JP2949637B2 - 二重特異性抗体を用いる測定方法 - Google Patents
二重特異性抗体を用いる測定方法Info
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- JP2949637B2 JP2949637B2 JP15881890A JP15881890A JP2949637B2 JP 2949637 B2 JP2949637 B2 JP 2949637B2 JP 15881890 A JP15881890 A JP 15881890A JP 15881890 A JP15881890 A JP 15881890A JP 2949637 B2 JP2949637 B2 JP 2949637B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、二重特異性抗体を用いる抗原の測定方法に
関するものであり、更に詳しくは、ビオチンまたはビオ
チン誘導体及び測定すべき抗原に対して特異性を有する
二重特異性抗体を用いる抗原の測定方法に関する。
関するものであり、更に詳しくは、ビオチンまたはビオ
チン誘導体及び測定すべき抗原に対して特異性を有する
二重特異性抗体を用いる抗原の測定方法に関する。
［従来の技術］ 血液や尿などの体液中の微量物質を高感度に測定する
方法として、免疫学的測定法が医療分野、特に診断の分
野において広く利用されている。特に、1975年、Milste
inらがマウスのミエローマ細胞と脾臓中の抗体産生細胞
との細胞融合によるモノクローナル抗体の生産方法を発
表して以来、ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗
体は、その特異性が高いこと、単一の抗体を比較的簡単
にかつ大量に供給することが可能であることなどの利点
を有するため、非常に注目され、盛んに研究、利用され
てきた。
方法として、免疫学的測定法が医療分野、特に診断の分
野において広く利用されている。特に、1975年、Milste
inらがマウスのミエローマ細胞と脾臓中の抗体産生細胞
との細胞融合によるモノクローナル抗体の生産方法を発
表して以来、ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗
体は、その特異性が高いこと、単一の抗体を比較的簡単
にかつ大量に供給することが可能であることなどの利点
を有するため、非常に注目され、盛んに研究、利用され
てきた。
このモノクローナル抗体をトレーサー抗体として使用
する場合には、この抗体分子にラジオアイソトープ、酵
素あるいは蛍光物質などを化学的な処理を施して結合さ
せて用いている。しかし、抗体分子にこのような化学的
処理を行うと、抗体分子に損傷を与え、抗体の比活性が
低下し、また抗体の安定性に影響を及ぼし、これらがア
ッセイ系の安定性や感度の低下の原因となっている。
する場合には、この抗体分子にラジオアイソトープ、酵
素あるいは蛍光物質などを化学的な処理を施して結合さ
せて用いている。しかし、抗体分子にこのような化学的
処理を行うと、抗体分子に損傷を与え、抗体の比活性が
低下し、また抗体の安定性に影響を及ぼし、これらがア
ッセイ系の安定性や感度の低下の原因となっている。
一方、モノクローナル抗体の特異性が高いことを利用
して、抗体分子中に二つの異なる抗原認識性を持たせ、
抗体の利用範囲を拡大する方法が研究されており、この
ような二重特異性抗体の一方の結合親和性が酵素を直接
認識するものである抗体についてすでに報告がなされて
いる。しかし、この抗体は直接酵素を認識するものであ
るために、標識抗体として免疫学的診断の分野において
使用する場合には、酵素の種類、つまり標識剤の種類に
多様性をもたせることができなかった。
して、抗体分子中に二つの異なる抗原認識性を持たせ、
抗体の利用範囲を拡大する方法が研究されており、この
ような二重特異性抗体の一方の結合親和性が酵素を直接
認識するものである抗体についてすでに報告がなされて
いる。しかし、この抗体は直接酵素を認識するものであ
るために、標識抗体として免疫学的診断の分野において
使用する場合には、酵素の種類、つまり標識剤の種類に
多様性をもたせることができなかった。
［発明が解決しようとする課題］ 以上のことに鑑み、広範囲な標識剤に適用可能であ
り、安定性に優れた抗体を用いた抗原の測定方法の提供
が要望されていた。
り、安定性に優れた抗体を用いた抗原の測定方法の提供
が要望されていた。
［発明の目的］ 本発明は、抗体を化学的に処理することなく標識剤に
よる標識が可能であり、さらに、測定系における標識剤
を変更しても広く適用可能である、二重特異性を有する
モノクローナル抗体を用いた抗原の測定方法を提供する
ものである。
よる標識が可能であり、さらに、測定系における標識剤
