JPH0566397B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、牛乳からウシラクトフエリンを分
離、精製する方法に関する。

ラクトフエリンは乳汁などの外分泌液に存在す
る鉄結合性蛋白質であつて、乳児の授乳において
栄養的に非常に有益であるばかりでなく、その鉄
結合能の特性の故に腸管における鉄要求性の高い
病理性細菌に対して強い静菌作用を呈するという
生理的効果を有するものである。すなわち、ラク
トフエリンは、乳汁に存在する免疫グロブリンや
リゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養学
的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質とい
える。

従来の技術 上述したようなラクトフエリンの特性にかんが
み、従来より乳からラクトフエリンを分離、精製
するための方法が種々提案されている。しかしな
がら、ラクトフエリンは非常に反応性に富んだ分
子構造を有する蛋白質であり、かつ他の乳蛋白質
とも相互作用を示すため、従来の方法では純度の
高いラクトフエリンを簡易にかつ有効に分離精製
して採取することは困難であつた。

例えば、従来、乳から脂肪を分離した脱脂乳を
PH4.6でカゼインを等電沈澱させることにより除
去し、ついで得られる乳清画分を硫酸アンモニウ
ムで塩析した画分を純水に対して透析した後、イ
オン交換樹脂に数回通して分離、精製する方法
〔Gordon、Ziegler、Bashら：「バイオケミア・
バイオフイジクス・アクタ（Biochim.Biophys.
Acta）、60、410−411、1962」及びMerton L.
Groveら：「バイオケミア・バイオフイジクス・
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、100、154−
162、1965」又はJohansson B.G.ら：「アクタ・
ケミストリー・スカンジナビア（Acta Chem.
Scand.）、23、683、1969」〕や上記方法において
イオン交換樹脂の代りにシリカ粒子を用いる方法
（特開昭58−28233号）及び上述のようにイオン交
換樹脂を通した後に、更に銅アフイニテイ−クロ
マトグラフイー処理を行なう方法（河方則裕、吉
野芳夫等「生化学会講演予稿集、第1053頁、
1983」）が行なわれているが、これらの方法は、
いずれも操作が煩雑で、処理に要する時間も長い
ため実用性に乏しいといえる。

更に、ラクトフエリンは乳中に存在する他の蛋
白質と相互作用を有するという特性のため、イオ
ン交換樹脂を用いる上掲の方法では乳中の免疫グ
ロブリン等の他の蛋白質の混入が避けられず、し
たがつて、純度の高いラクトフエリンを採取する
ことが実際上困難であり、加うるに、塩析及びイ
オン交換による処理を繰返して行なうために、ラ
クトフエリンの回収率の著しい低下が避けられな
いのみならず、ラクトフエリンを分離精製する過
程で得られる残留分に含まれる、ラクトフエリン
以外の乳蛋白質及びその他の乳成分を回収して再
利用することが実質上不可能であるという欠点が
みられる。

発明の目的 本発明は、ラクトフエリンに関する従来技術の
現状に鑑みてなされたものであつて、牛乳または
ホエーからウシラクトフエリンを高純度でかつ高
収率で有利に分離、精製するための方法を提供す
ることを目的とする。

以下本発明を詳しく説明する。

発明の構成 本発明の構成上の特徴は、モノクローナル抗ウ
シラクトフエリン抗体を不溶性の担体に固定化し
て成るアフイニテイーカラムを用い、特定の条件
下で溶出を行なうことによつて牛乳またはホエー
からウシラクトフエリンを分離精製することにあ
る。

すなわち、本発明の方法は、生物学的親和力と
いう生体成分同志の極めて買い特異的な相互作用
を利用したラクトフエリンの分離、精製方法であ
つて、従来の物理的、化学的親和力を利用した分
離方法とは本質的に異なるものである。

本発明で利用するモノクローナル抗ウシラクト
フエリン抗体は、ウシラクトフエリンで免疫した
マウスの脾臓リンパ球（以下脾細胞と称する）と
マウスの骨髄腫細胞（以下ミエローマ細胞と称す
る）を融合させて得られるモノクローナル抗ウシ
ラクトフエリン抗体産生ハイブリドーマを、公知
の手法に従つて、マウス腹腔内に投与し、その腹
腔水を回収するか、或は該、ハイブリドーマを培
地中で培養してその上清液を回収し、これらの回
収液体を硫安沈澱、陰イオン交換樹脂を用いて精
製することにより得られる。

