FR2574800A1 - Procede et separation de la lactoferrine bovine du lait de vache et sa purification - Google Patents
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Abstract
PROCEDE POUR LA SEPARATION D'UNE FORME EXTREMEMENT PURE DE LACTOFERRINE BOVINE A PARTIR DE LAIT DE VACHE ET DE PURIFICATION DE CELLE-CI QUI COMPORTE LES ETAPES CONSISTANT A : -PREPARER UNE COLONNE DE CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE EN FIXANT UN ANTICORPS MONOCLONAL CONTRE LA LACTOFERRINE BOVINE SUR UN SUPPORT INSOLUBLE; -FAIRE PASSER DU LAIT DE VACHE OU UNE SOLUTION DE LACTOFERRINE BOVINE DERIVEE DU LAIT DE VACHE A TRAVERS LA COLONNE DE CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE; ET -LA LACTOFERRINE BOVINE ADSORBEE SUR LA COLONNE DE CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE. APPLICATION A LA PREPARATION D'UNE LACTOFERRINE BOVINE UTILISABLE A TITRE PREVENTIF CONTRE LES INFECTIONS, NOTAMMENT COMME ADDITIF DU LAIT EN POUDRE POUR LES NOURRISSONS.
Description
Procédé de séparation de la lactoferrine bovine du lait
de vache et sa purification.
La présente invention concerne un procédé de sé- paration et de purification en vue de l'obtention de lactoferrine bovine à partir du lait de vache sous une
forme extrêmement pure et à haut rendement.
La lactoferrine est une protéine fixant le fer que l'on rencontre dans les fluides de sécrétion externe tel que le lait. Elle s'avère extrêmement bénéfique non seulement dans l'alimentation des nourrissons du point
de vue nutritionnel mais possède également l'effet phy-
siologique d'exercer une action bactériostatique sur les bactéries pathogènes rencontrées dans les intestins et de présenter un haut degré de besoin en fer en raison de
sa capacité caractéristique de fixation du fer. En d'au-
tres termes, on peut dire que la lactoferrine est une protéine du lait importante qui sert non seulement de nutriment mais présente également une signification pharmacologique en tant qu'agent anti-infectieux au même titre que les immunoglobulines et le lysozyme présents
dans le lait.
Traditionnellement, compte tenu des propriétés
caractéristiques ci-dessus mentionnées de la lactofer-
rine, plusieurs procédés visant à séparer la lactofer-
rine du lait et à la purifier ont été proposés. Cepen-
dant étant donné que la lactoferrine est une protéine ayant une structure moléculaire hautement réactive et qu'elle est également susceptible d'interagir avec d'autres protéines du lait, il s'est avéré 'difficile d'isoler, d'une manière simple et efficace selon les
procédés classiques, une forme extrêmement pure de lac-
toferrine.
Par exemple, un procédé classique pour la sépa-
ration et la purification de la lactoferrine consiste à se procurer du lait écrémé dont on a séparé la graisse, à en enlever la caséine par précipitation isoélectrique
à pH 4,6, à relarguer la fraction de petit-lait en ré-
sultant à l'aide de sulfate d'ammonium, à dialyser la fraction résultante contre l'eau désionisée, puis à fai- re passer le produit retenu plusieurs fois à travers une résine échangeuse d'ions (Gordon, Ziegler, Bash et col.: Biochim. Biophys. Acta, 60, 410-411, 1962; Merton L. Glove et col.: Biochim. Biophys. Acta, 100, 154-162, 1965; Johansson, B.G. et col.: Acta Chem. Scand., 23,
683, 1969). Par ailleurs, des variantes au procédé ci-
dessus comprennent un processus dans lequel des particu-
les de silice sont utilisées à la place de la résine échangeuse d'ions (brevet japonais publié n 28233/'83) et un processus selon lequel, après avoir fait passer le produit retenu à travers une résine échangeuse d'ions, le produit qui en résulte est soumis ultérieurement à
une chromatographie d'affinité au cuivre (Norihiro Kawa-
kata, Yoshio Yoshino et col., Abstracts of Lectures at
the 1983 Annual Meeting of the Japan Biochemical Socie-
ty, p.1053). Toutefois, ces procédés manquent tous d'u-
tilité pratique car ils nécessitent des opérations com-
plexes ainsi que des durées excessives de traitement.