を変更しても広く適用可能である、二重特異性を有する
モノクローナル抗体を用いた抗原の測定方法を提供する
ものである。
［課題を解決するための手段］ 本発明に係わる二重特異性抗体は、測定すべき抗原と
ビオチンまたはビオチン誘導体の両方に特異性を有する
モノクローナル抗体である。すなわち、この二重特異性
抗体とビオチン化した酵素や蛍光物質などとを組み合わ
せることによって、抗体分子を化学的に処理することな
くトレーサーとして利用することを可能とし、抗体の安
定性の増加、さらにはビオチン化酵素などを異なる抗原
測定系に使用することをも可能にしたものである。
ビオチンまたはビオチン誘導体の両方に特異性を有する
モノクローナル抗体である。すなわち、この二重特異性
抗体とビオチン化した酵素や蛍光物質などとを組み合わ
せることによって、抗体分子を化学的に処理することな
くトレーサーとして利用することを可能とし、抗体の安
定性の増加、さらにはビオチン化酵素などを異なる抗原
測定系に使用することをも可能にしたものである。
本発明に係わる二重特異性抗体は、下記の手順に従っ
て作製することが可能である。
て作製することが可能である。
まず、測定すべき抗原に対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ、及びビオチンに対するモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマをそれぞれ通常の方法に従っ
て作製する。次に、これらハイブリドーマにおける核酸
生合成サルベージ経路のそれぞれ別の酵素を欠損させ
る。すなわち抗原に対するモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマはヒポキサンチン グアニン ホスホリボシ
ル トランスフェラーゼ（HGPRT）欠損細胞、ビオチン
に対するモノクローナル抗体産生細胞はチミジン キナ
ーゼ（TK）欠損細胞とする。この２つの異なった酵素欠
損細胞をポリエチレングリコール法により融合させた
後、HAT培地（正常培地にヒポキサンチン（10-4M）、ア
ミノプテリン（４×10-7M）およびチミジン（1.6×10-5
M）を加えた倍地）を用いて融合細胞のみを選択する。
このようにして得られたハイブリッド ハイブリドーマ
から、クローニングにより抗原とビオチンとを同時に認
識する抗体を産生している細胞株を選択し、得られたモ
ノクローナル抗体産生株をマウス腹腔中に投与し、抗体
含有腹水を作製し、この腹水より目的とする抗体を得
る。この抗体は抗原に対する結合親和性と、ビオチンに
対する結合親和性を持つ二重特異性抗体であり、この抗
体をトレーサーとして用いて抗原の測定系を作製する。
上記モノクローナル抗体産生株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、微工研菌寄第11531号
（TBHF2H6）あるいは微工研菌寄第11532号（TBHF1H50）
であるハイブリッド ハイブリドーマが産生する抗体
は、ビオチン及びヒト血清アルブミンに対して特異性を
有する二重特異性抗体で、それを用い、ビオチン−HRPO
を標識剤として使用することにより、ヒト血清アルブミ
ンをEIAにより測定することができる。
生ハイブリドーマ、及びビオチンに対するモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマをそれぞれ通常の方法に従っ
て作製する。次に、これらハイブリドーマにおける核酸
生合成サルベージ経路のそれぞれ別の酵素を欠損させ
る。すなわち抗原に対するモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマはヒポキサンチン グアニン ホスホリボシ
ル トランスフェラーゼ（HGPRT）欠損細胞、ビオチン
に対するモノクローナル抗体産生細胞はチミジン キナ
ーゼ（TK）欠損細胞とする。この２つの異なった酵素欠
損細胞をポリエチレングリコール法により融合させた
後、HAT培地（正常培地にヒポキサンチン（10-4M）、ア
ミノプテリン（４×10-7M）およびチミジン（1.6×10-5
M）を加えた倍地）を用いて融合細胞のみを選択する。
このようにして得られたハイブリッド ハイブリドーマ
から、クローニングにより抗原とビオチンとを同時に認
識する抗体を産生している細胞株を選択し、得られたモ
ノクローナル抗体産生株をマウス腹腔中に投与し、抗体
含有腹水を作製し、この腹水より目的とする抗体を得
る。この抗体は抗原に対する結合親和性と、ビオチンに
対する結合親和性を持つ二重特異性抗体であり、この抗
体をトレーサーとして用いて抗原の測定系を作製する。
上記モノクローナル抗体産生株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、微工研菌寄第11531号