次に、本発明で用いるモノクローナル抗ウシラ
クトフエリン抗体を産生する上記ハイブリドーマ
の形成法について説明する。

モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体産生ハ
イブリドーマの形成 ウシラクトフエリンの溶液を調整し、（一般に
食塩を含むリン産緩衝液PH7.2（PBS）を用いる）、
この溶液とフロインド・アジユバント
（Freund′s adjuvant）を等量混合して得られる
エマルジヨンをマウス（一般に６〜８週令）の腹
腔内に２週間おきに３回免疫を行なう。この際用
いるウシラクトフエリンは若干不純物を含んでい
ても差支えないが、目的とするハイブリドーマを
得るためには純度の高いものを用いるのが好まし
いことは勿論である。

本発明に使用するマウスの種類は特に限定され
ないが、一般にはBALB／ｃ系のマウスを用い
るとよい。

従来、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の形成に用いられる脾細胞は、特定の抗原による
最終免疫後３〜４日目に摘出した脾臓から採取す
るのが一般的であるが、本発明において対象とす
るウシラクトフエリンの場合には、上記最終免疫
後３〜４日目ではマウスにおける抗体価の上昇が
最高値に達せず、また、脾臓リンパ球中の抗体産
生細胞の活性化が不充分であり、したがつて、目
的とするモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗
体産生ハイブリドーマの形成率が低くなる。

本発明者は、ウシラクトフエリンで最終免疫後
６〜７日目のマウスから摘出した脾臓から採取し
た脾細胞を用いると上記ハイブリドーマの形成率
が非常に高くなることを見出した。

上述のようにしてマウスの脾臓から採取した脾
細胞はマウスエミローマ細胞と融合させる。

ここで用いるエミローマ細胞は特に限定されな
いが、BALB／ｃ系マウスの脾細胞と融合させ
る場合には、IgGのｋ鎖を分泌しないSP2／０−
Ag14を用いるのが好ましい。融合方法は公知の
手法に準じて行ない得るが、ミエローマ細胞とし
て上記SP2／０−Ag14を用いる場合には、融合
促進剤（融合誘導剤）の添加、混合及び希釈の各
操作から成る融合時間を５〜15分、好ましくは９
〜11分の範囲内にすることが肝要である。

この場合、融合時間が５分より短いと融合が不
完全となり、一方15分を越えると融合促進剤とし
て用いたポリエチレングリコールの被毒により細
胞が死滅する。因に上記融合時間を９〜11分の範
囲にするとほぼ100％に近いコロニー形成率が得
られる。また、ウシラクトフエリンで免疫した
BALB／ｃ系マウスの脾細胞とSP2／０−Ag14
を融合する場合には、融合促進剤としてメルク社
製ガスクロマトグラフイー用の分子量4000のポリ
エチレングリコールを濃度50％で用いると特に高
いコロニー形成率（融合率）が得られる。

融合終了後、融合細胞を従来法にしたがつて、
HT培地（ヒポキサンチン・チミジン・10％ウシ
胎児血清を含むダルベツコ変法MEM培地）に分
散させ、ついで96穴マイクロタイタープレート上
に散布し、37℃の温度で５％炭酸ガス雰囲気下に
培養し、その翌日よりHAT培散（ヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン・10％ウシ胎児血
清を含むダルベツコ変法MEM培地）中でハイブ
リドーマの選択を行なう。

ついでハイブリドーマのコロニーが充分に大き
くなつたところでソリツドフエイズ法（Solid
phase method）に従つてスクリーニングを行な
い陽性反応を示したハイブリドーマについて限界
希釈法を用いてクローニングを行なう。

なお、ソリツドフエイズ法は、可溶性の抗原を
96穴ソフトマイクロウエルに吸着させた後、牛血
清アルブミン（BSA）で上記ウエル中に非吸着
部分をブロツクし、上記の培養液上清を各ウエル
に入れて抗原と反応させ、反応後各ウエルを充分
洗い、ついで二次抗体としてビオチニル化させた
マウス抗体に対する抗体を添加し、その後アビジ
ン及び螢光色素で標識したビオチンを反応させ
て、目的とする抗体を螢光で検出して行なつた。