En outre, étant donné que la lactoferrine a la propriété d'interagir avec d'autres protéines présentes dans le lait, les procédés ci-dessus qui utilisent une
résine échangeuse d'ions, ne peuvent éviter la contami-
nation du produit par les immunoglobulines et autres protéines rencontrées dans le lait. En conséquence, il s'avère difficile, dans la pratique, d'obtenir une forme extrêmement pure de lactoferrine. En outre, ces procédés
présentent également l'inconvénient de ce que le traite-
ment répété par relarguage et échange d'ions non seule-
ment provoque une réduction prononcée dans la récupéra-
tion de lactoferrine mais rend également pratiquement impossible la récupération et la réutilisation des protéines du lait autres que la lactoferrine et autres constituants du lait présents dans les résidus obtenus au cours de la séparation et de la purification de la lactoferrine. Compte tenu des problèmes ci-dessus-rencontrés dans les procédés selon l'art antérieur pour l'isolement d'une forme extrêmement pure de lactoferrine à partir du lait de vache, la demanderesse a effectué des recherches
en vue d'établir un procédé de séparation et de purifi-
cation pouvant être avantageusement utilisé pour l'iso-
lement de la lactoferrine bovine du lait de vache sous
une forme extrêmement pure et à haut rendement. En con-
séquence, la demanderesse a trouvé que la lactoferrine bovine pouvait spécifiquement se combiner avec et être adsorbée sur une colonne de chromatographie d'affinité avec, fixé sur ladite colonne, un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, et a réussi à obtenir une forme extrêmement pure de lactoferrine bovine avec un haut rendement en séparant la lactoferrine bovine du lait de vache et en la purifiant à l'aide d'une telle
colonne de chromatographie d'affinité.
En conséquence, l'objet principal de la présente invention est de fournir un procédé de séparation et de purification pour l'obtention d'une forme extrêmement pure de lactoferrine bovine à partir du lait de vache,
avec un haut rendement.
La description suivante fera apparaître d'autres
objets de la présente invention.
Ceux-ci ainsi que les autres objets de la pré-
sente invention sont atteints au moyen d'un procédé pour la séparation d'une forme extrêmement pure de lactoferrine bovine à partir de lait de vache et de purification de celle-ci, qui comprend les étapes consistant à préparer une colonne de chromatographie d'affinité en fixant un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine sur un support insoluble; à faire passer le lait de vache ou une solution de lactoferrine bovine dérivée du lait de vache à travers la colonne de
chromatographie d'affinité; puis à éluer la lactoferri-
ne bovine adsorbée sur la colonne de chromatographie d'affinité.
Le procédé de la présente invention est caracté-
risé en ce qu'une colonne de chromatographie d'affinité comprenant un support insoluble sur lequel est fixé un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est utilisée pour séparer la lactoferrine bovine du lait de
vache et pour la purifier.
Ainsi le procédé de la présente invention est
une méthode de séparation et de purification de la lac-
toferrine grâce à l'utilisation de l'affinité biologique (c'est-à-dire une interaction spécifique élevée entre
les composants biologiques) et est essentiellement dif-
férent des procédés de séparation classiques utilisant
l'affinité physique ou chimique.
Un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine pour utilisation dans la présente invention peut
être obtenu comme suit: un hybridome-capable de pro-
duire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est formé en fusionnant des lymphocytes de rate
(appelés ci-après cellules de rate) d'une souris immu-
nisée contre la lactoferrine bovine avec des cellules de
myelome de souris (appelées ci-après cellules de myelo-
me). Ensuite, selon toute technique bien connue, l'hy-
bridome est injecté dans la cavité abdominale de souris et l'on récupère leur liquide d'ascite. En variante, on peut cultiver l'hybridome dans un milieu approprié et
l'on récupère son surnageant. Le liquide d'ascite récu-
péré ou le surnageant est ensuite purifié par précipi-
tation au sulfate d'ammonium et traitement avec une résine échangeuse d'anions pour obtenir l'anticorps
désiré.
Dans un premier temps, à l'aide d'un exemple concret on décrira ci-après le procédé de préparation
d'un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine.
Comme indiqué ci-dessus, un anticorps monoclonal
contre la lactoferrine bovine peut être produit en pro-
cédant à la culture d'un hybridome qui est obtenu en fu- sionnant des cellules de rate d'une souris immunisée
contre la lactoferrine bovine avec les cellules de mye-
lome. Un tel hybridome peut être formé, par exemple, selon le mode opératoire suivant (le procédé précité
pour la formation d'un tel hybridome est décrit et re-
vendiqué dans une demande de brevet indépendant déposé
par la même demanderesse).
Formation d'un hYbridome caPable de Produire un
anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine.
La lactoferrine bovine est isolée à partir de la fraction de petit-lait du lait selon une procédure bien connue (par exemple, Johansson, B.G. et col.: Acta Chem. Scand., 23, 683, 1969) puis une solution de celle-ci est préparée (habituellement en utilisant une solution tampon saline au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant du chlorure de sodium 0,15M). Cette solution est mélangée avec une quantité égale d'adjuvant complet de Freund pour former une émulsion. En injectant cette
émulsion dans sa cavité abdominale, une souris (habi-
tuellement âgée de 6 à 8 semaines) est immunisée trois fois à des intervalles de deux semaines. La lactoferrine bovine utilisée pour ce faire peut contenir des petites
quantités d'impuretés. Toutefois, afin d'obtenir l'hy-
bridome désiré, il est naturellement préférable d'uti-
liser une forme extrêmement pure de lactoferrine bovine.
