FR2541285A1 - - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'ERYTHROPOIETINE. CE PROCEDE COMPREND LA MISE EN CONTACT D'UNE MATIERE CONTENANT DE L'ERYTHROPOIETINE AVEC UN ADSORBANT AYANT UN ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-ERYTHROPOIETINE, L'ADSORPTION DE L'ERYTHROPOIETINE SUR L'ADSORBANT ET L'ELUTION DE L'ERYTHROPOIETINE ADSORBEE DE L'ADSORBANT.

Description

PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'ERYTHROPOIETINE

La présente invention concerne un procédé pour

la production d'érythropolétine.

Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour produire de l'érythropoiétine très pure par récolte efficace de l'érythropolétine à partir d'une

matière en contenant selon une technique de chromatogra-

phie d'affinité dans laquelle on utilise un adsorbant

ayant un anticorps monoclonal anti-érythropoiétine.

L'érythropoiétine (qu'on désigne ci-après par l'abréviation EPO) est un facteur connu d'accélération de la formation des érythrocytes et l'EPO est un type

d'hormones agissant sur les cellules de la lignée éry-

throcytaire dans la moëlle osseu se pour accélérer leur différenciation en cellules érythrocytaires Bien que la structure chimique de l"EPO n'ait pas été totalement élucidée, on sait que l'EPO est une glycoprotéine acide ayant un poids moléculaire de 30 000 à 40 000 produite essentiellement dans le rein et qu'on peut utiliser de

façon générale comme médicament pour les malades anémi-

ques, les opérés et les malades subissant une hémodialy-

se après ablation d'un rein.

Normalement, la formation d'EPO dans l'organisme vivant est influencée par l'équilibre entre le besoin d'oxygène et la fourniture d'oxygène dans l'organisme

vivant et, par conséquent, la formation d'EPO est accé-

lérée lorsque l'organisme est en hypoxie, tandis qu'au

contraire, la formation d'EPO est réduite lorsque l'or-

ganisme -est en état d'hyperoxie Par exemple, chez un sujet anémique, la formation d'EPO est accélérée et, par

conséquent, de l'EPO est excrétée dans ses urines.

A ce jour, on connait un procédé d'isolement d'EPO ayant une activité stabilisée à partir de l'urine humaine contenant de l'E Po (voir le brevet US

n' 3 865 801) dans lequel on utilise comme liquide d'o-

rigine une solution d'EPO brute dans une solution saline de tampon phosphaté, on ajoute du p-aminosalicylate de sodium à la solution, on extrait la solution avec du phénol et on dialyse l'extrait contre la solution saline

de tampon phosphaté, puis on recueille l'EPO du dialy-

sat.

Cependant, comme la teneur en EPO de l'urine hu-

maine ordinaire est extrêmement faible, de l'ordre d'en-

viron 0,01 à 0,02 X du poids des protéines totales de l'urine, il est difficile de produire de façon efficace

de l'EPO selon le procédé connu précité et en particu-

lier ce procédé ne convient pas pour la production d'EPO utile comme médicament A cet égard, actuellement, l'EPO

n'est produit que comme réactif chimique.

La Demanderesse a effectué des études pour re-

cueillir de façon efficace de l'EPO très pure à partir de diverses matières contenant de l'EPO et est parvenue

à recueillir de façon efficace de l'EPO très pure à par-

tir d'une matière contenant de l'EPO selon une technique de chromatographie sur colonne utilisant un adsorbant ayant un anticorps monoclonal anti-EPO, ce qui constitue l'invention. Le but principal de l'invention est de fournir un procédé pour séparer de façon efficace l'EPO d'une matière en contenant et d'obtenir une préparation très

purifiée d'EPO D'autres buts de l'invention apparai-

tront à la lecture de la description qui suit.

L'expression "matière contenant de l'EPO" men-

tionnée ici désigne l'urine des sujets normaux, l'urine des sujets anémiques, l'érythropoiétine urinaire brute qui en dérive, le liquide surnageant de la culture de cellules productrices d'EPO, l'humeur de l'organisme

d'un animal auquel on a transplanté des cellules produc-

trices d'EPO, l'extrait tissulaire liquide de cet animal

ayant subi une transplantation et son urine.

La description qui suit concerne principalement

le cas o on utilise comme matière contenant de l'EPO de :3 l'urine de sujets anémiques mais il convient cependant de noter que la source d'EPO selon l'invention n'est pas

limtée à cette urine.

Le procédé de l'invention pour produire de l'é-

rythropolétine très pure à partir d'une matière conte- nant de l'érythropoiétine est caractérisé en ce qu'il comprend: la mise en contact de ladite matière contenant

de l'érythropoiétine avec un adsorbant ayant un anti-

corps monoclonal anti-érythropolétine, ledit anticorps monoclonal anti érythropoiétine étant préparé à partir

d'un hybridome obtenu par fusion cellulaire d'une cellu-

le de myélome et d'une cellule splénique d'un animal expérimental immunisé par l'érythropoiétine

l'adsorption de ladite érythropoiétine sur le-

dit anticorps monoclonal anti-érythropolétine dans ledit adsorbant

l'élution de ladite érythropolétine dudit ad-

sorbant; et la récolte de l'érythropoiétine éluée L'anticorps monoclonal anti-érythropoiétine

(qu'on appelle ci-après anticorps monoclonal) qu'on uti-

lise pour le fixer à l'adsorbant dans l'invention est produit à partir de cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire de cellule(s) cultivées) de myélome et de cellule(s) de la rate d'un animal expérimental, tel que la souris ou le rat, que l'on a immunisé par

administration, comme antigène d'EPO recueillie à par-

tir de l'urine d'un sujet anémique et purifiée On ef-

fectue de préférence la fusion cellulaire entre les

cellules d 'un ou plusieurs animaux de la même espèce.

