FR2505871A1 - Anticorps monoclonal, reagissant avec la ferritine oncofoetale humaine, procede de sa production et de celle du clone le donnant ainsi que les moyens pour la detection de la ferritine oncofoetale - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES ANTICORPS MONOCLONAUX REAGISSANT AVEC LA FERRITINE ONCOFOETALE HUMAINE, UN PROCEDE DE PRODUCTION D'UN CLONE PRODUISANT CES ANTICORPS, UN PROCEDE DE PRODUCTION DE CES ANTICORPS ET UNE DETERMINATION ET UN NECESSAIRE POUR LA DETECTION DE LA FERRITINE ONCOFOETALE; L'INVENTION S'APPLIQUE EN PARTICULIER A LA DETECTION CHEZ LES HUMAINS DU CANCER DU SEIN OU DE LA MALADIE DE HODGKIN.

Description

La présente invention concerne des anticorps mo-

noclonaux réagissant avec la ferritine oncofoetale humaine, un procédé de production d'un clone produisant ces anticorps, un procédé de production de ces anticorps, ainsi que des moyens pour la détection de la ferritine oncofoetale. L'invention concerne des anticorps monoclonaux qui réagissent avec la ferritine embryonnaire du placenta

humain et qui ne réagissent pas avec la ferritine spléni-

que ou hépatique de l'homme adulte, ainsi que des anticorps monoclonaux qui réagissent avec la ferritine embryonnaire de placenta humain et donnent une réaction croisée avec la

ferritine splénique de l'homme adulte.

L'invention concerne de plus un moyen de détec-

tion du cancer du sein et/ou de la maladie de Hodgkin, qui comprend une détermination sélective dans des tissus de l' organisme et/ou des lymphocytes provenant de patients chez

lesquels la ferritine oncofoetale humaine est présente.

Dans un mode de réalisation particulier de l'in-

vention, on détermine la présence ou l'absence de ferritine

oncofoetale humaine par un essai de cytotoxicité.

Selon un autre mode de réalisation particulier de

l'invention, on détermine la présence ou l'absence de fer-

ritine oncofoetale humaine par radio-immunologie.

Les déterminations, suivant la présente invention, reposent sur l'emploi d'anticorps monoclonaux, spécifiques, que l'on peut utiliser dans un type approprié, quelconque,

de déterminations de la présence ou de l'absence de ferri-

tine oncofoetale; la présence de celle-ci indique l'existen-

ce chez des patients humains d'un cancer du sein au stade I

ou II ou d'une maladie de Hodgkin.

Selon un mode de réalisation préféré de l'inven-

tion, on détermine la présence de ferritine de type onco-

foetal à la surface des lymphocytes dans la circulation des

patients, la présence de cette ferritine indiquant un can-

cer du sein ou une maladie de Hodgkin.

La ferritine est la protéine principale de sto-

ckage du fer dans les tissus et on peut en détecter de petites quantités ( 65-150 ng/ml) dans le plasma L'analyse

de la ferritine tissulaire normale par focalisation isoélec-

trique a révélé une hétérogénéité considérable Marcus et

Zimberg (Arch Biochem Biophysic 162, 493, 1974) ont mon-

tré que la ferritine, isolée de tissus de tumeurs du sein, contenait de l'isoferritine acide, que l'on ne trouve pas dans la ferritine hépatique de l'adulte, tandis que Drysdale et Singer (Cancer Res 44, 3352, 1974) ont mis en évidence l'isoferritine acide dans des cellules de tumeurs Hela et dans des cellules placentaires Ils ont proposé d'appeler

"carcinofoetale" cette isoferritine.

