CN1233258A - 用于制备静脉内给药的lgM制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备适于静脉给药的免疫球蛋白溶液的方法,该溶液的IgM部分以免疫球蛋白部分计多于5重量%,该方法包括用蛋白酶处理含有IgM的免疫球蛋白溶液,如此获得的静脉可耐受制剂的特征在于,是不经化学修饰的,并且具有低的抗补体的活性ACA。

Description

用于制备静脉内给药的IgM制剂的方法
本发明涉及一种用于制备适于静脉给药的免疫球蛋白溶液的方法。人或动物血液中包含的蛋白质组分用作出发材料，该组分含有浓缩形成的免疫球蛋白。
免疫球蛋白在人和哺乳动物防御感染的免疫系统中起重要作用。免疫球蛋白被分类为具有不同的生化和生理特性的不同类型(如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。直到1980年仅分离了IgG，并用作用于预防和治疗的适于静脉给药的制品。在EP-A-0013901、EP-A-0413187和EP-A-0352500中描述了IgM制品，该制品主要是通过用β-丙醇酸内酯处理。使之适用静脉内给药。EP-A-0413188描述了一种方法，其中通过选择性洗脱静脉适用的组分的离子交换层析来达到静脉适用性。
本发明的目的是制备一种高纯度的适用于静脉内给药的IgM浓缩剂以用于治疗和预防。该制品在型模型中应当展示低的抗补体活性(ACA)和低的血压下降，但是IgM分子是未经化学修饰的。该发明目的令人惊讶地通过用蛋白酶处理含有IgM的免疫球蛋白溶液实现。
因此如前所述本发明的主题是如权利要求1所定义的方法。
优选地，蛋白酶处理在较高温度下，在胃蛋白酶、番木瓜蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或嗜热菌蛋白酶的存在下温育完成。蛋白酶可以是化学修饰的，固定化在载件上和/或基因工程技术制备的。按照本发明的方法获得的制剂可以从可静脉给药的溶液形式递送。这样的制品在大鼠模型中显示出ACA，血压下降的消失，以及C1q结合活性。
适用于本发明的方法的出发材料是含有免疫球蛋白的溶液，如血浆、来自Kistler-Nitschmann级分的沉淀A或B；Cohn组分Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ；Ⅱ/Ⅲ,Ⅲ或其他来自人或动物血浆的含有IgM的血浆组分。例如一种含有免疫球蛋白的组分，即Kistler-Nitschmann的沉淀B，溶于缓冲液中，其大多数杂质通过pH4至6优选5的0.5至5％的辛烷酸沉淀而去掉，随后将该溶液在低离子强度下，在20至50℃，优选37℃，加入至少50U/g胃蛋白酶，优选600U/g温育1至48小时，优选9小时。
为进一步纯化，可将溶液吸附，例如借助于含有DEAE基团的凝胶的床或柱的方法。为了进一步提高终产物中的IgM浓度，应将含有IgM的溶液上样于离子交换柱(如TMAE-Fraktogel)。通过选择性洗脱，如借助于盐或pH梯度可分离IgM组分。通过超滤和透析过滤，如凝胶过滤，可将溶液浓缩和将电解质含量基于最终的适于静脉给药的制剂进行调整。蛋白质浓度总计1至20％，优选3至6％，该产品另外还可含有蛋白质，如白蛋白，以及糖，优选葡萄糖或蔗糖或者是氨基酸。
为评价免疫球蛋白制剂的静脉可给药性通常应考虑抗补体活性(ACA)。为测定ACA，将一定量的待测产品和一定量的豚鼠补体温育，并滴定剩余补体的量。ACA定义为每克免疫球蛋白的CH 50需用量。给出的ACA的结果进而按M.Mayer发表的方法确定(Mayer,M.M.(1961)，补体和补体固定，见实验免疫化学，第2版，PP 132-240,C Thomas,Spingfield,Ⅱ)。可静脉给药的IgG产品的近似值被认为其ACA是＜1000 CH 50每克蛋白质。
为评定可静脉给药性，可进而衡量C1q补体组分在免疫球蛋白上的结合。为进行测量，将一定量的待测产品和一定量纯化的、放射性标记的C1q-补体在缓冲液和血清中温育，待测产品的C1q-结合活性通过在聚乙二醇存在的条件下沉淀而测定。沉淀中放射活性越高，该产品的C1q-结合活性越高。通过此种方法精确地证明了C1q结合活性，对产品进行定性，其中C1q用两种不同的方法进行放射标记。一方面，在可能温和的条件下采用乳过氧过物酶(LPO)；另一方面，在强氧化条件下采用氯胺T(CT)。该研究进一步按P.Spth发表的方法进行P.J.Spth,A,Corvetta,U.E.Nydegger,R.Bttler使用乳过氧化物酶和氯胺T碘标C1q进行的持续的C1q-结合测试，Scand免疫学杂志18,319-328,1983)。期待一种完整的，可静脉给药的制剂，其C1q结合活性尽可能地低。一种用于测定免疫球蛋白的可静脉给药性的模型是Bleaher等人的大鼠模型〔W.K.Bleeker,J.Agterbery,G.Rigter,A.de Vries-VanRossen,J.C.Bakker：用于检测免疫球蛋白制剂的低血压副作用的动物模型。Vox.Sang.52:281-290(1987)〕。该模型中，静脉可适用性参数是血压。不适用于静脉给药的产物引起明显的血压降低。
实施例
对比例1
1kg来自Kistler-Nitschmann的沉淀B悬浮于4kg 0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.1中，在室温下加入2％辛酸。每克辛酸加入0.15g磷酸钙，并过滤沉淀。用20 mmol/L哌嗪，60 mmol/L Nacl,pH 5.8透析滤液。经透析的溶液用每g蛋白质75mg DEAE-Sephadex处理。随后将蛋白浓度调整到20 mg/ml，将溶液于25℃用1％Tween80和0.3％TNBP(三-正-丁基-磷酸酯)处理8小时。溶液随后上样于TMAE-Fraktogel-柱，并用20 mmol哌嗪，160 mmol Nacl,pH 5.8洗脱IgM-组分。终产物浓缩到含蛋白质为5％，其pH值被调整到4.5。
对比例2
1kg来自Kistler-Nitschmann的沉淀B悬浮于4kg 0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.1中，在室温下加入2％辛酸。每克辛酸加入0.15克磷酸钙，并过滤沉淀。用20 mmol/L Nacl透析滤液，溶液获得20 mg/ml蛋白质用0.2M HCL将pH调到4.0，溶液于37℃温孵9小时。冷却至20℃后，将pH调到5.8，将哌嗪加入，其终浓度是20 mmol/L加入Nacl，其浓度是60 mmol/L。溶液于25℃用1％Tween80和0.3％TNBP(三-正-丁基-磷酸酯)处理8小时。溶液随后上样于TMAE-Frakogel-柱，并用20 mmol哌嗪，160 mmol Nacl,pH 5.8洗脱IgM组分。将终产物浓缩到含蛋白质为5％，其pH值被调整到4.5。
实施例1
1kg来自Kistler-Nitschmann的沉淀B悬浮于4kg 0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.1中，在室温下加入2％辛酸。每克辛酸加入0.15g磷酸钙，并过滤沉淀。滤液用20 mmol/L Nacl透析，溶液获得20 mg/ml蛋白质。用0.2 M HCL将pH值调到4.0，每克蛋白中加入600 U胃蛋白酶。将溶液于37℃温孵9小时。冷却至20℃后，pH调节为5.8，加入哌嗪，其终浓度为20 mmol/L，加入Nacl，其终浓度为60 mmol/L。溶液于25℃，用1％Tween80和0.3％TNBP(三-正-丁基-磷酸酯)处理8小时。溶液随后上样于TMAE-Frakogel-柱，并用20 mmol哌嗪，160 mmolNacl,pH 5.8洗脱。终产物的蛋白质被浓缩到5％，其pH值被调整到4.5。
实施例2
类似于对比实施例2处理1kg沉淀B，然而，在pH 4温孵之前。将1200 U胃蛋白酶每克蛋白质而不用600 U胃蛋白酶每克蛋白质加入到溶液中。
Ⅰ．表征实验产品
用抗血清比浊法测定免疫球蛋白IgG、IgA和IgM。总蛋白含量用Kjeldahl-方法测定。
                            表Ⅰ
   蛋白质   IgG    IgA     IgM        同种凝集素Mg/g    Mg/g   Mg/g    Mg/g    Anti-A    Anti-B
对比例1对比例2实施例1实施例2     44.4    4.1    16.8    45.0    1∶64     1∶6448.1    8.6    19.3    43.5    1∶128    1∶6451.3    7.0    22.0    50.5    1∶128    1∶6446.9    4.7    20.2    51.0    1∶128    1∶64
                                           表Ⅱ．适用性参数
    处理     ACA 大鼠模型     结合
缓冲液 血清
CH 50/G 血压下降％ LPO％ CT％ LPO％ CT％
对比例1     不是pH 4     515     19    1.5  0.1  43  5.5
对比例2     pH 4     179     18     0  0.5  42  6.7
实施例1  pH 4加入600 U胃蛋白酶     125     7     0  0.3  34  3.9
实施例2  pH 4和加入1200 U胃蛋白酶     89     2     0  0.5  23  3.7
加入胃蛋白酶将降低ACA，消除大鼠模型中的血压下降，以及降低C1q-结合活性。