（TBHF2H6）あるいは微工研菌寄第11532号（TBHF1H50）
であるハイブリッド ハイブリドーマが産生する抗体
は、ビオチン及びヒト血清アルブミンに対して特異性を
有する二重特異性抗体で、それを用い、ビオチン−HRPO
を標識剤として使用することにより、ヒト血清アルブミ
ンをEIAにより測定することができる。
測定すべき抗原に対するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマとしては、ヒト血清アルブミンに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマHSAF6H1C11,H
SAF6H33C11,癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマCEAF22H5,エラスターゼ−１に対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマELSF13H4,IgE
に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマIGEF3H
22,インスリンに対するモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマINSF9H2、扁平上皮癌関連抗原SCCに対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマSCCF1H3、TSHに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマTSHF8H4など
を挙げることができるが、測定すべき抗原に対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマとしては、上記のよ
うな処理をして、二重特異性抗体を製造しうるようなも
のであれば、特に限定されずに用いることができる。
るハイブリドーマとしては、ヒト血清アルブミンに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマHSAF6H1C11,H
SAF6H33C11,癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマCEAF22H5,エラスターゼ−１に対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマELSF13H4,IgE
に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマIGEF3H
22,インスリンに対するモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマINSF9H2、扁平上皮癌関連抗原SCCに対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマSCCF1H3、TSHに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマTSHF8H4など
を挙げることができるが、測定すべき抗原に対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマとしては、上記のよ
うな処理をして、二重特異性抗体を製造しうるようなも
のであれば、特に限定されずに用いることができる。
この場合における測定すべき抗原としては、タンパク
質、ポリペプチド、多糖類、核酸及びこれらの結合物な
どを挙げることができる。このようなもののうちには、
燐タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ムコタ
ンパク質、細菌、ウイルス、腫瘍細胞、リケッチアある
いはそれらの表面抗原などが挙げられる。
質、ポリペプチド、多糖類、核酸及びこれらの結合物な
どを挙げることができる。このようなもののうちには、
燐タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ムコタ
ンパク質、細菌、ウイルス、腫瘍細胞、リケッチアある
いはそれらの表面抗原などが挙げられる。
このような抗原のうち、タンパク質及びポリペプチド
としては、ソマトトロピン、プロラクチン、インスリ
ン、LH−RH、ゴナドトロピンなどのホルモン類、チロキ
シン結合グロブリン、α１−アンチトリプシン、α１−
酸性糖タンパク質、α２−マクログロブリン、アルブミ
ンなどの血漿タンパク質、免疫グロブリンあるいはそれ
らの断片、補体因子、血液凝固因子、セクレチン、ガス
トリンなどの組織ホルモン類などが挙げられる。