Les cellules spléniques utilisées ici (principalement des cellules B) ont été obtenues à partir de la rate d'un animal expérimental, tel qu'une souris, environ trois jours après la dernière immunisation de cet animal par injection intrapéritonéale d'une émulsion préparée par dissolution de l'EPO purifiée dans une solution saline aqueuse de tampon phosphaté (PBS) et mélange d'adjuvant de Freund à la solution De plus, lors de l'immunisation de l'animal, il est préférable de répéter l'injection à intervalles réguliers, par exemple de deux semaines, pour provoquer une immunisation suffisante.

Les cellules de myélome utilisées dans l'inven-

tion correspondent à un type de cellules de tumeurs ma-

lignes ayant une vitesse de multiplication élevée Par exemple, on utilise comme cellules de myélome de souris, les souches P 3-X 63-Aga, P 3-NSI/1Ag 4-1, X 63-Ag 8 653 et

similaires après multiplication par culture.

On peut effectuer la fusion cellulaire d'une ou

plusieurs cellules de la rate et d'une ou plusieurs cel-

lules de myélome selon le procédé ponnu suivant.

On découpe le tissu splénique en petits morceaux dans un mélange de sérum foetal de veau (qu'on appelle ci-après FCS) et de milieu de culture synthétique RPMI 1 640 (qu'on appelle ci-après milieu RPMI 1 640) avec

addition de 100 U/ml de pénicilline, 100 pg/ml de strep-

tomycine, 2 m M de glutamine et 1 m M d'acide pyruvique puis on sépare ou on perfuse en cellules isolées On disperse les cellules isolées dans le milieu RPMI 1 640

et on mélange les cellules de myélome avec la disper-

sion Après centrifugation du mélange, on décante le liquide surnageant et on ajoute au mélange des'-"cellules

une solution aqueuse à 50 X en poids de polyéthylène-

glycol 1 500 comme inducteur de la fusion afin d'effec-

tuer la fusion cellulaire.

Dans le stade suivant, on sélectionne les cel-

lules d'hybridome dans le mélange de cellules soumises à

la fusion cellulaire selon la technique connue de sélec-

tion sur milieu HAT On peut effectuer la sélection sur

milieu RAT en utilisant une plaque de microtitration.

Par exemple, on répartit le mélange des cellules soumi-

ses à la fusion cellulaire sur une plaque de microtitra-

tion comportant 96 godets et on cultive dans un milieu de culture HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine) pendant environ 2 semaines On détermine les godets dans lesquels les cellules soumises à la fusion cellulaire prolifèrent sans extinction et on recueille les cellules d'hydridome de ces godets. La méthode de sélection des cellules capables de produire l'anticorps monoclonal anti-EPO à partir des

cellules d'hybridome est la suivante.

On examine les cellules d'hybridome pour confir-

mer selon la méthode en phase solide qu'elles produisent

bien un anticorps anti-EPO et on transplante ces cellu-

les d'hybridome dans la cavité abdominale d'une souris pour produire un liquide d'ascite dont on recueille les

protéines selon une méthode-connue telle que le frac-

tionnement avec du sulfate d'ammonium Les protéines

recueillies sont constituées principalement d'une immu-

noglobuline (Ig G) On fixe les protéines contenant principalement de l'Ig G, constituant un anticorps, à un adsorbant tel que l'AFFI-GEL (fabriqué par Bio-Rad Co) ou le SEPHADEX {fabriqué par FARMACIA Co) pour obtenir un adsorbant portant un anticorps On garnit une colonne

de l'adsorbant auquel l'anticorps est fixé puis en fai-

sant passer une préparation témoin d'EPO à travers la

colonne préparée on détermine si elle est capable d'ad-

sorber l'EPO afin de savoir si les cellules d'hybridome obtenues sont ou non capables de produire l'anticorps anti-EPO On soumet ensuite les cellules d'hybridome produisant l'anticorps anti-EPO à un monoclonage selon les méthodes bien connues de dilution limitante et on détermine si les cellules d'hybridome monoclonales sont

capables de produire de façon stable l'anticorps mono-

clonal, selon la méthode en phase solide et la méthode d'adsorption dans laquelle on utilise la colonne ayant

adsorbé l'anticorps pour examiner la capacité d'adsorp-

tion de l'EPO On peut obtenir à tout moment l'anticorps nécessaire par décongélation des cellules congelées, culture des cellules et transplantation des cellules dans la cavité abdominale d'une souris car les cellules d'hybridome obtenues peuvent être conservées à l'état congelé. L'anticorps monoclonal anti-EPO produit par transplantation des cellules monoclonales capables de produire l'anticorps anti-EPO dans la cavité abdominale d'une souris selon les techniques mentionnées ci-dessus est purifié puis l'anticorps monoclonal anti-EPO purifié est fixé à un adsorbant tel que l'AFFI-GEL ou le SEPHADEX pour préparer un adsorbant spécifique auquel

l'anticorps a été fixé L'adsorbant spécifique est uti-

lisé pour adsorber 1 'EPO de matières contenant de l'EPO

pour obtenir de l'EPO.

