JPH0228195A - 抗イディオ型抗体を溶出剤として使用する免疫親和性クロマトグラフ法による生理活性物質の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗イディオ型抗体を溶出剤として使用して、
免疫親和性クロマトグラフ法により生理活性物質を単離
する方法に関するものである。

〔従来の技術） 親和性クロマトグラフ法は、生理活性物質を単離する有
用な方法として使用されており、特に免疫親和性クロマ
トグラフ法は、抗原−抗体間の特異的な親和力を利用す
る選択的単離方法である。

免疫親和性クロマトグラフ法は、単離せんとする生理活
［生物質に対する抗体を製造して、固形担体に共有結合
させた後、単離せんとする生理活性物質を含む試料を抗
体−担体複合体に添加して、生理活性物質を抗体に吸着
させ、適当な方法で洗浄した後、溶出剤を添加して目的
物質を溶出収得する方法である。

このような方法は既存の方法、即ち、ゲル濾過法、イオ
ン交換クロマトグラフ法等の方法に比べ、生理活性物質
を迅速に定量的に得ることができる長所がある。

しかし、親和性クロマトグラフ法の最も重要な段階であ
る溶出段階において、全ての物質の溶出に汎用すること
のできる溶出方法がないので、単離せんとする物質ごと
に目的物質の安定性とゲルの安定性及び目的物質とリガ
ンドの相互作用を考慮して、適切な溶出条件を設定しな
ければならない難しさがある。また、−射的に利用され
る次の溶出方法等は、その条件が苛酷であるため目的物
質の変性により活性収率の低下を起こすか、リガンドに
非特異的に結合された物質の溶出による精製率の低下を
起こすので、産業的応用が大きく制限されている。

親和性クロマトグラフ法で一般的に使用される溶出方法
は次のようである。

１）ｐＨを変化させる方法 単離せんとする生理活性物質とリガンドの結合は、主と
してイオン結合に適当なｐＨが、必ずしも単離せんとす
る生理活性物質が安定に存在するｐＨではないので、使
用に制限がある。

例）プロティンＡ−アガロースによるＩｇＧの単離（１
Ｍ硝酸またはＯ，１ＭグリシンＨＣｌ２ｐＨ３） ２〕イオンの強度を変化させる方法 イオンの強度を高めて溶出させる方法として、ＮａＣＪ
２とＫＣβを主に使用する０通常、燐酸緩衝液の中には
０．１〜０．５Ｍ程度のＮａＣｇ及びＫ（１２が含まれ
ているので、最終の濃度を１〜３Ｍにするため高濃度の
塩を使用する。

例）ヘパリン−アガロースによる蛋白質の単離 ３）変性剤を添加する方法 単離せんとする生理活性物質とリガンドの相互作用が極
めて強く、ｐＨやイオン強度の変化によっては溶出され
ず、また適当な親和性溶出剤を発見することができない
場合に使用される方法で、特異性が高（相互作用の強い
免疫親和性クロマトグラフ法において主に使用される。

変性剤としては、通常６〜８Ｍの沃素や４〜６Ｍのグア
ニジン塩酸が使用されるが、このような苛酷な溶出条件
は単離せんとする生理活性物質を不可逆的に変性させる
欠点がある。

４）カオトロピック試薬ｆ（：ｈａｏｔｒｏｐｉｃ　Ａ
ｇｅｎｔｌを添加する方法 カオトロピック試薬は、単離せんとする生理活性物質の
水に対する溶解度を増加させることにより溶出作用を表
すが、同時に変性剤としても作用するので、適当なカオ
トロピックイオンを適当な温度で使用しなければならず
、条件を求めるのが極めて難しい。

５）親和性溶出剤を添加する方法 親和性クロマトグラフ法の特性を最もよく利用した溶出
方法で、リガンドに対して単離せんとする生理活性物質
と和親的に結合または相互作用することのできる物質を
溶出剤として使用する方法である。

親和性溶出剤は他の溶出剤とは異なり、目的物質だけを
選択的に溶出させるので、リガンドに非特異的に吸着さ
れた物質を溶出させず、通常最も安全な条件で低濃度の
溶出剤を使用するので、精製せんとする生理活性物質の
変性による生理活性の低下を起こさない。

以上のように、既存の溶出方法１）〜４）は単離せんと
する生理活性物質の安定性を阻害する苛酷な条件で溶出
を行うため、目的物質の活性収率が低いのは勿論、リガ
ンドに非特異的に吸着された物質の混入により精製率が
低くなる短所がある。ただ極めて制限的な親和性溶出剤
を利用した溶出方法５）が利用されているが、この方法
は基質や基質類似物質、阻害剤等が良く研究されている
酵素の単離にのみ局限されており、−射的にはリガンド
に特異的親和性のある溶出剤を発見し難いので生理活性
物質の単離に利用するのは殆ど不可能であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記のような従来の溶出方法に伴う問題点を
解決することのできる、親和性クロマトグラフ法による
生理活性物質の単離方法を提供し、特に既存の親和性ク
ロマトグラフ法により単離が極めて困難な生理活性物質
の単離に有効に利用しつる。

また、本発明は、苛酷な溶出条件で、容易に変性して活
性が低下する生理活性物質や高純度が要求される生理活
性物質及び微量の生理活性物質を高純度、高収率で単離
することのできる経済的方法を提供する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、免疫親和性クロマトグラフ法により生理活性
物質を単離するに当って、リガンドに使用された抗体に
対し単離せんとする物質と和親的に結合することのでき
るイメージを保持する抗イディオ型（Ｉｍａｇｅ　Ｂｅ
ａｒｉｎｇ　Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ）抗体を溶出
剤に使用して、目的物質を溶出、収得する方法である。