Marcus et Zimberg, (Clin Res 23, A 447, 1975)

et Jacobs et coll (Br J Cancer 34, 286, 1976) ont signa-

lé des concentrations accrues en ferritine sérique chez des patients atteints d'un cancer du sein et ont suggéré

sa détermination comme une indication possible pour la dé-

tection du cancer du Sein Cependant, comme toute anti-fer-

ritine sérique hétérologue présente une réaction croisée avec les déterminants antigéniques, associés à la ferritine de l'adulte et à la ferritine carcinofoetale, on ne peut pas différencier les deux isoferritines Leurs résultats n'ont donc été significatifs que chez les patients dont la

teneur en ferritine était supérieure à la gamme normale (su-

périeure à 200 ng/ml) Dans une étude récente, Moroz et coll, Cancer Immunol and Immunotherapy 3, 101, ( 1977) ont identifié une souspopulation de lymphocytes portant de la

ferritine à leur surface chez des patients atteints de can-

cer du sein La ferritine est du type carcinofoetal et ces lymphocytes ferritine-positifs apparaissent à des stades précoces du cancer du sein (stades I-II) Ils ne sont pas présents chez les patients atteints de maladies bénignes du sein ni chez les sujets sains (Giller et coll, Surgery

Gyn Obst 149, 655, 1979).

L'identification de la ferritine liée aux lympho-

cytes, ou la présence de celle-ci dans les liquides tissu-

laires, constituent la base de la détermination pour la

détection précoce du cancer du sein chez des humains.

Ces dernières années on a mis au point une mé- thode, selon laquelle on hybride des cellules de myélome

de souris avec des cellules spléniques de souris hyperimmuni-

sées, (Kohler et Milstein, Nature, 256: 495: 1975) Une

telle cellule hybride peut produire un anticorps unique di-

rigé contre un déterminant antigénique unique Après clona-

ge d'une telle cellule hybride, on obtient donc un clone de

cellule hybride produisant un anticorps monoclonal unique.

L'emploi de l'anticorps monoclonal, dirigé contre un déter-

minant antigénique unique, n'existant que sur la ferritine carcinofoetale et non sur la ferritine de l'adulte, fait de l'identification d'une telle isoferritine à l'âge adulte

(dans le plasma ou sur les lymphocytes) un moyen plus spéci-

fique et sensible de/étection d'une affection maligne Les

risques de détecter une maladie bénigne que l'on sait asso-

ciée à une élévation de la ferritine sérique de l'adulte

sont fortement réduits.

L'invention concerne la production de deux anti-

corps monoclonaux de souris, spécifiques chacun d'un déter-

minant antigénique différent de la ferritine placentaire, humaine:

1) CM-OF-H 9 dirigé contre un déterminant antigénique spé-

cifique de la ferritine embryonnaire humaine, et

2) CM-OF-3 dirigé contre un déterminant commun à la ferri-

tine embryonnaire humaine et à la ferritine hépatique de

l'adulte.

L'invention concerne de plus un moyen sensible

pour la détection précoce du cancer du sein Ce moyen détec-

te également la présence de la maladie de Hodgkin Le test repose sur l'identification de la ferritine "oncofoetale" dans le sérum et dans d'autres liquides de l'organisme, ou liée aux lymphocytes,pour la détection précoce du cancer

du sein et pour la détection de la maladie de Hodgkin.

La spécificité, unique en son genre, de l'anti-

corps monoclonal CM-OF-H 9 vis-à-vis de la ferritine de ty-

pe oncofoetal permet de différencier une augmentation de la ferritine sérique, provoquée par une maladie maligne, de

la ferritine normale ou de la ferritine liée à des mala-

dies bénignes, comme par exemple à la thalassémie CM-OF-

3 peut détecter l'élévation de la ferritine dans les deux

groupes de maladies Un test effectué avec les deux anti-

corps permet de différencier les maladies malignes des

maladies non malignes.

PROCEDES

Préparation de la ferritine oncofoetale

On prépare la ferritine à partir du placenta hu-

main selon une modification du procédé utilisé par Beamish

et coll (J Clin Path 24, 581, 1971) On découpe en tran-

ches 500 g de tissu placentaire et on ajoute de l'eau jusqu' à un volume total de 2 000 ml Après homogénéisation, on

chauffe la suspension tissulaire à 75 C pendant 20 minutes.

