JPH0661263B2 - モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 - Google Patents
モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法Info
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- JPH0661263B2 JPH0661263B2 JP59022412A JP2241284A JPH0661263B2 JP H0661263 B2 JPH0661263 B2 JP H0661263B2 JP 59022412 A JP59022412 A JP 59022412A JP 2241284 A JP2241284 A JP 2241284A JP H0661263 B2 JPH0661263 B2 JP H0661263B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モノクローナル抗ヒストラクトフエリン抗体
を産生するハイブリドーマの製造法に関する。
を産生するハイブリドーマの製造法に関する。
ラクトフエリンは乳汁などの外分泌液中の存在する鉄結
合性蛋白質であつて、乳児の授乳において栄養的に著し
く有益であるばかりでなく、その鉄結合能の特性のため
腸管における鉄要求性の高い病原性細菌に対して強い静
菌作用を呈するという生理的効果を有するものである。
すなわち、ラクトフエリンは、乳汁に存在する免疫グロ
ブリンやリゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養
学的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質といえ
る。
合性蛋白質であつて、乳児の授乳において栄養的に著し
く有益であるばかりでなく、その鉄結合能の特性のため
腸管における鉄要求性の高い病原性細菌に対して強い静
菌作用を呈するという生理的効果を有するものである。
すなわち、ラクトフエリンは、乳汁に存在する免疫グロ
ブリンやリゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養
学的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質といえ
る。
従来技術 上述したようなラクトフエリンの特性にかんがみ、従来
より乳からラクトフエリンを分離、精製するための方法
が種々提案されている。しかしながら、ラクトフエリン
は非常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であ
り、かつ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、従来の
方法では純度の高いラクトフエリンを簡易にかつ有効に
分離精製して採取することは困難であつた。
より乳からラクトフエリンを分離、精製するための方法
が種々提案されている。しかしながら、ラクトフエリン
は非常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であ
り、かつ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、従来の
方法では純度の高いラクトフエリンを簡易にかつ有効に
分離精製して採取することは困難であつた。
例えば、従来、乳から脂肪を分離した脱脂乳よりpH4.6
でカゼインを等電沈澱させることにより除去し、ついで
得られる乳清画分を硫酸アンモニウムで塩折した画分を
純水に対して透析した後、イオン交換樹脂に数回通して
分離、精製する方法（Gordon,Ziegler,Bash et al.：「B
iochim.Biophys.Acta,60,410〜411,1962」及びMerton L.
Grove et al.：「Biochim.Biophys.Acta,100,154〜162,1
965」またはJohansson,B.G.et al.：「Acta Chem.Scand.2
3,683,1969」）や上記方法においてイオン交換樹脂の代
りにシリカ粒子を用いる方法（特開昭58-28233号）及び
上述のようにイオン交換樹脂を通した後に、更に銅アフ
イニテイークロマトグラフィー処理を行なう方法（河方
則裕、吉野芳夫等「生化学会講演予稿集、第1053頁、19
83」）が行なわれているが、これらの方法は、いずれも
操作が煩雑で、処理に要する時間も長いため実用性に乏
しいといえる。
でカゼインを等電沈澱させることにより除去し、ついで
得られる乳清画分を硫酸アンモニウムで塩折した画分を
純水に対して透析した後、イオン交換樹脂に数回通して
分離、精製する方法（Gordon,Ziegler,Bash et al.：「B
iochim.Biophys.Acta,60,410〜411,1962」及びMerton L.