溶出剤に使用される抗イディオ型抗体は、リガンドに使
用されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を抗
原として公知の方法により製造することのできる、モノ
クローナルまたはポリクローナル抗イディオ型抗体であ
る。

このような方法は、生理活性物質をリガンドから溶出さ
せるために苛酷な条件を加＾ないので、単離せんとする
生理活性物質を構造的、機能的に最も安定にする物理化
学的条件で溶出させることにより、生理活性物質の活性
収率を高めることができ、リガンドとして使用された抗
体に対する非特異的結合により、吸着された汚染物質を
溶出させないので、目的物質のみを高純度で単離するこ
とができる。

目的物質の溶出過程において混入することのある抗イデ
ィオ型抗体は、抗イディオ型抗体の製造に使用した動物
の免疫グロブリンに対し、親和性のある抗ＩｇＧ免疫親
和性カラムを利用するか、ゲル？濾過法を利用して容易
に分離することができる。

本発明の方法は、免疫親和性クロマトグラフ法により単
離することのできる全ての活性物質の単離に利用するこ
とができ、具体的には次のようである。

１）　人体または動物の体液や分泌物、例えば、血液、
リンパ液、腹水、消化官液、尿等からの生理活性ペプチ
ド、例えばインシュリン、ウロキナーゼ、α−インター
フェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロ
ン、エリスロポエチン、セクレチン、α−フェトプロテ
イン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血球分化刺激因子（
Ｃ３Ｆ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、組
織型プラスミノゲン活性因子（ＴＰＡ）、血液凝固因子
■、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒト型成長ホル
モン（ＨＧＨ）等を単離せんとする場合には、目的物質
を含む試料を塩析、透析、濃縮等の簡単な操作により前
処理した後、本発明の方法により短時間内に高純度、高
収率で単離することができる。

人体または動植物から人為的に分離した細胞株及び細胞
融合や遺伝子組換えにより人為的に製造した細胞株の培
養液から抽出、単離することのできる生理活性ポリペプ
チド、例えばヒト型インシュリン、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン（ＨＣＧ）、　α−インターフェロン、β−イ
ンターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ）、
ヒト型成長ホルモン（ＨＧＨ）、インターロイキン−１
，ｌ１１１１、ＩＶ、セクレチン、組織型プラスミノー
ゲン活性因子（ＴＰＡ）、ソマトスフチン、ウロキナー
ゼ等を単離せんとする場合には、目的物質を含む培養液
を塩析、透析、Ｊ縮等の簡単な操作で前処理して使用す
るか、または直接使用することができる。

２）の生理活性物質を培養した細胞株から抽出単離せん
とする場合には、公知の方法により細胞を破砕して遠心
分離、塩析、透析、濃縮等の操作により前処理した後、
本発明の方法により抽出単離することができる。

人体及び動物の体液や分泌物または細胞培養液や培養し
た細胞株から得ることのできる抗原性のある生理活性物
質、例えばプロティン、リビド、リボプロティン、ヌク
レオチド、ヌクレオプロティン、ポリサッカライド等の
場合にも、１）３）の方法により抽出単離することがで
きる。

１）４）の生理活性物質、特に抗原または指標物質、例
えばＢ型肝炎表面抗原 （ＨＢｓＡｇ）、ＣＡＬＬＡ、β−ＨＣＧ、α−フェト
プロテイン等と放射線同位元素、ビオチン、アビジン、
ＨＲＰＯ、アルカリフォスファターゼ等との結合体を単
離せんとする場合も、本発明の方法により高純度、高収
率で単離することができる。

本発明の方法を具体的に説明する。

イメージを保持する抗イディオ型抗体の製造本発明の方
法に使用されるイメージを保持する抗イディオ型抗体は
、次の方法で製造することができる。

単離せんとする生理活性物質を抗原とするモノクローナ
ル抗体を、公知の方法（Ｋｏｅｌｅｒ、　Ｇ。

ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　２
５６：４９５　１９７５Ｃ１ａｆｌｉｎ　Ｌ、　ａｎｄ
　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｋ、、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉｃ
ｓＭｉｃｒｏｂｉａｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　８１：
１（１７，１９７８１により製造し、製造したモノクロ
ーナル抗体で再び動物を免疫にした後、公知の方法（Ｃ
ｏｎｓｔａｎｔｉｎ　Ａ。

Ｂｏｎａ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ　　７９：　　２５−４４１９８４、　１ｂｉ
ｄ　　９０：　　１１５−１２７．１９８６．Ｊｅｒｎ
、Ｎ、Ｋ。

ＥＭＢＱ　　Ｊ、　　Ｉ　　：　　２４３．１９８２．
Ａｎｎ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２５：３７３−３
８９．　１９７４．　　Ｇｏｒｄｏｎ　　Ｒ，Ｄｒｅｅ
ｓｍａｎ　　ａｎｄＲｏｎａｌｄ　　Ｃ，Ｋｅｎｎｅｄ
ｙ、　　Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＩｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　　１５１：　　７６１−
７６５．１９８５．Ｂ。

Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇｅｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔ
ｏｄａｙ　６：　１０−１１１９８５１　、要するに免
疫された動物の牌臓細胞を分離してミエローマ細胞と融
合した後、モノクローナル抗体に対して免疫原として使
用した生理活性物質と和親的に結合することのできる、
イメージを保持するモノクローナル抗イディオ型抗体を
生成するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリド
ーマ細胞株を培養する方法により、イメージを保持する
モノクローナル抗イディオ型抗体を製造することができ
る。