また、限界希釈法は、マウスの胸腺細胞10⁸個
とハイブリドーマ50個を10mlのHT培地に分散し
たものを、96穴マイクロタイタープレート上にハ
イブリドーマが各ウエル当り１個以下になるよう
に散布して散布してハイブリドーマの単一コロニ
ーを得るように行なつた。なお、マウスの胸腺細
胞はハイブリドーマが細胞密度が低いと増殖でき
ないので、フイーダー細胞（feeder cell）とし
て添加した。

上述のようなクローニングを３回以上繰返し行
なつてモノクローン化されたハイブリドーマを得
る。

本発明では、上述のようにして形成したハイブ
リドーマが産出するモノクローナル抗ウシラクト
フエリン抗体をアフイニテイークロマトグラフイ
ー用担体のような不溶性担体、例えばアフイゲル
−10（バイオラツド社）と公知の手法を利用して
結合させて固定し、アフイニテイーカラムとして
牛乳及びホエーからのウシラクトフエリンの分
離、精製に用いる。

因に、モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗
体を、アフイニテイーゲルのような担体に固定し
たものは、0.02％アジ化ナトリウムを含むリン散
緩衝液PH7.2（PBS）中に分散させておけば４℃の
温度下で約３ケ月以上保存することが可能とな
る。

上述のようにしてモノクローナル抗ウシラクト
フエリン抗体を不溶性の担体に固定したアフイニ
テイーカラムを用いて牛乳からウシラクトフエリ
ンを分離、精製するには、該アフイニテイーカラ
ムに50℃以下の温度、好ましくは室温で牛乳のよ
うなウシラクトフエリン含有試料の適当量を通液
してカラムに対する非吸着画分を流出させた後、
カラムを0.5M食塩を含むPH7.2のリン酸緩衝液お
よび0.15M食塩溶解で洗浄し、ついで0.15M食塩
を含むPH4.7以下、好ましくはPH4.3〜2.7の酢酸緩
衝液を通液してカラムに吸着しているウシラクト
フエリンを溶出するとよい。得られたウシラクト
フエリン画分は直ちにアルカリ剤を加えPHを中性
に戻す。

なお、ウシラクトフエリンを分離するための原
料乳としては、初乳、移行乳、常乳、末期乳等い
ずれでも使用可能であるが、回収率の点で初乳お
よび末期乳が望ましい。また殺菌処理した乳およ
びホエー、殺菌ホエーさらに、WPCのような粉
乳からのウシラクトフエリンの回収も可能であ
る。

本発明に従つて、モノクローナル抗ウシラクト
フエリン抗体を固定したアフイニテイーカラムを
用いて牛乳等からウシラクトフエリンを分離、精
製すると、従来の方法におけるカゼインの酸によ
る分離、硫酸アンモニウムによる塩析、透析及び
凍結乾燥などの前処理を行なう必要が全くなく、
又、従来法では上記の各処理を施したものをイオ
ン交換樹脂に数回通す必要があるも、本発明では
アフイニテイーカラムに１回通すのみで牛乳等か
らウシラクトフエリンをその他の乳成分から容易
に分離し得るようになる。

さらに、モノクローナル抗ウシラクトフエリン
抗体を固定したアフイニテイーカラムは、ウシラ
クトフエリンのみを分離するものであり、種の異
なる哺乳類の乳由来のラクトフエリン、例えばヒ
トラクトフエリンとは親和性を持たない。つま
り、モノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体を
固定したアフイニテイーカラムは、ヒトラクトフ
エリンのみを、モノクローナル抗ウシラクトフエ
リン抗体を固定したアフイニテイーカラムは、ウ
シラクトフエリンのみを分離するという極めて特
異性の高いものである。

また、従来法で得られるラクトフエリンの純度
は最高で66％程度であり、回収率も60％程度であ
るが、本発明によると、一度のカラムへの通液操
作で純度98％以上の極めて高純度のウシラクトフ
エリンがしかも80％以上乃至90％以上の高い回収
率で回収することが可能となる。