On traite le surnageant, après refroidissement, puis centri-

fugation à 10 000 tr/min pendant 15 minutes, avec de l'acide

acétique, pour porter le p H à 4,6 On sépare la protéine pré-

cipitée par centrifugation à 10 000 tr/min pendant 15 minu-

tes et on ajuste à la neutralité le p H du surnageant limpide avec de l'hydroxyde de sodium dilué On soumet ensuite le surnageant limpide, brun, à une ultra-centrifugation à 000 g pendant 240 minutes, la ferritine en suspension se rassemblant, sous la forme d'une petite pastille, au fond du tube On redissout le précipité dans du soluté salé à 0,9 %r

et on le purifie par passage à travers une colonne de Sepha-

dex G 200 On fait passer la fraction de ferritine de cette colonne à travers une résine échangeuse d'anions constituée de DEAE-cellulose, en utilisant du tampon Tris-H Cl à p H 7,5 et un gradient de 0,02 à 0,5 M Onobtient trois pics de

protéine: le pic le plus acide p I = 4,8 (n III) est re-

cueilli et utilisé pour l'analyse Sa pureté est déterminée

par focalisation isoélectrique et immunoélectrophorèse con-

tre du sérum anti-ferritine et du sérum entier anti-homme.

On l'utilise pour l'immunisation de la souris comme indiqué ci-dessous. Préparation d'hybridomes Cellules de myélome: Les cellules de myélome, utilisées pour l'hybridation, sont

des cellules PB/NSI/1-Ag 4-1 que l'on cultive dans du RPMI-

1640 avec 20 % de sérum foetal de veau.

Souris Femelles Balb/c, âgées au départ de 4-6 semaines Protocole d'immunisation Trois immunisations hebdomadaires avec 50/g de ferritine acide dans de l'adjuvant complet de Freund, hybridation 3

jours après la dernière injection de 10 J g de ferritine.

On laisse au repos les souris hyperimmunisées au moins un

mois avant le dernier rappel.

Pr Eparation de cellules Cellules spléniques a Prélèvement des rates des souris; et on les place dans du RPMI-O; b rinçage deux fois dans une boîte de Pétri avec du RPMI-O; c distribution dans du RPMI-O avec des aiguilles de 0,12 mm de diamètre; d transfert de la suspension cellulaire dans un tube, o les gros morceaux de tissu sédimentent;

e introduction de la suspension monocellulaire dans un nou-

veau tube que l'on centrifuge à 800 tr/min ( 160 x g) pen-

dant 5 minutes; lyse des globules rouges avec du chlorure d'ammonium à 0, 83 %, p H 7,5; f lavage des cellules trois fois avec du RPMI-O et remise en suspension dans le même milieu;

g comptage des cellules avec du bleu Trypan.

Cellules de myélome

a On prélève les cellules des flacons de culture par pi-

pettage ménagé et on les introduit dans un tube Falcon/ Corning de 50 ml;

b centrifugation 1 à 900 tr/min ( 200 x g) pendant 5 minu-

tes; c lavage une fois avec du RPMI-O; on remet en suspension

dans le même milieu et on compte avec du bleu Trypan.

Combinaison de cellules spléniques et de cellules de myélome.

a Réunion des cellules spléniques et des cellules de myé-

lome dans un rapport de 10/1 dans un seul tube à centri-

fuger conique à usage unique Falcon/Corning de 50 ml; b formation d'un culot cellulaire à 900 tr/min ( 200 x g) pendant 5 minutes; c aspiration du milieu aussi complètement que possible; d toutes les solutions et tous les milieux, utilisés à partir de ce moment, sont à la température de la pièce; on plonge le tube avec le culot cellulaire dans un bain à 37 C et on ajoute, en agitant doucement, 0,2 ml de PEG 1500 à 33 % en une minute, puis on centrifuge à 200 g

pendant 5 minutes; après remise des cellules en sus-

pension, on agite doucement pendant 1 minute,puis on ad joute 5 ml de RPMI-O, sou 4 agitation douce, ensuite 5 ml/

RPMI-O contenant 20 % de sérum de veau foetal.