モノクローナル抗イディオ型抗体を製造する場合には、
ハイブリドーマを選別するに当って、単離せんとする生
理活性物質に、リガンドとして使用せんとする抗体に対
する親和力の犬きい（解離恒数の少ない）抗イディオ型
抗体を生産するハイブリドーマを選別するのが重要であ
る。また生理活性物質のサブタイプを分離して単離せん
とする場合には、サブタイプ特異的モノクローナル抗体
を抗原にして、サブタイプ特異的イメージを保持するモ
ノクローナル抗イディオ型抗体を生産するハイブリドー
マを選別することにより、特定のサブタイプだけを選択
的に溶出させることのできる、抗イディオ型抗体を製造
することができる。

２、目的物質の溶出 本発明の方法に使用する免疫親和性カラムは、公知の方
法により製造することのできるポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体をリガンドに使用して、通常の方法に
より製造することができる。

即ち、リガンドに使用せんとするポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を固形担体に適当な方法で共有結合
させた後、カラムに充填し平衡化させて製造することが
できる。

上記のように製造した免疫親和性カラムに単離せんとす
る生理活性物質を含む試料を接触して、目的物質をリガ
ンドに使用された抗体に結合させた後、適当な方法で洗
浄し抗イディオ型抗体溶液を加えて、目的物質を溶出収
得することができる。

目的物質の溶出は、溶出剤として使用された抗イディオ
型抗体と、単離せんとする生理活性物質のリガンドに対
する親和力の差異によって起こるのが殆んどであるので
、溶出条件は単離せんとする生理活性物質と溶出剤に使
用された抗イディオ型抗体を最も安定にする温度、ｐＨ
、イオン強度などを選択することができる。

また、２個以上のサブタイプを連続的に分離せんとする
場合には、各々のサブタイプに対するサブタイプ特異性
モノクローナル抗体を適当な比率で混合して免疫親和性
カラムを製造し。

このカラムに目的物質を結合させた後、各々のサブタイ
プに対するサブタイプ特異的イメージを保持する抗イデ
ィオ型抗体を順次加えて、各々のサブタイプを連続的に
分離精製することができる。

溶出剤に使用した抗イディオ型抗体のリガンドに対する
親和力が単離せんとする生理活性物質のリガンドに対す
る親和力に比べて十分大きい場合には、カラムを使用し
ないでバッチ型で単離することができる。

即ち、上記の方法によって製造した担体−抗体複合体を
カラムに充填しないで試料を直接加久て結合させた後、
洗浄、濾過し、抗イディオ型抗体を添加して目的物質を
溶出させた後、溶出液を濾過収得することができる。

バッチ型はカラム型に比べ操作が短時間内に行うことが
できる長所があるが、リガンドに対する目的物質と溶出
剤の親和力の差異が大きくない場合は、目的物質の溶出
が完全になされないか、溶出剤を過量に使用しなければ
ならない短所がある。

３、目的物質と溶出剤の分離 溶出剤を添加して収得した溶出液には、単離せんとする
生理活性物質だけでな（、通量に添加されるか、リガン
ドに結合されない溶出剤、即ち抗イディオ型抗体が含ま
れているので、純粋な目的物質を得るためには目的物質
と溶出剤を分離する操作が必要である。抗イディオ型抗
体と目的物質の分子量の差異が大きい場合にはゲル濾過
により容易に分離することができ、射的には抗イディオ
型抗体の製造に利用した動物の免疫グロブリンに対し親
和性のある免疫親和性カラム、即ち、抗ＩｇＧ親和性カ
ラムに溶出液を通過させることにより、抗イディオ型抗
体を容易に除去することができる。

実施例１ 血液からＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の単離 ｌ）免疫親和性カラムの製造 Ｂ型肝炎患者の血液１４℃から公知の方法（Ｊａｃｏｕ
ｅｓ　Ｐｉｌｌｏｔ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｅ−Ａｎｎｅ　
Ｐｅｔｉｔ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２１：　
５３．１９８４）により製造した粗製ＨＢｓＡｇ溶液（
ＰＢＳ　　０．０１Ｍ、ｐＨ７，２）３５５−を出発物
質として、ＨＢｓＡｇを単離した。粗ＨＢｓＡｇ溶液３
５５−中の総蛋白質量はｌ　２．１ｇであり、ＨＢｓＡ
ｇの力価は逆間接血球凝集法（ＲＰＨＡ法）で測定した
結果蛋白質１ｍｇ当り１：４８００であった。

ＨＢｓＡｇの単離に使用した免疫親和性カラムは、公知
の方法（Ｅｌｓ、　Ｍ、　Ｃ，の方法：　Ｖｏｘ　Ｓａ
ｎｇ４６：　１６５．１９８４等）により別に製造した
。マウスモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ　　ＩｇＧ　　４
５３ｍｇを常法によりＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ
２５ｇにカップリングさせ、カップリングされたゲル８
７−をガラスカラム（３ｃｍＸ２０ｃ＋ｎ）に充填後、
燐酸緩衝液ＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡
化させて使用した。

このカラムに粗ＨＢｓＡｇ溶液３５５−を４℃において
０．５＋ｄ／分速度で通過させて、ＨＢｓＡｇを結合さ
せた後、ＰＢＳ　（０，０１ＭｐＨ７，２）１ｊ２で洗
浄した。

