CN1035128A - 抗促卵泡激素单克隆抗体及其制备和使用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及单克隆抗体及其制备方法和使用方
法。制备方法包括:提供一种能产生抗FSH的B细
胞和一种骨髓瘤细胞,将它们融合并繁殖,产生杂种
瘤细胞,采集杂种瘤细胞产生的抗体。使用方法包
括:将制备的单克隆抗体用于纯化FSH,并将制得的
纯FSH单独和将其与单克隆抗体合用于哺育动物,
以诱发雌性动物动情和(或)增强其生殖能力。
Description
本发明涉及单克隆抗体及其制备和使用方法。
促卵泡激素(FSH或follitropin)是由垂体分泌的一种糖蛋白激素。FSH及其它垂体糖蛋白激素(促黄体激素LH,促甲状腺素TSH)均由α亚基和β亚基构成,这些激素的α亚基是相同的,而β亚基却是不同的,它决定着各激素的特异性。
FSH与雄性动物和雌性动物的性功能有关,就雄性动物而言,FSH最重要的作用似乎是与精子成熟和营养有关,而对雌性动物来说,FSH起着促进卵发育和排卵的作用。在胚胎转移过程中,外源性FSH可用于加速排卵,或增加排卵,以得到更高的生殖力。然而,治疗动物的应答变化可能是主要问题,应答变化可能是因为批料变化和在FSH中存在污染物,尤其是有其它垂体糖蛋白激素、LH(促黄体激素)存在之故。
现有技术中,提取羊FSH(oFSH)已知的主要方法包括:
(ⅰ)利用乙醇和酸沉淀,由羔羊垂体腺制备oFSH粗提物(Sherwood,et al(1970)J.Biol Chem.245:2329-2336),
(ⅱ)硫酸铵沉淀(Reichcrt,L.E.in Methods in Enzymology Vol.xxxvll Fd.O′Malley B.W.and Hardman J.G.Academic Press Inc.N.Y.1975)。
按照该方法,通过分批加入冷乙醇或硫酸铵,沉淀出不需要的蛋白质。最后一次加入的乙醇或硫酸铵沉淀出活性组分及污染物。这些方法生产出含0.5-1.0iu/mg粗蛋白的FSH粗提物。
用垂体粗提物进一步提纯的步骤包括凝胶过滤和离子交换层析(Sherwood,et al,1970,Sairam 1979,Grinecti 1974),得到的纯化产品的效能为每mg总蛋白含110至188单位FSH。
但是这些方法带来大量花费,浪费时间而且从每个垂体腺中提取的产品量也很少,其结果难以大量满足兽医的使用,尤其是具有稳定效能的FSH。
因此,本发明的目的是克服或至少是减轻现有技术中诸多难点之一或几个难点。
因此,本发明首先提供一种抗促卵泡激素(FSH)的单克隆抗体的制备方法,该方法包括:
提供能产生抗FSH抗体的B细胞和骨髓瘤细胞;
使B细胞与骨髓瘤细胞融合;
并繁殖生成的杂种瘤细胞。
根据本发明制备单克隆抗体的方法还包括采集所述杂种瘤细胞产生的抗体。
能产生抗FSH抗体的B细胞可选自试验动物的脾细胞和淋巴细胞。该试验动物可以是小鼠、大鼠等。该B细胞可从用FSH免疫的动物或从其致免疫的组织中获得。BALB/C小鼠是最佳免疫动物。一次或多次免疫的动物可用作产生淋巴细胞或脾细胞的抗体源。最佳方法是用多次免疫的鼠的细胞用来制备融合细胞杂种。
骨髓瘤细胞可以是任何适宜的类型。现有技术中,众所周知的从淋巴细胞瘤中形成的专门骨髓瘤细胞系,已用于产生杂种瘤的融合过程。
有几个骨髓瘤细胞系可用来制备融合的细胞杂种,其中包括P3/x63-Ag8,NS-I型骨髓瘤细胞,例如P3/NSI/1-Ag4-1,Sp2/O-Ag14和S194/5XXO·BU·1。在本发明的实例中,NS-I型骨髓瘤细胞(取自BALB/C小鼠)是最佳细胞系。
为了产生抗体的脾细胞或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种细胞,按照本发明的融合步骤包括将体细胞与骨髓瘤细胞混合,混合比例大约为20∶1至1∶1,以10∶1为最佳。在能促进细胞膜融合的一种或数种试剂存在下,进行融合。理想的是将同类动物用作融合过程中使用的体细胞和骨髓瘤细胞源。所用的促融合剂可包括仙台(Sendai)病毒或聚乙二醇(PEG)。