Dans l'invention, on recueille l'EPO à partir de

matières contenant de 1 EPO selon une technique de chro-

matographie sur un immunoadsorbant en utilisant une co-

lonne garnie de l'adsorbant spécifique auquel l'anti-

corps monoclonal anti-EPO a été fixé comme décrit

ci-dessus Comme matière contenant de l'EPO qu'on utili-

se comme matière de départ dans le procédé de l'inven-

tion, on a précédemment mentionné l'urine d'un sujet

anémique, l'urine d'un sujet normal, le surnageant ob-

tenu à partir de la culture de cellules productrices d'EPO, l'humeur de l'organisme d'un animal auquel on a transplanté des cellules productrices d'EPO, l'extrait

liquide des tissus de cet animal et son urine.

Pour traiter ces matières contenant de 1 EPO avec l'adsorbant auquel l'anticorps monoclonal anti-EPO est fixé, dans le cas o on utilise une urine, telle que l'urine d'un sujet anémique, on la filtre, on concentre

le filtrat puis on le soumet à un traitement de dessale-

ment ou un-traitement avec du dodécylsulfate de sodium <SDS) et on applique l'échantillon traité à l'adsorbant de la colonne De plus, pour inactiver les protéases de l'urine, on peut traiter l'urine avec du phénol ou la

chauffer avant de l'appliquer à l'adsorbant de la colon-

ne.

On fait passer la matière contenant l'EPO pré-

traitée comme indiqué ci-dessus à travers la colonne garnie del'adsorbant auquel on a fixé l'anticorps mono-

clonal -anti-EPO selon l'invention, si bien que l'anti-

corps adsorbe sélectivement l'EPO Par conséquent, il n'est pas nécessaire de répéter le stade de passage et on élue l'EPO adsorbée sur l'adsorbant par passage d'une solution d'élution, telle qu'un mélange d'acide acétique aqueux 0,2 M et d'une solution de chlorure de sodium

aqueux 0,15 M, à travers la colonne puis on peut re-

cueillir de façon efficace l'éluat constitué d'EPO très pure.

Après élution de l'EPO, on peut traiter l'ad-

sorbant de la colonne pour le régénérer et l adsorbant

régénéré peut être réutilisé environ dix fois Le trai-

tement de régénération de l'adsorbant utilisé est ef-

fectué par passage d'une solution, telle qu'un mélange d'une solution d'acide acétique, et d'une solution

aqueuse de chlorure de sodium, à travers la colonne gar-

nie de l'adsorbant à régénérer,

La pureté de l'EPO obtenue selon les modes opé-

ratoires mentionnés ci-dessus peut être évaluée par me-

sure de l'activité de l'EPO <unité) de la protéine de l'éluat L'activité de l'EPO est mesurée selon l'une des méthodes bien connues telles que la méthode des colonies

par observation de la morphologie des colonies d'éry-

throcytes, la méthode à la H-thymidine par examen de la fixation de la Hthymidine par l'ADN des colonies et la méthode au 5 Fe par examen du taux de fixation du 9 Fe à l'hème des colonies De plus, comme substance standard

de mesure de l'EPO, on peut utiliser l'EPO (Erythropoie-

tin Step 3, fabriqué par Connort Co, Canada) à partir

de sérum prélevé à un mouton anémique traité par la-phé-

nylhydrazine. a

Comme décrit, selon l'invention, on peut prépa-

rer de façon efficace de l'EPO très pure à partir de matières contenant une très petite quantité d'EPO De plus, l'anticorps que l'on fixe à l'adsorbant utilisé selon l'invention est un anticorps monoclonal et par conséquent on peut obtenir l'anticorps ayant la même propriété De plus, comme on peut obtenir l'anticorps sous une forme stable, la présente invention permet de

façon pratique la -préparation d'érythropolétine puri-

fiée. L'invention est illustrée plus concrètement par

les exemples non limitatifs suivants.

Exemple 1

I Préparation d'anticorps monoclon al anti-EPO 1 Préparation-d'EPO pour l'utilisation comme antigène pour la production de l'anticorps monoclonal anti-EPO On fait passer 600 1 d'urine de sujets anémiques à travers un appareil-d'ultrafiltration pour éliminer les substances de bas poids moléculaire jusqu'à un poids

moléculaire de 10 000 puis on concentre l'urine obtenue.

On dilue l'urine concentrée avec une quantité appropriée d'eau et on concentre le mélange de la même façon que ci-dessus pour le dessaler On soumet 20 1 de l'urine concentrée obtenue à une lyophilisation pour obtenir 31,0 g de protéines urinaires totales sous forme d'une poudre ayant une activité d'EPO de 1 800 000 unités/ 31,0 g (l'activité de l'EPO est déterminée ci-après avec

le coffret de dosage des protéines de Biô-Rad Co).

