CZ125599A3 - Způsob výroby IgM pro nitrožilní použití - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby imunoglobulinového roztoku, vhodného pro nitrožilní použití. Jako výchozí materiál se používá proteinová frakce, obsažená v lidské nebo zvířecí krvi, která obsahuje ve zkoncentrované formě imunoglobulíny.

Dosavadní stav techniky

Imunoglobulíny hrají jak známo důležitou roli v imunním systému člověka a savců při obraně před infekcí. Imunoglobulíny se dělí do různých tříd (např. IgG,IgA,IgM,IgD a IgE) s rozdílnými biochemickými a fyziologickými vlastnostmi. Do roku 1980 byl izolován pouze IgG a použit jako nitrolžilní produkt pro profylaxy a terapii. V patentech EP-A-0 013 901, EP-A-0 413.187 a EP-A-0 352 500 jsou popsány preparáty IgM, které byly zejména zpracováním s βpropiolaktonem nitrožilně únosné. Patentová přihláška EP-A-0 413 188 popisuje způsob, v němž se dosahuje nitrožilní únosnosti výměnnou chromatografií aniontů se selektivní elucí nitrožilně únosné frakce.

Podstata vynálezu

Cílem předloženého vynálezu je výroba vysoce vyčištěného, koncentrátu IgM, vhodného k nitrožilnímu podávání pro terapii a profylaxy. Produkt má mít nízkou antikomplementární aktivitu (ACA) a vykazovat u modelu krysy vysoké snížení krevního tlaku, molekuly IgM nemají být ale chemicky modifikovány. Tohoto cíle bylo překvapivě dosaženo zpracováním imunoglobulinového roztoku s obsahem IgM proteinázou.

Předmětem vynálezu je proto způsob, definovaný v patentovém nároku 1. Výhodně je zpracování proteinázou inkubace, provedená za zvýšené teploty, za přítomnosti pepsinu, papainu, plazminu či ter·· 9 ··«·

Φ ·· ··

Φ · · · • · · · • * · · · · · molyzinu. Proteinázy mohou být rovněž chemicky imobilizovány na nosiči nebo vyrobeny genotechnicky. Preparát, získaný, způsobem podle vynálezu, může být převeden do roztoku, který je podáván nitrožilně. Takový roztok ukazuje u krysího modelu snížení ACA, pokles krevního tlaku a vazební aktivitu Clq.

Jako výchozí materiály pro způsob podle předloženého vynálezu se hodí imunoglobulinové roztoky,jako například plazma, sraženina A nebo B z Kistler-Nitschmannovy frakcionace; Cohnových frakcí I/II/III, II/III,III nebo jiné frakce plazmy z lidské či zvířecí plazmy s obsahem IgM. Imunoglobulinová frakce se může rozpustit, například jako sraženina B podle Kistler-Nitschmanna v pufru, kde se odstraní většina nečistot srážením 0,5 až 5%ní kyselinou octovou při pH 4 až 6, výhodně při pH 5. Nakonec se roztok inkubuje při nízké iontové síle 1 až 48 hodin, výhodně 9 hodin, při teplotě od 20° do 50°C°, výhodně při 37° C, za přídavku alespoň 50 U/g pepsinu, výhodně 600 U/g.

Pro další čistění může být roztok podroben adsorpci, například gelem s obsahem skupin DEAE v předsměsi nebo sloupcovým způsobem. Má-li být koncentrace IgM v konečném produktu dále zvýšena, tak se vnese roztok, obsahující IgM na výměník iontů (např. TMAEFraktogel®) . Selektivní elucí např. pomocí solných gradientů nebo gradientů pH může být frakce IgM izolována. Ultrafiltrací a diafiltrací, výhodně gelovou filtrací může být roztok koncentrován a obsah elektrolytu nastaven na konečnou nitrožilně únosnou formulaci. Koncentrace proteinu může činit 1 až 20%, výhodně 3 až 6%. Produkt může doplňkově obsahovat proteiny, výhodně albumin, jakož i cukr, výhodně glukózu nebo sacharózu nebo aminokyseliny.

K posouzení nitrožílní únosnosti imunoglobulinových preparátů se bere obvykle antikomplementární aktivita (ACA) . K určení ACA se inkubuje definované množství produktu, který je třeba zkoušet s definovaným množstvím komplementu morčat a zbývající množství kom3 · 00 0 00 0«

0« ' 0 0 · «00«

000 0 00« 0 0,0 0

00·· 0 0 0 «000 0 000 00«

0 0 0 0 0 0 «0« 0 00 0 00 00 plementu se titruje. ACA se udává jako spotřeba CH50 na g imunoglobulinu. Udané výsledky ACA byly dalekosáhle stanoveny podle metody, publikované M.Mayerem. (Mayer,M.M. (1961) Complement and complement fixation). V Experimental Immunochemistry, 2nd. end. pp 133-240. C Thomas, Springfield II). Jako ukazatel pro nitrožilně použitelné produkty IgG platí ACA< 1.000 CH50 na g proteinu.