Grove et al.：「Biochim.Biophys.Acta,100,154〜162,1
965」またはJohansson,B.G.et al.：「Acta Chem.Scand.2
3,683,1969」）や上記方法においてイオン交換樹脂の代
りにシリカ粒子を用いる方法（特開昭58-28233号）及び
上述のようにイオン交換樹脂を通した後に、更に銅アフ
イニテイークロマトグラフィー処理を行なう方法（河方
則裕、吉野芳夫等「生化学会講演予稿集、第1053頁、19
83」）が行なわれているが、これらの方法は、いずれも
操作が煩雑で、処理に要する時間も長いため実用性に乏
しいといえる。
更に、ラクトフエリンは乳中に存在する他の蛋白質と相
互作用を有するという特性のため、イオン交換樹脂を用
いる上掲の方法では乳中の免疫グロブリン等の他の蛋白
質の混入が避けられず、したがつて、純度の高いラクト
フエリンを採取することが実際上困難であり、加うる
に、塩析及びイオン交換による処理を繰返して行なうた
めに、ラクトフエリンの回収率の著しい低下が避けられ
ないのみならず、ラクトフエリンを分離精製する過程で
得られる残留分を含まれる、ラクトフエリン以外の乳蛋
白質及びその他の乳成分を回収して再利用することが実
質上不可能であるという欠点がみられる。
互作用を有するという特性のため、イオン交換樹脂を用
いる上掲の方法では乳中の免疫グロブリン等の他の蛋白
質の混入が避けられず、したがつて、純度の高いラクト
フエリンを採取することが実際上困難であり、加うる
に、塩析及びイオン交換による処理を繰返して行なうた
めに、ラクトフエリンの回収率の著しい低下が避けられ
ないのみならず、ラクトフエリンを分離精製する過程で
得られる残留分を含まれる、ラクトフエリン以外の乳蛋
白質及びその他の乳成分を回収して再利用することが実
質上不可能であるという欠点がみられる。
発明の目的 本発明は、ラクトフエリンに関する従来技術の現状に鑑
みてなされたものであつて、人乳からヒトラクトフエリ
ンを高純度でかつ高収率で有利に分離、精製するのに用
い得るモノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体を産生
するハイブリドーマの製造法を提供することを目的とす
る。以下本発明を詳しく説明する。
みてなされたものであつて、人乳からヒトラクトフエリ
ンを高純度でかつ高収率で有利に分離、精製するのに用
い得るモノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体を産生
するハイブリドーマの製造法を提供することを目的とす
る。以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の構成上の特徴は、ヒトラクトフェリンで免疫
し、最終免疫してから６〜７日目に摘出したマウスの脾
臓から採取したリンパ球と、マウスの骨髄腫細胞とを融
合させてなることを特徴とするモノクローナル抗ヒトラ
クトフェリン抗体産生ハイブリドーマにある。
し、最終免疫してから６〜７日目に摘出したマウスの脾
臓から採取したリンパ球と、マウスの骨髄腫細胞とを融
合させてなることを特徴とするモノクローナル抗ヒトラ
クトフェリン抗体産生ハイブリドーマにある。
さらに、本発明のもうひとつの特徴は、マウスの腹腔に
ヒトラクトフェリンとフロインドアジュバンドとのエマ
ルジョンを投与して免疫し、最終免疫終了後６〜７日目
に脾臓を摘出し、そのリンパ球を採取し、IgGk鎖を分泌
しない融合促進剤として分子量4000のポリエチレングリ
コールを用いて融合させ、ハイブリドーマを選択し、ソ
リッドフェイズ法に従ってスクリーニングを行い、マウ
ス胸腺細胞を、フィーダー細胞として用いて、限界希釈
法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得
ることを特徴とするモノコローナル抗ヒトラクトフェリ
ン抗体産生ハイブリドーマの製造法にある。
ヒトラクトフェリンとフロインドアジュバンドとのエマ
ルジョンを投与して免疫し、最終免疫終了後６〜７日目
に脾臓を摘出し、そのリンパ球を採取し、IgGk鎖を分泌
しない融合促進剤として分子量4000のポリエチレングリ
コールを用いて融合させ、ハイブリドーマを選択し、ソ
リッドフェイズ法に従ってスクリーニングを行い、マウ
ス胸腺細胞を、フィーダー細胞として用いて、限界希釈
法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得
ることを特徴とするモノコローナル抗ヒトラクトフェリ
ン抗体産生ハイブリドーマの製造法にある。
従来、免疫されたマウスの脾臓リンパ球とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることによりモノクローナル抗体産生
のハイブリドーマを得る手段は、G.Khler、C.Milstein
等により発表(Nature，２５６，４９５〜４９７，１９
７５）されて以来、細胞融合によるハイブリドーマの形
成および得られたハイブリドーマ産生の抗体についての
科学的研究及びその利用に関する報告が多くなされてい
る。
腫細胞を融合させることによりモノクローナル抗体産生