On purifie la poudre de protéines urinaires to-

tales obtenues par chromatographie sur colonne et élec-

trophorèse en présence de SDS comme indiqué ci-dessous.

Premier stade de chromatographie sur colonne

On dissout la poudre obtenue de protéines uri-

3 naires totales dans une solution tamponnée 5 m M de Tris-acide chlorhydrique (p H 6,8) et on fait passer la solution de la poudre à travers une colonne garnie de DEAE-cellulose (diéthylaminoéthylcellulose) que l'on a préalablement équilibrée avec une solution tamponnée m M de Tris-acide chlorhydrique (p H 6,8) Les protéines urinaires de la solution d'urine sont adsorbées sur la colonne et on élue les protéines urinaires adsorbées

avec une solution tamponnée 5 m M de Tris-acide chlorhy-

drique contenant 200 m M de chlorure de sodium (p H 6,8)

pour obtenir une fraction présentant une activité d'EPO.

La fraction contient 16,0 g de protéines et l'activité

spécifique de la fraction est de 99 unités/mg de pro-

téines. Deuième stade de chromat Qgra Qhie sur colonne On soumet la fraction présentant une activité d'EPO obtenue dans le premier stade à une dialyse contre de l'eau et on lyophilise le dialysat pour obtenir une matière en poudre Après dissolution de la matière en poudre obtenue dans une solution tamponnée 10 m M en phosphate de sodium (p H 6,8) et du chlorure de sodium 4 M, on fait passer la solution de la matière en poudre à travers une colonne garnie de Phényl-Sepharose CL-48 que l'on a préalablement équilibrée avec une solution tamponnée (p H 6,8) contenant du phosphate de sodium m M et du chlorure de sodium 4 M pour y adsorber les protéines On lave les protéines adsorbées avec une solution tamponnée (p H 7,1), du phosphate de sodium m M et du chlorure de sodium 0,5 M puis on élue avec un mélange constitué d'une solution aqueuse d'hydroxyde

de sodium 10 m M d'une solution aqueuse à 20 % d'éthy-

lèneglycol et d'une solution aqueuse 6 M de chlorhydrate de guanidine pour obtenir une fraction présentant une activité d'EPO La fraction contient 2,3 g de protéines et l'activité spécifique d'EPO de la fraction est de

421 unités/mg de protéines.

Troisième stade de chromatographie sur colonne On soumet la fraction présentant une activité d'EPO obtenue dans le second stade à une dialyse contre de l'eau puis on obtient la matière en poudre à partir

du dialysat de la fraction par lyophilisation On dis-

sout la matière en poudre obtenue dans une solution tamponnée de phosphate de sodium 5 m M (p H 6,9) et on dialyse la solution de la matière en poudre contre la même solution tamponnée On fait passer le dialysat obtenu à travers une colonne garnie d'hydroxy-apatite que l'on a équilibrée avec une solution tamponnée de phosphate de sodium 5 m M (p H 6,9) pour obtenir une fraction non adsorbée La fraction obtenue contient 672 mg de protéines et l'activité spécifique d'EPO est

de 1 240 unités/mg de protéines.

Quatrième stade de chromatographie sur colonne

On dialyse contre de l'eau la fraction présen-

tant une activité d'EPO obtenue dans le troisième stade, c'est-à-dire la fraction non adsorbée, et on lyophilise le dialysat pour obtenir une matière en poudre Après dissolution de la matière en poudre obtenue dans une solution tamponnée constituée d'une solution aqueuse de phosphate de sodium 10 m M (p H 6,9) et d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 150 m M, on fait passer la solution préparée à travers une colonne garnie de

Sephadex G 100 que l'on a équilibrée avec la même solu-

tion tamponnée que ci-dessus pour effectuer le fraction-

nement selon les différents poids moléculaires des

substances dissoutes puis on obtient une fraction-pré-

sentant une activité d'EPO La quantité de protéines

contenue dans la fraction obtenue est de 83 mg et l'ac-

tivité spécifique d'EPO de la fraction est de 3 000 uni-

tés/mg de protéines.

Cinauième stade de chromatoaraphie sur colonne Après avoir soumis la fraction présentant une activité d'EPO obtenue dans le quatrième stade à une dialyse contre de l'eau, on lyophilise le dialysat pour obtenir une matière en poudre On dissout la matière en poudre obtenue dans une solution aqueuse de chlorure de calcium 5 m M (p H 7,0) et on dialyse la solution obtenue

contre la même solution aqueuse On ajuste le p H du dia-

lysat à 4,5 par addition d'une solution 0,1 N d'acide chlorhydrique et on fait passer à travers une colonne

garnie de SP-Sephadex que l'on a équilibrée avec une so-

lution aqueuse de chlorure de calcium 5 m M (p H 4,5) On

lave la matière adsorbée sur la colonne avec une solu-

tion tamponnée d'acétate de calcium 5 m M (p H 4,5 > et on élue avec une solution tamponnée d'acétate de calcium m M (p H 5,S) pour obtenir une fraction présentant une

activité d'EPO Cette fraction contient 16 mg de protéi-

nes et présente une activité spécifique d'EPO de 100 unités/mg de protéines. Sixième stade de chromat Qaraohie sur colonne Après avoir fait passer la fraction présentant une activité d'EPO obtenue dans le cinquième stade à travers une colonne garnie de Sephadex G 50 que l'on a équilibrée préalablement avec du PBS, on élue la colonne avec la solution tamponnée pour obtenir une fraction

présentant une activité d'EPO.