Il n'existe-aucune limitation particulière quant
au type de souris utilisées dans la présente invention.
Toutefois, il est habituellement souhaitable d'utiliser
une souris de la souche BALB/C.
Sur la souris immunisée de la manière décrite ci-dessus, on excise la rate de préférence 6 ou 7 jours
après l'immunisation finale contre la lactoferrine bo-
vine. Ceci étant donné que la vitesse de formation des hybridome souhaités est accrue lorsque l'on utilise des cellules de rate recueillies à partir de la rate ainsi excisée. Aucune limitation particulière n'est imposée quant au type de cellules-de myelome que l'on veut faire fusionner avec les cellules de la rate obtenues de la manière ci-dessus. Toutefois, lorsque l'on souhaite les faire fusionner avec des cellules de rate obtenues sur
une souris de souche BALB/C, il est préférable d'utili-
ser des cellules SP2/0-Ag14 qui ne sécrètent pas la chaîne K de l'IgG. La fusion peut être effectuée suivant tout procédé bien connu. Toutefois lorsque l'on utilise des cellules SP2/0-Agl4 comme cellules de myelome, il est essentiel que le temps de fusion fasse entrer en ligne de compte l'addition d'un stimulateur de fusion
"promoterN (inducteur de fusion) le mélange et la dilu-
tion devant se faire dans une plage de 5 à 15 minutes et de préférence de 9 à 11 minutes. A cet égard, si le temps de fusion se trouve dans la plage de 9 à 11 minutes, le taux de formation de colonies approchera pratiquement 100%. Lorsque les cellules de la rate d'une souris de souche BALB/C immunisée contre la lactoferrine bovine sont fusionnées avec les cellules SP2/0-Ag14, le taux de formation de colonies (le taux de fusion) peut
être fortement augmenté en utilisant du glycol polyéthy-
lène de qualité destinée à la chromatographie gazeuse (PM 4000; Merck & Co., Inc.) en tant que stimulateur de
fusion à une concentration de 50%.
Lorsque la fusion est achevée, les cellules fu-
sionnées pourront être traitées de la manière tradition-
nelle. De façon spécifique, les cellules fusionnées sonc
dispersées dans un milieu HT (milieu MEM modifié Dulbec-
co contenant de l'hypoxanthine, de la thymidine et 10% de sérum de veau foetal), pulvérisées sur une plaque microtitrée à 96 trous et cultivées à une température de 37'C sous atmosphère de 5% de dioxyde de carbone. Dès le lendemain on procède à la sélection des hybridomes dans un milieu HAT (milieu MEM modifié Dulbecco contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine, de la thymidine et
% de serum de veau foetal).
Dès que les colonies ont atteint une taille suf-
fisante, les hybridomes sont passés au crible selon la
méthode en phase solide. Ensuite, les hybridomes présen-
tant une réation positive sont clones suivant la méthode
de dilution limite.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la
méthode en phase solide est effectuée en faisant en sor-
te qu'un antigène soluble soit adsorbé dans un micro-
puits mou à 96 trous et en traitant les puits avec de
l'albumine de sérum bovin (BSA) pour bloquer les por-
tions sur lesquelles l'antigène n'est pas adsorbé et en
plaçant les surnageants des milieux de la culture ci-
dessus mentionnés dans les puits pour effectuer la
réaction avec l'antigène. Dès que la réaction est ter-
minée, on lave soigneusement les puits et on y ajoute les anticorps contre les anticorps de souris biotinyléés en tant qu'anticorps secondaires. Ensuite on traite les puits à l'aide d'avidine et de biotine marquées à la fluorescéine pour détecter l'anticorps désiré par la
production de fluorescence.
Dans une autre réalisation de l'invention, la méthode de dilution limite est effectuée comme suit: une dispersion de 108 cellules de thymus de souris et 50
cellules d'hybridome dans 10ml d'un milieu HT est pulvé-
risée sur une plaque microtitrée à 96 trous de sorte qu'une cellule d'hybridome ou moins soit présente dans
chaque puits et, partant, de former des colonies indi-
viduelles d'hybridome. Les cellules de thymus de souris sont ajoutées comme cellules nutritives car les cellules d'hybridome ne peuvent croitre à de faibles densités de cellules. r4800 Le procédé de clonage ci-dessus est répété trois
fois ou plus pour obtenir un hybridome monocloné.
Préparation d'un anticorps monoclonal contre la
lactoferrine bovine.
L'hybridome formé de la manière ci-dessus est injecté dans la cavité abdominale de souris et l'on récupère le liquide d'ascite. En variante, on cultive l'hybridome dans un milieu approprié et l'on récupère son surnageant. Le liquide d'ascite ou le surnageant récupéré est ensuite purifié par précipitation avec du sulfate d'ammonium et une chromatographie d'échange d'ions pour obtenir un anticorps monoclonal contre la
lactoferrine bovine.
