SK46699A3

SK46699A3 - Method for producing an igm preparation for intravenous administration

Info

Publication number: SK46699A3
Application number: SK466-99A
Authority: SK
Inventors: Markus Rentsch
Original assignee: Rotkreuzstiftung Zentrallab
Priority date: 1996-10-14
Filing date: 1997-10-14
Publication date: 2000-06-12
Also published as: NO991733L; AU4449597A; NZ334885A; HUP0001069A2; CN1233258A; NO991733D0; CZ125599A3; EP0835880A1; JP2001504092A; BR9712306A; CA2266848A1; PL332774A1; SI9720063A; HUP0001069A3; WO1998016558A1; ID21364A; US6136312A; KR20000048826A; RU2191032C2; AU725134B2

Description

Spôsob výroby preparátu IgM na vnútrožiffté použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby imunoglobulínového roztoku, vhodného na vnútrožilné použitie. Ako východzí materiál sa používa proteínová frakcia, obsiahnutá v ľudskej alebo zvieracej krvi, ktorá obsahuje v skoncentrovanej forme imunoglobulíny.

Súčasný stav techniky

Imunoglobulíny hrajú, ako je známe, dôležitú roľu v imúnnom systéme človeka a cicavcov pri obrane pred infekciou. Imunoglobulíny sa delia do rôznych tried (napr. IgG, IgA, IgM, IgD a IgE) s rozdielnymi biochemickými a fyziologickými vlastnosťami. Do roku 1980 bol izolovaný len IgG a použitý ako vnútrožilný produkt na profylaxiu a terapiu. V patentoch EP-A-0 013 901 a EP-A-0 352 500 sú opísané preparáty IgM, ktoré boli najmä spracovaním s β-propiolaktónom vnútrožilné únosné. Patentová prihláška EP-A-0 413 188 opisuje spôsob, v ktorom sa dosahuje vnútrožilová únosnosť výmennou chromatografiou aniónov so selektívnou elúciou vnútrožilnej únosnej frakcie.

Podstata vynálezu

Cieľ predloženého vynálezu je výroba vysoko vyčisteného koncentrátu IgM, vhodného na vnútrožilné podávanie na terapiu a profylaxiu. Produkt má mať nízku antikomplementárnu aktivitu (ACA) a pri modeli krysy vykazovať vysoké zníženie krvného tlaku, molekuly IgM nemajú ale byť chemicky modifikované. Tento cieľ sa prekvapujúco dosiahol spracovaním imunoglobulínového roztoku s obsahom IgM proteinázou. ¹

Predmetom vynálezu je preto spôsob, definovaný v patentovom nároku 1. Výhodnou je spracovanie inkubácie proteinázou, realizovanou pri zvýšenej teplote, pri prítomnosti pepsínu, papaínu, plazmínu či temolyzínu. Proteinázy môžu byť rovnako chemicky imobilizované na nosiči alebo vyrobené genotechnicky. Preparát, získaný spôsobom podľa vynálezu, môže byť prevedený do roztoku, ktorý je podávaný vnútrožilné. Taký roztok pri krysom modeli ukazuje zníženie ACA, pokles krvného tlaku a väzobnej aktivity C1q.

Ako východzie materiály na spôsob podľa predloženého vynálezu sa hodia imunoglobulínové roztoky, ako napríklad plazma, zrazenina A alebo B z Kistler-2Nitschmannovej frakcionácie; Cohnových frakcií l/ll/lll, ll/ΙΙΙ,ΙΙΙ alebo inej frakcie plazmy z ľudskej, či zvieracej plazmy s obsahom IgM. Imunoglobulínová frakcia sa môže rozpustiť, napríklad ako zrazenina B podľa Kistler-Nitschmana v tlmivom roztoku, kde sa odstráni väčšina nečistôt zrážaním 0,5 až 5%-nou kyselinou octovou pri pH 4 až 6, výhodnejšie pri pH 5. Nakoniec sa roztok inkubuje pri nízkej iónovej sile 1 až 48 hodín, výhodnejšie 9 hodín, pri teplote od 20° do 50 ’C, výhodnejšie pri 37 °C, pri pridaní aspoň 50 U/g pepsínu, výhodnejšie 600 U/g.

Pre ďalšie čistenie môže byť roztok podrobený adsorpcii, napríklad gélom s obsahom skupín DEAE v predzmesi alebo stĺpcovým spôsobom. Ak má byť koncentrácia IgM v konečnom produkte ďalej zvýšená, tak sa vnesie roztok, obsahujúci IgM na výmenník iónov (napr. TMAE-Fraktogel®). Selektívnou elúciou, napr. s pomocou soľných gradientov, alebo gradientov pH, môže byť frakcia IgM izolovaná. Ultrafiltráciou a diafiltráciou, výhodnejšie gélovou filtráciou, môže byť roztok koncentrovaný a obsah elektrolytu nastavený na konečnú vnútrožilnú únosnú formuláciu. Koncentrácia proteinu môže predstavovať 1 až 20%, výhodnejšie 3 až 6%. Produkt môže doplnkovo obsahovať proteíny, výhodnejšie albumín, ako aj cukor, výhodnejšie glukózu alebo sacharózu alebo aminokyseliny.