Claims (10)

1．用于制备可静脉给药的多克隆，非化学修饰的免疫球蛋白制剂的方法，所述制剂中IgM一部分以总免疫球蛋白部分计多于5重量％，且具有低的抗补体活性，其特征在于，相应的含有IgM的血浆部分的水悬液用蛋白酶处理。
2．根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该制剂显示具有＜500CH 50/g蛋白质，优选＜200 CH 50/g蛋白质，特别是＜150 CH 50/g蛋白质的抗补体活性。
3．根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有IgM的血浆部分的水溶液或悬浮液在酸性pH值下，在加入蛋白酶，在至少15℃温度下温育。
4．根据权利要求3所述的方法，其特征在于，温育温度为20至50℃，优选35至40℃。
5．根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，温育时间为1至48小时，优选6至12小时。
6．根据权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，含有IgM的血浆部分的水溶液或悬浮液中蛋白酶浓度至少是50 U/g蛋白质，优选300至1200 U/g蛋白质。
7．根据权利要求1至6之任一所述的方法，其特征在于，含有IgM的血浆部分的水溶液或悬浮液经受蛋白酶处理时的pH值是3.5至5.5，优选3.7至4.3。
8．根据权利要求1至7之任一的方法，其特征在于，蛋白酶是一内肽酶(Endopepdidase)。
9．根据权利要求8所述的方法，其特征在于，蛋白酶是至少一种内肽酶，其选自胃蛋白酶、番木瓜蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或嗜热菌蛋白酶，其任意地固定在载体上。
10．根据权利要求1至9之任一的方法，其特征在于，含有IgM的血浆部分的水溶液或悬浮液的离子强度＜0.1，优选＜0.04。
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