A ce moment le mélange hybride a l'aspect d'une suspen-

sion cellulaire mal remise en suspension avec de nom-

breux petits amas; e on centrifuge le mélange à 200 x g pendant 5 minutes pour former un culot;

f on remet les cellules en suspension dans du RPMI-HY-

HATD (à 37 C) à la concentration de 3 x 106/ml en fai-

sant gicler le milieu sur le culot cellulaire; g les hybrides sont appliques sur des bottes à 96 godets à fond plat par addition de deux gouttes de suspension cellulaire avec une pipette de 5 ml ou un Multipipettor,

en utilisant des embouts coupes (environ 65/4 l) conte-

nant 100-120/1 de RPMI-HY-HATD (environ 2 x 105 cellu-

les); h préparation de godets témoins contenant des cellules NS-1 + RPMIHY-HATD à la concentration de 1 x 106/ml; i culture des plaques pendant 7 jours; j le huitième jour puis deux fois par jour, la moitié du milieu de culture est éliminée par aspiration soigneuse, et l'on introduit 80-100/1 l de milieu RPMI-HY-HT; k on détermine les godets positifs 3 à 4 semaines après l'hybridation. Milieux et solutions 1 RPMI-0 (sans sérum foetal de veau)

2 RPMI 1640-HY

500 ml d'eau distillée stérile ml 10 x RPMI-1640 6 ml d'hydroxyde de sodium 1,0 N 14 ml de bicarbonate de sodium à 7,5 % 6 ml Pen/strep ml glutamine + DMEM 86,5 ml sérum de veau foetal 3 RPMI-HY-HATD jour O jour 7 Pour 100 ml de milieu 95 ml RPMI-1640 + 20 % de sérum de veau foetal 1, 0 ml de pyruvate ( 100 x) 2,0 ml 50 x HAT 2,0 ml 50 x désoxycytidine 4 RPMI-HY-HT jour 8 Jour 14 Pour 100 ml de milieu 97 ml de RPMI-1640 + 20 % de sérum de veau foetal 2,0 ml 50 x HT 1,0 ml de pyruvate ( 100 Ox) Pour les hybrides à partir du jour 15 utiliser le RPMI-1640 + 20 % de sérum de veau foetal

avec du pyruvate ou maintenir dans du RPMI-HY-HT.

PEG 33 à 25 % p/v Doit être inodore et blanc Pour 100 ml autoclaver le

poids (g) nécessaire dans un flacon de verre à la pres-

sion de 1,0 bar pendant 10 à 15 minutes Lorsque le flacon est suffisamment froid pour être tenu à la main (environ 50 C) ajouter du RPMI 1640-0 pour porter le volume à 100 ml, mélanger en faisant tourbillonner,

conserver à la température ordinaire.

6 HATD Concentrations finales des réactifs H = Hypoxanthine 10 -4 M A = Aminoptérine 10-6 M -5 T = Thymidine 2 x 10 M D = Désoxycytidine 2 x 10-6 M HT stock 100 x 100 ml thymidine PM 242,33: 0,04846 g hypoxanthine PM 136,1: 0,1361 g

Ajouter de l'eau bidistillée jusqu'à 100 ml et chauf-

fer à 60-70 C pour dissoudre Réajuster le volume fi-

nal avec de l'eau bidistillée Diluer à 50 x et stéri-

liser par filtration ( 0,2/,m) Diviser en fractions de 2 ml, conserver à 20 C A stock 1000 x 100 ml Aminoptérine, poids de formule 440,4: 0,44 g Porter à 50 ml avec de l'eau bidistillée et ajouter goutte à goutte de l'hydroxyde de sodium 0,1 N jusqu'à dissolution de l'aminoptérine Porter le volume final à 100 ml avec de l'eau bidistillée et stérilisée par

filtration ( 0,2 /hm) Conserver à -20 C.

D stock 100 x 100 ml Désoxycytidine PM 227,2: 0,00454 g Dissoudre dans de l'eau bidistillée, ajuster à 100 ml, diluer pour obtenir une solution stock 50 x, stériliser

par filtration ( 0,2/m), conserver à -20 C.

HAT 50 x 200 ml Combiner 100 ml de 100 x HT avec 10 ml de 1000 x A +

ml d'eau bidistillée pour obtenir 50 x HAT, stéri-

liser par filtration ( 0,2/um), diviser en portions de

2 ml et congeler à -20 C.

La sélection et la détermination de la spécifici- té des anticorps monoclonaux sont effectués par un test d' hémagglutination On couple de la ferritine placentaire, embryonnaire, et de la ferritine splénique d'adulte à des

globules rouges Ox avec du Cr Cl 2.

On mélange 50/A 1 de dilutions croissantes (à par-

tir de 1/10) du surnageant du milieu de culture de l'hybri-

dome avec 101 l de globules rouges Ox coupleés à de la fer-

ritine d'adulte ou de la ferritine embryonnaire et on dé-

termine l'agglutination.