としては、ソマトトロピン、プロラクチン、インスリ
ン、LH−RH、ゴナドトロピンなどのホルモン類、チロキ
シン結合グロブリン、α１−アンチトリプシン、α１−
酸性糖タンパク質、α２−マクログロブリン、アルブミ
ンなどの血漿タンパク質、免疫グロブリンあるいはそれ
らの断片、補体因子、血液凝固因子、セクレチン、ガス
トリンなどの組織ホルモン類などが挙げられる。
さらにまた、測定すべき抗原としては、グラム陽性
菌、グラム陰性菌に存在する各種抗原、リケッチア、マ
イコプラズマあるいは肝炎ウイルス、腫瘍ウイルス、AI
DS原因ウイルスなどの各種ウイルス及びその産生抗原が
挙げられる。またこれらの抗原のうちには、各種アルカ
ロイド、各種ステロイド、ペニシリン系及びセファロス
ポリン系抗生物質、ゲンタマイシン、カナマイシン、エ
リスロマイシン等の抗生物質、バルビツール酸系薬物、
カテコールアミン、エフェドリン等の薬物、クロルプロ
マジン、アゼピン類、ビタミン類、プロスタグランジン
類をはじめとする各種の薬剤・薬物が挙げられる。これ
らの抗原は、本発明の目的を達成しうる限り、特に限定
せずに選ぶことができ、当該分野の文献などにより知ら
れているものの中から選ぶことができる。
菌、グラム陰性菌に存在する各種抗原、リケッチア、マ
イコプラズマあるいは肝炎ウイルス、腫瘍ウイルス、AI
DS原因ウイルスなどの各種ウイルス及びその産生抗原が
挙げられる。またこれらの抗原のうちには、各種アルカ
ロイド、各種ステロイド、ペニシリン系及びセファロス
ポリン系抗生物質、ゲンタマイシン、カナマイシン、エ
リスロマイシン等の抗生物質、バルビツール酸系薬物、
カテコールアミン、エフェドリン等の薬物、クロルプロ
マジン、アゼピン類、ビタミン類、プロスタグランジン
類をはじめとする各種の薬剤・薬物が挙げられる。これ
らの抗原は、本発明の目的を達成しうる限り、特に限定
せずに選ぶことができ、当該分野の文献などにより知ら
れているものの中から選ぶことができる。
このようにして得られた二重特異性抗体を用いる抗原
の測定系としては、血液などの体液中の抗原を測定する
サンドイッチ法や、組織中の抗原を測定する組織染色法
などがある。サンドイッチ法による抗原の測定は、以下
のように行うことができる。
の測定系としては、血液などの体液中の抗原を測定する
サンドイッチ法や、組織中の抗原を測定する組織染色法
などがある。サンドイッチ法による抗原の測定は、以下
のように行うことができる。
測定すべき抗原に対する抗体を不溶性担体に結合させ
て得られた固相化抗体に対して、血清や尿などの検体を
反応させた後、未反応液を洗浄除去する。次に、抗原及
びビオチンに対し結合親和性を有する二重特異性抗体溶
液を反応させる。さらに固相を洗浄した後、これに酵素
を結合したビオチン溶液を混合し、反応を行う。この反
応は、予め二重特異性抗体とビオチン化酵素を混合して
おき、この混合溶液を検体を反応させた後の固相と反応
させても良い。このビオチン化酵素と反応した固相を洗
浄し、基質溶液を加え酵素反応を行わせる。酵素反応を
停止させた後、反応溶液の吸光度を測定し、検体の代わ
りに標準抗原を用いて作成された標準曲線より測定すべ
き抗原濃度を求めることができる。
て得られた固相化抗体に対して、血清や尿などの検体を
反応させた後、未反応液を洗浄除去する。次に、抗原及
びビオチンに対し結合親和性を有する二重特異性抗体溶
液を反応させる。さらに固相を洗浄した後、これに酵素
を結合したビオチン溶液を混合し、反応を行う。この反
応は、予め二重特異性抗体とビオチン化酵素を混合して
おき、この混合溶液を検体を反応させた後の固相と反応
させても良い。このビオチン化酵素と反応した固相を洗
浄し、基質溶液を加え酵素反応を行わせる。酵素反応を
停止させた後、反応溶液の吸光度を測定し、検体の代わ
りに標準抗原を用いて作成された標準曲線より測定すべ
き抗原濃度を求めることができる。
本発明の二重特異性抗体は、一方の抗原認識部位がビ
オチンを認識するものであり、ビオチンは蛋白質や核
酸、その他様々な化学物質と結合することができるた
め、標識剤として酵素に限定されることなく蛍光物質
等、種々の化合物を使用することが可能である。さら
に、ビオチンはアビジンとのシステムを利用することに
より、測定系の感度を上げることも可能である。
オチンを認識するものであり、ビオチンは蛋白質や核
酸、その他様々な化学物質と結合することができるた
め、標識剤として酵素に限定されることなく蛍光物質
等、種々の化合物を使用することが可能である。さら
に、ビオチンはアビジンとのシステムを利用することに
より、測定系の感度を上げることも可能である。
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