K posouzení nitrožilní únosnosti může být vzata dále vazba komponent komplementu Clq na imunoglobulin. Ke stanovení se inkubuje definované množství zkušebního produktu s definovaným množstvím čistého, radioaktivně označeného komplementu Clq do pufru a do séra. Vazební aktivita Clq zkušebního produktu se zjistí precipitací za přítomnosti polyetylenglykolu. Čím je vyšší radioaktivita ve sraženině, tím vyšší je vazební aktivita Clq produktu. Podrobnější výpovědi o druhu vazby Clq a tím kvality produktu se dají docílit, jestliže se Clq označí radioaktivně dvěma různými metodami. Na jedné straně za co možná mírných oxidačních podmínek laktoperoxidázou (LPO) a na druhé straně za drastických oxidačních podmínek chloraminem T (CT). Výzkumy byly dalekosáhle prováděny podle metody, publikované P.Spáthem. (P.J.Spáth, A.Corvetta,

U.E.Nydegger, R.Bůttler: 7\n Extended Clq-Binding Assay Using Lactoperoxidase- and Chloramin-T-lodinated Clq. Scand

J.Immunol.18,219-328,1983). Od intaktního nitrožilně únosného preparátu se očekává, že vazební aktivita Clq je pokud možno malá. Modelem pro zkoušení nitrožilní únosnosti imunoglobulinu je model krysy podle Bleekera a spol. [W.K.Bleeker, J.Akterberg,

G.Rigter,A.de Vries-van Rossen, J,C. Bakker: AN animal model for the detection of hypotensive side effects of immunoglobulin preparations. Vox.Sang 52: 281-290 (1987). Parametrem únosnosti v tomto modelu je krevní tlak. Nitrožilně neúnosné produkty vedou ke zřetelnému poklesu krevního tlaku.

...... ...............~ - ................ “....

«·»·*·· ·* ··· «·« * * · · • · · · ··· · · · · * ««·« « · · ·««« η .·· ·«* • · · · · » * »*· · «· · »t ··

Příklady

Referenční příklad 1 kg sraženiny B podle Kistler-Nitschmanna bylo suspendováno do 4 kg 0,1 M acetátového pufru, pH 5,1 a založeno 2%ní kyselinou octovou při pokojové teplotě. Na g kyseliny octové bylo přidáno 0,15 g fosforečnanu vápenatého a sraženina odfiltrována. Filtrát byl diafiltrován proti 20mmol/l piperazinu, 60 mmol/l NaCl, pH 5,8. Diafiltrovaný roztok byl zpracován 75 mg DEAE-Sephadexu® na g proteinu. Následně byla nastavena koncentrace proteinu na 20 mg/ml a roztok zpracován l%Tweenem® 80 a 0,3% TNBP (tri-n-butylfosfátem) 8 hodin při 25°C. Následně byl roztok vnesen na sloupec TMAE-Fraktogelu® a eluována frakce IgM 20 mmol piperazinu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt byl zahuštěn na 5% proteinu a nastavena hodnota pH na 4,5.

Referenčí příklad 2 kg sraženiny B podle Kistler-Nitschmanna bylo suspendováno do 4 kg 0,1 M acetátového pufru, pH 5,1 a založeno 2%ní kyselinou octovou při pokojové teplotě. Na g kyseliny octové bylo přidáno 0,15 g fosforečnanu vápenatého a sraženina odfiltrována. Filtrát byl diafiltrován proti 20 mmol/l NaCl a roztok přiveden na koncentraci 20 mg/ml proteinu. 0,2 M HCÍ byla nastavena hodnota pH na 4,0 a roztok byl během 9 hodin při 37°C inkubován. Po ochlazení na 20°C bylo pH nastaveno na 5,8 a přidán piperazin do množství 20mmol/l a NaCl do množství 60mmol/l. Roztok byl pak zpracován l%Tweenem® 80 a 0,3% TNBP (tri-n-butyl-fosfátem) 8 hodin při 25°C. Následně byl roztok vnesen na sloupec TMAE-Fraktogelu® a eluována frakce IgM 20 mmol piperazinu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt byl zahuštěn na 5% proteinu a nastavena hodnota pH na 4,5.