Selon un mode de réalisation de la présente in-
vention, l'anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine peut être préparé comme suit: les cellules de l'hybridome ci-dessus sont dispersées dans un PBS et injectées dans la cavité abdominale de souris de souche
BALB/C auxquelles on a préalablement administré du pris-
tane (2, 6, 10, 14-tetraméthylpentadécane). Après 7 à 10 jours, on recueille leur liquide d'ascite clarifié par centrifugation dilué avec du PBS de façon à fournir une concentration de protéines de l'ordre de 10 à 12mg/ml, et ensuite on relargue avec du sulfate d'ammonium saturé
à 45%. Une solution de la fraction du précipité résul-
tant est dialysée puis purifiée par chromatographie à
échange d'ions.
Ensuite l'anticorps monoclonal contre la lacto-
ferrine bovine ainsi obtenu peut être utilisé dans la
séparation et la purification de la lactoferrine bovine.
On peut accomplir ceci en préparant une colonne de chro-
matographie d'affinité de l'anticorps selon le procédé décrit ci-après et en faisant passer une solution de lactoferrine bovine brute obtenue à partir du lait de
vache à travers la colonne de chromatographie d'affi-
nité. Préparation d'une colonne de chromatoqraphie d'affinité L'anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine préparé de la manière ci-dessus est mélangé avec des quantités égales d'un support insoluble tel qu'un
support utilisé en chromatographie d'affinité (par exem-
ple, Affigel-10; commercialisé par Bio-Rad Co.) et ce mélange est agité à basse température pour lier et fixer l'anticorps sur le -support. Après lavage, les groupes fonctionnels sur le support duquel l'anticorps précité n'est pas fixé sont inactivés et le support est ensuite lavé. Le gel d'affinité en résultant est tassé dans une colonne de dimension appropriée pour former une colonne
de chromatographie d'affinité.
A cet égard, un support (tel qu'un gel d'affini-
té) sur lequel est fixé un anticorps monoclonal contre
la lactoferrine bovine peut être conservé à une tempéra-
ture de 4'C pendant environ 3 mois ou plus, dans la me-
sure o il demeure dispersé dans un PBS, contenant 0,02%
d'azide de sodium.
Séparation et purification de la lactoferrine bovine Afin de séparer la lactoferrine bovine du lait
de vache et de le purifier à l'aide d'une colonne chro-
matographique d'affinité préparée en fixant un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine sur un support insoluble de la manière ci- dessus, on fait passer une
quantité appropriée d'un échantillon contenant la lacto-
ferrine bovine (tel que du lait de vache) à travers la colonne de chromatographie d'affinité à une température de 50'C ou au dessous, de préférence à la température ambiante. Apres avoir laissé s'écouler la fraction non adsorbée à la colonne, on lave la colonne au moyen d'un o PBS contenant du chlorure de sodium 0,5M puis au moyen d'une solution de chlorure de sodium 0,15M. Ensuite, la lactoferrine bovine adsorbée à la colonne est éluée en la faisant passer à travers une solution d'acétate ayant un pH de 4,7 ou moins, de préférence un pH de 4,3 à 2,7, et contenant du chlorure de sodium O,15M. On neutralise
immédiatement le pH de la fraction de lactoferrine bovi-
ne résultant par addition d'alkali. Le lait brut utilisé pour la séparation de la lactoferrine bovine pourra consister en deux types de lait de vache y compris le colostrum, le lait transitif, le lait normal et le lait tardif. Toutefois le colostrum et le lait tardif sont préférés du point de vue du taux de récupération. De plus, on pourra également récupérer la lactoferrine bovine à partir de lait pasteurisé, de petitlait, de petit-lait pasteurisé et de poudres de lait tels que les concentrés de protéines de petit-lait
(WPC).
Lorsque l'on sépare la lactoferrine bovine du lait de vache et qu'on procède à la purification selon le procédé objet de la présente invention en utilisant une colonne de chromatographie d'affinité sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, il sera possible de supprimer tous les
prétraitements nécessaires dans les méthodes tradi-
tionnelles y compris la séparation de la caséine avec un acide, le relarguage au sulfate d'ammonium, la dialyse
et la lyophilisation. En outre, dans les méthodes clas-
siques, le lait brut soumis aux prétraitements mention-
nés ci-dessus doit être passé plusieurs fois à travers une résine échangeuse d'ions. Dans la méthode suivant la
présente invention, toutefois, la lactoferrine peut fa-
cilement être séparée des autres constituants du lait en faisant passer le lait de vache à travers une colonne de
chromatographie d'affinité et ce une fois seulement.