On choisit les surnageants des clones donnant un

titre d'agglutination des clones d'au moins 1/1000.

On choisit un clone appelé CM-OF-3 Ce clone CM-OF-3 est spécifique de la ferritine embryonnaire et il présente une réaction croisée avec la ferritine d'adulte et la ferritine embryonnaire L'anticorps monoclonal

CM-OF-3 est utilisé pour le blocage des déterminants à réac-

tion croisée de la ferritine foetale et de la ferritine d'a-

dulte, en vue de la production d'un anticorps monoclonal différent, CM-OFH 9, qui est dirigé contre un déterminant

foetal spécifique.

Le mode d'immunisation suivant est appliqué.

A Protocole d'immunisation et de fusion

On fait réagir de la ferritine embryonnaire, iso-

lée du placenta humain, qui est une protéine de pic p I = 4,8 (mentionnéplus haut) avec les anticorps monoclonaux CM-OF-3, dans le rapport suivant: on mélange la ferritine embryonnaire ( 90/,g dans du tampon salé phosphaté) avec du liquide d'ascite de souris BALB/c contenant des anticorps

monoclonaux CM-OF-3 antiferritine ( 10 mg/ml).

Le mélange est incubé pendant 30 minutes à 37 C, puis pen-

dant une nuit à 40 C On centrifuge le mélange à 10 000 G; après rejet du précipité formé, le surnageant est employé pour l'immunisation On immunise chaque souris BALB/c avec le surnageant ci-dessus mélangé avec de l'adjuvant complet de Freund, par injection intradermique une fois par semaine pendant 3 semaines, On effectue une immunisation de rappel

par injection intrapéritonéale du cinquième de la dose ci-

dessus.

Trois jours après le rappel, on prélève aseptique-

ment la rate de la souris et on effectue la fusion par incu-

bation de 108 cellules spléniques avec 107 cellules de myé-

lome P 3-NSI/l-Ag 4, comme indiqué plus haut pour l'hybrida-

tion, et l'on reprend les mêmes opérations suivantes pour

l'identification du clone positif On obtient ainsi un clo-

ne appelé CM-OF-H 9.

B Caractérisation de l'anticorps monoclonal obtenu.

Caractérisation des anticorps monoclonaux CM-OF-H 9.

L'anticorps monoclonal CM-OF-H 9 appartient à la classe Ig G 1; il ne forme pas de précipité avec la ferritine et il fixe le complément de lapin Dans le liquide d'ascite

obtenu la teneur en anticorps est d'environ 7 mg/ml Un mil-

lilitre de liquide d'ascite fixe environ 2 mg de ferritine embryonnaire, mais pas de ferritine splénique ou hépatique d'adulte. Réactivité de l'anticorps monoclonal Source de ferritine humaine CM-OF-H 9 CM-OF-3 1 Rate d'adulte atteint de thalassémie + 2 Sérum normal + 3 Cancer du sein (lymphocytes du sang périphérique) + + 4 Cancer du sein (sérum) + + Maladie de Hodgkin (rate) + +

6 Affection bénigne du sein (lympho-

cytes du sang périphérique) -

7 Affection bénigne du sein sérum +

Les deux anticorps permettent une détection rapi-

de et pratique des affections malignes du sein et de la ma-

ladie de Hodgkin et une différentiation de ces maladies et

de la thalassémie qui provoque une augmentation de la fer-

ritine. Principes des déterminations sérologiques Détermination de la ferritine liée aux lymphocytes La présence de ferritine liée aux lymphocytes

indique la présence d'un cancer du sein humain.

La détermination de cette ferritine s'effectue de

lafaçon suivante.

a On isole des lymphocytes duisang périphérique; b la ferritine liée aux lymphocytes est déterminée par

une méthode classique, reposant sur l'emploi des nou-

veaux anticorps monoclonaux, spécifiques, de la ferri-

tine dérivant du placenta humain.

Selon un mode de réalisation préféré, on effec-

tue cette détermination de la façon suivante.

a On isole des lymphocytes du sang périphérique par cen-

trifugation avec un gradient de Ficoll-Hypaque;

b la présence ou l'absence de ferritine, liée aux lym-

phocytes, est déterminée à la manière classique, tel

que test cytotoxique ou détermination radio-immunolo-

gique.

