JPH025894A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はモノクローナル抗体、その製法およびその使用
に関する。

［従来の技術］ 卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）またはフォリトロピン
は下垂体により分泌される糖蛋白系ホルモンである。Ｆ
ＳＨおよび他の下垂体性糖蛋白系ホルモン（黄体形成ホ
ルモンＬＨ，甲状腺刺激ホルモンＴＳＨ）はα−および
β−サブユニットからなる。これらのホルモンのα−サ
ブユニットは種内で共通であるが、β−サブユニットは
異なり、各ホルモンの特異性を与える。

ＦＳＨは雌雄双方の動物における性的機能に役割をもつ
。雄の場合ＦＳＨの最も重要な機能は精子の成熟および
栄養供給であると思われるが、雌の場合ＦＳＨは卵子の
発育および排卵において役割をもつ。肝移植プログラム
における過剰排卵のために、または排卵を増加して生殖
能を高めるために外来性ＦＳＨを用いることができる。

しかし処理された動物の反応の変動が大きな問題となる
可能性がある。これはバッチ間変動およびＦＳＨ製剤中
に存在する汚染物質、特に他の下垂体性糖蛋白系ホルモ
ン、ＬＨ（黄体化ホルモン）の存在に帰因すると思われ
る。

先行技術のヒツジＦＳＨ（ｏＦｓＨ）抽出における既知
の主要な方法には下記のものが含まれる。

（ｉ）エタノールおよび酸沈殿により子ヒツジ下垂体か
らｏＦＳＨの粗抽出物を調製する方法（シャーウッドら
、　　（Ｓｈｅｒｖｏｏｄ、　ａｔ　ａｌ　（１９７０
）Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｌ、　２４５：　２３２９−
２３３６）　）　、および（１１）硫酸アンモニウム沈
殿法（Ｌ、　Ｅ、ライヘルド、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ
　ｈｎｚｙｌｏＩｏｇｙ　Ｖｏｌ、ＸＸＸＶＩＩ、　Ｂ
、　Ｗ。

オマレイおよびＪ、　Ｇ、ハードマン編、アカデミツク
プレス社、ニューヨーク、　１９７５）。

採用する方法に応じて、目的外の蛋白質が冷エタノール
または硫酸アンモニウムの段階的添加によって沈殿する
。エタノールまたは硫酸アンモニウムの最終添加によっ
て有効成分が若干の汚染物質と共に沈殿する。これらの
方法によって粗製蛋白質０．５〜１，０ｉｕ／■を含有
する粗ＦＳＨ抽出物が得られる。

机下垂体抽出物を用いる後続の精製工程にはゲルｆｆ’
ｌ過およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（
シャーウッド（Ｓｈｃｒｗｏｏｄ）ら、　１９７０．サ
イラム（Ｓａｉｒａｍ）、　１９７９．グリメクチ（Ｇ
ｒｉｍｅｃｔｉ）　。

１９７４）。得られる精製された生成物の効力は総蛋白
質ｍｇ当たりｏＦｓＨ１ｌＯ〜１８８単位である。

しかしこれらの方法は多大な費用を要し、時間がかかり
、各下垂体から少量を生成するにすぎず、その結果獣医
用としての大全のＦＳＨｌ特に−貫した効力をもつＦＳ
Ｈはほとんど得られない。

［発明が解決しようとする課題］ 従って本発明の目的は、先行技術に関連する難点のうち
１または２以上を克服し、または少な（とも軽減するこ
とである。

［課題を解決するための手段］ 従って第１の観点においては、本発明は卵胞刺激ホルモ
ン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）に対するモノクローナル抗体の製法で
あって、 ＦＳＨに対する抗体を産生しうるＢ細胞、および骨髄腫
細胞を用意し； 該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ；そしてこれにより形
成されたハイブリドーマを増殖させる ことを含む。

本発明のこの観点によるモノクローナル抗体の製法は、
さらに 上記ハイブリドーマにより産生された抗体を採取するこ
とをも含みうる。

ＦＳＨに対する抗体を産生しうるＢ細胞は実験動物の肺
細胞およびリンパ節細胞から選ぶことができる。実験動
物はマウス、ラットなどである。

Ｂ細胞はＦＳＨまたはその免疫原性断片で免疫処置した
動物から得られる。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスは免
疫処置に好ましい動物である。１回の初回抗原刺激、ま
たは高度免疫処置を施した動物を抗体産生リンパ球また
は肺細胞の供給源として用いることができる。特に好ま
しい形態においては、高度免疫処置したマウスの肺細胞
を用いて融合細胞ハイブリッドを形成する。

骨髄腫細胞は適切ないかなる種類のものであってもよい
。ハイブリドーマ形成のための融合法に用いられるリン
パ球腫瘍から発達した特殊化骨髄腫細胞系が先行技術に
おいて知られている。

融合細胞ハイブリッドの形成には数種の骨髄腫細胞系が
使用でき、これにはＰ　３／Ｘ６３−　Ａ　ｇ　８゜Ｎ
Ｓ−Ｉ型丹髄肺細胞、たとえばＰ３／ＮＳＩ／１−　Ａ
ｇ４−１．Ｓｐ　２１０−Ａｇ１４および５１９４１５
、　ＸＸＯ，ＢＵ、　１が含まれる。本発明の例におい
てはＮＳ−Ｉ型骨髄腫細胞（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）
が好ましい細胞系である。