De plus, une colonne de chromatographie d'affi-
nité sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal con-
tre la lactoferrine bovine est utile dans la séparation de la lactoferrine bovine seule, et ne possède aucune d4 affinité pour les lactoferrines dérivées du lait de mammifères de différentes espèces, par exemple, la lactoferrine humaine. En d'autres termes, la spécificité de telles colonnes de chromatographie d'affinité est si élevée qu'une colonne chromatographique d'affinité sur laquelle est fixée un anticorps monoclonal contre la lactoferrine humaine est efficace dans la séparation de
la lactoferrine humaine seule et une colonne chromato-
graphique d'affinité sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est efficace
dans la séparation de la lactoferrine bovine seule.
En outre, les méthodes classiques produisent de la lactoferrine dont la pureté maximum est aux alentours
de 66%, et sa récupération est de l'ordre de 60%. Sui-
vant le procédé de la présente invention, toutefois, une forme extrêmement pure de lactoferrine bovine ayant une pureté de 98% ou plus peut être obtenue par un seul passage à travers une colonne et avec une récupération
élevée de 80% minimum, voire 90%.
La pureté et la récupération de la lactoferrine
bovine mentionnée ici ont été estimées selon les procé-
ssus suivants.
L'électrophorèse au dodécylsulfate de sodium (SDS) de la fraction de lactoferrine bovine récupérée a donné une bande parfaite unique. Toutefois, à partir de cette analyse électrophorétique on ne peut conclure que
la pureté de la lactoferrine est de 100%, car la lacto-
péroxydase a sensiblement le même poids moléculaire (environ 80 OOO) que la lactoferrine présente dans le lait de vache. Séparément, un test de diffusion double immunologique entre le sérum anti-lactopéroxydase et la fraction de lactoferrine bovine a révélé qu'aucune ligne de précipitine ne s'était formée. Ainsi la teneur en lactopéroxydase qui peut être présente dans la fraction
de lactoferrine bovine peut être estimée comme ne dé-
passant pas O,01%. Ceci en raison du- fait que la
257?4800
fraction de lactoferrine bovine peut contenir 0,01% ou plus de lactopéroxydase pour former une telle ligne de précipitine.
En conséquence, à la lumière des résultats obte-
nus par l'électrophorèse SDS mentionnée ci-dessus, le test de diffusion double immunologique, et la mesure de
la concentration en protéines de la fraction de lacto-
ferrine bovine, la pureté de la lactoferrine bovine obtenue par le procédé objet de la présente invention a
été jugée comme atteignant 98% ou plus.
Quant à la récupération, un test de double diffusion immunologique entre le sérum de lactoferrine
anti-bovine et la fraction non adsorbée a révélé qu'au-
cune ligne de précipitine ne s'était formée. Ainsi la
teneur en lactoferrine bovine résiduelle dans la frac-
tion non adsorbée peut être jugée comme ne dépassant pas 0,01%. Ceci en raison du fait que la fraction non
adsorbée doit contenir 0,01% ou plus de lactoferrine bo-
vine pour former-une telle ligne de précipitine.
En conséquence, sur la base des résultats obte-
nus par le test de double diffusion immunologique men-
tionné ci-dessus et les mesures de concentration en pro-
téines, la récupération de lactoferrine bovine dans le procédé selon la présente invention peut être jugée comme atteignant au minimum 80% ou plus, voire 90% ou plus. La lactoferrine séparée et purifiée selon le procédé de la présente invention offre les avantages suivants. Comme indiqué ci-dessus la lactoferrine possède
l'effet physiologique d'exercer une forte action inhi-
bitrice vis-à-vis de la croissance sur les bactéries pathogènes nécessitant du fer en raison de sa capacité à fixer le fer. En conséquence afin de profiter de son effet physiologique, la lactoferrine récupérée ne doit pas être saturée en fer mais doit conserver sa capacité de fixation du fer. Toutefois, la lactoferrine récupérée par les procédés classiques peut parfois être une lactoferrine liée au fer prenant une couleur rose (voir brevet japonais n 28233/'83). Dans un tel cas, l'effet physiologique décrit ci-dessus ne peut être prévu sauf lorsque la lactoferrine est traitée au moyen d'un agent
de chélation du fer (tel que EDTA) (acide éthylène-dia-
mine-tétracétique) pour la débarasser du fer.
En revanche, la lactoferrine séparée et purifiée par le procédé objet de la présente invention conserve
parfaitement sa capacité inhérente de fixation du fer.
Soit dit accessoirement, les capacités de fixa-
tion du fer des échantillons de lactoferrine bovine obtenus selon le procédé de la présente invention furent déterminées suivant le processus de Suzuki, Nonaka et
col. ("Eiyo-to-Shokuryo", vol. 31, N' 4, 395-403, 1978).