２）ＨＢｓＡｇの溶出 ＨＢｓＡｇの溶出にはマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗
体を抗原として、公知の方法（ＹａｓｍｉｎＭ、　Ｔｈ
ａｎａｖａｌａの方法：　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５５
：１９７．１９８５等）により別に製造したマウスモノ
クローナル抗ＨＢｓ抗イディオ型抗体５００ｍｇをＰＢ
Ｓ（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）１００−に溶解して溶出
剤に使用し、溶出剤１００−をカラムに加えて、４℃で
０．５ｄ／分の速度で１２時間循環させた後、溶出して
得た溶出液１００−と、ＰＢＳ（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，
２）１００−を加えて得た溶出液１００−を合わせて、
溶出液２００−を収得した。

３）マウスモノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入したマウスモノクローナル抗イディオ型
抗体はＨＢＳＡｇとの分子量の差異を利用してゲル濾過
により除去した。

セファロースＣＬ−４Ｂゲル１０００−をガラスカラム
（４ｃｍＸ　１００ｃＩｍ）に充填し、ＰＢＳ（０，Ｏ
ＬＭ、ｐＨ７，２）で平衡化させた後、２）で収得した
溶出液２００−を２５−に濃縮して加え、Ｏ，ＬＭ　　
ＰＢＳで溶出してＨＢｓＡｇ陽性分画を集合濃縮した。

最終的に収得した粗製ＨＢｓＡｇ溶液５〇−中の総蛋白
質量は２１７ｍｇ、ＨＢｓＡｇの力価はＲＰＨＡ法で測
定した結果、蛋白質１ｍｇ当り１　：２００．ｏｏｏ、
活性収率ば７４．７％、精製度は４２倍であり、精製Ｈ
ＢｓＡｇに対する免疫電気泳動を実施した結果、他の血
清蛋白は認められなかった。

実施例２ マウスＬ細胞の細胞培養液からのＨＢｓＡｇの単離 ＨＢｓＡｇを生産する組換え生物体であるマウスＬ細胞
を、公知の方法（野崎の方法：　Ｇｅｎｅ　３８：３９
−４４．１９８５１により培養して得た培養液５００ｉ
を出発物質にしてＨＢｓＡｇを単離した。

培養液５００ＷＩｌ中の総蛋白質量は１７．０ｇであり
、ＨＢＳＡｇの力価はＲＰＨＡ法で測定した結果、蛋白
質１ｍｇ当り１：２０であった。

ＨＢｓＡｇの単離に使用した免疫親和性カラムは、実施
例１の方法により、別に製造したマウスモノクローナル
抗ＨＢｓＡｇ　　ＩｇＧ　　５０＋ｎｇを常法に従って
ＣＮＢｒ活性化セファロース３．５ｇにカップリングさ
せ、カップリングされたゲル１２−をガラスカラム（１
，５ｃｍＸ　１２ｃａ＋）に充填した後、ＰＢＳ　（０
，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡化して使用した。

このカラムに培養液５００−を４℃で０．５−７分の速
度で通過させて、ＨＢｓＡｇを結合させた後、ＰＢＳ　
（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）１２０−で洗浄した。

２）ＨＢｓＡｇの溶出 ＨＢｓＡｇの溶出には、マウスモノクローナル抗ＨＢｓ
抗体を抗原にして、実施例１の方法により、別に製造し
たマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗イディオ型抗体６０
ｍｇをＰＢＳ　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ７，２）６−に溶解して溶出剤に使用し、溶出剤６
−をカラムに加え、４℃において０．０５ｉ／分の速度
で１２時間循環させた後、溶出して得た溶出液６−と、
再びＰＢＳ　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ７，２）６−を加えて得た溶出液６１Ｒ１を合わせ
て、溶出液１２−を収得した。

３）マウスモノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入されたマウスモノクローナル抗イディオ
型抗体はＨＢｓＡｇどの分子量の差異を利用してゲル濾
過により除去した。

セファロースＣＬ−４Ｂゲル６０−をガラスカラム（１
、５ｃｍＸ　４５ｃｍ）に充填し、ＰＢＳ（０，ＯＬＭ
、ｐＨ７，２）で平衡化した後、２）において収得した
溶出液１２−を２−に濃縮して加え、０．１ＭＰＢＳで
溶出して、ＨＢｓＡｇ陽性分画を集合濃縮した。

最終の精製ＨＢｓＡｇ溶液５−中の総蛋白質量は１．３
ｍｇ、ＨＢｓＡｇの力価はＲＰＨＡ法で測定した結果、
蛋白質１ｍｇ当り１：２００．０００、活性化収率は７
６．４７％、精製度は １０．０００倍であり、精製ＨＢｓＡｇに対し免疫電気
泳動を実施した結果、他の蛋白質は認められなかった。

実施例３ ＨＢｓＡｇビオチン結合体の単離 １）免疫親和性カラムの製造 Ｂ型肝炎患者の血液から取得した粗ＨＢｓＡｇ溶液３０
−（溶液３〇−中の総蛋白質量は７．５ｍｇ、ＲＰＨＡ
法によるＨＢｓＡｇ力価は蛋白質１ｍｇ当り１　：　８
００．０００）に、ビオチン化Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミド（ＢＮＨＳ）２０ｍｇをジメチルホルムアミド１
０−に溶解した溶液０．７−を加えて混和した後、２０
°Ｃにおいて３時間反応させて得たＨＢｓＡｇ−ビオチ
ン結合体含有溶液３２−を出発物質にして、ＨＢｓＡｇ
−ビオチン結合体を単離した。ＨＢｓＡｇ−ビオチン結
合体の力価は、ＲＰＨＡ法で測定した結果、蛋白質１ｍ
ｇ当り１　：４００．ｏｏｏ、総蛋白質量は７．５ｍｇ
であった。