抗体産生肺細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハ
イブリット形成のための本発明のこの観点による融合工
程には、体細胞を骨髄腫細胞と混合することが含まれる
。その割合はそれぞれ約２０：１〜１：１、好ましくは
１０：１である。融合工程は細胞膜の融合を促進する物
質の存在下で行うこともできる。同一種の動物が融合処
理に用いる体細胞および骨髄腫細胞の供給源として用い
られることか好ましい。用いられる融合促進剤にはセン
ダイウィルスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
が含まれる。

融合処理によって生成する生育可能なバイブノットはき
わめて頻度が低いので（たとえば肺細胞を体細胞源とし
て用いる場合、はぼ２×１０５個の肺細胞につき１個の
ハイブリッドが得られるにすぎない）、融合細胞ハイブ
リッドを残りの非融合細胞、特に非融合骨髄腫細胞から
選択する手段を用いることが好ましい。生成した他の融
合細胞ハイブリッド中から目的の抗体産生ハイブリドー
マを検出する手段も必要である。

一般に融合細胞の選択は、ハイブリドーマの増殖を支持
するが、普通は無限に分割し続ける骨髄細胞の増殖を阻
止する培地で細胞を培養することによって達成される。

これらの細胞はヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ
ジン（ＨＡＴ）培地、すなわち融合細胞ハイブリッドが
ＨＰＲＴ陽性遺伝子型の肺細胞のため生存する培地にお
いて選別される。遺伝子型において適応性のハイブリッ
ドの増殖を支持する培地において選別できる異なる遺伝
的欠損（たとえば他の酵素欠損、薬物感受性など）をも
つ骨髄腫細胞を用いることもできる。

ハイブリドーマ細胞系のクローニングおよび選択に際し
て識別性の高いスクリーニングアッセイ法を採用するこ
とは、目的とする特異性を備えたモノクローナル抗体の
選択を助ける。

抗体産生ハイブリッドの選択は数種の標準的アッセイ法
のいずれによっても行うことができ、これには酵素結合
イムノアッセイ法およびラジオイムノアッセイ法が含ま
れる。免疫組織学的方法も抗体の検出および選択に用い
ることができる。好ましい検出法は、放射性ヨウ素標識
した。ＦＳＨを用いる二重抗体ラジオイムノアッセイ法
である。試験した他のアッセイ法は偽陽性の結果をＩラ
ーえる可能性がある。

目的とする融合細胞ハイブリッドを選択して個々の抗体
産生細胞系にクローン化すると、各細胞系を２種の標準
法のいずれかによって増殖させることができる。最初の
融合のための体細胞および骨髄腫細胞を得るのに用いた
種類の組織学的親和性動物に、ハイブリドーマの試料を
注射することもできる。注射された動物は、融合細胞ハ
イブリッドにより産生された特異的モノクローナル抗体
を分泌する腫瘍を形成する。動物の体液、たとえば血清
または腹水を取出して、高濃度のモノクローナル抗体を
得ることができる。あるいは個々の細胞系を実験室用培
養容器内でインビトロ増殖させ；同様に高濃度の単一の
特異的モノクローナル抗体を含む培地をデカント、濾過
または遠心分離により採取することができる。

従って本発明の他の観点においては、卵胞刺激ホルモン
に対する抗体を産生しうるＢ細胞を骨髄腫細胞と融合さ
せることにより形成されたハイブリドーマを含む、卵胞
刺激ホルモンに対するモノクローナル抗体を産生ずる連
続細胞系が提供される。

好ましくは、ＮＳ−Ｉ型骨髄腫細胞と、卵胞刺激ホルモ
ンで免疫処置したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスから得
た肺臓Ｂ細胞とを融合させることによりハイブリドーマ
細胞系が形成される。マウスを免疫処置するためにはヒ
ツジ卵胞刺激ホルモン（ｏＦｓＨ）製剤を使用しうる。

子ヒツジまたはブタの下垂体から抽出したＦＳＨをアジ
ュバントと併用してマウスを免疫処置する。ハイブリド
ーマ細胞系は栄養素溶液を用いた組織培養において増殖
する。この細胞系を反復継代組織培養後に希釈クローニ
ング法により純度につき分析すると、抗体産生ＦＳＨ特
異性クローンが１００％の頻度で示されるであろう。

目的のハイブリドーマは単一細胞系の選択を確認するた
めに希釈クローン化することができる。ハイブリドーマ
は少なくとも４回希釈できる。個々のハイプリドーマ細
１抱系の例はヒツジＦＳＨに対して形成されたＢＦＲ８
７−７０およびＢＦＲ８７−１２４と表示されるもので
ある。

上記のものの試料はバング（オーストラリア）ｐｔｙ、
社、細胞コレクション（オーストラリア、ノース・メル
ボルン、フレミントン・ロード８９）に維持されている
。ここに記載する本発明の範囲は例示されるハイブリド
ーマ細胞系に限定されるわけではない。これらの形態は
本発明の詳細な説明するためのものであり、機能的に均
等のモノクローナル抗体を産生ずる均等な細胞系はいず
れも本発明の範囲内にある。下記ハイブリドーマ細胞系
の試料は欧州動物細胞培養物コレクション（ＥＣＡＣＣ
）に寄託されている。

培　養　物　　寄託番号 ＢＦＲ８７−７０８９０１０３０１ Ｂ　Ｆ　Ｒ８７−１２４８９０１０３０２本発明のさら
に他の観点においては、卵胞刺激ホルモンに対する抗体
を産生しうるＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させることによ
り形成されたハイブリドーマを含む、卵胞刺激ホルモン
に対するモノクローナル抗体を産生ずる連続細胞系から
産生された、卵胞刺激ホルモンに対するモノクローナル
抗体が提供される。