L'examen des capacités de fixation du fer des échantil-
lons a donné des résultats de l'ordre de 2a4 à 3,7 mg
par gramme de lactoferrine, attestant ainsi que la lac-
toferrine bovine obtenue par le procédé objet de la pré-
sente invention conserve parfaitement sa capacité inhé-
rente de fixation du fer.
En conséquence, la lactoferrine bovine obtenue par le procédé selon la présente invention peut être utilisée à titre préventif pour protéger les nourrissons
contre les infections provoquées par des-bactéries pa-
thogènes nécessitant du fer et comme remède face à di-
vers symptômes relevant de telles bactéries pathogènes et, en outre, elle peut également être ajoutée à la poudre de lait pour l'alimentation des nourrissons en vue d'approcher la composition protéique de celle du
lait maternel et d'augmenter la capacité anti-infec-
tieuse du lait en poudre.
Il est par ailleurs connu, que les lactoferrines bovines et humaines peuvent agir comme facteurs de croissance pour des types spécifiques de cellules (Biochim. Biophys. Acta, 763, 377, 1983). Tandis que l'effet de stimulation de croissance de la lactoferrine humaine ne se constate que sur les lymphocytes humains B et T, la lactoferrine bovine exerce un effet stimulateur de croissance non seulement sur ces cellules mais égale-
ment sur les lymphocytes de la souris. Pour cette rai-
son, la lactoferrine bovine permet de réaliser une culture de cellules efficace pour de telles cellules en
l'ajoutant au milieu de culture.
La présente invention est par ailleurs illustrée à l'aide des exemples suivants. Toutefois, ces exemples ne devront pas être interprétés comme limitant la portée de l'invention
EXEMPLE 1
Formation d'un hybridome capable de produire un
anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine.
La lactoferrine bovine (pure à 60%) qui avait
été obtenue selon le processus d'échange d'ions classi-
que est dissoute dans une solution saline tampon au phosphate (PBS), pH 7, 2 contenant du chlorure de sodium 0,15M afin de donner une concentration de 0,3%. Cette solution est mélangée dans des proportions égales à de
l'adjuvant complet de Freund (commercialisé par la so-
ciété Difco) pour former une émulsion.
* Une souris de souche BALB/C, âgée de 6 à 8 semaines est immunisée par injection de l'émulsion dans sa cavité abdominale. Cette immunisation est répétée trois fois à des intervalles de deux semaines. Six jours après la dernière immunisation, la rate de la souris est excisée et les cellules de la rate sont recueillies. Ces cellules de la rate sont dispersées dans un DMEM (Milieu essentiel minimum modidifié Dulbecco) et mélangées à des cellules de myelome de souris SP2/O-Ag14 à un taux de 2/1. A ce mélange on ajoute une solution de 50% de polyéthylèneglycol (qualité pour chromatographie gazeuse P. M. 4000 Merck & Co., Inc.) en tant que stimulateur de fusion. Ainsi la fusion des cellules est réalisée en 10 minutes. Les cellules fusionnées en résultant sont séparées du polyéthylèneglycol par centrifugation, dispersées dans un milieu HT afin de donner une densité de cellules de 1XlO7 cellules/ml ou moins,pulvérisées sur des plaques microtitrées à 96 trous, et cultivées à
37C sous une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone.
Dès le lendemain de la mise en route de la culture (désigné comme étant le premier jour), on procède au remplacement continu de la moitié du milieu par un milieu HAT. Le 17-è jour, les hybridomessont passés au "crible" selon le procédé en phase solide. Comme résultat, on peut constater que 99% des hybridomes forment une colonie, tandis que 8,3% des hybridomes présentent une réaction positive à la lactoferrine bovine. Ainsi, les hybridomes présentant une réaction positive sont transférés sur des plaques microtitrées à 24 trous, conservés en culture dans un milieu HT et clones dès qu'ils atteignent une densité de cellules de IX105 cellules par ml. Ensuite, ils sont cultivés dans un milieu HT pendant deux semaines et les hybridomes formant une colonie unique dans le puits sont soumis à
un deuxième clonage.
Ce processus de clonage et de "criblage" est répété trois fois. Ainsi, on obtient des monoclones d'un hybridome capables de produire un anticorps contre la
lactoferrine bovine.
Une souche de l'hybridome résultant capable de produire un anticorps monoclonal contre la'lactoferrine bovine est conservée à American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776 EUA
sous le numéro de dépôt ATCC HB 8852.