［実施例］二重特異性モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 （１）抗ヒト血清アルブミン（HSA）抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 HSA（Miles Inc.）50μｇをフロインドコンプリート
アジュバント（ヤトロン）とでエマルジョンを調製
し、これをBALB/cマウスの皮下に注射した。これを２週
間ごとに４回行い、さらに２週間後にHSA50μｇを生理
食塩水に溶かし腹腔中に投与した。このマウスの脾細胞
を３日後に摘出し、マウスミエローマ細胞（P3×63Ag8
・U1:P3U1）とポリエチレングリコール法を用いて細胞
融合させた。この融合細胞をHAT培地で選択後、培養上
清の抗HSA抗体活性を125I標識したHSAを用いて調べ、さ
らにクローニングを行い、抗HSAモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ（HSAF6H1C11,HSAF6H33C11）を確立し
た。
ドーマの作製 （１）抗ヒト血清アルブミン（HSA）抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 HSA（Miles Inc.）50μｇをフロインドコンプリート
アジュバント（ヤトロン）とでエマルジョンを調製
し、これをBALB/cマウスの皮下に注射した。これを２週
間ごとに４回行い、さらに２週間後にHSA50μｇを生理
食塩水に溶かし腹腔中に投与した。このマウスの脾細胞
を３日後に摘出し、マウスミエローマ細胞（P3×63Ag8
・U1:P3U1）とポリエチレングリコール法を用いて細胞
融合させた。この融合細胞をHAT培地で選択後、培養上
清の抗HSA抗体活性を125I標識したHSAを用いて調べ、さ
らにクローニングを行い、抗HSAモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ（HSAF6H1C11,HSAF6H33C11）を確立し
た。
抗HSAモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを2,6,1
0,14−テトラメチルペンタデカン（プリスタン：アルド
リッチ社）処理したマウスの腹腔中に投与し、抗体含有
腹水を作製した。
0,14−テトラメチルペンタデカン（プリスタン：アルド
リッチ社）処理したマウスの腹腔中に投与し、抗体含有
腹水を作製した。
産生されたモノクローナル抗体のサブクラスは、IgG1
であった。
であった。
（２）ビオチンに対するモノクローナル抗体の作製 キャリア蛋白としてのウサギIgGに結合したビオチン
（VECTER Lab.）100μｇをフロインドコンプリート ア
ジュバント（ヤトロン）とでエマルジョンを調製し、こ
れをBALB/cマウスの皮下に投与した。これを２週間ごと
に２回行い、さらに２週間後にウサギIgGに結合したビ
オチン100μｇを生理食塩水に溶かし腹腔中に投与し
た。このマウスの脾臓細胞を３日後に摘出し、マウスミ
エローマ細胞（P3U1）とポリエチレングリコール法を用
いて細胞融合を行った。この融合細胞をHAT培地で選択
後、培養上清の抗ビオチン抗体活性をホースラディッシ
ュ パーオキシデースを標識したビオチン［ビオチン−
HRPO］（VECTER Lab.）を用いて調べ、さらにクローニ
ングを行い、抗ビオチン・モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを確立した。
（VECTER Lab.）100μｇをフロインドコンプリート ア
ジュバント（ヤトロン）とでエマルジョンを調製し、こ
れをBALB/cマウスの皮下に投与した。これを２週間ごと
に２回行い、さらに２週間後にウサギIgGに結合したビ
オチン100μｇを生理食塩水に溶かし腹腔中に投与し
た。このマウスの脾臓細胞を３日後に摘出し、マウスミ
エローマ細胞（P3U1）とポリエチレングリコール法を用
いて細胞融合を行った。この融合細胞をHAT培地で選択
後、培養上清の抗ビオチン抗体活性をホースラディッシ
ュ パーオキシデースを標識したビオチン［ビオチン−
HRPO］（VECTER Lab.）を用いて調べ、さらにクローニ
ングを行い、抗ビオチン・モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを確立した。
これらハイブリドーマから分泌されるモノクローナル
抗体BRIF2H15C23を選んだ。このモノクローナル抗体の
サブクラスはIgG1であった。
抗体BRIF2H15C23を選んだ。このモノクローナル抗体の
サブクラスはIgG1であった。
（３）サルベージ経路酵素欠損ハイブリドーマの作製 （ａ）抗HSA・モノクローナル抗体産生細胞のHGPRT欠損