Na posúdenie vnútrožilnej únosnosti imunoglobulínových preparátov sa berie obyčajne antikomplementárna aktivita (ACA). Na určenie ACA sa inkubuje definované množstvo produktu, ktorý je potrebné skúšať s definovaným množstvom komplementu morčiat a ostávajúce množstvo komplementu sa titruje. ACA sa udáva ako spotreba CH50 na g imunoglobulínu. Udané výsledky ACA boli ďalekosiahle stanovené podľa metódy, publikovanej M. Mayerom. (Mayer, M. M. (1961) Complement ant complement fixation). V Experimental Immunochemistry, 2nd. énd. pp 133-240. C Thomas, Springfield Ii). Ako ukazovateľ pre vnútrožilne použiteľné produkty IgG platí ACA 1.000 CH50 na g proteinu.

Na posúdenie vnútrožilnej únosnosti môže byť ďalej väzba komponent komplementu C1q na imunglobulín. Na stanovenie sa inkubuje definované množstvo skúšobného produktu s definovaným množstvom čistého, rádioaktívne označeného komplementu C1q dotlmivého roztoku a do séra. Väzobná aktivita C1q skúšobného produktu sa zistí precipitáciou pri prítomnosti polyetylénglykolu. Čím je vyššia rádioaktivita v zrazenine, tým ve vyššia väzobná aktivita C1q produktu. Podrobnejšie výpovede o druhu väzby C1q a tým kvality produktu sa dajú docieliť, ak sa C1q označí rádioaktívne dvomi rôznymi metódami. Na jednej strane pri čím možno miernych oxidačných podmienkach

-3 laktoperoxidázou (LPO) a na druhej strane pri drastických oxidačných podmienkach chloramínom T (CT). Výskumy boli vykonávané ďalekosiahle podľa metódy, publikovanej P. Späthom. (P. J. Späth, A. Corvetta, U. E. Nydegger, R. Buttler: An Extended C1qBinding Assay Using Lactoperoxidase- and Chloramin-T-lodinated C1q. Scand J. Immunol. 18,219-328,1983). Od intaktného vnúrožilne únosného preparátu sa očakáva, že väzobná aktivita C1q je pokiaľ možno malá. Modelom na skúšanie vnútrožilnej únosnosti imunoglobulínov je model krysy podľa Bleekera a spol. [W. K. Bleeker, J. Akterberg, G. Rigter, A. de Vries-van Rossen, J. C. Bakker: AN animal model for the detection of hypotensive side effects of immunoglobulin preparations. Vox. Sang 52: 281 - 290 (1968)]. Parametrom únosnosti v tomto modeli je krvný tlak. Vnútrožilné neúnosné produkty vedú k zreteľnému poklesu krvného tlaku.

Príklady

Referenčný príklad 1 kg zrazeniny B podľa Kistler-Nitschmanna bol suspendovaný do 4 kg 0,1 M acetátového tlmivého roztoku, pH 5,1 a založené 2 %-nou kyselinou octovou pri izbovej teplote. Na g kyseliny octovej bolo pridané 0,15 g fosforečnanu vápenatého a zrazenina odfiltrovaná. Filtrát bol diafiltrovaný proti 20 mmol/1 piperazínu, 60 mmol/1 NaCl, pH 5,8. Diafiltrovaný roztok bol spracovaný 75 mg DEAE-Sephadexu® na g progeínu. Nasledovne bola nastavená koncentrácia proteínu na 20 mg/ml a roztok spracovaný 1 % Tweenem® 80 a 0,3 % TNBP (tri-n-butyl-fosfátom) 8 hodín pri 25 °C. Nasledovne bol roztok vnesený na stĺpec TMAE-Fraktogelu® a eluované frakcia IgM 20 mmol piperazínu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt bol zahustený na 5 % proteínu a nastavená hodnota pH na 4,5.

I .

¹ i

Referenčný príklad 2 kg zrazeniny B podľa Kistler-Nitschmanna bol suspendovaný do 4 kg 0,1 M acetátového tlmivého roztoku, pH 5,1 a založené 2 %-nou kyselinou octovou pri izbovej teplote. Na g kyseliny octovej bolo pridané 0,15 g fosforečnanu vápenatého a zrazenina odfiltrovaná. Filtrát bol diafiltrovaný proti 20 mmol/1 NaCl a roztok privedený na koncentráciu 20 mg/ml proteínu. 0,2 M HCl bola nastavená hodnota pH na 4,0 a roztok bol v priebehu 9 hodín pri 37 *C inkubovaný. Po ochladnutí na 20OC bolo pH nastavené na 5,8 a pridaný piperazín do množstva 20 mmol/1 a NaCl do množstva 60 mmol/1. Roztok bol potom spracovaný 1

-4% Tweenem R 80 a 0,3 TNBP (tri-n-butyl-fosfátom) 8 hodín pri 25 °C. Nasledovne bol roztok vnesený na stĺpec TMAE-Fraktogelu R a eluovaná frakcia IgM 20 mmol piperazínu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt bol zahustený na 5 % proteínu a nastavená hodnota pH na 4,5.