Préparation d'un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine Les cellules de l'hybridome ci-dessus capables 16 '
de produire un anticorps monoclonal contre la lactofer-
rine bovine sont dispersées dans une solution PBS afin de fournir une dose de 107 cellules/O,5 ml pour chaque souris, et injectées dans la cavité abdominale de 18 souris de souche BALB/C auxquelles on a administré préa-
lablement du pristane (2, 6, 10, 14-tétraméthylpentadé-
cane). Sept à dix jours après l'injection mentionnée ci-dessus, 86ml de liquide d'ascite sont recueillis, clarifiés par centrifugation, dilués au PBS afin de donner une concentration en protéines de 10 à 12mg/ml, puis relargués à l'aide de sulfate d'ammonium à 45% de saturation. La fraction de précipité résultante est dissoute dans une solution tampon de tris 0, 02M, pH 7,9, contenant 0,04M de chlorure de sodium et cette solution est dialysée pendant la nuit à basse température sur la même solution tampon. En utilisant une colonne (2cm de
diamètre et 80cm de longueur) garnie de 200ml de cellu-
lose DEAE (DE-52; Whatman Co.), le produit retenu étant soumis à une chromatographie par échange d'ions dans laquelle un gradient de force ionique est établi avec des solutions tampons tris 0,02M, pH 7,9, contenant du chlorure de sodium 0,04M à 15M. Ainsi, une fraction éluée à une concentration de chlorure de sodium de 0,04M
est récupérée. Cette fraction est ultérieurement préci-
pitée à l'aide de sulfate d'ammonium à 50% de saturation et le précipité ainsi formé est dissout dans de l'eau désionisée. Cette solution est dialysée puis lyophilisée pour obtenir 364mg d'un anticorps monoclonal contre la
lactoferrine bovine.
Un test immuno-enzymatique en phase hétérogène (principe ELISA "EnzineLinked Immunosorbent Assay) a
révélé que l'anticorps était du type IgG.
Préparation d'une colonne de chromatoaraDhie d'affinité -30 mg/ml, de préférence 20 mg/ml ou plus, de l'anticorps monoclonal purifié contre la lactoferrine bovine obtenue de la manière ci-dessus sont mélangés
dans des proportions égales à un support pour utilisa-
tion dans la chromatographie d'affinité (Affigel-10) et ce mélange est agité pendant la nuit à basse température pour lier l'anticorps sur le support. Après avoir lavé plusieurs fois avec la solution tampon au bicarbonate de sodium O,1M, pH 8,0, contenant du chlorure de sodium 0,15M, le support est mélangé avec une quantité égale
d'éthanolamine 0,1M ajusté à un pH de 8,0 avec de l'aci-
de chlorhydrique, et ce mélange est agité doucement à température ambiante pendant une heure pour inactiver
les groupes fonctionnels sur le support auquel l'anti-
corps monoclonal contre la lactoferrine bovine n'avait
pas été adsorbé. Ensuite le support est lavé soigneuse-
ment avec un PBS, contenant du chlorure de sodium 0,15M puis tassé dans une colonne de dimension appropriée pour
former une colonne de chromatographie d'affinité.
Séparation et purification de la lactoferrine bovine
2m1 du gel d'affinité formé de la manière ci-
dessus sur lequel est fixé un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est tassé dans une colonne
ayant un diamètre interne de 13mm. L'anticorps mono-
clonal contre la lactoferrine bovine est fixé dans les proportions de 4, 7mg par ml de gel d'affinité. Après
avoir entièrement lavé au PBS le gel d'affinité à l'in-
térieur de la colonne mentionnée ci-dessus, on fait pas-
ser une solution de 5,5mg de lactoferrine bovine brute (pure à 60%) dans 1 ml de PBS à travers la colonne à un
débit de 2,5 ml/mn.
Ensuite, le gel d'affinité à l'intérieur de la colonne est lavé au PBS pour enlever la fraction non adsorbée. On peut alors constater un pique correspondant aux impuretés présentes dans la solution échantillon et la teneur en protéines de cette fraction s'élève à
2S74800
1,7mg. Ultérieurement, après avoir soigneusement lavé le
gel d'affinité mentionné ci-dessus avec un PBS, conte-
nant du chlorure de sodium O,5M puis avec une solution
de chlorure de sodium O,15M, la lactoferrine bovine ad-
sorbée est éluée avec une solution tampon d'acétate, pH
2,7, contenant du chlorure de sodium 0,15M. Cette sé-
quence d'opérations est effectuée à température ambian-
te. La fraction d'éluat résultant est ajustée à pH 7, dialysée contre l'eau désionisée puis lyophilisée pour obtenir 3,4mg de lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine ainsi obtenue a une pureté de 98% ou plus et une capacité de fixation du fer de 3,7 mg/g. Sa récupération est de 92%. Ainsi comme illustré par cet exemple, la colonne de chromatographie d'affinité utilisée dans la présente invention permet de récupérer la lactoferrine à un rendement élevé sans provoquer de réduction dans la
pureté ou dans la capacité de fixation du fer.
EXEMPLE 2
Le gel d'affinité à l'intérieur de la colonne utilisée dans l'exemple 1 est lavé entièrement d'abord avec un PBS, contenant du chlorure de sodium 0,5M puis un PBS contenant du chlorure de sodium 0,15M. (Ainsi, la même colonne est utilisée à plusieurs reprises dans cet exemple ainsi que dans les exemples suivants). Ensuite
on fait passer 19ml de colostrum écrémé de vache à tra-
vers la colonne de la même manière que cela est décrit
dans l'exemple 1.