モノクローナル抗体は上記ハイブリドーマ細胞系から産
生される。モノクローナル抗体の個々の例には、ヒツジ
ＦＳＨに対して形成されたハイブリドーマ細胞系ＢＦＲ
８７−７０およびＢＦＲ８７１２４により産生されるも
のが含まれる。細胞系の試料はバング（オーストラリア
）　Ｐｔｙ、社の細胞コレクション施設（オーストラリ
ア、ノース・メルボルン、フレミントン令ロード８９）
に維持されている。

本発明の他の観点においては、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）の精製法であって、 不純なＦＳＨ源、およびマトリックスに結合した、ＦＳ
Ｈに対するモノクローナル抗体を用意し；そして 不純なＦＳＨをモノクローナル抗体−マトリックスに導
通してＦＳＨを捕獲する ことを含む方法が提供される。

この精製法にはさらに、捕獲されたＦＳＨをモノクロー
ナル抗体マトリックスから溶離することをも含みうる。

マトリックスに結合したモノクローナル抗体は上記のモ
ノクローナル抗体のいずれであってもよい。

先行技術において既知の方法は費用および時間がかかり
、低純度の生成物が得られるので、ＦＳＨの精製法が簡
単なことは重要である。精製されたＦＳＨはインビボに
おける生物学的反応を大幅に改良するので重要である。

たとえばＬＨによる汚染は投与されたＦＳＨの効果を低
下させる。

高純度ＦＳＨはヒト用医薬の投与にとってきわめて望ま
しい。

モノクローナル抗体アフィニテイクロマトグラフィーに
よるＦＳＨの精製を可能にする技術の開発によって、高
純度ＦＳＨ製品を商業的量で供給しうる方法が提供され
た。

高純度ＦＳＨは現在得られる不純なＦＳＨ製品に勝る幾
つかの明らかな利点をもつ。すなわら後者は商業用ＦＳ
Ｈのバッチ間変動が著しく、インビボ反応の質がより低
い。不純なＦＳＨバッチから本発明方法によって精製さ
れたＦＳＨはバッチ間変動があったとしてもわずかであ
り、大幅に改良されたインビボ反応を与える。この改良
された反応は試験されたあらゆる種において明らかであ
った。

従って本発明のさらに他の観点においては、精製された
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が提供される。好ましくは
精製ＦＳＨは精製ヒツジＦＳＨである。

使用するマトリックスは適切ないかなる種類のものであ
ってもよい。クロマトグラフィー用ゲルが好ましい。ア
フィニティクロマトグラフィー用ゲルを使用しうる。ア
フィゲル（ＡＦＦＩＧＥＬ）　１０の商標でパイオーラ
ド・ラボラトリーズから得られるゲルが適切であること
が認められた。アフィブレプ（ＡＦｌ’１ｌ）ｌ？ＥＩ
））１０および１５（パイオーラド・ラボラトリーズ）
も適している。

不純なＦＳＨをモノクローナル抗体−マ！・リックスに
導通ずる工程は適切ないかなる容器中でも行うことがで
きる。アフィニティカラムは比較的小規模の作業に使用
できる。大規模の作業には大型の容器またはバットを使
用しうる。大型の容器またはバットは、不純なＦＳＨと
モノクローナル抗体−マトリックスの十分な接触を保ゴ
するために回転または撹拌してもよい。ローターボトル
を適切な容器として用いることができる。

捕獲されたＦＳＨは適切な溶離液を用いてモノクローナ
ル抗体−マトリックスから溶離することかできる。有機
酸溶液を使用しうる。ｐａ１緩衝化溶液も用いられる。

未結合物質をカラムから除去するだめにはクエン酸塩／
クエン酸緩衝液を使用しうる。

ｐｉｔ約６．７５〜２．０の０．１Ｍクエン酸塩／クエ
ン酸溶液による段階的溶離が適切であることが認められ
た。

ＦＳＨに対するインビボ反応は下記の新規な技術、 すなわち （ｉ）高純度ＦＳＨ，および （ｉｆ）ＦＳＨに対するモノクローナル抗体の適用によ
って改良できる。

本発明の他の観点においては、雌性動物に有効量の精製
卵胞刺激ホルモンを投与することを含む、雌性動物にお
ける発情誘発および／または生殖力増強のための方法が
提供される。非発情期動物はこれによって発情周期が誘
発され、排卵する。

本明細書および特許請求の範囲において用いられる動物
という語にはヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタなどを含む家畜
、ならびにヒトを含む他の動物が含まれる。

ヒツジおよびヤギについては、ヒツジ卵胞刺激ホルモン
を約２〜１Ｏｉｕの量で投与できる。ウシについては卵
胞刺激ホルモンを約２〜２０ｉｕの量で投与できる。

本発明のさらに好ましい観点においては、雌性動物にお
ける１回の発情周期中に産生される卵子の数を実質的に
高める方法（過剰排卵）が提供される。この方法は、動
物に有効量の精製卵胞刺激ホルモンを投与することを含
む。産生される卵子の数は少なくとも約５個、好ましく
は１５〜２０個の水準にまで高められるであろう。

この場合、ヒツジおよびヤギについては卵胞刺激ホルモ
ンを約４〜２０ｉｕの量で投与できる。

ウシについては、卵胞刺激ホルモンを約４〜２０ｉｕの
量で投与できる。

卵胞刺激ホルモンに対するモノクローナル抗体は動物に
おいて卵胞刺激ホルモンの生物活性を遮断および／また
は増強しうることか見出された。

モノクローナル抗体を用いてＦＳＨ生物活性を制御する
ことは、ＦＳＨを （ｉ）過剰排卵、 （ｉｉ）生殖力増強、および （ｉｉｉ　）発情周期の操作 に使用する際にＵ利である。

