JP2001504092A - 静脈内適用のためのＩｇＭ製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩｇＭ分が免疫グロブリンの５重量％より多い静脈内適用に適した免疫グロブリン溶液の製造方法において、ＩｇＭ含有免疫グロブリン溶液をプロテアーゼで処理する。得られる静脈内適合性製剤は、化学的に修飾されていないことおよび低い抗補体活性ＡＣＡを示すことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 静脈内適用のためのＩｇＭ製剤の製造方法 本発明は、静脈内適用に適した免疫グロブリン溶液の製造方法に関するもので ある。出発物質としては、ヒトまたは動物の血液から得られた、免疫グロブリン を濃縮された形で含有する蛋白質画分を使用する。 免疫グロブリンは、周知のように、ヒトおよび哺乳動物の免疫系において、感 染防御に当たっての重要な役割を果たす。免疫グロブリンは、生化学的および生 理学的性質を異にする種々のクラス（たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ およびＩｇＥ）に分類される。１９８０年までは、単離され、予防および治療の ための静脈内適合性製品として投入されたのは、ＩｇＧのみであった。ＥＰ−Ａ −００１３９０１、ＥＰ−Ａ−０４１３１８７およびＥＰ−Ａ−０３５２５００ には、とりわけβ−プロピオラクトンで処理することによって静脈内適合性とさ れたＩｇＧ製剤が記載されている。ＥＰ−Ａ−０４１３１８８は、陰イオン交換 クロマトグラフィーにより静脈内適合性画分を選択的に溶出させることによって 静脈内適合性を達成する方法を記載している。 本発明の目的は、静脈内投与に適した治療および予防用の高度精製ＩｇＭ濃縮 物を製造することである。その製品は、低い抗補体活性（ＡＣＡ）およびラット モデルにおいての低い血圧低下を示すべきであるが、ＩｇＭ分子は化学的に修飾 されるべきではない。この目的は、驚くべきことに、ＩｇＭ含有免疫グロブリン 溶液をプロテアーゼで処理することによって達成された。 従って、本発明の対象は、特許請求の範囲の請求項１において定義されている 方法である。 プロテアーゼ処理は、ペプシン、パパイン、プラスミンまたはサーモリシンの 存在下での高昇温度で実施されるインキュベーションであることが好ましい。そ れらプロテアーゼは化学的に修飾されていても、担体に固定化されていても、そ して／または遺伝子工学的に製造されたものであってもよい。本発明の方法に従 って得られた製剤は、静脈内投与可能な溶液とすることができる。かかる製剤は ＡＣＡの低下、ラットモデルでの血圧低下の低減およびＣ１ｑ結合活性の低下を 示す。 本発明方法のための出発材料としては、たとえばキストラー・ニッチマン（Ｋ ｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）分画で得られた血漿、沈澱ＡまたはＢ； コーン（Ｃｏｈｎ）画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ；ＩＩ／ＩＩＩ、ＩＩＩ；またはその 他のヒトまたは動物血漿由来のＩｇＭ含有血漿画分が適当である。たとえば、キ ストラー・ニッチマン法による沈澱Ｂなどの免疫グロブリン含有画分を緩衝液に 溶解させ、０．５〜５％オクタン酸を用いてｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ５で沈 澱させることによってほとんどの不純物を除去することができる。その後、その 溶液を、少なくとも５０Ｕ／ｇ、好ましくは６００Ｕ／ｇのペプシン添加のもと に、大きいイオン強度のもとで、１〜４８時間、好ましくは９時間、２０〜５０ ℃、好ましくは３７℃で、インキュベートする。 さらに精製するためには、この溶液を、たとえばＤＥＡＥ基含有ゲルを用いて のバッチ式またはカラム法による吸着処理に付す。最終製品中のＩｇＭ濃度を高 めたいときには、ＩｇＭ含有溶液をイオン交換体（たとえばＴＭＡＥフラクトゲ ル）にかける。たとえば塩の勾配またはｐＨの勾配を利用しての選択的溶出によ って、ＩｇＭ画分を単離できる。限外濾過およびダイアフィルトレーション、も しくはゲル濾過によって、溶液を濃縮し、電解質含量を最終の静脈内適合性処方 に調整することができる。蛋白質濃度は１〜２０％、好ましくは３〜６％としう る。