因为融合方法在很低频率(例如当脾用作体细胞源时,大约每2×105个脾细胞只得到1个杂种)下产生能活的杂种细胞,所以最好有一种能从未融合细胞中尤其是未融合的骨髓瘤细胞中选出融合的细胞杂种的方法。在其它产生融合的细胞杂种中,一种测定所需的能产生抗体的杂种瘤的方法也是必需的。
通常挑选融合细胞杂种的方法是在培养基中培育这些细胞,所用培养基只容许杂种瘤细胞生长,而不容许无限分裂下去的骨髓瘤细胞生长。用次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸嘧啶(HAT)培养基来挑选融合细胞杂种,由于脾细胞的HPRT阳性基因型,则融合细胞杂种能在HAT培养基中幸存下来。在容许有遗传能力的杂种细胞生长的培养基中,挑选有各种遗传缺陷(如其它酶缺乏,药物敏感性等)的骨髓瘤细胞也是有可能的。
在杂种瘤细胞系的无性繁殖和挑选时,应用高分辨的检测方法有助于选择具有所需特异性的单克隆抗体。
可用几种标准分析法之任何一种,来检测能产生抗体的杂种细胞,这些方法包括酶联免疫测定法和放射免疫测定法。免疫组织法也可用于抗体测定和选择,最佳测定法是应用放射性碘标记的oFSH的双抗体放射免疫测定法,已经证明其它分析方法会导致假阳性结果。
一旦选择了所需融合的细胞杂种,并无性繁殖成为产生抗体的细胞系,则每个细胞系可以两种标准方法之任一种进行繁殖。杂种瘤的试样可注入组织相容的动物体内,该动物能提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射后,动物生出瘤,该瘤分泌出由融合细胞杂种产生的特异单克隆抗体。该动物的体液,如血清或腹水可穿刺放液,以提供高浓度单克隆抗体。另外,每个细胞系可在实验室培养皿中作体外繁殖。通过滗析、过滤或离心可获得含有高浓度单一特异性单克隆抗体的培养基。
本发明的目的之二是提供一种能产生抗促卵泡激素的单克隆抗体的连续细胞系,其中包括由能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合而形的杂种瘤细胞。
最好通过NS-I骨髓瘤细胞与用促卵泡激素免疫的BALB/C小鼠体中得到的脾B细胞融合,形成杂种瘤细胞系,羊促卵泡激素(oFSH)制剂可用来使上述小鼠免疫。
用由羔羊或猪垂体腺提取的FSH与佐剂的混合物,使小鼠免疫。杂种瘤细胞系生长于营养溶液组织培养基中。当通过稀释克隆反复地进行组织培养后分析纯度时,该细胞系给出以100%频率产生FSH特异克隆的抗体。
有意义的是杂种瘤细胞可稀释克隆,以确保单细胞系的选择。杂种瘤细胞至少可稀释克隆4次,杂种瘤细胞系的具体实例是标记为BFR87-70和BFR87-124的细胞系,培养它们对抗羊FSH。
上述试样保存于Bunge(Australia)Pty.Ltd.Cell Collection at 89 Flemington Road,North Melbourne,Australia。本文所述的发明并不局限于列举的杂种瘤细胞系范围,由于这些实施例旨在说明本发明的一种目的,因此,产生功能上相当的单克隆抗体的任何等效细胞系均在本发明范围内。下述杂种瘤细胞系试样已保藏在欧洲动物的细胞培养物收藏中心(ECACC)。
培养物 保藏号
BFR87-70
BFR87-124
本发明目的之三是提供一种抗促卵泡激素的单克隆抗体,该单克隆抗体是由能产生抗FSH的单克隆抗体的连续细胞系产生的,其中包括能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂种瘤。