従って本発明方法はさらに、動物にＦＳＨ投与と同時に
、または投与後に、ハイブリドーマ細胞系により産生さ
れた、ＦＳＨに対する精製モノクローナル抗体約０．２
５〜３．０＋ａｇを投与することを含む。

過剰排卵について既に述べた利点が、生殖力増強、すな
わち収給形成および発情周期の操作のための低周ｆｉｔ
ＦＳＨの使用にも適用される。これらのモノクローナル
抗体を低周ｆｆ１ＦｓＨと併用することにより、多様な
種において収給産出の頻度をより良く制御することがで
きる。従って収給形成がより容易に、より再現可能にな
り、望ましくない三重体および高度多重体の産出回数が
少なくなる。

従って本発明の他の観点においては、雌性動物にａ動量
の精製卵胞刺激ホルモンを投与することを倉む、−ｕｒ
性動物において収給を形成すべく排卵を高める方法が提
供される。

この場合、処置される動物は好ましくはヒツジ、ヤギ、
またはウシであり、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２〜
２０ｉｕである。

より好ましくは、収給を形成すべく排卵増加する方法は
さらに、動物に卵胞刺激ホルモン投与と同時に、または
投与後に、ハイブリドーマ細胞系により産生された精製
−抗卵胞刺激ホルモンモノクローナル抗体約０．０５〜
１．Ｏｍｇを投与することを含む。

本発明の好ましい観点においては、発情誘発および／ま
たは生殖力増強のための方法はさらに、彼処理動物に卵
胞刺激ホルモン投与を同時に、または投与後に、卵胞刺
激ホルモンに対するモノクローナル抗体（ハイブリドー
マ細胞系により産生されたもの）をＨ動量投与すること
を含む。

モノクローナル抗体は前記のいかなる抗体であってもよ
い。モノクローナル抗体は適切ないかなる有効量におい
ても投与できる。ヒツジおよびヤギについては、モノク
ローナル抗体は約０．２５〜１．０ｍｇの出で投与でき
る。ウシについては、モノクローナル抗体は約１．０〜
３．Ｏｍｇの量で投与できる。ブタについては、モノク
ローナル抗体は約０．２〜０．５ｍｇの量で投与できる
。

過剰排卵法の場合、モノクローナル抗体はヒツジおよび
ヤギに対し約０．５〜２．０ｍｇの量で投与できる。ウ
シについては、モノクローナル抗体は約０．５〜３．０
ｍｇの量で投与できる。

ＦＳＨモノクローナル抗体をインビトロＦＳＨ制御のた
めに投与する場合、必要量を厳密に評価することが好ま
しい。

抗体の適量は以下のものを含む幾つかの変数に依存する
。

（１）選ばれたモノクローナル抗体、 （ｉｔ）ＦＳＨ量、 （ｉｉｉ）ＦＳＨ注射後の抗体注射までの時間、（ｉｖ
）これを使用する動物種、 （Ｖ）動物の大きさ、および、 （ｖｉ）動物を以前に処置した回数。

モノクローナル抗体をインビボＦＳＨの制御に用いる場
合、過剰排卵、生殖力すなわち収給形成の増強、または
発情誘発のいずれのために使用するのであっても、先に
雌ヒツジおよび雌ウシについて述べたものがヤギ、ヒト
、イヌ、ネコ、ブタその他の哺乳動物に同様に適用され
る。

有効であるために必要な抗体の量は用いる個々の抗体、
動物種、ＦＳＨ処置の程度、およびＦＳＨ注射後の投与
までの時間に応じて異なるであろう。たとえば約１５〜
２０ｉｕのＦＳＨを雌ヒツジに注射する好ましい形態の
場合、上記の変数に応じて約０．０５〜０．５０ｍｇの
抗体を使用しうろことを見出した。モノクローナル抗体
処置はＦＳＨ処置と同時に行うか、またはＦＳＨ処置後
に行うことができる。

ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に投与されたモノク
ローナル抗体はＦＳＨの生物活性を変異させることがで
きる。この変異によってＦＳＨの活性は低下または増大
するであろう。ＦＳＨ生物活性の増大および低下は共に
同一方式に含めることができる。“ＦＳＨ−抗体”複合
体によってＦＳＨの効力を５〜１０倍高めることができ
る。

ＦＳＨとモノクローナル抗体を予備インキュベーション
、同時注射または個別投与すると、抗体−ＦＳＨ複合体
の形成によりＦＳＨ活性を高め、結果的に生物活性を高
めることができる。

これと同様に、種々の抗体−ＦＳＨ複合体の形成はＦＳ
Ｈの生物活性を無効にすることにより、ＦＳＨまたは先
に複合体を形成したＦＳＨの生物活性を効果的に低下さ
せることができる。

本発明のさらに他の観点においては、哺乳動物における
卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）の検出法が提供される
。検出アッセイ法は免疫蛍光アッセイ法、ラジオイムノ
アッセイ法、酵素結合イムノアッセイ法、凝集アッセイ
法などである。１ｇＭ免疫グロブリンクラスのモノクロ
ーナル抗体については凝集アッセイ法が好ましい。赤血
球凝集アッセイ法が好ましい。

特に好ましい形態においては、検出アッセイ法は赤血球
凝集抑制アッセイ法である。

検査すべき試料は適切ないずれの種類のものであっても
よい。血清、血漿、唾液もしくは尿試料、またはそれら
の抽出物を用いることができる。

次いでＦＳＨの存在を視覚的手段により検出しうろこと
は理解されるであろう。対象血清中にＦＳＨが存在する
場合は、ＦＳＨはモノクローナル抗体−ヒにある結合部
位に結合するであろう。