製品には、蛋白質、好ましくはアルブミン、ならびに糖類、好ましくはグル コースおよびサッカロース、またはアミノ酸を追加的に含有させることもできる 。 免疫グロブリン製剤の静脈内適合性の評価のためには、抗補体活性（ＡＣＡ） を参照するのが普通である。ＡＣＡを測定するには、試験すべき製品の所定量を 所定量のモルモット補体とともにインキュベートし、補体の残存量を定量する。 ＡＣＡは、免疫グロブリン１ｇ当たりのＣＨ５０の消費量として表示する。報告 しているＡＣＡの結果は、大部分が、Ｍ・マイヤー（Ｍａｙｅｒ）が発表してい る方法に従って測定したものである（Ｍ・Ｍ・マイヤー（１９６１年）補体およ び補体結合（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａ ｔｉｏｎ）。実験免疫化学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ）第２版中の第１３３−２４０頁、Ｃ・トーマス社、スプリングフィ ールド、イリノイ州）。静脈内適用可能なＩｇＧ製品に対する基準値としては、 蛋白質１ｇ当たり＜１０００ＣＨ５０のＡＣＡが妥当である。 静脈内適合性の評価のためには、さらに、Ｃ１ｑ補体成分の免疫グロブリンへ の結合を考慮に入れることができる。この測定のためには、所定量の試験製品を 所定量の精製放射性標識Ｃ１ｑ成分とともに緩衝液中および血清中でインキュベ ートする。試験製品のＣ１ｑ結合活性は、ポリエチレングリコール存在下での沈 降によって求められる。沈降物中の放射能が高いほど、製品のＣ１ｑ結合活性は 大きい。Ｃ１ｑを２つの異なる方法で放射能標識するとき、Ｃ１ｑ結合の様式お よびそれと同時に製品の品質についてより高度の情報を得ることができる。一方 ではできる限り温和な酸化条件のもとでラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）と、 他方では強烈な酸化条件下にクロラミンＴ（ＣＴ）と。Ｐ・シュペート（Ｓｐａ ｅｔｈ）が発表している方法に従って検討が行われた。（Ｐ・Ｊ・シュペート、 Ａ・コルヴェッタ（Ｃｏｒｖｅｔｔａ）、Ｕ・Ｅ・ニデッガ（Ｎｙｄｅｇｇｅｒ ）、Ｒ・ビュトラー（Ｂｕｅｔｔｌｅｒ）：ラクトペルオキシダーゼ−およびク ロラミンＴ−沃素化Ｃ１ｑを用いての拡張Ｃ１ｑ結合アッセイ。スカンジナヴィ アン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ）第１８巻第３１９−３２８頁、１９８３年）。完全な静脈内適合性製剤につい ては、Ｃ１ｑ結合活性ができるかぎり少ないことが期待される。免疫グロブリン の静脈内適合性を検定するための一つのモデルは、ブレーカーらのラットモデル である〔Ｗ・Ｋ・ブレーカー（Ｂｌｅｅｋｅｒ）、Ｊ・アハテルベルフ（Ａｇｔ ｅｒｂｅｒｇ）、Ｇ・リッヒター（Ｒｉｇｔｅｒ）、Ａ・デ・フリース＝ヴァン ・ロッセン（ｄｅ Ｖｒｉｅｓ−ｖａｎ Ｒｏｓｓｅｎ）、Ｊ・Ｃ・バッカー（ Ｂａｋｋｅｒ）：免疫グロブリン製剤の降圧性副作用を検出するための動物モデ ル。ヴォークス・サングイニス（Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．）第５２巻第２８１−２９ ０頁（１９８７年）〕。このモデルでの適合性パラメータは血圧である。静脈内 非適合性製品は明瞭な血圧低下を惹起する。実施例 参照例１ キストラー・ニッチマン法による沈澱Ｂ１ｋｇをｐＨ５．１の０．１Ｍ酢酸緩 衝液４ｋｇに懸濁させ、室温で２％のオクタン酸と混合した。オクタン酸１ｇ当 たり０．１５ｇの燐酸三カルシウムを加え、沈澱を濾別した。濾液を２０ミリモ ル／ピペラジン、６０ミリモル／ＮａＣｌ（ｐＨ５．８）に対するダイアフィル トレーションに付した。ダイアフィルトレーション後の溶液を、蛋白質１ｇ当た り７５ｍｇのＤＥＡＥ−セファデックスで処理した。続いて、蛋白質濃度を２０ ｍｇ／ｍに調整し、溶液を、２５℃において、１％トゥイーン ８０および０． ３％ＴＮＢＰ（燐酸トリ−ｎ−ブチル）で８時間処理した。つぎに、溶液をＴＭ ＡＥ−フラクトゲル カラムにかけ、２０ｍｍｏｌピペラジン、１６０ｍｍｏｌ ＮａＣｌ（ｐＨ５．８）によりＩｇＭ画分を溶出した。最終製品を蛋白質５％に 濃縮し、ｐＨ値を４．５に調整した。 参照例２ キストラー・ニッチマン法による沈澱Ｂ１ｋｇをｐＨ５．１の０．１Ｍ酢酸緩 衝液４ｋｇに懸濁させ、室温で２％のオクタン酸と混合した。オクタン酸１ｇ当 たり０．１５ｇの燐酸三カルシウムを加え、沈澱を濾別した。