可由如上所述的杂种瘤细胞系产生单克隆抗体。单克隆抗体的具体实例包括那些由杂种瘤细胞系标记为BFR87-70和BFR87-124形成的抗体,该细胞系的培养是为抗羊FSH。其样品保藏在Cell Collection facility of Bunge(Australia)Pty.Ltd.at 89 Flemington Road,North Melbourne,Australia。
本发明目的之四是提供一种纯化促卵泡激素(FSH)的方法,该方法包括:
提供一个不纯的FSH源和与一种基质结合的抗FSH的单克隆抗体;以及
将不纯的FSH通过单克隆抗体基质,以俘获FSH。
该提纯方法还包括将单克隆抗体基质俘获的FSH洗脱下来。
与基质结合的单克隆抗体可用上述的任一种单克隆抗体。
由于现有技术中公知方法均昂贵而耗时,并且产品纯度低,因此能纯化促卵泡激素的简易方法具有重要意义。纯化的FSH也具有重要意义,因为它在体内能提供更完善的生物学反应。例如,带有LH的污染物降低了所给的FSH的作用。就人用药物而言,高纯度的FSH是极需要的。
通过单克隆抗体的亲合色谱,纯化FSH的技术得以发展从而提供了一种方法,该方法有可能提供大批量高纯度的FSH。
高纯度的FSH比现有不纯的FSH产品具有某些独特的优点。比较起来,现有商品FSH的每批号间差异很大,在体内应答的质量很差。用本文所述从不纯的FSH批料中提纯FSH,即使存在批间差别也是微乎其微的,并且在体内提供了更完善的应答。用各种试验均能证明这种完善的应答。
本发明目的之五是提供一种纯化的促卵泡激素(FSH),最佳的纯FSH是纯羊FSH。
所用的基质可以是任何适宜类型,以色谱凝胶为最佳,可采用亲合色谱凝胶。从Bio-Rad实验室获得的市售商标为AFFIGEL10的凝胶是最适宜的。AFFIPREP10中15(从Bio-rad实验室获得)也较适宜。
将不纯的FSH通过单克隆抗体基质的步骤可以在任何适宜容器中进行,小规模纯化时可用亲合柱,而大规模纯化应采用大容器或大桶。该大容器或大桶通过旋转、振荡或搅拌以确保不纯的FSH和单克隆抗体基质之间充分接触。最适宜容器是旋转瓶。
可用任何适宜的洗脱液,从单克隆抗体基质上洗脱俘获的FSH。可用有机酸溶液,也可用各种pH缓冲液,用柠檬酸盐/柠檬酸缓冲液可除去柱中未结合的物质。
用PH约6.75至2.0的0.1M柠檬酸盐/柠檬酸溶液分阶洗脱是适宜的。
应用下述新技术可改进FSH的体内应答:
(ⅰ)高纯度FSH,和
(ⅱ)FSH的单克隆抗体。
本发明的目的之六是提供一种诱发雌性动物动情和/或增强其生殖力的方法,该方法包括给动物施加有效量的纯化促卵泡激素。由此诱导动物进入动情期和排卵。
本文在说明书和权利要求中所用术语“动物”包括家畜动物,如绵羊、山羊、牛和猪等,也包括人在内的其它动物。
对绵羊和山羊可施以约2至10iu的羊促卵泡激素,对牛可施以约2至20iu促卵泡激素。
本发明目的之七是提供一种增加雌性动物在动情周期内的排卵数(排卵加速)的方法。该方法包括对动物施以有效量纯促卵泡激素。排卵的数目至少可增加至最少时约5个,最佳时为15-20个。
对绵羊和山羊可施以约4至20iu促卵泡激素。
对牛可施以约4至20iu促卵泡激素。
业已公开促卵泡激素的单克隆抗体可阻滞和/或增强动物促卵泡激素的生物活性。
当FSH用于下述目的时,使用单克隆抗体控制体内FSH的生物活性是有利的。所述目的为:
(ⅰ)加速排卵;
(ⅱ)提高生殖力;以及
(ⅲ)控制动情周期。
因此,上述的方法还包括在给予动物FSH的同时或之后,再施以约0.25-3.0mg由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的纯单克隆抗体。
可利用上述加速排卵的特点,给予低剂量FSH以增强生殖力,即动情期的双生和多生。通过这些单克隆抗体与低剂量FSH合用,能较好地控制各特殊情况下的双生。由于双生是较容易的,而且更易重复,故不希望有的三生和多生的次数可减少。
本发明目的之八是提供一种通过增加排卵使雌性动物双生的方法,该方法包括对动物施以有效量纯化的促卵泡激素。
待试验动物最好是绵羊、山羊或奶牛,施用的促卵泡激素的量约为2至20iu。