On fait passer cette fraction à travers une co-

lonne garnie de l'adsorbant auquel l'anticorps a été

fixé pour effectuer une chromatographie sur immuno-

adsorbant et obtenir une fraction non adsorbée La frac-

tion non adsorbée contient 4 mg de protéines et a une

activité spécifique d'EPO de 25 000 unités/mg de pro-

téines. Préparation de la colonne garnie d'un adsorbant auauel on a fixé l'anticorps

On immunise une souris avec la fraction présen-

tant une activité d'EPO obtenue dans la chromatographie sur colonne du cinquième stade On prélève les cellules spléniques de la souris immunisée et on obtient les cellules de myélome par culture séparée On soumet les cellules spléniques et les cellules de myléome obtenues

à une fusion cellulaire pour préparer des cellules d'hy-

bridome. On obtient des anticorps à partir des cellules

d'hybridome préparées puis on soumet les anticorps ob-

tenus à une électrophorèse en présence de SDS. On sélectionne ainsi un anticorps dirigé contre la protéine présentant une forte activité immunisante, ladite protéine étant présente dans la région de poids moléculaire inférieur adjacente à la région présentant une activité d'EPO -dans l'électrophorèse sur gel en présence de SDS On fixe l'anticorps sélectionné à un gel d'AFFI-GEL (fabriqué par Bio-Rad Co-) et on garnit

une colonne du gel auquel est fixé l'anticorps.

Purification de l'EPO par électrophorèse en présence de SDS

On dialyse contre de l'eau une fraction présen-

tant une activité d'EPO (une fraction non adsorbée) que

l'on a obtenue comme ci-dessus et on lyophilise le dia-

lysat pour obtenir une matière en poudre On dissout la

matière en poudre dans une solution tamponnée de Tris-

acide chlorhydrique contenant 2 ô de SDS (p H 6,8) On soumet la solution préparée à une électrophorése sur un gel à 13 Z de polyacrylamide en présence de SDS selon les techniques habituelles On découpe la portion de gel présentant une activité d'EPO Après avoir ajouté une

quantité de PBS triple à la fraction de gel ainsi obte-

nue, on broie le mélange en particules fines pour ex-

traire une protéine L'extrait liquide contient 1,2 mg de protéine et présente une activité spécifique d'EPO de

50 000 unités/mg de protéine Après avoir soumis l'ex-

trait liquide à une dialyse contre de l'eau, on lyophi-

lise le dialysat pour obtenir une matière en poudre.

2 Préparation de cellules d'hvdridome Récolte des cellules soléniques

On imunise une souris <BALB/C) selon la techni-

que en trois stades suivante en utilisant comme antigène

l'échantillon purifié d'EPO obtenu comme ci-dessus.

Premier stade d'immunisation On mélange une solution obtenue par dissolution

de l'échantillon purifié d'EPO dans du PBS <solution sa-

line aqueuse de tampon phosphaté) à raison de 200 pg/ml avec de l'adjuvant complet de Freund pour préparer une émulsion et on introduit dans la cavité abdominale de la souris 0,5 ml de l'émulsion préparée correspondant à

fg de protéine EPO.

Second stade d'immunisation On mélange une solution obtenue par dissolution de l'échantillon purifié d'EPO dans du PBS à raison de

/pg/ml avec de l'adjuvant complet de Freund pour ob-

tenir une émulsion et on administre 0,5 ml de l'émulsion préparée correspondant à 25 pg de protéine EPO dans la cavité abdominale de la souris deux semaines après le

premier stade d'immunisation.

Troisième stade d'i sation

Deux semaines après le second stade d'immunisa-

tion, on administre dans la cavité abdominale de la

souris traitée pour achever le traitement d'immunisa-

tion, 0,5 ml d'une solution obtenue par dissolution de l'échantillon purifié d'EPO dans du POS à raison de

)ig/ml correspondant à 25 jg de protéine EPO.

Trois jours après l'achèvement du traitement d'immunisation, on prélève aseptiquement la rate de la souris immunisée Après avoir lavé la rate prélevée avec

une solution mixte constituée de milieu de culture syn-

thétique (solution RPMI 1 640) et d'une solution aqueuse à 15 Y de sérum foetal de veau <FCS>, on découpe la rate lavée en petits morceux dans la même solution mixte avec des ciseaux pour obtenir des cellules isolées Après avoir lavé deux fois les cellules isolées avec la même solution mixte, on disperse les cellules isolées lavées

dans la solution RPMI 1 640 Le nombre des cellules pré-

sentes est de 2,0 x 10 Préparation de cellules de mvélome On cultive des cellules de myélome <P -NSI/1-Ag 4-1) dans le mélange de solution RPMI 1 640 et de FCS et on lave les cellules multipliées avec la solution RPMI 1 640 Le nombre des cellules est de 10 Fusion cellulaire Après mélange de la dispersion des cellules

spléniques provenant de la souris immunisée avec la dis-

persion des cellules de myélome de souris en culture dans la solution RPMI 1 640, on soumet le mélange à une

centrifugation pour éliminer le surnageant.