ＦＳＨコーチンク′した哺乳動物赤血球を添加すると、
血球ｉ−の抗原に結合する抗体が効果的に失われ、その
結果凝集が抑制される。凝集していない血球は次いで固
形支持体のウェルの丸底に沿ってすべり、濃色の血球ド
ツトを形成する。

固形支持体は適切ないかなる種類のものであってもよい
。ミクロタイタープレー１・もしくはトレーまたは試験
管を使用しうる。丸底型のミクロタイターブレー１・ま
たはトレーが好ましい。モノクローナル抗体は溶液とし
て装入できる。リン酸塩緩衝化食塩液を使用しうる。

池の観点においては本発明は上記の七ツクローナル抗体
またはそれらの混合物から選ばれる釘動量のモノクロー
ナル抗体を含む、単位剤形の形の、哺乳動物におけるＦ
ＳＨの生物活性を変異させるための獣医材用または医療
用薬剤組成物を提供する。

獣医材用または医療用薬剤組成物は、獣医材用として受
容できる、または医療用として受容できる、上記に対す
る希釈用キャリヤーまたは賦形剤をさらに含ｈ゛できる
。モノクローナル抗体は溶液状で提供できる。緩衝化食
塩液を使用しうる。

リン酸緩衝液が使用できる。

本発明を以下の実施例に関連してより詳細に記述する。

ただし以下の記述は説明のためのものにすぎず、何らか
の形で上記の本発明の一般性を限定するものと考えるべ
きでない。

実施例 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスに５ｍｇの精製した。Ｆ
ｓＨまたはｐＦＳＨ製剤（５０ｉｕ／ｍｇ、ライヘルド
（１９７５）の方法に従って硫酸アンモニウム沈殿させ
たのち数工程のイオン交換クロマトグラフィー処理した
もの）をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と１
＝１の比でＰ　Ｂ　Ｓ　５０＋＋＋ｌ中に乳化したもの
を腹腔的注射した。この免疫処置工程を１週間の間隔で
４回反復した。最終注射の１週間後に、足部採血により
得たマウス血清をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によ
りＦＳＨの反応性および特異性につき試験した。最高血
清力価を示したマウスを、融合前にＰＢＳＯ，１ｍｌ中
の同一の精製ｏＦＳＨまたはｐＦｓＨ製剤（５０ｉｕ／
ｍｇ）　　ｌｏＯｕｇの尾静脈注射により追加免疫処理
した。

初回抗原刺激したマウスを頚部脱臼により層殺し、肺臓
を無菌的に摘出した。１０ｍ１のＧ　Ｋ　Ｎ７８７［ｔ
ｉｊ（０，８ｇ　　ＮａＣρ、　０．４ｇ　　ＫＣΩ、
　１．４２ｇＮａ　　ＨＰ　０　　、　２Ｈ２０，２，
０ｇ　　Ｄ−グルコ−ス、および０．０１にフェノール
串レッド：２回蒸留水１β中）中で肺臓を細砕すること
によって牌細胞を得た。細胞を遠心分離により採取した
。ｔｆｌ織培養培地（ダルベツコの改良イーグルズ培地
、ＤＭＥおよび炭酸水素ナトリウム０．２％Ｗ／Ｖ）中
で増殖させたＮＳ−Ｉ型骨側腫細胞（２Ｘ１０７）Ｐ３
／ＮＳ　１／１−Ａｇ４〜１を遠心分離（２００ｇ。

５分間、室温）により採取し、ＧＫＮ溶液１０ｍ１に再
懸濁した。

肺細胞およびＮＳ−Ｉ型骨側腫細胞を５０ｍ１の遠心管
（ファルコシ）中で混合し、室温において７０ｇで５分
間遠心分離した。次いで上清を注ぎ出して細胞のペレッ
トを残した。遠心管をかるくたたくことによりこれらの
細胞をごく少量の残留上清に再懸濁してスラリーとなし
た。１．５ｍｌの無菌５０％ポリエチレングリコール（
３７°Ｃ）［ＰＥＧ。

Ａ　ｒｔ、　　９７２７ポリエチレ２ングリコール４０
００．　　メルク］、ＰＥＧ　Ｌ、Ｏｇを２回蒸留水１
．０ｍｌと共に密閉容器内でオートクレーブ処理するこ
とにより調製−を次いでスラリーに９０秒間にわたって
緩徐に混合しながら添加した。さらに３０秒間混合した
のち、３７℃のＧ　Ｋ　Ｎを２分間にわたって慎重に添
加し、次いでさらに８ｍｌを３分間にわたって、添加し
た。最後にＧ　Ｋ　Ｎ　３０ｍ１を遠心管の側面に沿っ
て緩徐に添加した。

この細胞懸濁液を直ちに室温において７０ｇで３分間遠
心分離し、上清を注ぎ出した。遠心管をかるくたたいて
細胞のスラリーを形成したのち、１００　＋ｎｌのＨＡ
Ｔ選択培地（培地ｐ当たりヒポキサンチン１３．６…ｇ
、アミノプテリンＯ，１９ｍｇおよびチミジン３．８７
ｍｇを含有する組織培養培地）に再懸濁した。次いでＨ
ＡＴ選択培地１．、５ｍｌ中のラット胸腺細胞１．５Ｘ
１０６個をそれぞれ含む、２４ウエル平底リンプロ（Ｌ
ｉｎｂｒｏ）プレート（フローΦラボラトリーズ）の各
ウェルに、細胞懸濁液の試料（０，５ｍ１）を添加した
。胸腺細胞は融合の前日に調製され、３７°Ｃで加湿５
％ＣＯ２雰囲気内において一夜インキユベートされた。