增加排卵使之双生的更好方法还包括施以促卵泡激素的同时或之后,对动物施以约0.50至1.0mg由杂种瘤细胞系生成的抗促卵泡激素的纯单克隆抗体。
本发明中诱发动情和/或提高生殖力的方法还包括在施以约FSH的同时或之后,对需处理动物再施以有效量的由杂种瘤细胞系生成的抗促卵泡激素单克隆抗体。
该单克隆抗体可以是上述任何一种抗体,并可以任何适宜的有效量施用,对绵羊和山羊可施以约0.25至1.0mg,牛可施以约1.0至3.0mg,猪可施以约0.2至0.5mg。
就加速排卵的方法而言,对绵羊和山羊可施以约0.5至2.0mg单克隆抗体,牛可施以约0.5至3.0mg。
当施以FSH单克隆抗体以控制体内的FSH时,最好精确估计所需剂量。
适宜的抗体剂量取决于下述几个变量:
(ⅰ)所选择的单克隆抗体;
(ⅱ)FSH剂量;
(ⅲ)FSH注入后抗体注入的时间;
(ⅳ)所用动物种类;
(ⅴ)动物的大小;以及
(ⅵ)动物预处理的次数。
对于母羊和奶牛,使用单克隆抗体控制体内FSH无论是为了加速排卵以增强生殖力即双生,还是为了诱发动情,上述这些方法也同样适用于山羊、人、狗、猫、猪和其它哺乳动物。
所需抗体的有效剂量随所用的抗体、动物的种类、FSH的治疗剂量和注射FSH后施药的时间而变化。例如,就最佳状态而言,将约15至20iuFSH注入母羊,我们发现,根据上述的变量,可用约0.05至0.50mg抗体。该单克隆抗体可以与FSH同时给药,或在FSH之后给药。
在施以FSH的同时或在其之后施以单克隆抗体可改变FSH的生物活性,这种改变可降低或增强FSH的活性,FSH生物活性的增强和降低都可归入同一生物活度。用“FSH-抗体”复合物可使FSH的效力强加5-10倍是可能的。
FSH和单克隆抗体分先后给药和同时一起或分别给药可形成抗体-FSH复合物,增强FSH的活性,导致更大的生物活性。
同样,形成的抗体-FSH复合物不同可有效地降低FSH或已复合的FSH的生物活性,活性降低的原因是复合物的形成使FSH的生物活性消失。
本发明目的之九是提供一种测定动物促卵泡激素(FSH)的方法。该测定方法可用免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法或凝集法。就IgM免疫球蛋白类单克隆抗体而言,采用凝集测定法为最佳。血凝集测定法是最佳的。
就最佳状态而言,以血凝集延缓测定法为佳。
试验样可以是任一种适宜的样品,可采用血清、血浆、唾液或尿,或它们的提取物为样品。
显然可用目视法鉴定FSH的存在,FSH主要存在于血清中,结合在单克隆抗体的有效键合位置上。当加入被哺乳动物红细胞包复的FSH时,没抗体与此抗源有效地结合,结果导致抑制凝集作用。未凝集细胞在容器底部滑动,形成细胞黑点。
容器可以是任一种适宜容器,可用微滴定板或微滴定盘或试管。以圆底形微滴定板或盘为佳。可采用单克隆抗体作为溶液,可用磷酸盐缓冲液。
本发明目的之十是提供一种能改变哺乳动物FSH生物活性的兽用或药用组合物,其中包括以单位剂形供给的有效量单克隆抗体,该单克隆抗体选自以上所述的抗体或其混合物。
该兽用或药用组合物还包括兽药可接受的或药物可接受的稀释载体或其赋形剂。可以溶液的形式提供单克隆抗体,可用缓冲磷酸盐缓冲液。
现以下述实施例更充分说明本发明,然而应理解,这仅仅为了说明而不应视作对以上所述的发明内容的限制。
实施例
FSH单克隆抗体的制备
对BALB/C小鼠腹膜内注入5mg oFSH或pFSH的纯制剂(50iu/mg,根据Reichert(1957年)法沉淀的硫酸铵,接着经几次离子交换层析步骤,用1∶1的完全弗罗因德氏佐剂(FCA)乳化的50μl PBS。这种免疫步骤一周内重复4次。在最终注射后一周,通过放射免疫法(RIA)测定小鼠血清中的FSH的反应性和特异性,血清取自小鼠尾巴。在融合前4天,通过尾静脉注射100μg相同纯度的oFSH或pFSH(50iu/mg)(溶于0.1mlPBS中),以提高具有最高血清滴定度的小鼠的免疫力。