On soumet le mélange obtenu des deux types de cellules à une fusion cellulaire dans une solution

* aqueuse à 50 Z de polyéthylèneglycol 1 500.

Après mélange des cellules fusionnées obtenues

par fusion cellulaire avec un milieu de culture HT (so-

lution RPMI 1 640) contenant de l'hypoxanthine, de la thymidine et une solution aqueuse à 15 X de sérum foetal

de veau>, on répartit le mélange liquide dans trois pla-

ques de microtitration comportant chacune 96 godets On

cultive les cellules pendant deux semaines sur les go-

dets respectifs des plaques en ajoutant le milieu de

culture HAT Isolution RPMI 1 640 contenant de l'hypoxan-

thine, de l'aminoptérine de la thymidine et une solu-

tion aqueuse à 15 Z de sérum foetal de veau) à partir du deuxième jour pour effectuer une sélection par l HAT On confirme que les cellules d'hybridome se multiplient

dans 264 godets.

3 Sélection des cellules avant une capacité de production d'anticorps à partir des cellules d'hvbridome multipliées A partir des cellules d'hybridome multipliées

dans les 264 godets différents <correspondant à 264 ty-

pes de cellules d'hybridome), on sélectionne les cellu-

les produisant un anticorps pouvant être fixé à l'échan-

tillon purifié d'EPO selon une technique de criblage en phase solide utilisant un système biotine-evidine On sélectionne ainsi 19 types de cellules comme cellules d'hybridome capables de produire un anticorps et, en particulier, on confirme que 7 types de cellules sur les 19 sont capables de produire l'anticorps de façon sta- ble. 4 ' Sélection des cellules produisant l'anticorps anti-EPO Par examen de la capacité d'adsorotion de l'EPO Après avoir préparé une colonne garnie d'und'adsorbant auquel un anticorps produit par chacune des sept cellules aété -fixé selon les techniques suivantes,

on examine la capacité d'adsorption de l'EPO de la co-

lonne pour effectuer une sélection complémentai re des

cellules produisant l'anticorps anti-EPO.

Dans la cavité abdominale de chacune des sept souris, on injecte 5 x 106 cellules de chacun des sept types mentionnés ci-dessus pour produire un anticorps et après récolte du liquide d'ascite des souris injectées, on fractionne chacun de ces liquides avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à 45 Z de la saturation et on obtient respectivement comme anticorps 40 à 60 mg d'une fraction d'Ig G Après fixation de la fraction d'Ig G obtenue à de l'AFFI-GEL 10 (fabriqué par Bio-Rad Co.) selon les techniques suivantes, on garnit du gel préparé une colonne pour obtenir une colonne garnie d'AFFI-GEL 10 auquel l'anticorps a été fixé On place l'AFFI-GEL 10 préparé sur un filtre de

verre et on lave avec de l'alcool isopropylique en re-

froidissant avec de l'eau glacée puis on lave trois fois avec de l'eau glacée On mélange l'AFFI-GEL 10 lavé avec un volume égal d'un liquide contenant l'anticorps obtenu (fraction d'Ig G), 0,2 H d'hydrogénocarbonate de sodium et 0,3 M de chlorure de sodium à p H 8,3 On agite le mélange obtenu pendant 5 heures à une température de 4 C pour effectuer la fixation de l'anticorps à l'AFFI-GEL On centrifuge ensuite le mélange pour recueillir le gel auquel l'anticorps est fixé et, après avoir lavé le gel recueilli deux fois avec un mélange d'une solution aqueuse 0,1 M d'hydrogénocarbonate de sodium et d'une

solution aqueuse 0 15 M de chlorure de sodium, on mélan-

ge soigneusement le gel lavé avec une solution aqueuse 0,1 M de chlorhydrate d'éthanolamine (p H 8) pendant minutes à la température ordinaire On garnit une colonne du mélange obtenu pour préparer une colonne

d'adsorption de l'EPO.

Chacune des sept colonnes préparées correspond à

chacun des sept types de cellules d'hybridome précédem-

ment mentionnés et on examine la capacité de chaque co-

lonne d'adsorber l'EPO selon les modes opératoires sui-

vantes en utilisant l'échantillon purifié d'EPO obtenu

dans le stade ( 1).

Après dissolution de l'échantillon purifié d'EPO dans du PBS, on fait passer la solution à travers la colonne que l'on a préparée comme cidessus et qu'on a préalablement équilibrée avec du PBS puis on élue la colonne avec un mélange d'une solution aqueuse 0, 2 M d'acide acétique et d'une solution aqueuse 0,15 M de chlorure de sodium On mesure l'activité d'EPO de la

fraction non adsorbée et de la fraction d'éluat.

Sur les sept colonnes préparées comme ci-dessus,

trois colon-nes se révèlent capables d'adsorber l'EPO.