On peut effectuer cette détermination avec du sé-

rum ou d'autres liquides de l'organisme.

Test de détection précoce du cancer du sein et la maladie de Hodgkin Récolte et préparation des cellules

1 Tubes de récolte du sang de 15 ml contenant de l'hépa-

rine.

2 Tubes à centrifuger coniques de 25 ml.

3 Pipettes Pasteur et tétines.

4 Tampon salé au phosphate de sodium (PBS) à p H 7,2.

5 Solution de Ficoll-Hypaque ayant une masse volumique de

1,077 g/ml.

Mode de récolte des cellules 1 Recueillir 15 ml de sang dans un tube de récolte du

sang hépariné, diluer au 1/2 dans du PBS à p H 7,2.

2 Placer 10 ml de solution du Ficoll-Hypaque sous la sus- pension de cellulas

3 Centrifuger pendant 30 minutes à 300 x g à la températu-

re ordinaire.

4 Recueillir les cellules mononucléaires à l'interface

milieu: Ficoll-Hypaque avec une pipette Pasteur et trans-

férer dans un nouveau tube de 15 ml.

Laver trois fois les cellules par mise en suspension dans ml de milieu de lavage et centrifugation à 300 x g

pendant 10 minutes à 4 C.

6 Remettre en suspension dans le milieu de lavage et déter-

miner le nombre des cellules.

Détermination radio-immunologique Matériel supplémentaire nécessaire 1 Tubes à essai Minisorp 100 x 15 mm

2 RPMI 1640

3 Sérum-albumine bovine à 5 % dans le PBS à p H 7,2, conte-

nant 0,025 % d'azide de sodium.

4 Sérum de lapin normal.

Anticorps monoclonaux CMH-9 6 Liquide d'ascite témoin 7 125 I-Ig G antisouris Détermination radio-immunologique 1

On isole des cellules mononucléaires du sang péri-

phérique par centrifugation avec un gradient de Ficoll-Hy-

paque On effectue la détermination en triple A blanc; B test 1 Distribuer 2 x 106 à 3 x 106 cellules dans six tubes à

à essai, centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 mi-

nutes pour obtenir un culot.

2 Ajouter 20/t 1 de sérum de lapin normal dilué à 1/10 dans

du PBS, incuber 60 minutes à 4 C.

-5 3 Ajouter 30,>l de liquide d'ascite (dilution 10 dans de la sérumalbumine bovine à 5 %) à chacun des trois tubes. A Liquide d'ascite témoin contenant un anticorps monoclo-

* nal Ig G 1 non spécifique ne réagissant pas avec la fer-

ritine oncofoetale.

B Anticorps monoclonaux CMH-9 mélanger soigneusement et incuber à la température de

la pièce pendant 2 heures.

4 Laver deux fois les cellules avec 10 ml de RPMI-1640

par centrifugation à 300 g pendant 10 minutes à 4 C.

Ajouter O,1 t Ci de 125 I Ig G de lapin anti-souris, incu-

ber 60 minutes à 4 C et laver deux fois avec du RPMI-

1640 froid comme en 4, compter la radio-activité.

Test positif: cpm A cpm B < 500.

Détermination radio-immunologique 2

Après le stade I de la détermination radio-immu-

nologique-1 on poursuit comme suit: on obtient les frag-

ments F(ab)2 de CMH-9 par digestion pepsique d'Ig G CMH-9

selon Utsumi et Karush (Biochem 1965 4, 1766) et des frag-

ments F(ab)2 d'Ig G 1 non spécifique (voir témoin de la déter-

mination radio-immunologique-1) On utilise les fragments F(ab)2 ainsi obtenus de façon suivante: Tube A: F(ab)2 témoin dans 5 % de sérumalbumine bovine dans

du PBS à p H 7,2 et 0,025 % d'azide de sodium.

Tube B: F(ab)2 de CMH-9 dans 5 % de sérum albumine bovine

dans du PBS à p H 7,2 et 0,025 % d'azide de sodium.