因に、ここでウシラクトフエリンの純度及び回
収率は下記手順により算出した。

回収されたウシラクトフエリン画分をSDS電気
泳動で処理すると完全な１本のバンドが得られる
が、牛乳中にはラクトフエリンとほぼ同じ分子量
（約80000）を有するセクレタリーコンポーネント
（SC）と称せられる糖蛋白質が含まれているため
電気泳動での処理のみで得られた結果から100％
ラクトフエリンとは断定し得ない。そこで、抗
SC血清とウシラクトフエリン画分との免疫二重
拡散を行なつたところ沈降線が生じないことか
ら、該ウシラクトフエリン画分に含まれている可
能性のあるSC含量は精々0.01％以下であるとい
える。すなわち、上記沈降線が生ずるにはウシラ
クトフエリン画分中にSCが少なくとも0.01％以
上含まれていなければならないからである。

したがつて、上記SDS電気泳動、免疫二重拡散
およびウシラクトフエリン画分の蛋白質濃度の測
定に基づいて、本発明により得られるウシラクト
フエリンの純度は98％以上と判断した。

また、回収率に関しては、抗ウシラクトフエリ
ン血清と非吸着画分との間で免疫二重拡散を行な
つた場合沈降線が生じないことが確認されたこと
から、非吸着画分中のウシラクトフエリンの残存
含量は多くても0.01％以下であると判断し得る。
すなわち、上記沈降線が生じるには非吸着画分中
に少なくとも0.01％以上のウシラクトフエリンが
含まれていなければならないからである。

したがつて、上記免疫二重拡散及び蛋白質濃度
の測定に基づいて本発明によるウシラクトフエリ
ンの回収率は少なくと80％以上又は90％以上であ
ると判断し得る。

発明の作用及び効果 叙上のように、本発明は特定の抗体を固定させ
て成る吸着体（アフイニテイーカラム）に対する
生物学的親和力を利用して目的物質としてウシラ
クトフエリンをその他の乳成分と有利に分離する
ものである。換言すると、相互に生物学的特異性
のある親和力を有する、抗原（ウシラクトフエリ
ン）と抗体（モノクローナル抗ウシラクトフエリ
ン抗体）の反応性を利用するものであり、そして
本発明では上記抗原−抗体反応の極めて高い特異
性を利用するものである故に、一段階の操作で高
純度のウシラクトフエリンを分離し得るのであ
る。

因に、抗原−抗体反応を利用したアフイニテイ
ーカラムを用いて目的物質を分離する手法自体は
広く知られている。モノクローナル抗体を用いず
に抗血清を用いる方法では目的物質に対する抗血
清を得、その中に含まれる抗体を担体に結合させ
たものを利用するものであつて、目的物質を高純
度で回収することはできない。何故ならば、抗血
清中には目的物質に対する抗体のほかに何種類も
の抗体も含まれており、特に、抗血清を得る目的
で免疫に供した抗原に不純物が含まれている場合
にはその不純物に対する抗体も混在しているから
である。

すなわち、高純度の目的物質を回収するには、
目的物質のみを認識するモノクローナル抗体を担
体に結合させたカラムを用いることが必要であ
り、また、目的物質を多量に回収するためには当
然多量の抗体が必要となるが、上述した従来法の
抗血清では量的に制限があるのに対してモノクロ
ーナル抗体はそれを産出するハイブリドーマを形
成しさえすれば量的に無限に得ることができる。

また、従来のアフイニテイーカラムを用いて目
的物質を分離、精製する方法では、目的物質を高
い純度及び収率で得ることができる反面、抗体に
結合している目的物質を遊離させる際に、一緒に
PHを下げる必要があるため往々にして回収した目
的物質の活性が失われるという欠点がみられるた
めに、すべての生理活性物質に普遍的に適用し得
るものではないが、本発明によると、溶出PHを従
来方法より若干高めにしても溶出可能なこと、及
び溶出後直ちに目的物質を含む溶出画分のPHを中
性に戻していることのために、このような欠点も
解消し得る利点がある。

更に、本発明の方法によつて分離、精製された
ラクトフエリンについても次のような利点があ
る。

ラクトフエリンは前述したように、その鉄結合
能の故に鉄要求性病理菌に対して強い成育抑制作
用を示す生理的効果を有するものであり、したが
つて、その生理的効果を利用するうえで回収して
得られたラクトフエリンは鉄飽和型であつてはな
らず、鉄結合能を保有している必要がある。しか
し、従来法により回収して得られるラクトフエリ
ンは時としてピンク色を呈する鉄結合型ラクトフ
エリンであるため（特開昭58−28233号参照）、
EDTAのような鉄キレート性物質を用いてラク
トフエリンから鉄をはずさなければ上述した生理
的効果は期待し得ない。