ＨＢｓＡｇの単離に使用した免疫親和性カラムは、実施
例１の方法により、別に製造したマウスモノクローナル
抗ＨＢｓＡｇ　　ＩｇＧ　　２５ｍｇを。

常法によりＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ１．２５ｇ
にカップリングさせ、カップリングされたゲル４．４−
をガラスカラム（１ｃｍｘ１５ｃｍ）に充填した後、Ｐ
ＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡化して使用し
た。

このカラムに試料溶液３２−を４℃において０．０５ｄ
／分の速度で通過させてＨＢｓＡｇ−ビオチン結合体を
結合させた後、４℃でＰＢＳ（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２
）５０−で洗浄した。

２）ＨＢｓＡｇ−ビオチン結合体の溶出ＨＢｓＡｇ−ビ
オチン結合体の溶出には、マウスモノクローナル抗ＨＢ
ｓＡｇ抗体を抗原にして、実施例１の方法により製造し
たマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗イディオ型抗体３５
ｍｇをＰＢＳ（０，０４Ｍ、ｐＨ７，２）７−に溶解し
て溶出剤として使用し、溶出剤７１ｎＩをカラムに加え
４°Ｃで０．０５ｄ／分の速度で１２時間循環させた後
、溶出して得た溶出液６−とＰＢＳ　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ７，２）６Ｍｌを加えて得た溶出液６−を合わせて
、溶出液１２ｍ１ｌを収得した。

３）マウスモノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入されたマウスモノクローナル抗イディオ
型抗体は、ＨＢｓＡｇ−ビオチン結合体との分子量の差
異を利用してゲル濾過により除去した。

セファロースＣＬ−４Ｂゲル６０−をガラスカラム（１
，５Ｘ４５ｃｍ）に充填し、ＰＢＳ（０，ＯＩＭ、ｐＨ
７，２）で平衡化した後、２）で取得した溶出液１２−
を１−に濃縮して加え、Ｏ，ＩＭ　　ＰＢＳで溶出して
ＨＢｓＡｇ−ビオチン結合体陽性分画を集合濃縮した。

最終の精製ＨＢｓＡｇ−ビオチン結合体溶液１０ＴＲ１
中に含まれた総蛋白質量は３．２２ｍｇ、ＨＢｓＡｇ−
ビオチン結合体の力価はＲＰＨＡ法で測定した結果、蛋
白質１ｍｇ当り１ニア２０．０００であり、活性収率は
７７．２８％、精製度は１゜８倍であった。

実施例４ ヒト・ミエローマ細胞培養液から組織型プラスミノーゲ
ン活性因子（ＴＰＡ）の単離 ｌ）免疫親和性カラムの製造 ＴＰＡを産生ずるヒト・ミエローマ細胞を公知の方法（
Ｐｅｒ　ｗａｌｌｅｎの方法：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ１３２：　６８１−６８６．１９８３等）に
より培養して得た培養液１０βを出発物質にしてＴＰＡ
を単離した。

培養液１０Ｉ２中の総蛋白質量は３００ｍｇであり、Ｔ
ＰＡの力価はＣ１ｏｔ　Ｌｙｓｉｓ法で測定して標準ウ
ロキナーゼと比較した結果、蛋白質１ｍｇ当り３．６０
０単位であった。

ＴＰＡの単離に使用した免疫親和性カラムは公知の方法
（Ｍａｒｉｌｙｎ　Ｅ、　Ｒｏｙｇｏｎの方法：Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８：　１−９．
１９８５等）により別に製造したマウスモノクローナル
抗ＴＰＡＩｇＧ　　２００ｍｇを常法によりＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂ６ｇにカップリングさせ、カップ
リングされたゲル２１−をガラスカラム（２，５ｃｍｘ
　１０　ｃｍ）に充填した後、ＰＢＳ　（０，６５Ｍ。

ｐＨ６，８）で平衡化して使用した。

培養液１０ｖ１を５００−に濃縮して、ＰＢＳ（０，６
５Ｍ　　ＮａＣ，９，ｐＨ６，８）に透析し、４°Ｃで
０．　５ｍｔ’／分の速度でカラムを通過させてＴＰＡ
を結合させた後、ＰＢＳ　（０，６５ＭＮ　ａ　Ｃｆ２
　、　ｐＨ６、８）で洗浄した。

２）ＴＰＡの溶出 ＴＰＡの溶出にはマウスモノクローナル抗ＴＰＡ抗体を
抗原として、通常の方法により別に製造したマウスモノ
クローナル抗ＴＰＡ抗イディオ抗体２５０ｍｇをＰＢＳ
　（０，６５Ｍ　　ＮａＣ１ｐＨ６、８、２５ＫＩＶ　
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ／ｉ）　２５ｍｌ＋に溶解して溶出
剤として使用し、溶出剤２５−をカラムに加え、４°Ｃ
で０．５ｍ／／分の速度で循環させた後、溶出して得た
溶出液２５ＷＪｌとＰＢＳ（０，６５Ｍ　　ＮａＣ１ｐ
Ｈ６，８，２５ＫＩＶＡｐｒｏｔｉｎｉｎ／＋＋＋ｆ）
　２５−を加えて得た溶出液２５−を合わせて溶出液５
０−を収得した。