已接触抗原的小鼠断头致死,在无菌操作下摘除脾脏,放在10mlGKN(1升二次蒸馏水中含0.8g NaCl,0.4gKCl,1.42g NaHPO4,2H1O,2.0gD葡萄糖和0.01g酚红)中,用针挑开该脾组织取得脾细胞。通过离心收集细胞。离心收集(200g5分钟,室温)生长于组织培养基〔Dulbecco′s氏改良的Fagles培养基、DME和0.2%(重量/体积)碳酸氢钠〕中的NS-I骨髓瘤细胞(2×107)P3/NSI/1-Ag4-1,并且重悬浮于10mlGIN溶液中。
在室温下,于50ml离心管(Falcon)中混合脾细胞和NS-I骨髓瘤细胞,并于70g离心5分钟,倒掉上清液,留下细胞,慢慢地轻拍该管子,使这些细胞重悬浮于极少量剩余的上清液中形成浆液,然后将1.5ml 50%的聚乙二醇无菌液于37℃在缓慢搅拌下加入该浆液中,90秒钟加完。该聚乙二醇(PEG,Art,9727聚乙二醇4000,Merck)无菌液是在密封容器中用1.0ml二次蒸馏水压热灭菌处理1.0gPEG而制得。再混合30秒钟后,在2分钟内于37℃谨慎地加入GKN,接着在3分钟内再加入8ml。最后沿离心管壁缓慢加入30ml GKN。
该细胞悬浮液在室温下立即以70g离心3分钟,倒掉上清液在重悬浮于100mlHAT选择性培养基(每l培养基含13.6mg次黄嘌呤、0.19mg氨基蝶呤和3.87mg胸腺嘧啶的组织培养基)之前,缓慢地轻拍该管,使形成细胞浆液。然后,将细胞悬浮液试样(0.5ml)加到8个一组的24#平底Linbro板(Flow实验室)的每个#中,每个#含有1.5mlHAT选择培养基(含1.5×106鼠胸腺细胞),在融合前一天制备胸腺细胞,并在湿润的5%CO2的环境中,于37℃下培养过夜。
在融合后13天,用RIA和组织免疫法测定上清液。在96#平底Linbro板中,选择的细胞用HAT选择培养基的胸腺细胞稀释克隆。
放射免疫测定法
通常将ELISA(酶连接免疫吸附剂测定)系统作为检测杂交瘤细胞上清液中单克隆抗体的方法。然而,在这类系统中,抗原产生于固相,即,粘附于塑性的ELISA板,由此许多科学家发表了不可靠的结果(Miller,K.F.,Goldsby,R.A,and Bolt,D.J.J.Endocr.(1987),115:283-288)。为测试抗体(这种抗体要求供液相应用使用,即:对抗体进行亲合性的色谱并将其注入动物,作为对FSH活性的抑制剂),研究开发了一种液相测定技术,下面对此进行描述。
一开始用双抗体RIA测定分泌羊FSH抗体的杂种瘤细胞。用碘精(Pierce,United States of America)放射碘化oFSH的纯制剂(75iu/mg,取自NIH Bethesda,United States of America)。在这一方法中,在玻璃管壁涂有1.2mg碘精情况下,将5ugoFSH与0.5mg125I(Amersham IMS 30)和50μl 0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.4)一起培养,在室温下培养10分钟后,用10ml G-25色谱柱从游离125I中分离出碘化的oFSH(125I-oFSH)。
将杂种瘤细胞上清液(100μl)加到装有含每分钟计数(CPm)125I-oFSH为约100,000的100μl0.1%BSA/PBS的聚苯乙烯试管(3DT管,Johns)中,在室温下培养2小时后,加入100μl第二种沉淀抗体,该第二抗体是从免子体内得到的抗鼠抗体(RAM,affinity Purified Silenus Laboratories),共轭于Spharose 4B(CnBr-Sepharose 4B,Pharmacia)旋转振荡后试管在室温放置1小时,加入1ml冷(4℃)磷酸盐缓冲液,在4℃下,这些管子立即以3,000rpm离心15分钟,抽出上清液中结合125I-oFSH的非抗体,用γ分光光度计计算含oFSH的125I-oFSH单克隆抗体的沉淀。