9· · • ·

Příklad 1 kg sraženiny B podle Kistler-Nitschmanna bylo suspendováno do 4 kg 0,1 M acetátového pufru, pH 5,1 a založeno 2%ni kyselinou octovou při pokojové teplotě. Na 1 g kyseliny octové bylo přidáno 0,15 g fosforečnanu vápenatého a sraženina odfiltrována. Filtrát byl diafiltrován proti 20 mmol/1 NaCl a roztok přiveden na koncentraci 20 mg/ml proteinu. 0,2 M HCl byla nastavena hodnota pH na 4,0 a roztok byl během 9 hodin při 39°C inkubován. Po ochlazeni na 20°C bylo pH nastaveno na 5,8 a přidán piperazin 20mmol/l a NaCl 60mmol/l. Roztok byl pak zpracován l%Tweenem® 80 a 0,3% TNBP (trin-butyl-fosfátem) 8 hodin při 25°C. Následně byl roztok vnesen na sloupec TMAE-Fraktogelu® a eluována frakce IgM 20 mmol piperazinu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt byl zahuštěn na 5% proteinu a nastavena hodnota pH na 4,5.

Přiklad 2 kg sraženiny B bylo zpracováno analogicky k referenčnímu přikladu 2, přičemž bylo před inkubaci namísto 600 U pepsinu na g proteinu přidáno 1200 U pepsinu na g proteinu.

I.Charakteristika experimentálních produktů

Imunoglobuliny IgG,IgA a IgM byly stanoveny nefelometricky antisérem. Celkový obsah proteinu byl stanoven Khejdalovou metodou.

« · ·· · • · · • ···· t • · · • · · ·« ' · ·'-· -· • · · · • · to · » · ·· ·

	protein mg/g	IgG mg/g	IgA mg/g	IgM mg/g	izoaglutin
anti'-A	anti-í
Referen. příkl.l	44,4	4,1	16,8	45,0	1:64	1:64
Referen. příkl.2	48,1	8,6	19,3	43,5	1:128	1:64
Přiklad 1	51,3	7,0	22,0	50,5	1:128	1:64
Přiklad 2	46,9	4,7	20,2	51,0	1:128	1:64

II. Tabulka - parametry únosnosti

	zpracování	ACA	model krysy	vazba Clq
pufr	sérum
CH50/g	pokles krevního tlaku %	LPO %	CT %	LPO %	CT %
Referen; příkl.l	bez pH 4	515	19	1,5	0,1	43	5,5
Referen. příkl.2	pH 4	179	18	0	0,5	42	6,7
Přiklad 1	pH 4 s akt. pepsinu 600 u	125	7	0	0,3	34	3,9
Příklad 2	pH 4 s aktivitou pepsinu 1200 v	89	2	0	0,5	23	3,7

Přídavek pepsinu způsobí snížení ACA, snížení poklesu krevního tlaku u modelu krysy, jakož i pokles vazební aktivity Clq.

Claims (9)

1. Způsob výroby nitrožilně podavatelného polyklonálního,chemicky nemodifikovaného imunoglobulinového preparátu s podílem IgM více než 5% hrn.,vztaženo na celkový podíl imunoglobulinu, a nízkou antikomplementární aktivitou vyznačující se tím, že se zpracovává vodný roztok nebo suspenze odpovídající plazmové frakce s obsahem IgM proteinázou.

   Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící preparát má antikomplementární aktivitu < 500 výhodně 250 CH50/g proteinu a především < 150 se t í m, že CH50/g proteinu, CH50/g proteinu.
2. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2,vyznačující se t ím, že se inkubuje vodný roztok nebo suspenze plazmové frakce s obsahem IgM při kyselém pH za přídavku proteinázy při teplotě alespoň 15°C.
3. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se t ím, že inkubační teplota činí 20 až 50°C, výhodně 35 až 40°C.
4. 5. Způsob podle nároku 3 nebo 4,vyznačující se t ím, že doba inkubace činí 1 až 48 hodin, výhodně 6 až 12 hodin.
5. 6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 5, vyznačuj ící se t í m, že koncentrace proteinázy ve vodném roztoku nebo suspenzi plazmové frakce s obsahem IgM činí alespoň 50 U/g proteinu, výhodně 300 až 1.200 U/g proteinu.
6. 7. Způsob podle jednoho z nároků laž 6, vyznačuj ící se t í m, že hodnota pH vodného roztoku plazmové frakce s obsahem IgM činí při zpracování proteinázou alespoň 3,5 až 5,5, výhodně 3,7 až 4,3.

   • · o · ··· · ·· · • ···· · · ····· · ··· ··· • · · · · · · • •a » «· · ·· ··
7. 8. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 7, vyznačuj ící se t í m, že proteináza je endopeptidáza.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t ím, že proteináza je alespoň endopeptidáza, která je vybrána ze skupiny pepsin, papain, plazmin nebo termolyzin, které mohou být eventuálně imobilizovány na nosiči.
9. 10. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se t ím, že síla iontů ve vodném roztoku nebo suspenzi plazmové frakce s obsahem IgM je < 0,1, výhodně < 0,04.