３）マウスモノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液の中に混入したマウスモノクローナル抗イディオ
型抗体とＡｐｒｏｔｉｎｉｎはゲル濾過により除去した
。

セファデックスＧ−２００ゲル４００−をガラスカラム
（２、５ｃｍＸ　Ｉ　ＯＯｃｍ）に充填し、ＰＢＳ　（
０，６５Ｍ　　ＮａＣＪ２．ｐＨ６，８）で平衡化した
後、２）で収得した溶出液５０−を１０−に濃縮して加
えた後、ＰＢＳ　（０，６５ＭＮａＣｊ２．ｐＨ６，８
）で溶出して、ＴＰＡ陽性分画を集合濃縮した。最終の
精製ＴＰＡ溶液１〇−中の総蛋白質量は４．１ｍｇであ
り、ＴＰＡの力価はＣ１ｏｔ　Ｌｙｓｉｓ法で測定して
標準ウロキナーゼと比較した結果、蛋白質１ｍｇ当り２
１７．０００単位、活性収率は８２．４％、精製度は６
０倍であった。

実施例５ ＪＵＲＫＡＴ細胞培養液からインターロイキン−２゜Ｉ
Ｌ−２の単離 １）免疫親和性カラムの製造 ヒト白血球Ｔ−株化細胞であるＪＵＲＫＡＴ細胞を公知
の方法（Ｐａｗｅｌｅｃ　Ｇ、の方法：　Ｅｕｒ、　Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２ｆ５１：　３８７−３９２．１９８２等）により培
養して得た培養液ＩＬを出発物質としてＩＬ−２を単離
した。

培養液ＩＬ中の総蛋白質量は、３１２ｍｇであり、ＩＬ
−２の力価は増殖にＩＬ−２を必要とするＭｕｒｉｎｅ
細胞障害Ｔ−リンパ球株化（ＣＴＬＬ）細胞を利用して
［３Ｈ］−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎで測定した結果、蛋白質１ｍｇ当り１．０００単
位であった。

ＩＬ−２の単離に使用した免疫親和性カラムは公知の方
法（Ｂｕｄｄ　Ｒ，Ｃ６の方法；　Ｊ、　ｉＨｍｕｎｏ
ｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　９５（２１：　２３７：２４８．１９
８６等）により、別に製造したマウスモノクローナル抗
−Ｉ　Ｌ−２ＩｇＧ　　１００ｍｇを、富法によりＣＮ
Ｂｒ活性化セファロース４Ｂ　　４ｇにカップリングさ
せ、カップリングされたゲル１４ｄをガラスカラム（１
、５ｃｍｘ　２０ｃｍ）に充填した後、ＰＢＳ（０，Ｏ
Ｉ　Ｍ、　ｐＨ７，２）で平衡化して使用した。

培！ｌ液ＩＬをＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）に
透析した後５００ｄに、ｌＪ＊Ｌ、４℃において０．５
ｄ／分の速度でカラムを通過させてＩＬ−２を結合させ
た後、ＰＢＳ　（０、ＯＩＭ、ｐＨ７，２）１５０１１
ＬＩｌで洗浄した。

２）ＩＬの溶出 ＩＬ−２の溶出には、マウス・モノクローナル抗ＨＢｓ
抗体を抗原にして、通常の方法により別に製造したマウ
ス・モノクローナル抗ＩＬ−２抗イディオ型抗体１２０
ｍｇを、ＰＢＳ　（０，０１Ｍ、ｐＨ７，２）２８−に
溶解して溶出剤として使用し、溶出剤２０−をカラムに
加え、４℃で０．１Ｍｌ／分の速度で１２時間循環させ
た後、溶出して得た溶出液２０−とＰＢＳ　（０，ＯＩ
Ｍｐ）（７，２）２０−を加λて得た溶出液２０Ｍ１を
合わせて溶出液４８−を収得した。

３）マウス・モノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入したマウス・モノクローナル抗イディオ
型抗体はＩ　Ｌ−２との分子量の差異を利用してゲル濾
過により除去した。

セファデックスＧ−１００ゲル２５０−をガラスカラム
（２ｃｍｘ　１００ｃｍ）に充填し、ＰＢＳ（０，ＯＩ
Ｍ、ｐｉ（７，２）で平衡化した後、２）で収得した溶
出液４０−をｌＯ−に濃縮して加え、Ｏ，ＬＭ　　ＰＢ
Ｓで溶出してＩＬ−２陽性分画を集合濃縮した。

最終の精製ＩＬ−２溶液５−中の総蛋白質量は１．２ｍ
ｇであり、Ｉ　Ｌ−２の力価は蛋白質ＩＢ当り３３０．
０００単位、活性収率は８４．６％、精製度は２．２０
倍であった。

精製Ｉ　Ｌ−２に対して５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実
施した結果、分子量１４．８００と１５５００のＩＬ−
２特有バンドが確認され、２次元電気泳動の結果におい
てもＩＬ−２に固有のバンドが確認され、汚染物質の存
在は確認できなかった。

実施例６ Ｎａｍａｌｖａ細胞培養液からα−インターフェロンの
単離 １）免疫親和性カラムの製法 ヒトのリンパ芽球株化細胞であるＮａｍａｌｖａ細胞を
公知の方法（Ｃｏｈｅｎ　Ｓ、の方法：　Ｄｅｖ、　Ｂ
ｉｏｌ。