濾液を２０ミリモ ル／ＮａＣｌに対するダイアフィルトレーションに付し、溶液を蛋白質２０ｍｇ ／ｍとした。０．２Ｍ ＨＣｌでｐＨ値を４．０に調整し、溶液を３７℃で９時 間インキュベートした。２０℃まで冷却後、ｐＨを５．８に調整し、ピペラジン を２０ｍｍｏｌ／ 、ＮａＣｌを６０ｍｍｏｌ／ となるように加えた。つぎに 、溶液を、２５℃において、１％トゥイーン ８０および０．３％ＴＮＢＰ（燐 酸トリ−ｎ−ブチル）により８時間処理した。続いて、溶液をＴＭＡＥ−フラク トゲル カラムにかけ、２０ｍｍｏｌピペラジン、１６０ｍｍｏｌＮａＣｌ（ｐ Ｈ５．８）によりＩｇＭ画分を溶出した。最終製品を蛋白質５％に濃縮し、ｐＨ 値を４．５に調整した。 実施例１ キストラー・ニッチマン法による沈澱Ｂ１ｋｇをｐＨ５．１の０．１Ｍ酢酸緩 衝液４ｋｇに懸濁させ、室温で２％のオクタン酸と混合した。オクタン酸１ｇ当 たり０．１５ｇの燐酸三カルシウムを加え、沈澱を濾別した。濾液を２０ミリモ ル／ ＮａＣｌに対するダイアフィルトレーションに付し、溶液を蛋白質２０ｍ ｇ／ｍとした。０．２Ｍ ＨＣｌでｐＨ値を４．０に調整し、蛋白質１ｇ当たり ６００単位のペプシンを加えた。つぎに、溶液を３７℃で９時間インキュベート した。２０℃まで冷却後、ｐＨを５．８に調整し、ピペラジンを２０ｍｍｏｌ／ 、ＮａＣｌを６０ｍｍｏｌ／ となるように加えた。つぎに、溶液を、２５℃ において、１％トゥイーン ８０および０．３％ＴＮＢＰ（燐酸トリ−ｎ−ブチ ル）により８時間処理した。続いて、溶液をＴＭＡＥ−フラクトゲル カラムに かけ、２０ｍｍｏｌピペラジン、１６０ｍｍｏｌＮａＣｌ（ｐＨ５．８）により ＩｇＭ画分を溶出した。最終製品を蛋白質５％に濃縮し、ｐＨ値を４．５に調整 した。 実施例２ 沈澱Ｂ１ｋｇを参照例２と同様に処理した。ただし、ｐＨ４でのインキュベー ションの前に、蛋白質１ｇ当たり６００単位のペプシンに代えて蛋白質１ｇ当た り１２００単位のペプシンを加えた。 Ｉ．実験的製品の特性決定 免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡおよびＴｇＭを、抗血清を用いて比濁法によっ て定量した。総蛋白質含量はケルダール法によって求めた。 ＩＩ．適合性パラメータの表ペプシンの添加は、ＡＣＡの低減、ラットモデルにおける血圧低下の減少ならび にＣ１ｑ結合活性の低下をもたらす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＩｇＭ分が全免疫グロブリン分に対して５重量％より大きい、化学的に修 飾されておらず、静脈内投与可能なポリクローナル免疫グロブリン製剤を製造す るために、相応したＩｇＭ含有血漿画分の水溶液または水性懸濁液をプロテアー ゼで処理することを特徴とする前記免疫グロブリン製剤の製造方法。 ２． 前記製剤の抗補体活性が＜５００ＣＨ５０／ｇ蛋伯質、好ましくは＜２ ００ＣＨ５０／ｇ蛋白質、とりわけ＜１５０ＣＨ５０／ｇ蛋白質であることを特 徴とする請求項１の方法。 ３． ＩｇＭ含有血漿画分の水溶液または水性懸濁液を、プロテアーゼ添加の もとに、酸性ｐＨ値において、少なくとも１５℃の温度でインキュベートするこ とを特徴とする請求項１または２の方法。 ４． インキユベーション温度が２０〜５０℃、好ましくは３５〜４０℃であ ることを特徴とする請求項３の方法。 ５． インキュベーション時間が１〜４８時間、好ましくは６〜１２時間であ ることを特徴とする請求項３または４の方法。 ６． ＩｇＭ含有血漿画分の水溶液または水性懸濁液中のプロテアーゼ濃度が 少なくとも５０単位／ｇ蛋白質、好ましくは３００〜１２００単位／ｇであるこ とを特徴とする請求項１〜５のいずれかの方法。 ７． プロテアーゼ処理に際してのＩｇＭ含有血漿画分の水溶液または水性懸 濁液のｐＨ値が３．５〜５．５、好ましくは３．７〜４．３であることを特徴と する請求項１〜６のいずれかの方法。 ８． プロテアーゼがエンドペプチダーゼであることを特徴とする請求項１〜 ７のいずれかの方法。 ９． プロテアーゼが、それぞれ場合により担体に固定化されていてもよいペ プシン、パパイン、プラスミンまたはサーモリシンからなる群から選ばれた少な くとも１種のエンドペプチダーゼであることを特徴とする請求項８の方法。 １０． ＩｇＭ含有血漿画分の水溶液または水性懸濁液のイオン強度が＜０． １、好ましくは＜０．０４であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの方 法。