化 対数増殖期の抗HSA・モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ（HSAF6H1C11,HSAF6H33C11）をMNNG（Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を１μg/
ml含む培地で３時間培養し、変異原処理を行った。変異
原処理後、２日間通常の培地で細胞を増殖させた後、８
−アザグアニンを20μg/ml添加した培地で培養を行っ
た。この８−アザグアニン添加培地で増殖可能な細胞
（８−アザグアニン耐性細胞）の一部をHAT培地中で培
養し増殖しなかった細胞（サルベージ経路が働いていな
い細胞）を選んだ。さらにELISA法でHSAに対し抗体活性
のある細胞を選び、この細胞とHGPRT欠損マウスミエロ
ーマ細胞（P3U1）とをポリエチレングリコール法により
細胞融合を行った。この融合細胞のうち、HAT培地中で
増殖不可能な細胞（HSAF6H1G,HSAF6H33J）を選んだ。８
−アザグアニン耐性細胞株がHAT培地中で増殖不可能で
あることと、P3U1細胞と融合させてもHAT培地中で増殖
可能とならないことから、この８−アザグアニン耐性細
胞はHGPRT欠損細胞であることが確認された。
化 対数増殖期の抗HSA・モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ（HSAF6H1C11,HSAF6H33C11）をMNNG（Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を１μg/
ml含む培地で３時間培養し、変異原処理を行った。変異
原処理後、２日間通常の培地で細胞を増殖させた後、８
−アザグアニンを20μg/ml添加した培地で培養を行っ
た。この８−アザグアニン添加培地で増殖可能な細胞
（８−アザグアニン耐性細胞）の一部をHAT培地中で培
養し増殖しなかった細胞（サルベージ経路が働いていな
い細胞）を選んだ。さらにELISA法でHSAに対し抗体活性
のある細胞を選び、この細胞とHGPRT欠損マウスミエロ
ーマ細胞（P3U1）とをポリエチレングリコール法により
細胞融合を行った。この融合細胞のうち、HAT培地中で
増殖不可能な細胞（HSAF6H1G,HSAF6H33J）を選んだ。８
−アザグアニン耐性細胞株がHAT培地中で増殖不可能で
あることと、P3U1細胞と融合させてもHAT培地中で増殖
可能とならないことから、この８−アザグアニン耐性細
胞はHGPRT欠損細胞であることが確認された。
（ｂ）抗ビオチン・モノクローナル抗体産生細胞のTK欠
損化 対数増殖期の抗ビオチン・モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ（BRIF2H15C23）をMNNG1μg/mlを含む培地
で３時間培養し、変異原処理を行った。変異原処理後２
日間通常の培地で細胞を増殖させた後、５−ブロモ−
２′−デオキシウリジン（BudR:シグマ Ｂ−5002）を3
0μg/ml添加した培地で培養した。このBudR添加培地で
増殖可能な細胞（BudR耐性細胞）の一部をHAT培地中で
培養し増殖しなかった細胞（サルベージ経路が働いてい
ない細胞）を選んだ。さらにELISA法でビオチンに対し
抗体活性である細胞を選び、これとP3U1細胞とをPEG法
により細胞融合させ、HAT培地中で増殖可能な細胞（BRI
F2H15B1）を選んだ。BudR耐性細胞がTK欠損細胞であれ
ば、HGPRT欠損細胞であるP3U1細胞との融合細胞は、お
互いの欠損酵素を補ってHAT培地中で増殖可能となる。
得られた融合細胞はHAT培地中で増殖が確認され、このB
udR耐性細胞がTK欠損細胞であることが確認された。
損化 対数増殖期の抗ビオチン・モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ（BRIF2H15C23）をMNNG1μg/mlを含む培地
で３時間培養し、変異原処理を行った。変異原処理後２
日間通常の培地で細胞を増殖させた後、５−ブロモ−
２′−デオキシウリジン（BudR:シグマ Ｂ−5002）を3
0μg/ml添加した培地で培養した。このBudR添加培地で
増殖可能な細胞（BudR耐性細胞）の一部をHAT培地中で
培養し増殖しなかった細胞（サルベージ経路が働いてい
ない細胞）を選んだ。さらにELISA法でビオチンに対し
抗体活性である細胞を選び、これとP3U1細胞とをPEG法
により細胞融合させ、HAT培地中で増殖可能な細胞（BRI
F2H15B1）を選んだ。BudR耐性細胞がTK欠損細胞であれ
ば、HGPRT欠損細胞であるP3U1細胞との融合細胞は、お
互いの欠損酵素を補ってHAT培地中で増殖可能となる。
得られた融合細胞はHAT培地中で増殖が確認され、このB