融合の１３日後に上清をＲＩＡおよび免疫組織学的にス
クリーニングした。選ばれたウェルはＨＡＴｉｉｌ択培
地中の胸腺細胞を含む９６ウエル平底リンプロプレート
内で希釈クローニングされた。

ラジオイムノアッセイ ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）系は
ハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体の検出法と
してしばしば用いられている。しかしこの系では抗原は
固相で提示され、すなわちプラスチック製ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａプレー１・に付着しており、多くの科学者が偽陽性の
結果を報告している（ミラー、コールズバイおよびボル
ト（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｋ、　Ｉζ、　Ｇｏｌｄｓｂｙ、　Ｉ？、　Ａ、、　ａ
ｎｄ　Ｂｏｌｔ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｊ。

Ｅｎｄｏｅｒ、　（１９８７）、　１１５　：　２８３
−２８８））、液相で使用する必要のある抗体−すなわ
ちアフィニティクロマトグラフィーを行い、抗体をＦＳ
Ｈ活性の抑制剤として動物に注射する−を試験するため
に、液相アッセイ法を開発した。これを以下に記述する
。

ラジオイムノアッセイスクリーニング法ヒツジＦＳＨに
対する抗体を分泌するハイブリドーマはまず二重抗体Ｒ
ＩＡにより検出された。

純粋なｏＦＳＨ製剤（７５ｕ　１ｍｇ、　Ｎ　Ｉ　Ｈよ
り入手、米国、ベテスダ）をヨートゲ゛ン（Ｉｏｄｏｇ
ｅｎ）（パース、米国）により放射性ヨウ素化した。こ
の方法ではｏＦＳＨ５μｇを　　１　（アメルシャムＩ
　Ｍ　Ｓ　３０）　　０．５ｍｇおよび０．１Ｍリン酸
塩緩衝液（ｐＨ７、４）５０ｇｇと共に、ガラス製試験
管に塗布したヨードゲン１．２ｍｇの存在下でインキュ
ベートした。

室温で１０分間インキュベートシたのち、放射性ヨウ素
化ｏＦＳＨ（Ｉ　　ｏＦｓＨ）をｌＱｍｌのＧ−２５カ
ラム上でのクロマトグラフィーにより遊離１２５Ｉから
分離した。

約１００．０００ｅｐｉの　　Ｉ　　ｏＦｓＨを含有す
る０、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　ｔｏｏμｇを含むポリスチ
レン製試験管（３ＤＴ試験管、ジョーンズ）にバイブリ
ド−マド清１００μＱを添加した。室温で２時間のイン
キュベーション後に沈殿用第２抗体１００μ９を添加し
た。第２抗体は家兎において形成された抗マウス抗体（
ＲＡＭ、アフィニティ精製、サイレナス・ラボラトリー
ズ）をセファロース４Ｂ（ＣｎＢｒ−セファロース４Ｂ
、ファルマシア）に結合させたものである。磁気撹拌後
に試験管を室温に１時間放置し、冷（４℃）リン酸塩緩
衝液１ｍｌを添加した。試験管を直ちに３．００Ｏｒｐ
ｍで４℃において１５分間遠心分離した。上清中の未抗
体結合１２５１−ｏＦＳＨを吸引除去し、１２５■−ｏ
ＦＳＨ−抗ｏＦＳＨモノクローナル抗体−第２抗体複合
体を含むペレットをガンマ分光光度計により計数した。

免疫組織学的方法 新鮮な組織（下垂体）を地元の屠殺場から集めた。この
組織をブーアン液中で２時間、次いでホルマリン中で一
夜固定した。組織をトリミングしたのち、４°Ｃの無水
エタノールを１時間毎に４回交換し、室温のキシレンを
４回交換し、５６°Ｃの流動パラフィンを４回交換し、
次いで４°Ｃで一夜固化させる処理により、パラフィン
に包埋した。

ミクロトーム（ライフ）により６μｍの組織切ハを切取
り、温１％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）水浴からスライドガラス
」−に浮遊させた。次いでスライドを３７°Ｃで一夜イ
ンキュベートシて切片を付着させた。

切片は使用前に下記の各溶液中で５分間ずつインキュベ
−１・することにより糾水和された；キシレン、新たな
キシレン、無水エタノール、新たなエタノール、７０％
エタノールおよび流水。

純ハイブリドーマ上清を直接に切片に乗せ、スライドを
加湿された箱内で室温において２〜３時間時間インキュ
ベートムシ切片をＰＢＳで緩和にリンスしたのちセイヨ
ウワサビ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ）ベルオキンダー
ゼに結合した家兎抗マウスＩｇＧ（ＲＡＭ−ＨＲＰ、　
　ダコパッツ、デンマーク）２％の正常ヒツジ血清を含
有するＰＢＳ中に１＝７５に希釈されたちの−で被覆し
、さらに１時間インキュベー１−　した。スライドをリ
ンスしたのち、０．０１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５）
　　２５Ｏｔｎｌ中の３，３′−ジアミノベンズアミジ
ンＯ，１４ｇおよび３０％過酸化水素２５０μｇを含Ｈ
する基質溶液に１５ｊ、潰した。１０分以内にスライド
を蒸留水中でリンスすることにより反応を停止した。

切片をハリスのへマドキシリンおよび炭酸リチウムで対
比染色し、次いで封入のため７０％アルコール、無水ア
ルコール、新たな無水アルコール、キシレン、および新
たなキシレンで１分間ずつリンスすることにより脱水し
た。下垂体細胞の細胞形質が文献に述べられた特徴的な
様式で染色された場合、上清はＦＳＨ抗体につき陽性で
あると考えられる。