５ｔａｎｄ、　６０：　１１１−１２２．１９８５等）
により培養して得た培養液５Ｊ２を出発物質としてα−
インターフェロンを単離した。

培養液５Ｉ２中の総蛋白質量は１．８５０ｍｇであり、
α−インターフェロンの力価はヒト包皮線維芽細胞と小
水痢のウィルスを利用して細胞病理的効果（ＣＰＥ）阻
害分析方法で測定した結果、蛋白質１ｍｇ当り２５．０
００単位であった。

α−インターフェロンの単離に使用した免疫親和性カラ
ムは、公知の方法（Ｎｅｕｒｓ　Ｅ、の方法；Ｉｎｆｅ
ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　３７（３１：　９１９−９２
６．１９８２等）により別に製造したマウスモノクロー
ナル抗−α−インターフェロン　ＩｇＧ　　５０ｍｇを
、常法によりＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ３．３ｇ
にカップリングさせ、カップリングされたゲル１１．５
−をガラスカラム（１、５ｃｍＸ　１２ｃｍ）に充填し
た後、ＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡化し
て使用した。

培養液５Ｉ２をＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）に
透析した後５００１ｄｌに濃縮し、４℃において０．５
ｄ／分の速度でカラムを通過させてα−インターフェロ
ンを結合させた後、ＰＢＳ（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）
１００−で洗浄した。

２）α−インターフェロンの溶出 α−インターフェロンの溶出には、マウス・モノクロー
ナル抗−α−インターフェロン抗体を抗原にして通常の
方法により、別に製造したマウス・モノクローナル抗−
α−インターフェロン抗イディオ型抗体６０ｍｇを、Ｐ
ＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）１０−に溶解して使
用し、溶出剤ｌ〇−をカラムに加え、４℃で０．　１１
＃ｌ／分の速度で１２時間循環させた後、溶出して得た
溶出液１０−とＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）１
０−を加えて得た溶出液ｌＯ−を合わせて溶出液２０−
を収得した。

３）マウス・モノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入したマウス・モノクローナル抗イディオ
型抗体はα−インターフェロンとの分子量差異を利用し
てゲル濾過により除去した。

セファデックスＧ−１００ゲル１００−をガラスカラム
（１，５ｃｍＸ７５ｃ＋ａ）に充填し、ＰＢＳ（０，Ｏ
ＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡化した後、２）で収得した溶
出液２０−を４１１１に濃縮して加え、０．１Ｍ　　Ｐ
ＢＳで溶出してα−インターフェロン陽性分画を集合濃
縮した。

最終の精製α−インターフェロン溶液５−中の総蛋白質
量は０．０６ｍｇであり、α−インターフェロンの力価
は蛋白質１ｍｇ当り６００．０００．０００単位、活性
収率は７７．８％、精製度は２４，０００倍であった。

精製α−インターフェロンは５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た結果、分子量１８．５００バンドが確認され、汚染物
質は発見されなかった。

実施例７ 粗製ウロキナーゼからウロキナーゼの単離１）免疫親和
性カラムの製造 人尿から公知の方法（Ｐｌｏｕｇ、　Ｊ、の方法；Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　２４：　
２７８−２８２．１９５７等）により得た粗製ウロキナ
ーゼ２ｇを出発物質としてウロキナーゼを単離した。粗
製ウロキナーゼの力価は、（：ｌｏｔ　Ｌｙｓｉｓ法で
測定して標準ウロキナーゼと比較した結果、蛋白質１ｍ
ｇ当り８００単位であった。

ウロキナーゼの単離に使用した免疫親和性カラムは、公
知の方法（Ｌａｒｓ　Ｓ、　Ｎ１ｅｌｓｅｎの方法；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：　６４１０．１９８２
等）により別に製造したマウスモノクローナル抗ウロキ
ナーゼＩｇＧ　　４００ｍｇを、常法によりＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂ　　１５ｇにカップリングさせ、
カップリングされたゲル５２−をガラスカラム（２，５
ｃｍｘ　２０ｃｍ）に充填した後、Ｏ，１Ｍトリス−Ｈ
（ｌ溶液（ｐＨ７，６，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０１で平衡化して使用した。このカラムに、粗製ウロキ
ナーゼ２ｇを０．１Ｍトリス−ＨＣｇ溶液（ｐＨ７，６
，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１に溶解した溶液２
００−を、４℃において０．３＋Ｊ／分の速度を加え、
０．１Ｍトリス−ＨＣ９，溶液（ｐＨ７，６，Ｏ，１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１５００−で洗浄した。

２）ウロキナーゼの溶出 ウロキナーゼの溶出には、マウス・モノクローナル抗ウ
ロキナーゼ抗体を抗原にして、通常の方法により別に製
造したマウス・モノクローナル抗ウロキナーゼ抗イディ
オ型抗体５００ｍｇを、０．１Ｍトリス−ＨＣＣ温溶液
ｐＨ７，６，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）　　４
０−に溶解して溶出剤として使用し、溶出剤４０−をカ
ラムに加えて４℃において０．２Ｊ／分の速度で１２時
間循環させた後、溶出して得た溶出液４０Ｍ１とＯ，Ｉ
Ｍ）−リス−Ｈ（，９溶液（ｐＨ７，６，Ｏ，１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００１４０ｄを加えて得た溶出液４０−
を合わせて溶出液８０Ｍ１を収得した。

３）マウス・モノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入したマウス・モノクローナル抗イディオ
型抗体はウロキナーゼとの分子量差異を利用してゲルｉ
濾過により除去した。