udR耐性細胞がTK欠損細胞であることが確認された。
（４）二重特異性抗体（TBHF1）の作製 （３）の（ａ）で作製したハイブリドーマHSAF6H1G
（HGPRT−）と、（３）の（ｂ）で作製したハイブリド
ーマBRIF2H15B1（TK−）のそれぞれ1.1×107細胞とをポ
リエチレングリコール法により細胞融合を行った。融合
後、HAT培地中で培養し細胞増殖をした融合細胞を選び
出し、この融合細胞の培養上清のHSAとビオチンへの抗
体活性をELISA法を用いて調べた。次に、この抗体をHSA
を固相化したELISAプレートに反応させ、これにビオチ
ン−HRPOを反応させた。固相上のHRPO活性をｏ−フェニ
レンジアミンとH2O2を用いて測定した。抗体活性測定
後、二重特異性抗体活性のある融合細胞のクローニング
を行い、ハイブリッド ハイブリドーマ（表１）を確立
した。
（HGPRT−）と、（３）の（ｂ）で作製したハイブリド
ーマBRIF2H15B1（TK−）のそれぞれ1.1×107細胞とをポ
リエチレングリコール法により細胞融合を行った。融合
後、HAT培地中で培養し細胞増殖をした融合細胞を選び
出し、この融合細胞の培養上清のHSAとビオチンへの抗
体活性をELISA法を用いて調べた。次に、この抗体をHSA
を固相化したELISAプレートに反応させ、これにビオチ
ン−HRPOを反応させた。固相上のHRPO活性をｏ−フェニ
レンジアミンとH2O2を用いて測定した。抗体活性測定
後、二重特異性抗体活性のある融合細胞のクローニング
を行い、ハイブリッド ハイブリドーマ（表１）を確立
した。
このハイブリッド ハイブリドーマをプリスタン処理
したBALB/cマウスの腹腔中に投与し、抗体含有腹水を作
製した。この腹水中のIgG1濃度は2.4〜13mg/mlであっ
た。
したBALB/cマウスの腹腔中に投与し、抗体含有腹水を作
製した。この腹水中のIgG1濃度は2.4〜13mg/mlであっ
た。
（５）二重特異性抗体（TBHF2）の作製 HSAF6H33J（HGPRT−）とBRIF2H15B1（TK−）のそれぞ
れ3.2×105細胞を（４）二重特異性抗体（TBHF1）の作
製と同様にポリエチレングリコール法で細胞融合を行っ
た。この融合細胞をHAT培地で選択後、二重特異性抗体
活性を測定し、さらにクローニングを行って、ハイブリ
ッド ハイブリドーマ（表２）を確立した。
れ3.2×105細胞を（４）二重特異性抗体（TBHF1）の作
製と同様にポリエチレングリコール法で細胞融合を行っ
た。この融合細胞をHAT培地で選択後、二重特異性抗体
活性を測定し、さらにクローニングを行って、ハイブリ
ッド ハイブリドーマ（表２）を確立した。
このハイブリッド ハイブリドーマをプリスタン処理
したBALB/cマウスの腹腔中に投与し、抗体含有腹水を作
製した。この腹水中のIgG1濃度は1.6〜11mg/mlであっ
た。
したBALB/cマウスの腹腔中に投与し、抗体含有腹水を作
製した。この腹水中のIgG1濃度は1.6〜11mg/mlであっ
た。
（６）二重特異性抗体を用いたHSAサンドイッチ法EIA 抗HSA・モノクローナル抗体HSAF6H1を固相化（２μg/
bead）したビーズに、HSA希釈溶液（1000,300,100,30,1
0ng/ml）100μｌ及び50mMリン酸緩衝液200μｌを室温で
３時間反応させた。これを精製水で２回洗浄した後、二
重特異性抗体TBHF2H6腹水希釈溶液100μｌ及び50mMリン
酸緩衝液200μｌを４℃で一晩反応させた。精製水で２
回洗浄後、さらにビオチン−HRPO希釈溶液（１×106）3
00μｌを室温で３時間反応させた。精製水で２回洗浄
後、ビーズを反応用試験管に移し、基質溶液（ｏ−フェ
ニレンジアミン、H2O2）300μｌを加え、室温で15分間
インキュベート後、1N硫酸1000μｌで反応を停止させ、
反応溶液の490nmにおける吸光度を測定した。このよう
にして得られた結果を図１に示した。
bead）したビーズに、HSA希釈溶液（1000,300,100,30,1
0ng/ml）100μｌ及び50mMリン酸緩衝液200μｌを室温で
３時間反応させた。これを精製水で２回洗浄した後、二
重特異性抗体TBHF2H6腹水希釈溶液100μｌ及び50mMリン
酸緩衝液200μｌを４℃で一晩反応させた。精製水で２
回洗浄後、さらにビオチン−HRPO希釈溶液（１×106）3
00μｌを室温で３時間反応させた。精製水で２回洗浄
後、ビーズを反応用試験管に移し、基質溶液（ｏ−フェ
ニレンジアミン、H2O2）300μｌを加え、室温で15分間
インキュベート後、1N硫酸1000μｌで反応を停止させ、
反応溶液の490nmにおける吸光度を測定した。このよう
にして得られた結果を図１に示した。
［発明の効果］ 本発明の測定方法における二重特異性抗体は、ビオチ