のハイブリドーマを得る手段は、G.Khler、C.Milstein
等により発表(Nature，２５６，４９５〜４９７，１９
７５）されて以来、細胞融合によるハイブリドーマの形
成および得られたハイブリドーマ産生の抗体についての
科学的研究及びその利用に関する報告が多くなされてい
る。
しかしながら、このようなハイブリドーマを形成するた
めの一般的手法を特定なモノクローナル抗体産生の新規
なハイブリドーマの形成に適用する場合、操作上種々の
困難な問題がみられる。すなわち、ハイブリドーマの形
成に当つて抗原として用いる蛋白質の相違により、その
後の免疫、融合の操作上特別な工夫を要し、かつ、所望
のハイブリドーマを単離するためのスクリーニング技術
に影響を与えるからである。
めの一般的手法を特定なモノクローナル抗体産生の新規
なハイブリドーマの形成に適用する場合、操作上種々の
困難な問題がみられる。すなわち、ハイブリドーマの形
成に当つて抗原として用いる蛋白質の相違により、その
後の免疫、融合の操作上特別な工夫を要し、かつ、所望
のハイブリドーマを単離するためのスクリーニング技術
に影響を与えるからである。
本発明に係るモノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体
産生ハイブリドーマは、ヒトラクトフエリンで免疫した
マウスから摘出した脾臓より採取した脾臓リンパ球とマ
ウスの骨髄腫細胞を公知の手法で融合させることにより
形成し得る。次に上記ハイブリドーマの形成法について
説明する。
産生ハイブリドーマは、ヒトラクトフエリンで免疫した
マウスから摘出した脾臓より採取した脾臓リンパ球とマ
ウスの骨髄腫細胞を公知の手法で融合させることにより
形成し得る。次に上記ハイブリドーマの形成法について
説明する。
モノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体産生ハイブリ
ドーマの形成 ヒトラクトフエリンの溶液を調製し（一般に食塩を含む
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）pH７．２を用いる）、この溶液
とフロインド・アジュバント(Freund'sadjuvant)を等量
混合して得られるエマルジヨンを、マウス（一般に６〜
８週令）の腹腔内に２週間おきに３回免疫を行なう。こ
の際用いるヒトラクトフエリンは若干不純物を含んでい
ても差支えないが、目的とするハイブリドーマを得るた
めには純度の高いものを用いるのが好ましいことは勿論
である。
ドーマの形成 ヒトラクトフエリンの溶液を調製し（一般に食塩を含む
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）pH７．２を用いる）、この溶液
とフロインド・アジュバント(Freund'sadjuvant)を等量
混合して得られるエマルジヨンを、マウス（一般に６〜
８週令）の腹腔内に２週間おきに３回免疫を行なう。こ
の際用いるヒトラクトフエリンは若干不純物を含んでい
ても差支えないが、目的とするハイブリドーマを得るた
めには純度の高いものを用いるのが好ましいことは勿論
である。
本発明に使用するマウスの種類は特に限定されないが、
一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスを用いるとよい。
一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスを用いるとよい。
従来、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの形成に
用いられる脾臓リンパ球は、特定の抗原による最終免疫
後３〜４日目に摘出した脾臓から採取するのが一般的で
あるが、本発明において対象とするヒトラクトフエリン
の場合には、上記最終免疫後３〜４日目ではマウスにお
ける抗体価の上昇が最高値に達せず、また脾臓中の抗体
産生細胞の活性化が不充分であり、したがつて、目的と
するモノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体産生ハイ
ブリドーマの形成率が低くなる。
用いられる脾臓リンパ球は、特定の抗原による最終免疫
後３〜４日目に摘出した脾臓から採取するのが一般的で
あるが、本発明において対象とするヒトラクトフエリン
の場合には、上記最終免疫後３〜４日目ではマウスにお
ける抗体価の上昇が最高値に達せず、また脾臓中の抗体
産生細胞の活性化が不充分であり、したがつて、目的と
するモノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体産生ハイ
ブリドーマの形成率が低くなる。
本発明者は、ヒトラクトフエリンで最終免疫後６〜７日
目のマウスから摘出した脾臓から採取した脾臓リンパ球
を用いると上記ハイブリドーマの形成率が非常に高くな
ることを見出した。
目のマウスから摘出した脾臓から採取した脾臓リンパ球
を用いると上記ハイブリドーマの形成率が非常に高くな
ることを見出した。
上述のようにしてマウスの脾臓から採取した脾臓リンパ
球（以下脾細胞と称する）はマウス骨髄腫細胞（以下ミ
エローマ細胞と称する）と融合させる。