Dans ce cas, toutefois, l'élution est effectuée à l'aide de solution tampon à acétate O,001M, pH 4,3, contenant du chlorure de sodium 0,15M. On peut ainsi obtenir une fraction adsorbée sur gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La fraction adsorbée est traitée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 1
afin de récupérer 4,Omg de lactoferrine bovine. La lac-
toferrine bovine récupérée a une pureté de 98% ou supé-
rieure et sa capacité de fixation du fer est de 2,7mg/g.
EXEMPLE 3
Après avoir soigneusement lavé la colonne utili-
sée de la même manière que cela est décrit dans l'exem-
ple 2, on fait passer 25ml de lait écrémé de vache à travers la colonne de la même manière que cela est dé-
crit dans l'exemple 1.
A cette occasion, on obtient une fraction adsor-
bée au gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La fraction adsorbée est traitée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 1 pour récupérer 3,0mg de lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine récupérée a
une pureté de 98% ou supérieure et sa capacité de fixa-
tion du fer est de 2,5mg/g.
EXEMPLE 4
Après avoir soigneusement nettoyé la colonne utilisée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 2, on fait passer 25ml de lait de vache écrémé et pasteurisé à travers la colonne de la même manière
que cela est décrit dans l'exemple 1.
A cette occasion, on obtient une fraction adsor-
bée au gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La
fraction adsorbée est traitée de la même manière que ce-
la est décrit dans l'exemple 1 pour récupérer 1,6mg de lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine récupérée a
une pureté de 98% ou supérieure et sa capacité de fixa-
tion du fer est de 2,4mg/g.
EXEMPLE 5
Après avoir soigneusement nettoyé la colonne utilisée de la même manière que cela est décrit dans
l'exemple 2, on fait passer 10Oml de petit-lait de fro-
mage à travers la colonne de la même manière que cela
est décrit dans l'exemple 1.
A cette occasion, on obtient une fraction adsor-
bée sur gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La fraction adsorbée est traitée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 1 pour récupérer 2,4mg de lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine récupérée a une pureté de 98% ou supérieure et sa capacité de
fixation du fer est de 2,8mg/g.
EXEMPLE 6
Après avoir soigneusement lavé la colonne utili-
sée de la même manière que cela est décrit dans l'exem-
ple 2, on fait passer 100ml de petit lait de fromage pasteurisé à travers la colonne de la même manière que
cela est décrit dans l'exemple 1.
A cette occasion, on obtient une fraction adsor-
bée sur gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La fraction adsorbée est traitée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 1 pour récupérer 2,2mg de lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine récupérée a
une pureté de 98% ou supérieure et sa capacité de fixa-
tion du fer est de 3,2mg/g.
EXEMPLE 7
Après avoir soigneusement lavé la colonne utili-
sée de la même manière que cela est décrit dans l'exem-
ple 2, on fait passer 100ml de solution aqueuse à 1% de WPC à travers la colonne de la même manière que cela est
décrit dans l'exemple 1.
A cette occasion, on obtient une fraction adsor-
bée sur gel d'affinité et une fraction non adsorbée. La fraction adsorbée est traitée de la même manière que cela est décrit dans l'exemple 1 pour récupérer O,2mg de
lactoferrine bovine. La lactoferrine bovine ainsi récu-
pérée a une pureté de 98% ou plus et sa capacité de fix-
ation du fer est de 3,Omg/g.
Claims (5)
1. Procédé pour la séparation d'une forme ex-
trémement pure de lactoferrine bovine à partir de lait de vache et de purification de celle-ci qui comporte les étapes consistant à:
- préparer une colonne de chromatographie d'af-
finité en fixant un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine sur un support insoluble; - faire passer du lait de vache ou une solution de lactoferrine bovine dérivée du lait de vache à travers la colonne de chromatographie d'affinité; et - éluer ensuite la lactoferrine bovine adsorbée
sur la colonne de chromatographie d'affinité.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est produit par un hybridome obtenu par la fusion de lymphocytes de rate d'une souris immunisée contre la lactoferrine bovine avec des cellules du myelome de
souris.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, cara-
ctérisé en ce que la colonne chromatographique d'affini-
té est préparée en fixant un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine sur un support consistant en un
gel d'affinité.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal a été produit par
l'hybridome déposé sous le n' ATCC HB 8852.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à
4, caractérisé en ce que la lactoferrine bovine adsorbée sur la colonne de chromatographie d'affinité est éluée à un pH de 4,7 ou moins et de préférence à un pH de 4,3 à 2,7, et, en ce que le pH de la fraction de lactoferrine
bovine éluée est immédiatement ramené à la neutralité.
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