免疫组织法
从本地屠场收集新鲜组织(垂体腺),置于Bouins溶液中固定2小时,然后置于甲醛液中过夜。修整该组织后,置于4℃的无水乙醇中,每小时换一次乙醇,换四次;然后在室温下置于二甲苯中,换四次二甲苯;最后置于56℃液化的石蜡中,通过上述步骤,组织被包埋于石蜡中,然后让其在4℃固化过夜。
用超荡切片刀(Leitz)将石蜡包埋的组织切成6μm厚的组织薄片,并将其浮于取自1%凝胶(重量/体积)温水浴的载物玻璃片上,然后将载物玻璃片在37℃保温过夜,使组织切片粘牢。在使用前,把该切片放在下述每种溶液中分别保温5分钟再水合,所述溶液为:二甲苯、无水酒精、淡无水酒精、70%酒精和流动水。
把杂种瘤细胞的净上清液直接置于载物玻璃板上的组织切片上,在室温下,将载物玻璃片置于潮湿盒子里保温2-3小时。在用PBS轻度漂清后,用共轭于马小萝卜过氧化物酶(RAM-HRP,Dakopatt,Denmar)的免抗小鼠IgG覆盖,该IgG是用含2%正常绵羊血清的PBS稀释(1∶75)。然后,再保温1小时,冲洗后,将载物玻璃片浸入基质液中,该基质液是将0.14g 3,3′-二氨基苄基咪四氯化物溶于250ml0.01M柠檬酸缓冲液(PH5)和250μl30%过氧化氢中制得。在10分钟后,停止该反应,用蒸馏水冲洗该载物玻璃片。
用哈里斯苏木精和碳酸锂复染色,然后分别用70%酒精、无水酒精、新蒸馏的无水酒精、二甲苯和新蒸馏二甲苯冲洗1分钟,以固定染色。如果用本文献介绍的典型方法染色垂体细胞细胞质,对FSH抗体来说可认为上清液是阳性的。
结果
在对oFSH免疫的小鼠脾细胞上进行的细胞融合生产出两种能产生oFSH抗体的杂种瘤细胞(结果见表1)。
表1
RIA 组织法
BFR87-70 30% +
BFR87-124 24% +
a,总的125I-oFSH的最大结合;
b,+表示垂体细胞细胞质的染色。
将FSH的单克隆抗体通过亲合色谱可改进FSH制剂的生物活性。当FSH与单克隆抗体偶合时,也能提高注入的FSH效力。
通过亲合色谱层析,从粗提物中提取的具有生物活性的纯FSH
能证实抗体的特异性,也可精确测定FSH的生物特性。
取每种单克隆抗体约200mg(取自细胞培养基或腹水)进行纯化,并与凝胶Affigel 10偶合(16mg/ml)。为了建立最佳偶合和洗脱条件使用少量(200μl)凝胶制备亲合凝胶柱。通过在200μl不同PH值的缓冲液中保温10μl凝胶研究了这些最佳条件。在室温下1个小时后,这些试管经离心,抽出未结合的125I-oFSH,然后用γ分光光度计测定含125I-oFSH的凝胶。
BFR87-70的最佳结合
缓冲液 结合计数 结合率%
0.1 乙醇胺-HCl pH11.0 2,610 2
PBS 磷酸盐 pH7.4 68,920 47
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH7.0 64,490 44
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH6.0 58,710 40
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH5.5 54,240 37
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH5.0 53,270 36
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH4.5 38,460 26
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH4.0 19.550 13
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH3.5 3,820 2.6