Incuber pendant 60 minutes à la température dela pièce, la-

ver une fois avec 2 ml de sérum-albumine bovine à 1 % dans du PBS à p H 7, 2; ajouter du ligand marqué au 125 I aux tubes à essai A et B

(pour obtenir environ 105 cpm); et soit de la ferritine on-

cofoetale marquée au 125 I soit un complexe d'anti-ferritine

oncofoetale polyclonale marquée au 125 I avec de la ferriti-

tine oncofoetale Le complexe est préformé avec des rap-

ports molaires antigène/anticorps de 1/1 ou d'au plus 1/2, avec préincubation mutuelle à la température de la pièce

pendant 1 heure Incuber le ligand marqué avec les cellu-

les pendant une heure à la température de la pièce, laver deux fois avec de la sérum-albumine bovine à 1 % dans du PBS

à p H 7,2 pour éliminer le ligand marqué non fixé et compter.

Si B est supérieur à A, le test est positif.

Détermination cytotoxique

On effectue l'essai en double.

A témoin; B test.

1 Mettre des lymphocytes de sang périphérique en suspen-

sion à la densité de 5 x 106 cellules/ml dans du RPMI-

1640. 2 Placer 1501 pl de lymphocytes de sang périphérique dans

4 tubes à essai de 12 x 75 mm Ajouter du liquide d'as-

cite ( 30 01; dilution 10-4) A Liquide d'ascite témoin ( 2 tubes), B CMH9 ( 2 tubes) Incuber pendant 45 minutes

à 4 C.

3 Ajouter du complément de lapin ( 100,1 l dilué au 1/5 dans

du PBS) et incuber 60 minutes à 37 C avec agitation lente.

4 Compter les cellules vivantes avec du bleu Trypan.

Test positif: Nombre des cellules vivantes dans A nombre de cellules vivantes dans B x 100 4 % Nombre de cellules vivantes dans A

NECESSAIRE POUR LE TEST DE CYTOTOXICITE

1 Anticorps monoclonaux CMH-9 2 Anticorps monoclonaux non spécifiques 3 Complément de lapin

4 Adjuvants classiques en solution standardisée.

NECESSAIRE POUR LA DETERMINATION RADIO-IMMUNOLOGIQUE

1 F(ab)2 de CMH-9 2 F(ab)2 d'anticorps monoclonaux non spécifiques 3 Ligand marqué au 125 I

NECESSAIRE POUR LA DETERMINATION RADIO-IMMUNOLOGIQUE-1

1 Anticorps monoclonaux CMH-9 2 Anticorps monoclonaux, non spécifiques 3 Ig G 1 anti-souris marquée au 125 I 4 Adjuvants et solutions standardisées

Claims (12)

Revendications

1 Anticorps-monoclonal, caractérisé en ce qu'il ne

réagit pas avec la ferritine oncofoetale, humaine.

2 Anticorps suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il ne réagit ni avec la ferritine splénique, ni avec la ferritine hépatique, humaines. 3 Anticorps suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il donne une réaction croisée avec la ferritine

splénique de l'homme adulte.

4 Procédé pour la production d'un clone produisant des anticorps monoclonaux anti-ferritine oncofoetale humaine du type défini dans la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend:

(a) l'immunisation de souris avec de la ferritine embryon-

naire dérivant du placenta humain, du cancer du sein, de la rate d'un sujet atteint d'un cancer du sein ou de la maladie de Hodgkin, après avoir fait réagir cette ferritine avec 1 ' anticorps monoclonal CM-OF-3, (b) l'hybridation de lymphocytes spléniques de souris

ainsi hyperimmunisées avec des cellules de myélome appro-

priées, et -

(c) la sélection d'un clone produisant des anticorps

réagissant seulement avec la ferritine embryonnaire, hu-

maine. Procédé pour la production d'un clone qui produit

des anticorps monoclonaux antiferritine oncofoetale, hu-

maine, du type défini dans la revendication 3, qui comprend

(a) l'immunisation de souris avec de la ferritine embryon-

naire, dérivant du placenta humain, du cancer du sein hu-

main ou de la rate d'un sujet humain atteint de maladie de Hodgkin;

(b) l'hybridation de lymphocytes spléniques de souris ain-

si hyperimmunisées avec des cellules de myélome appropriées; et

(c) la sélection d'un clone donneur des anticorps réagis-

sant avec la ferritine embryonnaire, humaine, et présentant

une réaction croisée avec la ferritine splénique d'adulte.