結　　果 ヒツジＦＳＨ ｏＦＳＨに対し免疫処置されたマウスから得た牌細胞に
ついて行った融合により、ｏＦＳＨに対する抗体を産生
ずるハイブリドーマ２種が得られた（第１表参照）。

ＢＦＲ８７−７０３０％　十 Ｂ　Ｆ　Ｒ８７−１２４２４％　　　　　　　＋ａ、添
加した総１２５Ｉ−ｏＦＳＨを最大限に結合。

ｂ、＋は下垂体細胞の細胞形質が染色させたもの。

生物活性の改良 ＦＳＨ製剤の生物活性の改良は、ＦＳＨに対するモノク
ローナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィー
により達成できる。ＦＳＨがモノクローナル抗体に結合
した場合、注射されたＦＳＨの効力の増大も証明される
。

粗抽出物から生物活性をもつ純粋なＦＳＨをアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより抽出することによって抗体
の特異性が確認され、ＦＳＨの生物学的特性を正確に評
価することができる。

アフィニティクロマトグラフィー 各モノクローナル抗体約２００ｍｇを精製しく細胞培養
物または腹水から）、アフィゲル（Ａｆｆ’ｉｇｃｌ）
１０にｌ［３ｍｇ　／　ｍｌ　（ゲル）で結合させた。

これらのカラムは各アフィニティゲル調製用として調製
され、少量（２００μＱ）のゲルを最適な結合および溶
離条件の確立のために用いた。最適条件はゲル１０μＱ
を種々のｐＨの緩衝液２００μΩ中でインキュベ−１・
することにより部１べられた。室温で１時間後に試、験
管を遠心分離し、未結合　　１　　ｏＦＳＨを吸引、除
去した。　　　Ｉ　　ｏＦｓＨを含有するケルを次いで
ガンマ分光光度計により計数した。

最適溶離のためには、ゲル１０μＱ１およびＰＢＳ中に
希釈された１２５Ｉ−ｏＦＳＨを含む一連の試験管をイ
ンキュベートした。結合した　　■ｏＦＳＨを含むこれ
らの試験管をさらに種々のｐＨ値の緩衝液と共にインキ
ュベートし、遠心分離し、計数した。

最適結合はＰＢＳを結合用緩衝剤として用いた場合に起
こるが、ゲルからの　　Ｉ　　ｏＦＳＨの最大溶出は０
．１Ｍクエン酸塩／クエン酸（ｐＨ３，０）緩衝液を用
いて達成される。ＦＳＨはｐＨ３，０における方が損傷
を受けにくいので、これはｐＨ１１，０より好ましい。

このことは第１図に示される。

このプロトコールを２ｍｌのカラムにおいて試験し、こ
の方法が適切であることが示された（第２表）。

第２表 アフィニティ力ラム（２ｍｌ） 添加した　　Ｉ　−ｏ　Ｆ　Ｓ　Ｈ３，０４７，８０Ｇ
洗出されたカウント　　　８４０，０００　　（２８％
）結合したカウント　　２，２００．ＯＯＯ７２％大規
模の試験はカラム法またはバッチ法により行うことがで
きる。アフィニティ精製ＦＳＨは生物活性につき、ステ
ィールマンおよびポーレイ（Ｓｔｅｃｌｍａｎ　ａｎｄ
　Ｐｏｈｌｅｙ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　５
３　：６０４−６１６．１９５３）のＦＳＨに関するｈ
ｃｃ増強アッセイ法、またはマウギウムーロシスターら
（ＭａｕｇｈｉｕｌＩｌ−Ｒｏｇｉｓｔｅｒ　ｅｔ　ａ
ｔ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

８６　：　１２１−１３１，１９７８）のブタ羞丸受容
体アセソイ法により試験することができる。

この精製ＦＳＨ製剤を用いると正確な用量のＦＳＨを投
与することができる。粗製製剤中に見出されるバッチ間
変動およびこれによる問題か軽減されるであろう。

これらのヒツジおよびブタＦ　Ｓ　Ｈに対する抗体を用
いると、生物学的ＦＳＨおよびその抗体を結合させ、こ
の複合体を対象に注射することにより、ＦＳＨ活性の増
大を調べることができる。この処置によってＦＳＨの投
与率を実質的に減少させ、従ってＦＳＨ処置の費用を減
少させることかできる。この処置の主な費用は精製ＦＳ
Ｈなのである。