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH3.0 3,490 2.4
为获得最佳洗脱条件,在一系列试管中加入10μl凝胶和用PBS稀释的125I-OFSH,然后保温,结合有125I-oFSH的那些试管,加入不同PH值的缓冲液继续保温,接着离心和计数。
BFR87-70的最佳洗脱
缓冲液 结合计数 洗脱率%
0.1 乙醇胺 pH11.0 8,270 91
PBS pH7.4 90,780 0
0.1M 磷酸盐 pH7.0 86,560 6
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH6.0 85,180 8
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH5.5 80,120 8
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH5.0 77,010 21
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH4.5 35,800 46
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH4.0 27,380 67
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH3.5 12,160 87
0.1M 柠檬酸盐/柠檬酸 pH3.0 9,160 91
*对照组的第一次保温用PBS
最佳结合是用PBS作为结合缓冲液,而将125I-oFSH从凝胶基质上最完全洗脱下来是用0.1M柠檬酸盐/柠檬酸(PH3.0)缓冲液,由于FSH在PH3时不易受损害,故最好用PH3而不用PH11.0的缓冲液洗脱,详见图1。
用2ml柱做试验表明该方法是适宜的(表2)。
表 2
亲合柱(2ml)
加入125I-oFSH 3,047,800
洗涤计数 840,000(28%)
键合计数 2,200,000(72%)
用PH3.0柠檬酸盐/柠檬酸洗脱计数2,116,550键合计数的96%
可用柱或分批法进行大规模试验。可采用Steelman和Pohley所介绍的FSH的hCG增强测定法(Endocrinology,53:604-616,1953),或利用Maughium-Rogister等的猪试验受体测定法(Eur.J.Biochen.86:121-131,1978)测试亲和纯化的FSH的生物活性。
这种经过纯化制得的FSH,可保证其以精确的剂量给出。原始制剂中存在的原料变化及产生的问题可得到缓解。
这些羊和猪FSH的抗体可用于促进FSH活性的研究方法是:将生物FSH和其抗体偶合,并将该复合体注入试验对象体内。这种处理可显著降低FSH的剂量率,由于纯化FSH的成本较高,因此也可降低对FSH进行处理的费用。
最后,应该意识到,可作出各种其它的改进和/或变换,而不脱离这里所述的本发明的精神。
Claims (30)
1、一种抗促卵泡激素(FSH)的单克隆抗体的制备方法,该方法包括:
提供一种能产生抗FSH抗体的B细胞和一种骨髓瘤细胞;
使B细胞与骨髓瘤细胞融合;
并繁殖融合生成的杂种瘤细胞;以及
采集所述杂种瘤细胞产生的抗体。
2、根据权利要求1的方法,其中能产生抗体的B细胞可从用羊促卵泡激素(oFSH)免疫的动物或从其致免疫的组织中获得;以及
骨髓瘤细胞系是一种NS-I型骨髓瘤细胞系。
3、根据权利要求2的方法,其中融合步骤包括在选自仙台(Sendai)病毒和聚乙二醇的促融合剂存在下,将体细胞与骨髓瘤细胞混合。
4、根据权利要求3的方法,其中杂种瘤细胞繁殖步骤包括:
利用放射免疫测定法和免疫组织法测定产生抗体的杂种瘤细胞;
接着将选择融合的细胞杂种无性繁殖成为产生抗体的细胞系;以及
每个细胞系在体内或体外繁殖。