セファデックスＧ−１５０スーパーフアインゲル４００
−をガラスカラム（２，５ｃｍＸ１００ｃｍ）に充填し
、０．１Ｍトリス−Ｈ（ｌ溶液（ｐＨ７，６，０，１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１１）（１１で平衡化した後、２）で
収得した溶出液８０−を２０−に濃縮して加え、０．１
Ｍ）リスーＨＣＪ２溶液（ｐＨ７，６，０，１％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００）で溶出してＨＢｓＡｇ陽性分画を集
合濃縮した。

最終の精製ウロキナーゼ溶液２〇−中の総蛋白質量は１
４ｍｇであり、ウロキナーゼの力価はＣ１ｏｔＬｙｓｉ
ｓ法で測定して標準ウロキナーゼと比較した結果、蛋白
質１’ｍｇ当り１００，０００単位、活性収率は８７．
５％、精製度は１２５倍であった。

実施例８ 粗製ヒト厳毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）からＨＣＧ
の単離 １）免疫親和性カラムの製造 妊娠初期（１０−１２週）の妊婦の尿から、公知の方法
（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ　Ｊ、　Ｂｅ１ｌの方法：Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　８４：　２９８．１９６９等）に
より得た粗製ＨＣＧ２００＋ｓｇを出発物質にＬｒ、Ｈ
ＣＧを精製し、粗製ＨＣＧの力価は、Ｒａｔ　Ｖｅｎｔ
ｒａｌＰｒｏｓｔａｔｅ重量法で測定した結果、蛋白質
１ｍｇ当り２５００単位であった。

ＨＣＧの単離に使用した免疫親和性カラムは、公知の方
法（Ｄｚｔｕｒｋ　Ｍ、　Ｂｅ１ｌｅｔ　Ｄ、の方法；
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２０：　５４９．１９
８７等）により別に製造したマウスモノクローナル抗−
ＨＣＧ　　ＩｇＧ４２０ｍｇを、常法によりＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂ　　２０ｍｇにカップリングさせ
、カップリングされたゲル８５−をガラスカラム（３ｃ
ｍｘ２０ｃｍ）に充填した後、ＰＢＳ　（０，ＯＩＭ、
ｐＨ７，２）で平衡化して使用した。

このカラムに、粗製ＨＣＧ　　２００ｍｇをＰＢＳ（０
，ＯＬＭ、ｐＨ７，２）　に溶解ＬＪ、＝溶液２０ｍｔ
ｌを４℃において０．０５ｍｔ’／分の速度で通過させ
てＨｃＧを結合サセタ後、ＰＢＳ　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ７，２）１０００−で洗浄した。

２）ＨＣＧの溶出 ＨＣＧの溶出には、マウス・モノクローナル抗−β−Ｈ
ＣＧ抗体を抗原にして、通常の方法により別に製造した
マウス・モノクローナル抗−〇−ＨＣＧ抗イディオ型抗
体５００ｍｇを、ＰＢＳ（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）５
０−に溶解して溶出剤として使用し、溶出剤５０−をカ
ラムに加え４°Ｃにおいて０．３ｄ／分の速度で１２時
間循環させた後、溶出して得た溶出液５０−とＰＢＳ（
０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）５０−を加太で得た溶出液５
０−を合わせて溶出液１００−を収得した。

３）マウス・モノクローナル抗イディオ型抗体の除去 溶出液中に混入したマウス・モノクローナル抗イディオ
型抗体はＨＣＧとの分子量差異を利用してゲル？濾過に
より除去した。

セファデックスＧ−１００ゲル４００−をガラスカラム
（２，５ｃｍｘ　ｌ　ＯＯｃ＋ｎ）に充填し、ＰＢＳ　
（０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）で平衡化した後、２）で収
得した溶出液１００−を２０−に濃縮して加λ、Ｏ，Ｌ
Ｍ　　ＰＢＳで溶出してＨＣＧ陽性分画を集合濃縮した
。

最終の精製ＨＣＧ溶液２〇−中の総蛋白質量は２９．７
ｍｇ、ＨＣＧの力価はＲｅｔ　ＶａｎｔｒａｌＰｒｏｓ
ｔａｔｅ重量法で測定した結果１５．０００単位であり
、活性収率は８９．１％、精製度は２５倍であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫親和性クロマトグラフ法により、生理活性物質
   を単離する方法において、リガンドとして使用した抗体
   に対し単離せんとする生理活性物質と相競的に結合する
   ことのできる抗イディオ型抗体を溶出剤として使用して
   目的物質を溶出収得する方法。 ２、生理活性物質が、インシュリン、ウロキナーゼ、エ
   リスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血球分化
   刺激因子（ＣＳＦ）、セクレチン、血液凝固因子VIII、
   Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒト型成長ホルモン
   （ＨＧＨ）、組織型プラスミノゲン活性因子（ＴＰＡ）
   、α−フェトプロテイン、α−インターフェロン、β−
   インターフェロン、γ−インターフェロン、ソマトスタ
   チン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、インタ
   ーロイキン I 、II、III、IVである請求項１記載の方法
   。 ３、抗原または指標物質と酵素、放射性同位元素、ビオ
   チンまたはアビジンの結合体である抗イディオ型抗体を
   溶出剤として使用する請求項１又は２記載の方法。 ４、０〜５℃の温度において溶出する請求項１記載の方
   法。 ５、ｐＨ５〜９の範囲で溶出する請求項１記載の方法。 ６、３０〜６００分間溶出する請求項１記載の方法。 ７、目的物質１００重量部当り溶出剤０．１〜１０００
   重量部を添加して溶出する請求項１記載の方法。