球（以下脾細胞と称する）はマウス骨髄腫細胞（以下ミ
エローマ細胞と称する）と融合させる。
ここで用いるミエローマ細胞は特に限定されないが、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ系マウスの脾細胞と融合させる場合には、Ig
Ｇのｋ鎖を分泌しないＳＰ２／０−Ａg14を用いるのが
好ましい。融合方法は公知の手法に準じて行ない得る
が、ミエローマ細胞として上記ＳＰ２／０−Ａg14を用
いる場合には、融合促進剤（融合誘導剤）の添加、混合
及び希釈の各操作から成る融合時間を５〜１５分、好ま
しくは９〜１１分の範囲内にすることが肝要である。
ＡＬＢ／ｃ系マウスの脾細胞と融合させる場合には、Ig
Ｇのｋ鎖を分泌しないＳＰ２／０−Ａg14を用いるのが
好ましい。融合方法は公知の手法に準じて行ない得る
が、ミエローマ細胞として上記ＳＰ２／０−Ａg14を用
いる場合には、融合促進剤（融合誘導剤）の添加、混合
及び希釈の各操作から成る融合時間を５〜１５分、好ま
しくは９〜１１分の範囲内にすることが肝要である。
この場合、融合時間が５分より短いと融合が不完全とな
り、一方１５分を越えると融合促進剤として用いたポリ
エチレングリコールの被毒により細胞が死滅する。因
に、上記融合時間を９〜１１分の範囲にするとほぼ１０
０％に近いコロニー形成率がえられる。また、ヒトラク
トフエリンで免疫したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾細胞と
ＳＰ２／０−Ａg14を融合する場合には、融合促進剤と
してメルク社製ガスクロマトグラフイー用の分子量4000
のポリエチレングリコールを濃度５０％で用いられると
特に高いコロニー形成率（融合率）が得られる。
り、一方１５分を越えると融合促進剤として用いたポリ
エチレングリコールの被毒により細胞が死滅する。因
に、上記融合時間を９〜１１分の範囲にするとほぼ１０
０％に近いコロニー形成率がえられる。また、ヒトラク
トフエリンで免疫したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾細胞と
ＳＰ２／０−Ａg14を融合する場合には、融合促進剤と
してメルク社製ガスクロマトグラフイー用の分子量4000
のポリエチレングリコールを濃度５０％で用いられると
特に高いコロニー形成率（融合率）が得られる。
融合終了後、融合細胞を従来法にしたがつて、ＨＴ培地
（ヒポキサンチン・チミジン・１０％ウシ胎児血清を含
むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）に分散させ、ついで９６
穴マイクロタイタープレート上に散布し、３７℃の温度
で５％炭酸ガス雰囲気下に培養し、その翌日よりＨＡＴ
培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン・１
０％ウシ胎児血清を含むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）中
でハイブリドーマの選択を行なう。
（ヒポキサンチン・チミジン・１０％ウシ胎児血清を含
むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）に分散させ、ついで９６
穴マイクロタイタープレート上に散布し、３７℃の温度
で５％炭酸ガス雰囲気下に培養し、その翌日よりＨＡＴ
培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン・１
０％ウシ胎児血清を含むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）中
でハイブリドーマの選択を行なう。
ついでハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなつた
ところでソリツドフエイズ法(Silid phase method)に従
つてスクリーニングを行ない、陽性反応を示したハイブ
リドーマについて限界希釈法を用いてクローニングを行
なう。
ところでソリツドフエイズ法(Silid phase method)に従
つてスクリーニングを行ない、陽性反応を示したハイブ
リドーマについて限界希釈法を用いてクローニングを行
なう。
なお、ソリツドフエイズ法は、可溶性の抗原を９６穴ソ
フトマイクロウエルに吸着させた後、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）で上記ウエル中の非吸着部分をブロツクし、
上記の培養液上清を各ウエルに入れて抗原と反応させ、
反応後各ウエルを充分洗い、ついで二次抗体としてビオ
チニル化させたマウス抗体に対する抗体を添加し、その
後アビジン及び螢光色素で標識したビオチンを反応させ
て、目的とする抗体を螢光で検出して行なつた。
フトマイクロウエルに吸着させた後、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）で上記ウエル中の非吸着部分をブロツクし、
上記の培養液上清を各ウエルに入れて抗原と反応させ、
反応後各ウエルを充分洗い、ついで二次抗体としてビオ
チニル化させたマウス抗体に対する抗体を添加し、その