Clonage des cellules productrices d'anticorps anti-EPO On soumet chacun des trois types de cellules

d'hybridome productrices d'anticorps anti-EPO à un clo-

nage selon les modes opératoires ordinaires de la métho-

de des dilutions limitantes comme suit.

Après dispersion de 50 cellules de chaque type d'hybridome et 10 cellules de thymus d'une souris BALB/C àgée de 4 semaines, dans 10 ml d'un mélange de solution RPMI 160 et d'une solution aqueuse à 15 Z de FCS on répartit la dispersion dans 96 godets d'une plaque de microtitration à raison de 0, 1 ml/godet On cultive les cellules en ajoutant le même mélange dans chaque godet le cinquième et le douzième jours de la culture On soumet les cellules d'hybridome multipliées à un test de capacité de production d'anticorps anti-EPO selon la même méthode en phase solide que ci-dessus et on effectue de plus une sélection relative à la capacité

de production d'anticorps anti-EPO par examen de la ca-

pacité d'adsorption de l'EPO puis on effectue le clona-

ge. On obtient ainsi trois lignées E-1 E-2 et E-3

comme lignées de cellules d'hybridome utiles dans l'in-

vention. On effectue une production d'anticorps selon le mode opératoire précité en utilisant chacune des lignées cellulaires E-1 E-2 et E-3 productrices d'anticorps anti-EPO On injecte chacune des lignées cellulaires dans la cavité abdominale de vingt souris pour produire un liquide d'ascite et on soumet la totalité du liquide

d'ascite recueilli sur les vingt souris à un fractionne-

ment avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à Z de la saturation pour obtenir une fraction d'Ig G.

On obtient ainsi 500 mg d'anticorps monoclonal.

Il Prénaration d'une colonne garnie d'un adsorbant auauel l'anticoros monoclpnal a été fixé

Selon les mêmes modes opératoires que ceux men-

tionnés ci-dessus on fixe chacune des fractions d'Ig G préparées à de l'AFFI-GEL 10 pour obtenir 50 ml d'un gel

fixé à chaque anticorps monoclonal de chaque lignée cel-

lulaire productrice d'anticorps monoclonal et on garnit

une colonne du gel auquel l'anticorps est fixé ainsi ob-

tenu pour préparer une colonne utile pour l'adsorption

de l'EPO.

III Récolte de l'EPO Selon les mêmes modes opératoires qu'en I, 1 ',

on obtient 50 mg de poudre de protéines urinaires tota-

les d'un sujet anémique et on dissout la poudre de pro-

téines urinaires totales présentant une activité d'EPO de 2 900 unités dans 10 ml de PBS (solution saline de tampon phosphaté) Après dialyse de la solution pendant une nuit contre 40 1 de PBS, on centrifuge le dialysat pour obtenir 10 ml de liquide surnageant qu'on utilise

ensuite comme liquide initial.

Après avoir fait passer 20 ml de PBS à travers

la colonne pour l'adsorption de l'EPO que l'on a prépa-

rée selon les mêmes modes opératoires qu'en II ( 0,8 cm de diamètre intérieur et 4 cm de longueur, garnie d'AFFI-GEL 10 auquel est fixé l'anticorps monoclonal produit par la lignée cellulaire E -1), à un débit de 20 ml/h pour l'équilibrer, on fait passer à travers la

colonne 50 ml d'un mélange d'une solution aqueuse d'aci-

de acétique 0,2 M et d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M à un débit de 20 ml/h pour laver la

colonne puis on fait encore passer 20 ml de PBS à tra-

vers la colonne pour l'équilibrer.

A travers la colonne ayant subi le traitement préliminaire on fait passer 10 ml du liquide initial préparé comme ci-dessus à un débit de 5 ml/h et après

avoir lavé la matière adsorbée dans la colonne par pas-

sage de 20 ml de PBS puis 20 ml d'une solution aqueuse

d'acide phosphorique tamponnée 10 m M contenant du chlo-

rure de sodium 0,5 M, à un débit de 20 ml/h, et 20 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M à un débit de 20 ml/h dans l'ordre indiqué, on fait passer à travers la colonne 20 ml d'un mélange d'une solution aqueuse d'acide acétique 0,2 M et d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M à un débit de 5 ml/h comme éluant pour obtenir un éluat contenant de l'EPO très pure. L'activité d'EPO de l'éluat obtenu est de 1 160 unités, c'est-à-dire que la récupération est de 40 g par 19 g

rapport à l'activité de 2 900 unités du liquide initial.

De plus, l'activité spécifique de l'EPO dans l'éluat est

de 45 000 unités/mg de protéines et l'activité spécifi-

que de l'EPO dans le liquide initial est de 58 unités/mg de protéines et par conséquent, la pureté de l'EPO a été

accrue de 780 fois par les opérations.

Exemple 2

En utilisant une colonne ( 0,8 cm de diamètre in-

térieur et 4 cm de longueur ayant une capacité de 2 ml) garnie d'un gel auquel on a fixé l'anticorps produit par la lignée E-2 de cellules d'hybridome, préparée selon

les mêmes modes opératoires que dans l'exemple 1, on ef-

fectue l'opération suivante.