6 Clone produisant les anticorps monoclonaux suivant la revendication 2 (appelés ici CM-OF-H 9). 7 Clone produisant les anticorps monoclonaux suivant

dans la revendication 3 (appelés ici CM-OF-3).

8 Procédé pour produire des anticorps monoclonaux

anti-ferritine oncofoetale, humaine, définis dans la reven-

dication 2 qui comprend:

(a) l'immunisation de souris avec de la ferritine embryon-

naire dérivant du placenta humain, du cancer du sein humain ou de la rate de sujet humain atteint de la maladie de

Hodgkin, après réaction de cette ferritine avec les anti-

corps monoclonaux CM-OF-3; (b) l'hybridation de lymphocytes spléniques de souris

ainsi hyperimmunisées avec des cellules de myélome appro-

priées; (c) la sélection d'un clone produisant des anticorps

réagissant uniquement avec la ferritine embryonnaire, hu-

maine, (d) la culture d'un tel clone pour obtenir des anticorps monoclonaux anti-ferritine oncofoetale, humaine, et (e) l'injection du clone à la souris et le prélèvement

de liquide d'ascite contenant l'anticorps monoclonal.

9 Procédé de production des anticorps monoclonaux

anti-ferritine oncofoetale, humaine, définis dans la reven-

dication 3 qui comprend:

(a) l'immunisation de souris avec de la ferritine embryon-

naire dérivant du placenta humain, ou du cancer du sein hu-

main ou de rate d'un sujet humain atteint de maladie de Hodgkin; (b) l'hybridation de lymphocytes spléniques de souris

ainsi hyperimmunisées avec des cellules de myélome appro-

priées; (c) la sélection d'un clone qui donne des anticorps réagissant avec la ferritine embryonnaire, humaine, et

présentant une réaction croisée avec la ferritine spléni-

que d'adulte;

(d) la culture d'un tel clone pour obtenir des anti-

corps monoclonaux anti-ferritine oncofoetale, humaine, et (e) l'injectionwdu clone à la souris et le prélèvement

de liquide d'ascite contenant l'anticorps monoclonal.

Procédé selon l'une des revendications 4, 5 ou 9,

caractérisé ence que les souris utilisées sont des femelles

Balb/c.

11 Procédé selon l'une des revendications 4, 5, 9 ou

, caractérisé en ce qu'on immunise les souris par une sé-

rie d'immunisations avec de la ferritine oncofoetale dans

de l'adjuvant complet de Freund.

12 Procédé selon l'une des revendications 4, 5, 8 ou

9, caractérisé en ce que l'on combine les cellules spléni-

ques et les cellules de myélome dans un rapport de 20/1

à 1/1, en particulier 10/1.

13 Application de l'anticorps suivant une des revendi-

cations 1 à 3 à la détection du cancer du sein ou de la mala-

die de Hodgkin chez les humains, caractérisée par la déter-

mination cytotoxique de la ferritine de type oncofoetale, provenant de patients atteints d'un cancer du sein ou de

la maladie de Hodgkin.

14 Application de l'anticorps,suivant une des revendi-

cations 1 à 3, à la détection du cancer du sein ou de la ma-

ladie de Hodgkin chez les humains, caractérisée par la dé-

termination immunologique de la ferritine de type oncofoetal,

provenant des patients.

15 Nécessaire pour la réalisation d'une détermination par cytotoxicité selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend les anticorps monoclonaux standardisés

CMH-9, des anticorps monoclonaux non spécifiques, du com-

plément de lapin et des adjuvants et des solutions.

16 Nécessaire pour effectuer une détermination radio-

immunologique selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend des fragments F(ab)2 standardisés de CMH-9, des fragments F(ab)2 d'anticorps monoclonaux non spécifiques et un ligand marqué au 125 I. 17 Nécessaire pour la détermination radio-immunolo- gique selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend des anticorps monoclonaux CMH-9 standardisés, des

anticorps monoclonaux non spécifiques, de l'Ig G 1 anti-

souris marquée au 125 I et des adjuvants et des solutions.