これに対し、本発明の方法に従つて分離、精製
されたラクトフエリンは従来の鉄結合能を完全に
保有している。因に、本発明の方法により得られ
たウシラクトフエリンについて、それらの鉄結合
能を鈴木、野中らの方法（“栄養と食糧”誌、
vol.31、No.４、395〜403、1978）に従つて測定し
た結果、ウシラクトフエリン１ｇ当り2.4〜3.7mg
の鉄結合能を示したことから、本発明によるウシ
ラクトフエリンは完全に本来の鉄結合能を保有し
ていることが立証される。

したがつて、本発明により得られるウシラクト
フエリンは、鉄要求性病理菌に由来する乳児の感
染防禦を目的とした予防薬及び上記病理菌によつ
てもたらされる各症状の治療薬として適用するこ
とができ、また、育児用粉乳などに添加して蛋白
質の組成を母乳に近似させ得ると共に該粉乳の上
記感染防禦能を高めることもできる効果がある。

また、ヒト及びウシラクトフエリンはある種の
細胞に対する増殖因子として働くことが知られて
いる。（Biochem.Biophys.Acta、763、377、
1983）。ヒトラクトフエリンはヒトＢリンパ球及
びＴリンパ球に対してのみ増殖効果が認められる
が、ウシラクトフエリンはこれに加うるにアウス
リンパ球に対しても増殖効果が認められ、従つ
て、細胞培養培地に添加することにより効果的な
培養を行なうことも可能となる。実際、ラクトフ
エリン添加した細胞培養用培地が試みられている
（特開昭59−166079、特開昭59−173078）。

発明の実施例 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。

実施例 １ モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体産生
ハイブリドーマの形成 従来のイオン交換法により取得したウシラクト
フエン（純度60％）を、食塩0.15Mを含むリン酸
緩衝液PH7.2（PBS）に0.3％濃度になるように溶
解し、この溶液にフロインド・アジユバント（デ
イフコ社製）を等量混合してエマルジヨンを作
り、得られたエマルジヨンを６〜８週令の
BALB／ｃ系マウス腹腔内に投与し免疫した。
この免疫を２週間おきに３回行ない、最終免疫後
６日目にマウスより脾臓を摘出し、これから脾細
胞を採取した。この脾細胞をDMEM培地ダルベ
ツコ変法MEM培地）に分散し、マウス骨髄腫細
胞SP2／０−Ag14と２：１の割合で混合した。
この混合液に50％ポリエチレングリコール（メル
ク社製、ガスクロマトグラフイー用、分子量
4000）溶液を融合促進剤として添加し、10分間で
融合を終了した。このようにして得られた融合細
胞を、遠心分離してポリエチレングリコールを除
いた後、HT培地中に１×10⁷個／ml以下の細胞
密度となるように分散し、ついで96穴マイクロタ
イタープレートにまき、37℃の温度で５％炭酸ガ
ス雰囲気下に培養を開始した。培養開始の翌日
（第１日目）よりHAT培地で半量交換を行ない
つつ、17日目にソリツドフエイズ法でスクリーニ
ングを行なつた。ハイブリドーマのコロニー形成
率は99％、ウシラクトフエリンの陽性率は8.3％
であつた。

次に、陽性反応を示したハイブリドーマを24穴
マイクロタイタープレートに移し、HT培地によ
る培養を続け、細胞密度が１×10⁵個／mlに増殖
した時点でクローニングを行なつた。その後２週
間HT培地中で培養し、単一コロニーを形成して
いるウエルを選んで２枚スクリーニングを行なつ
た。

このようなクローニングとスクリーニング操作
を計３回行ない、抗ウシラクトフエリン抗体を産
生するハイブリドーマのモノクローンを得た。

モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体の調
整 上述のようにして形成したモノクローナル抗ウ
シラクトフエリン抗体産生ハイブリドーマをマウ
ス１匹あたり10⁷個／0.5mlの割合でPBSに分散さ
せ、予めプリスタン（Pristan；２，６，10，14
−テトラメチルペンタデカン）を投与しておいた
BALB／ｃ系マウス18匹の腹腔内に注射した。