後アビジン及び螢光色素で標識したビオチンを反応させ
て、目的とする抗体を螢光で検出して行なつた。
また、限界希釈法は、マウスの胸腺細胞１０８個とハイ
ブリドーマ５０個を１０ｍのＨＴ培地に分散したもの
を、９６穴マイクロタイタ−プレート上にハイブリドー
マが各ウエル当り１個以下になるように散布してハイブ
リドーマの単一コロニーを得るように行なつた。なお、
マウスの胸腺細胞はハイブリドーマが細胞密度が低いと
増殖できないので、フイーダー細胞(feeder cell)とし
て添加した。
ブリドーマ５０個を１０ｍのＨＴ培地に分散したもの
を、９６穴マイクロタイタ−プレート上にハイブリドー
マが各ウエル当り１個以下になるように散布してハイブ
リドーマの単一コロニーを得るように行なつた。なお、
マウスの胸腺細胞はハイブリドーマが細胞密度が低いと
増殖できないので、フイーダー細胞(feeder cell)とし
て添加した。
上述のようなクローニングを３個以上繰返し行なつてモ
ノクローン化されたハイブリドーマを得る。
ノクローン化されたハイブリドーマを得る。
次に、このようにして得られたモノクローナル抗ヒトラ
クトフエリン抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法に
従つて、マウス腹腔内に投与し、その腹水を回収する
か、或は培地中で培養してその上清液を回収し、硫安沈
澱、陰イオン交換樹脂を用いて精製することにより、モ
ノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体を産生し得る。
クトフエリン抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法に
従つて、マウス腹腔内に投与し、その腹水を回収する
か、或は培地中で培養してその上清液を回収し、硫安沈
澱、陰イオン交換樹脂を用いて精製することにより、モ
ノクローナル抗ヒトラクトフエリン抗体を産生し得る。
因に、本発明に係るハイブリドーマ産生の上記モノクロ
ーナル抗ヒトラクトフエリン抗体を用いて人乳からヒト
ラクトフエリンを分離、精製するには、該抗体を不溶性
の担体に固定化したアフイニテイカラムを用いて行な
う。なお、上記抗体を用いての人乳からのヒトラクトフ
エリンの分離、精製方法は別に特許出願されている。
ーナル抗ヒトラクトフエリン抗体を用いて人乳からヒト
ラクトフエリンを分離、精製するには、該抗体を不溶性
の担体に固定化したアフイニテイカラムを用いて行な
う。なお、上記抗体を用いての人乳からのヒトラクトフ
エリンの分離、精製方法は別に特許出願されている。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施例 ヒトラクトフエリン（シグマ社製、純度９８％）を、食
塩０．１５Ｍを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）pH７．２に
０．３％濃度になるように溶解し、この溶液にフロイン
ド・アジユバント（デイフコ社製）を等量混合してエマ
ルジヨンを作り、得られたエマルジヨンを６〜８週令の
ＢＡＬＢ／ｃ系マウス腹腔内に投与し、免疫した。この
免疫を２週間おきに３回行ない、最終免疫後７日目にマ
ウスより脾臓を摘出し、これから脾細胞を採取した。こ
の脾細胞をＤＭＥＭ培地（ダルベツコ変法ＭＥＭ培地）
に分散し、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０−Ａg14と２：
１の割合で混合した。この場合液に５０％ポリエチレン
グリコール（メルク社製、ガスクロマトグラフイー用、
分子量4000）を溶液を融合促進剤として添加し、１０分
間で融合を終了した。このようにして得られた融合細胞
を、遠心分離してポリエチレングリコールを除いた後、
ＨＴ培地中に１×１０７個／ｍ以下の細胞密度となる
ように分散し、ついで96穴マイクロタイタ−プレートに
まき、３７℃の温度で５％炭酸ガス雰囲気下に培養を開
始した。培養開始の翌日（第１日目）よりＨＡＴ培地で
半量交換を行ないつつ、１７日目にソリツドフエイズ法
でスクリーニングを行なつた。ハイブリドーマのコロニ
ー形成率は９９％、ヒトラクトフエリン陽性率は２４％
であつた。
塩０．１５Ｍを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）pH７．２に
０．３％濃度になるように溶解し、この溶液にフロイン
ド・アジユバント（デイフコ社製）を等量混合してエマ
ルジヨンを作り、得られたエマルジヨンを６〜８週令の
ＢＡＬＢ／ｃ系マウス腹腔内に投与し、免疫した。この
免疫を２週間おきに３回行ない、最終免疫後７日目にマ
ウスより脾臓を摘出し、これから脾細胞を採取した。こ
の脾細胞をＤＭＥＭ培地（ダルベツコ変法ＭＥＭ培地）
に分散し、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０−Ａg14と２：
１の割合で混合した。この場合液に５０％ポリエチレン
グリコール（メルク社製、ガスクロマトグラフイー用、
分子量4000）を溶液を融合促進剤として添加し、１０分
間で融合を終了した。このようにして得られた融合細胞