最後に、ここに記載する本発明の精神から逸脱すること
なく池の種々の修正および／または変更をなしうろこと
を理解すべきである。

らのｐＨ３，０溶出液の還元試料である。ｌｏＯｍｇの
粗製○ＦＳＨをこのカラムでクロマトグラフィー処理し
た。第２列は非還元試料である。

（外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対するモノクローナ
   ル抗体の製法であって、 ＦＳＨに対する抗体を産生しうるＢ細胞、および骨髄腫
   細胞を用意し； 該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ； これにより形成されたハイブリドーマを増殖させ；そし
   て 該ハイブリドーマにより産生された抗体を採取する ことを含む方法。 ２、抗体を産生しうるＢ細胞が、ヒツジ卵胞刺激ホルモ
   ン（ｏＦＳＨ）またはその免疫原性断片で免疫処置され
   た動物から得られ；そして 骨髄腫細胞系がＮＳ− I 型骨髄腫細胞系である、請求
   項１に記載の方法。 ３、融合工程が体細胞と骨髄腫細胞をセンダイウイルス
   およびポリエチレングリコールから選ばれる融合促進剤
   の存在下で混合することを含む、請求項２に記載の方法
   。 ４、ハイブリドーマ増殖工程が ラジオイムノアッセイ法を免疫組織学的方法と併用する
   ことにより抗体産生ハイブリドーマを検出し； 次いで選ばれた融合細胞ハイブリッドを個々の抗体産生
   細胞系にクローニングし；そして各細胞系をインビボま
   たはインビトロで増殖させることを含む、請求項３に記
   載の方法。５、卵胞刺激ホルモンに対する抗体を産生し
   うるＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより形成さ
   れたハイブリドーマを含む、卵胞刺激ホルモンに対する
   モノクローナル抗体を産生する連続細胞系。 ６、ＮＳ− I 型骨髄腫細胞をヒツジ卵胞刺激ホルモン
   で免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾臓Ｂ細胞
   と融合させることにより形成された、請求項５に記載の
   連続細胞系。 ７、ＢＦＲ８７−７０およびＢＦＲ８７−１２４から選
   ばれる、連続細胞系。 ８、卵胞刺激ホルモンに対する抗体を産生しうるＢ細胞
   を骨髄腫細胞と融合させることにより形成されたハイブ
   リドーマを含む、卵胞刺激ホルモンに対するモノクロー
   ナル抗体を産生する連続細胞系から産生された、卵胞刺
   激ホルモンに対するモノクローナル抗体。 ９、ＢＦＲ８７−７０およびＢＦＲ８７−１２４より選
   ばれる連続細胞系から産生されるモノクローナル抗体。 １０、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の精製法であって、 不純なＦＳＨ源、およびマトリックスに結合したＦＳＨ
   に対するモノクローナル抗体を用意し；不純なＦＳＨを
   モノクローナル抗体−マトリックスに導通してＦＳＨを
   捕獲し；そして 捕獲されたＦＳＨをモノクローナル抗体−マトリックス
   から溶離する ことを含む方法。 １１、卵胞刺激ホルモンがヒツジ卵胞刺激ホルモン（ｏ
   ＦＳＨ）であり；そして マトリックスに結合したモノクローナル抗体がＢＦＲ８
   ７−７０およびＢＦＲ８７−１２４より選ばれる連続細
   胞系から産生される、 請求項１０に記載の方法。 １２、マトリックスがクロマトグラフィー用ゲルであり
   、溶離工程が０．１Ｍクエン酸塩／クエン酸溶液による
   段階的溶離を含む、請求項１１に記載の方法。 １３、請求項１０に記載の方法により調製された精製卵
   胞刺激ホルモン。 １４、雌性動物に請求項１３に記載の精製卵胞刺激ホル
   モンを有効量投与することを含む、雌性動物における発
   情誘発および／または生殖力増強法。 １５、処置される動物がヒツジまたはヤギであり、精製
   ＦＳＨの投与量が約２〜１０ｉｕである、請求項１４に
   記載の方法。 １６、さらに、ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に、
   動物にハイブリドーマ細胞系により産生された、ＦＳＨ
   に対する精製モノクローナル抗体約０．２５〜１．０ｍ
   ｇを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。 １７、処置される動物がウシであり、ＦＳＨの投与量が
   約２〜２０ｉｕである、請求項１４に記載の方法。 １８、さらに、ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に、
   動物にハイブリドーマ細胞系により産生された、ＦＳＨ
   に対する精製モノクローナル抗体約１．０〜３．０ｍｇ
   を投与することを含む、請求項１７に記載の方法。 １９、雌性動物に請求項１３に記載の精製ＦＳＨを有効
   量投与することを含む、雌性動物において１回の発情周
   期中に産生される卵子の数を実質的に増加させる方法。 ２０、処置される動物がヒツジまたはヤギであり、ＦＳ
   Ｈの投与量が約４〜２０ｉｕである、請求項１９に記載
   の方法。 ２１、さらに、ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に、
   動物にハイブリドーマ細胞系により産生された、ＦＳＨ
   に対する精製モノクローナル抗体約０．５〜２．０ｍｇ
   を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。 ２２、動物がウシであり、ＦＳＨの投与量が４〜２０ｉ
   ｕである、請求項１９に記載の方法。 ２３、さらに、ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に、
   動物にハイブリドーマ細胞系により産生された、ＦＳＨ
   に対する精製モノクローナル抗体約０．５〜３．０ｍｇ
   を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。 ２４、雌性動物に請求項１３に記載の精製ＦＳＨを有効
   量投与することを含む、雌性動物において双胎を形成す
   べく排卵を高める方法。 ２５、動物がヒツジ、ヤギまたはウシであり、ＦＳＨの
   投与量が約２〜２０ｉｕである、請求項２４に記載の方
   法。 ２６、さらに、ＦＳＨ投与と同時に、または投与後に、
   動物にハイブリドーマ細胞系により産生された、ＦＳＨ
   に対する精製モノクローナル抗体約０．０５〜１．０ｍ
   ｇを投与することを含む、請求項２４に記載の方法。 ２７、ハイブリドーマ細胞系により産生された、卵胞刺
   激ホルモン（ＦＳＨ）に対するモノクローナル抗体の有
   効量；および 獣医科用または医療用として受容できる、上記に対する
   希釈用賦形剤またはキャリヤー を含有する、獣医科用または医療用薬剤組成物。 ２８、さらに、請求項１３に記載の精製ＦＳＨを有効量
   含有する、請求項２７に記載の薬剤組成物。 ２９、精製ＦＳＨが精製されたヒツジ卵胞刺激ホルモン
   である、請求項２８に記載の薬剤組成物。 ３０、組成物が緩衝化食塩中の溶液である、請求項２９
   に記載の薬剤組成物。