上記注射の７日〜10日後に腹水86mlを採取し、
遠心分離によつて清浄し、蛋白質濃度が10〜12
mg／mlとなるようにPBSで希釈し、ついで45％
飽和硫安で塩析した。得られた沈澱画分を0.04M
食塩を含む0.02Mトリス緩衝液（PH7.9）に溶解
後、該緩衝液に対し低温で１晩透析した。得られ
た透析内液をDEAEセルロース（ワツトマン社
製：DE−52）200mlを、直径２cm、長さ80cmのカ
ラムに詰め、0.04Mから0.15Mの食塩を含む
0.02Mトリス緩衝液（PH7.9）を用いたイオン強
度勾配によるイオン交換クロマトグラフイーを行
ない、0.04M食塩濃度で溶出された画分を回収し
た。この画分をさらに50％飽和硫安で沈澱させ、
生成した沈澱を脱イオン水に溶解、透析した後、
凍結乾燥してモノクローナル抗ウシラクトフエリ
ン抗体364mgを得た。

尚、ELISA法（Enzyme linkd immunosor−
bent assay）によつて抗体の種類を確認したと
ころIgGであつた。

アフイニテイーカラムの作成 上述のようにして得た精製モノクローナル抗ウ
シラクトフエリン抗体10〜30mg／ml、好ましくは
20mg／ml以上を等量のアフイニテイークロマトグ
ラフイー用担体Affigel−10と低温で１晩撹拌し
つつ結合させ、0.15M食塩を含むPH8.0の0.1M重
炭酸ナトリウム緩衝液で数回洗浄した後、塩酸で
PH8.0にした等量の0.1Mエタノールアミノンと混
合し、室温で１時間ゆるやかに撹拌し、モノクロ
ーナル抗ウシラクトフエリン抗体の吸着し得なか
つた担体上の官能基を不活性化させた。その後、
0.15M食塩を含むPH7.2のリン酸緩衝（PBS）で
充分担体を洗浄し、適当な大きさのカラムに充填
しアフイニテイーカラムとした。

ウシラクトフエリンの分離、精製 内径13mmのカラムに、上述のようにして作成し
たモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を固
定させたアフイニテイーゲル２mlを充填した。な
お、このアフイニテイーゲル１mlあたりモノクロ
ーナル抗ウシラクトフエリン抗体が4.7mg固定さ
れている。ついで、上記カラム内のアフイニテイ
ーゲルをPBSで充分洗浄した後、粗ウシラクト
フエリン（純度60％）5.5mgをPBS1mlに溶解した
溶液をカラムに2.5ml／minの割合で流した。

次に、カラム内のアフイニテイーゲルをPBS
で洗浄し、非吸着画分を除去した。この時、試料
溶液の不純物に相当するピークが得られ、この画
分の蛋白質は1.7mgであつた。さらに、上記アフ
イニテイーゲルを0.5M食塩を含むPH7.2のリン酸
緩衝液および0.15M食塩溶液で充分洗浄後、吸着
されたウシラクトフエリンを0.15M食塩を含むPH
2.7の酢酸緩衝液によつて溶出させた。なお、こ
れら一連の操作は室温において実施した。この溶
出画分のPHを７に調整した後、脱イオン水に対し
て透析し、凍結乾燥してウシラクトフエリンを
3.4mg得た。得られたウシラクトフエリンの純度
は98％以上であり、１ｇ当り3.7mgの鉄を結合し
た。また、回収率は92％であつた。すなわち、本
実施例にみられるように、本発明で用いるアフイ
ニテイーカラムは、ウシラクトフエリンの純度及
びその鉄結合性を全く損なうことなく、高い収率
で回収し得るものである。

実施例 ２ 実施例１での使用済カラム（すなわち、カラム
の繰返し使用）内のアフイニテイーゲルを0.5M
食塩を含むPH7.2のリン酸緩衝液及びPBSで充分
洗浄した後、該カラムへ脱脂したウシ初乳19mlを
実施例１に記載したと同様な手順で流した。