ン化した酵素や蛍光物質などと組み合わせることによっ
て、従来の化学的手法により酵素や蛍光物質を結合させ
た標識抗体の代わりに使用することが可能であって、抗
体分子を化学的に処理することなくトレーサーとして使
用することができるので、製造効率の向上、安定性の増
加、さらにはビオチン化酵素などを異なる抗原の測定系
に共通試薬として用いることができるなどの利点を有す
る。
ン化した酵素や蛍光物質などと組み合わせることによっ
て、従来の化学的手法により酵素や蛍光物質を結合させ
た標識抗体の代わりに使用することが可能であって、抗
体分子を化学的に処理することなくトレーサーとして使
用することができるので、製造効率の向上、安定性の増
加、さらにはビオチン化酵素などを異なる抗原の測定系
に共通試薬として用いることができるなどの利点を有す
る。
図１は、本発明の測定方法によるHSAのサンドイッチ法E
IAの標準曲線を示したものである。
IAの標準曲線を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531 - 33/535
Claims (8)
- 【請求項１】二つの異なる抗原に対して特異性を有する
抗体であって、該抗原の一方がビオチンまたはビオチン
誘導体であり、他方が測定すべき抗原である二重特異性
抗体を用いることを特徴とする抗原の測定方法。 - 【請求項２】二重特異性抗体が、ビオチンまたはビオチ
ン誘導体に対して特異性を有する抗ビオチン・モノクロ
ーナル抗体産生細胞と、測定すべき抗原に対して特異性
を有するモノクローナル抗体産生細胞との融合細胞によ
り産生されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の抗原の測定方法。 - 【請求項３】ビオチン誘導体がビオチン化酵素あるいは
ビオチン化した蛍光物質である特許請求の範囲第１項及
び第２項に記載の抗原の測定方法。 - 【請求項４】抗原の測定方法が、測定すべき抗原に対し
て特異性を有する抗体を不溶性担体に結合させて得られ
た固相化抗体を用いるサンドイッチ法である、特許請求
の範囲第１項、第２項あるいは第３項に記載の方法。 - 【請求項５】抗原の測定方法が、組織中の抗原を検出す
る組織染色法である、特許請求の範囲第１項、第２項あ
るいは第３項に記載の方法。 - 【請求項６】測定すべき抗原が、タンパク質、多糖類、
核酸及びこれらの結合物である、特許請求の範囲第１項
ないし第５項に記載の方法。 - 【請求項７】測定すべき抗原が、ヒト血清アルブミン、
癌胎児性抗原、エラスターゼ−１、IgE,インスリン、扁
平上皮癌関連抗原（SCC）あるいはTSHである、特許請求
の範囲第１項ないし第５項に記載の方法。 - 【請求項８】測定すべき抗原がヒト血清アルブミンであ
る特許請求の範囲第１項ないし第５項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15881890A JP2949637B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | 二重特異性抗体を用いる測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15881890A JP2949637B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | 二重特異性抗体を用いる測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0450768A JPH0450768A (ja) | 1992-02-19 |
| JP2949637B2 true JP2949637B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
ID=15680041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15881890A Expired - Lifetime JP2949637B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | 二重特異性抗体を用いる測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2949637B2 (ja) |
-
1990
- 1990-06-19 JP JP15881890A patent/JP2949637B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0450768A (ja) | 1992-02-19 |
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