Dans 10 ml de PBS contenant 2 Z de SDS on dis-

sout 50 mg < 2 900 unités d'activité d'EPO) de la poudre de protéines urinaires totales provenant de l'urine d'un sujet anémique selon les mêmes modes opératoires que

dans l'exemple 1 en utilisant un appareil d'ultrafiltra-

tion et, après traitement de la solution par chauffage à 100 'C pendant 3 minutes, on dialysée la solution traitée

pendant une nuit contre 10 1 de PBS Après avoir centri-

fugé le dialysat, on dilue le liquide surnageant obtenu au cinquième en volume avec du PBS et on fait passer le

liquide dilué à travers la colonne précédemment mention-

née que l'on a prétraitée comme dans l'exemple 1 à un débit de 5 ml/h Ensuite, après avoir fait passer 20 ml

de PBS, 20 ml d'une solution aqueuse d'acide phosphori-

que tamponnée 10 m M, de chlorure de sodium 0,5 M et ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M, dans cet ordre à travers la colonne, pour laver la matière adsorbée dans la colonne, on fait passer à travers la colonne 200 ml d'un mélange d'une solution aqueuse d'acide acétique 0, 2 M et d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M à un débit de 20 ml/h comme éluant pour obtenir un éluat contenant de l'EPO très pure L'activité d'EPO de l'éluat obtenu est de 2 600 unités Comme la poudre d'origine a une activité d'EPO

de 2 900 unités, le taux de récolte est de 90 Z L'acti-

vité spécifique de-l'EPO dans léluat est de 60 000 uni-

tés/mg de protéines L'activité initiale est de 58 uni- tés/mg de protéines dans la poudre d'origine et, par conséquent, la pureté de l'EPO est accrue d'environ

1 000 fois par rapport à la poudre d'origine.

Exemple 3

On effectue l'opération suivante en utilisant une colonne (diamètre intérieur 2 cm et longueur 6,4 cm ayant une capacité de 20 ml) garnie d'un gel auquel on a fixé l'anticorps produit par la lignée E-3 de cellules d'hybridome, préparée selon les mêmes modes opératoires

que dans l'exemple 1.

On dissout 500 mg d'une poudre de protéines uri-

naires totales provenant de l'urine d'un sujet anémique

( 29 000 unités d'activités d'EPO) dans 50 ml de PBS con-

tenant 2 de SDS et on chauffe la solution obtenue pen-

dant 3 minutes à 100 'C On dialyse la solution traitée pendant une nuit contre 40 1 de PSS puis on centrifuge

pour obtenir 50 ml d'un liquide surnageant.

Après dilution du liquide surnageant au cinquiè-

me en volume avec du PBS, on fait passer le liquide di-

lué à travers la colonne prétraitée à un débit de ml/h Après lavage de la colonne par passage de ml de P 8 S 200 ml d'une solution aqueuse d'acide phosphorique tamponnée 10 m M contenant du chlorure de

sodium 0,5 M et 200 ml d'une solution aqueuse de chlo-

rure de sodium 0,15 M à travers la colonne, dans l'ordre

indiqué, à un débit de 100 ml/h on fait passer à tra-

vers la colonne 200 ml d'un mélange d'une solution aqueuse d'acide acétique 0,2 M et d'une solution aqueuse

de chlorure de sodium 0,15 M pour obtenir un éluat con-

tenant de l'EPO très pure L'activité d'EPO de l'éluat est de 25 000 unités et le pourcentage de récupération o de 'EPO est de 86 par rapport aux 29 000 unités d'activité d'EPO de la poudre d'origine L'activité spécifique d'EPO de l'éluat est de 60 000 unités/mg de protéines, ce qui indique une amélioration atteignant environ 1 000 de la pureté de 'EPO.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 Procédé pour la production d'érythropo étine

très pure à partir d'une matière contenant de l'érythro-

poiétine, qui comprend: la mise en contact de ladite-matière contenant

de l'érythropoiétine avec un adsorbant ayant un anti-

corps monoclonal anti-érythropolétine, ledit anticorps monoclonal antiérythropoiétine étant préparé à partir

d'un hybridome obtenu par fusion cellulaire d'une cellu-

le de myélome et d'une cellule splénique d'un animal ex-

périmental immunisé par l'érythropoiétine;

l'adsorption de ladite érythropolétine sur le-

dit anticorps monoclonal anti-érythropolétine dans ledit adsorbant;

l'élution de ladite érythropolétine dudit ad-

sorbant; et

la récolte de l'érythropoiétine éluée.

2 Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'adsorbant est préparé à partir d'anticorps monoclonal

anti-érythropolétine et d'AFFI-GEL ou de Sephadex.

3 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 ou 2 dans lequel on fait passer la matière con-

tenant l'érythropolétine à travers une colonne garnie de l'adsorbant.

4 Procédé selon la revendication 1, dans lequel

on élue l'érythropoiétine adsorbée avec un mélange d'a-

cide acétique et d'une solution aqueuse de chlorure de sodium. Procédé selon la revendication 1, dans lequel

on régénère l'adsorbant après son utilisation et on uti-

lise de façon répétée l'adsorbant régénéré dans le stade d'adsorption.