ただし、溶出は0.15M食塩を含むPH4.3の
0.001M酢酸緩衝液で行なつた。その結果、アフ
イニテイーゲルに吸着する画分と非吸着画分が得
られた。吸着画分から実施例１に記載したと同様
の手順でウシラクトフエリンを回収し、4.0mgを
得た。回収されたウシラクトフエリンの純度は98
％以上で、鉄結合能は１ｇ当り2.7mgであつた。

実施例 ３ 実施例２に記載したと同様の手順で使用済カラ
ムを充分洗浄した後、該カラムへ脱脂したウシ常
乳25mlを、実施例１に記載したと同様な手順で流
した。

その結果、アフイニテイーゲルに吸着する画分
と非吸着画分が得られ、吸着画分から実施例１に
記載したと同様な手順でウシラクトフエリンを回
収し3.0mgを得た。回収されたウシラクトフエリ
ンの純度は98％以上で、鉄結合能は１ｇ当り2.5
mgであつた。

実施例 ４ 実施例２に記載したと同様な手順で、使用済カ
ラムを充分洗浄した後、該カラムへ低温殺菌した
脱脂ウシ常乳25mlを、実施例１に記載したと同様
な手順で流した。

その結果、アフイニテイーゲルに吸着する画分
と非吸着画分が得られ、吸着画分から実施例１に
記載したと同様な手順でウシラクトフエリンを回
収し、1.6mgを得た。回収されたウシラクトフエ
リンの純度は98％以上で、鉄結合能は１ｇ当り
2.4mgであつた。

実施例 ５ 実施例２に記載したと同様な手順で、使用済カ
ラムを充分洗浄した後、該カラムへチーブホエー
100mlを、実施例１に記載したと同様な手順で流
した。

その結果、アフイニテイーゲルに吸着する画分
と非吸着画分が得られ、吸着画分から実施例１に
記載したと同様の手順でウシラクトフエリンを回
収し2.4mgを得た。回収されたウシラクトフエリ
ンの純度は98％以上で、鉄結合能は１ｇ当り2.8
ｇであつた。

実施例 ６ 実施例２に記載したと同様な手順で、使用済カ
ラムを充分洗浄した後、該カラムへ低温殺菌した
チーズホエー100mlを、実施例１に記載したと同
様な手順で流した。

その結果、アフイニテイーゲルに吸着する画分
と非吸着画分が得られ、吸着画分から実施例１に
記載したと同様の手順でウシラクトフエリンを回
収し2.2mgを得た。回収されたウシラクトフエリ
ンの純度は98％以上であり、鉄結合能は１ｇ当り
3.2mgであつた。

実施例 ７ 実施例２に記載したと同様な手順で、使用済カ
ラムを充分洗浄した後、該カラムへ１％WPC溶
液100mlを、実施例１に記載したと同様な手順で
流した。

その結果、アフイニテイーゲルに吸着する画分
と非吸着画分が得られ、吸着画分から実施例１に
記載したと同様の手順でウシラクトフエリンを回
収し0.2mgを得た。

上記各実施例にみられるように、本発明による
と牛乳から高純度のウシラクトフエリンを回収し
得るようになる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 牛乳またはホエーを、モノクローナル抗ウシ
   ラクトフエリン抗体を不溶性の担体に固定化して
   なるアフイニテイーカラムで処理して牛乳または
   ホエー中のウシラクトフエリンを該カラムに吸着
   させ、この吸着したウシラクトフエリンをPH4.7
   以下、好ましくはPH4.3〜2.7の緩衝液を用いて溶
   出させ、溶出したウシラクトフエリン画分のPHを
   直ちに中性に戻すことを特徴とするウシラクトフ
   エリンの分離精製方法。 ２ モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体
   は、ウシラクトフエリンで免疫したマウスの脾臓
   リンパ球とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得
   られるハイブリドーマが産生するものである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ウシラクトフエリンの溶出処理前に、カラム
   を中性のPHの緩衝液で洗浄する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ４ カラムの洗浄を0.5M食塩を含む中性PHのリ
   ン酸緩衝液及び0.15M食塩水溶液で順次行ない、
   ウシラクトフエリンの溶出を0.15M食塩を含むPH
   4.3〜2.7の酢酸緩衝液で行う特許請求の範囲第３
   項記載の方法。