Príklad 1 kg zrazeniny B podľa Kistler-Nitschmanna bolo suspendované do 4 kg 0,1 M acetátového tlmivého roztoku, pH 5,1 a založené 2 %-nou kyselinou octovou pri izbovej teplote. Na 1 g kyseliny octovej bolo pridané 0,15 g fosforečnanu vápenatého a zrazenina odfiltrovaná. Filtrát bol diafiltrovaný proti 20 mmol/1 NaCl a roztok privedený na koncentráciu 20 mg/ml proteínu. 0,2 M HCI bola nastavená hodnota pH na 4,0 a roztok bol v priebehu 9 hodín pri 39 ’C inkubovaný. Po ochladnutí na 20 °C bolo pH nastavené na 5,8 a pridaný piperazín 20 mmol/1 a NaCl 60 mmol/1. Roztok bol potom spracovaný 1% Tweenem® 80 a 0,3 TNBP (tri-n-butyl-fosfátom) 8 hodín pri 25 °C. Nasledovne bol roztok vnesený na stĺpec TMAE-Fraktogelu® a eluovaná frakcia IgM 20 mmol piperazínu, 160 mmol NaCl, pH 5,8. Konečný produkt bol zahustený na'5% proteínu a nastavená hodnota pH na 4,5.

Príklad 2 kg zrazeniny B bolo analogicky spracované k referenčnému príkladu 2, pričom bolo pred inkubáciou namiesto 600 U pepsínu na g proteínu pridané 1200 U pepsínu na g proteínu.

-5I. Charakteristika experimentálnych produktov

Imunoglobulíny IgG, IgA a IgM boli stanovené nefelometricky antisérom. Celkový obsah proteínu bol stanovený Khejdalovou metódou.

	spracovanie	ACA	model krysy	väzba Clq
tlm.roztok	sérum
CH50/g	pokles krvn. tlaku %	LPO %	CT %	LPO %	CT %
Referen. Príkl.1	bez pH4	515	19	1,5	0,1	43	5, 5
Referen. Príkl.2	pH4	179	18	0	0,5	42	6,7
Príkl.1 t	pH4 s akt. Pepsínu 600 U	125 1	7	0	0, 3	34 1	3,9
Príkl.2	pH4 s akt. Pepsín u 1200 U	89	2	0	0, 5	23	3,7

Prídavok pepsínu spôsobí zničenie ACA, zníženie poklesu krvného tlaku pri modeli krysy, ako aj pokles väzobnej aktivity C1q.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob výroby vnútrožilne podávateľného polygonálneho, chemicky nemodifikovaného imunoglobulínového preparátu s podielom IgM viac ako 5 % hm., vo vzťahu na celkový

I I podiel imunoglobulínu, a nízkou antikomplementárnou aktivitou vyznačujúci sa tým, že sa proteinázou spracováva vodný roztok alebo suspenzia zodpovedajúca plazmovej frakcie s obsahom IgM.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že preparát má antikomplementárnu aktivitu 500 CH50/g proteínu výhodnejšie 250 CH50/g proteínu a predovšetkým 500 CH50/g proteínu.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa inkubuje vodný roztok alebo suspenzia plazmovej reakcie s obsahom IgM pri kyslom pH pri pridaní proteinázy pri teplote aspoň 15 °C.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že inkubačná teplota predstavuje 20 až 50 °C, výhodnejšie 35 až 40 °C.
5. Spôsob podľa nároku 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že doba inkubácie predstavuje 1 až 48 hodín, výhodnejšie 6 až 12 hodín.
6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia proteinázy vo vodnom roztoku alebo suspenzii plazmovej frakcie s obsahom IgM predstavuje aspoň 50 U/g proteínu, výhodnejšie 300 až 1.200 U/g proteínu.
7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH vodného roztoku plazmovej frakcie s obsahom IgM predstavuje pri spracovaní proteinázou aspoň 3,5 až 5,5, výhodnejšie 3,1, až 4,3.
8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že proteináza je endopeptidáza.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že proteináza je aspoň endopeptidáza, ktorá je vybraná zo skupiny pepsín, papaín, plazmín, alebo termolyzín, ktoré môžu byť eventuálne imobilizované na nosiči.
10. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že sila iónov vo vodnom roztoku alebo suspenzii plazmovej frakcie s obsahom IgM je 0,1, výhodnejšie 0,04.