

Claims (22)

1.具有式(A)结构的寡核苷酸衍生物：
其中R3为第一寡核苷酸；R1选自烷基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、和第二寡核苷酸；R2为接头或直连键；Z1为NR4、S、或O，且Z2为NR4或S，其中R4选自H、烷基、芳基、杂环基、或杂芳基。
2.权利要求1的寡核苷酸衍生物，其中R2为与第一寡核苷酸的核碱基上的5’羟基、3’羟基或环外氨基连接的(C1-C12)接头。
3.权利要求1-2的寡核苷酸衍生物，其中Z2为NH。
4.权利要求1-3的寡核苷酸衍生物，其中R1为(C1-C12)烷基和Z1为O。
5.权利要求1-3的寡核苷酸衍生物，其中R1为1K-80K聚乙二醇且Z1为NH。
6.权利要求1-3的寡核苷酸衍生物，其中R1为第二寡核苷酸且Z1为NH。
7.权利要求6的寡核苷酸衍生物，其中第二寡核苷酸与第一寡核苷酸互补。
8.一种制备寡核苷酸-方形酸酯衍生物的方法，包括：
a.合成包含氨基或硫醇基团的寡核苷酸衍生物；和
b.使3,4-二烷氧基环丁烯-1,2-二酮与该寡核苷酸衍生物反应产生寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物。
9.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸衍生物包含含氨基或硫醇基团的接头。
10.权利要求8的方法，还包括使所述寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物与靶向实体反应，其中靶向实体选自聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、和第二寡核苷酸。
11.权利要求8的方法，其中还包括使所述寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物与胺/硫醇标记的表面反应，其中所述表面选自阵列表面、水凝胶、纳米粒子、可溶性和不溶性聚合物。
12.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸衍生物在寡核苷酸衍生物中的第二位置上包含第二氨基或硫醇基团，该方法还包括形成产生环状结构的寡核苷酸内交联。
13.权利要求8的方法，其中使所述寡核苷酸-方形酸酯单-缀合物与含多个氨基/硫醇的物质合并，从而提供具有经由该方形酸酯的寡核苷酸的多个连接点的物质。
14.具有式(A)结构的化合物：
其中R3为第一寡核苷酸；R1选自聚乙二醇、肽、蛋白质、多糖、和第二寡核苷酸；R2为接头或直连键；Z1为NR4、S、或O，且Z2为NR4或S，其中R4选自H、烷基、芳基、杂环基、或杂芳基。
15.权利要求14的化合物，其中R1为聚乙二醇。
16.权利要求14的化合物，其中R1为肽。
17.权利要求14的化合物，其中R1为第二寡核苷酸。
18.权利要求17化合物，其中第二寡核苷酸与第一寡核苷酸互补。
19.权利要求17的化合物，其中各自Z1和Z2各自为NH。
20.权利要求17的化合物，其中Z1为O且Z2为NH。
21.权利要求15的化合物，其中R1为20k–40k聚乙二醇且Z1为NH。
22.权利要求17的化合物，其中第二寡核苷酸包含约2至约200个核苷酸且Z1为NH。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114008061A (zh) * 2019-06-20 2022-02-01 豪夫迈·罗氏有限公司 放射性标记的moem型寡核苷酸及其制备方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016089433A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
US10059940B2 (en) * 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
WO2016138035A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Agilent Technologies, Inc. Preparation of long synthetic oligonucleotides by squarate conjugation chemistry
AU2016246450B2 (en) 2015-04-06 2022-03-17 Agilent Technologies, Inc. Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation
WO2017040511A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for crispr/cas-based genome editing by homologous recombination
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
SE541640C2 (sv) 2016-08-29 2019-11-19 Bae Systems Bofors Ab Optikmodul för siktesenhet och metod för konvertering av vapenstation
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030575A1 (en) * 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of macromolecules
WO2009156421A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Topotarget A/S Squaric acid derivatives as inhibitors of the nicotinamide
CN102459301A (zh) * 2009-05-05 2012-05-16 米拉根医疗公司 亲脂性多聚核苷酸缀合物

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4341524C2 (de) * 1993-12-06 1997-01-16 Gluesenkamp Karl Heinz Dr Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger
DE69706417T2 (de) * 1996-04-19 2002-06-27 Amersham Pharmacia Biotech Uk Ltd., Little Chalfont Quadratfarbstoffe und deren verwendung in einem fluorescenzsequenzierungsverfahren
WO1998030720A1 (en) * 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of oligonucleotides
US6455539B2 (en) * 1999-12-23 2002-09-24 Celltech R&D Limited Squaric acid derivates
GB0119665D0 (en) * 2001-08-10 2001-10-03 Isis Innovation Conjugates
SE520256C2 (sv) * 2001-10-25 2003-06-17 Lundonia Biotech Ab Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär
AU2002367639A1 (en) * 2001-11-14 2003-10-20 Luminex Corporation Functionalized compositions for improved immobilization
JP2005247706A (ja) * 2004-03-01 2005-09-15 Japan Science & Technology Agency スクアリルアミド骨格を有する新規な核酸類縁体
CA2625196C (fr) * 2005-10-07 2016-04-05 Guerbet Composes comprenant une partie de reconnaissance d'une cible biologique, couplee a une partie de signal capable de complexer le gallium
EP3372684B1 (en) * 2010-08-24 2020-10-07 Sirna Therapeutics, Inc. Single-stranded rnai agents containing an internal, non-nucleic acid spacer
EP2852667A4 (en) 2012-05-21 2016-01-20 Agilent Technologies Inc REACTION OF RETRO DIELS-ALDER AS A CLIENT IN CARD / DNA APPLICATIONS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030575A1 (en) * 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of macromolecules
WO2009156421A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Topotarget A/S Squaric acid derivatives as inhibitors of the nicotinamide
CN102459301A (zh) * 2009-05-05 2012-05-16 米拉根医疗公司 亲脂性多聚核苷酸缀合物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGBIN YAN，等: "Preparation of carbohydrate–oligonucleotide conjugates using the squarate spacer", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》, vol. 17, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 6535 - 6538, XP 022325931, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2007.09.078 *
KOUSUKE SATO，等: "Synthesis and properties of a new oligonucleotide analogue containing an internucleotide squaryl amide linkage", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH SUPPLEMENT》 *
YUYAN ZHAO，等: "Preparation of Mannosylated Oligoribonucleotides", 《NUCLEIC ACIDS SYMPOSIUM SERIES》, no. 52, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 89 - 90 *
YUYAN ZHAO，等: "Synthesis and characterization of mannosylated oligoribonucleotides", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》, vol. 344, 31 August 2009 (2009-08-31), pages 2137 - 2143, XP 026674411, DOI: doi:10.1016/j.carres.2009.08.033 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114008061A (zh) * 2019-06-20 2022-02-01 豪夫迈·罗氏有限公司 放射性标记的moem型寡核苷酸及其制备方法
CN114008061B (zh) * 2019-06-20 2024-03-12 豪夫迈·罗氏有限公司 放射性标记的moem型寡核苷酸及其制备方法

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