5、产生抗促卵泡激素的单克隆抗体的连续细胞系包括由能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合而形成的杂种瘤细胞。
6、通过NS-I骨髓瘤细胞与用羊促卵泡激素免疫的BALA/C小鼠体中得到的B细胞融合,形成根据权利要求5所述的连续细胞系。
7、连续细胞系选自上述的BFR87-70和BFR87-124。
8、由产生抗促卵泡激素单克隆抗体的连续细胞系产生的抗促卵泡激素单克隆抗体包括能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂种瘤细胞。
9、由选自上述的BFR87-70和BFR87-124连续细胞系产生的单克隆抗体。
10、一种纯化促卵泡激素(FSH)的方法,该方法包括提供一个不纯的FSH源和与一种基质结合的抗FSH的单克隆抗体;将不纯的FSH通过单克隆抗体基质,以俘获FSH,以及将俘获的FSH从单克隆抗体基质洗脱下来。
11、根据权利要求10的方法,其中促卵泡激素是一种羊促卵泡激素(oFSH);与基质结合的单克隆抗体选自上述的BFR87-70和BFR87-124。
12、根据权利要求11的方法,其中所述基质是色谱凝胶,所述洗脱步骤包括用0.1M柠檬酸盐/柠檬酸溶液分阶洗脱。
13、用权利要求10的方法制备纯促卵泡激素。
14、一种诱发雌性动物动情和/或增强其生殖力的方法,该方法包括给动物施以权利要求13所述的有效量的纯化促卵泡激素。
15、根据权利要求14的方法,其中处理动物是绵羊或山羊,纯FSH的给药量约2至10iu。
16、根据权利要求15的方法,还包括在给予动物FSH的同时或之后,再施以约0.25-1.0mg由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的单克隆抗体。
17、根据权利要求14的方法,其中处理动物是奶牛,施用的FSH的量约为2至20iu。
18、根据权利要求17的方法,还包括施以FSH的同时或之后,对动物施以约1.0至3.0mg由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的纯单克隆抗体。
19、一种在雌性动物一个动情期内显著增加产卵数的方法,该方法包括给动物施以根据权利要求13所述的有效量纯FSH。
20、根据权利要求19的方法,其中处理动物是绵羊或山羊,施用的FSH的量约为4至20iu。
21、根据权利要求20的方法,还包括施以FSH的同时或之后,对动物施以约0.5至2.0mg由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的纯单克隆抗体。
22、根据权利要求19的方法,其中所述动物是奶牛,施用的FSH的量为4至20iu。
23、根据权利要求22的方法,还包括施以FSH的同时或之后,对动物以由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的纯单克隆抗体。
24、一种增加排卵使雌性动物双生的方法,该方法包括对动物施以根据权利要求13所述的有效量纯FSH。
25、根据权利要求24的方法,其中所述动物是绵羊、山羊或奶牛,施用的FSH的量约为2至20iu。
26、根据权利要求24的方法,还包括施以FSH的同时或之后,对动物施以由杂种瘤细胞系生成的抗FSH的纯单克隆。
27、一种兽用或药用组合物,其中包括由杂种瘤细胞系生产的抗促卵泡激素(FSH)的有效量单克隆抗体;以及
一种兽药或药物可接受的稀释赋形剂或其载体。
28、根据权利要求27所述的药用或兽用组合物,其中还包括根据权利要求13所述的有效量纯FSH。
29、根据权利要求28的兽用或药用组合物,其中所述纯促卵泡激素是一种纯羊促卵泡激素。
30、根据权利要求29的兽用或药用组合物,其中所述组合物是一种缓冲盐水溶液。
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