を、遠心分離してポリエチレングリコールを除いた後、
ＨＴ培地中に１×１０７個／ｍ以下の細胞密度となる
ように分散し、ついで96穴マイクロタイタ−プレートに
まき、３７℃の温度で５％炭酸ガス雰囲気下に培養を開
始した。培養開始の翌日（第１日目）よりＨＡＴ培地で
半量交換を行ないつつ、１７日目にソリツドフエイズ法
でスクリーニングを行なつた。ハイブリドーマのコロニ
ー形成率は９９％、ヒトラクトフエリン陽性率は２４％
であつた。
次に、陽性反応を示したハイブリドーマを２４穴マイク
ロタイタープレートに移し、ＨＴ培地による培養を続
け、細胞密度が１×１０５個／ｍに増殖した時点でク
ローニングを行なつた。その後２週間ＨＴ培地中で培養
し、単一コロニーを形成しているウエルを選んで２次ス
クリーニングを行なつた。
ロタイタープレートに移し、ＨＴ培地による培養を続
け、細胞密度が１×１０５個／ｍに増殖した時点でク
ローニングを行なつた。その後２週間ＨＴ培地中で培養
し、単一コロニーを形成しているウエルを選んで２次ス
クリーニングを行なつた。
このようなクローニングとスクリーニング操作を計３回
行ない、抗ヒトラクトフエリン抗体を産生するハイブリ
ドーマのモノクローンを得た。これに対し最終免疫後４
日目にマウスから脾臓を摘出し、これから得られる脾細
胞を用いて実施例１と同様にして処理したところハイブ
リドーマのコロニー形成率68％、ヒトラクトフェリン陽
性率14％であった。
行ない、抗ヒトラクトフエリン抗体を産生するハイブリ
ドーマのモノクローンを得た。これに対し最終免疫後４
日目にマウスから脾臓を摘出し、これから得られる脾細
胞を用いて実施例１と同様にして処理したところハイブ
リドーマのコロニー形成率68％、ヒトラクトフェリン陽
性率14％であった。
従って、実施例１とこの比較例とを対比すると次のよう
であり、本発明は比較例にくらべて両者の点で著しく優
れていた。
であり、本発明は比較例にくらべて両者の点で著しく優
れていた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿彦 健吉 東京都小平市花小金井２−688―18 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，256，495−497（1975) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，87（13），Ｐ．486，抄録番号100588 ｎ
Claims (1)
- 【請求項１】マウスの腹腔にヒトラクトフェリンとフロ
インドアジュバンドとのエマルジョンを投与して免疫
し、最終免疫終了後６〜７日目に脾臓を摘出し、そのリ
ンパ球を採取し、ＩｇＧκ鎖を分泌しないマウス骨髄腫
細胞と、融合促進剤として分子量4000のポリエチレング
リコールを用いて融合させ、ハイブリドーマを選択し、
ソリットフェイズ法に従ってスクリーニングを行い、マ
ウス胸線細胞をフィーダー細胞として用いて、限界希釈
法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得
ることを特徴とするモノクローナル抗ヒトラクトフェリ
ン抗体産生ハイブリドーマの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59022412A JPH0661263B2 (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59022412A JPH0661263B2 (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60168383A JPS60168383A (ja) | 1985-08-31 |
| JPH0661263B2 true JPH0661263B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=12081949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59022412A Expired - Fee Related JPH0661263B2 (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0661263B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04118067U (ja) * | 1991-04-03 | 1992-10-22 | フランスベツド株式会社 | マツトレス装置 |
-
1984
- 1984-02-09 JP JP59022412A patent/JPH0661263B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，８７（１３），Ｐ．４８６，抄録番号１００５８８ｎ |
| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60168383A (ja) | 1985-08-31 |
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