CN111596074A - 一种检测牛生育能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测牛生育能力的方法，包括：收集母牛的晨尿或在上次小便后1‑2小时再小便的尿液；将牛的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中5‑‑10秒，于15‑18分钟后，观察试纸质控线C未显色、检测线T显色，检测结果无效；质控线C显色，检测线T未显色，牛的促卵泡生成素FSH水平正常；质控线C及检测线T都显色，与FSH比色卡进行对比；FSH＜5mIU/ml，牛生育能力正常；FSH为5‑‑10mIU/ml，牛生育能力下降；FSH＞10mIU/ml，牛无生育能力，弥补现有技术不能直接检测牛的生育能力，失去更多配种机会，有效提高繁殖率，减少经济损失，提高牛的生产效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种检测牛生育能力的方法，属于动物检测方法技术领域。
背景技术
目前牛的生育能力通常会在牛成年之后通过空怀期、受配百分比、输精受孕率、流产率、犊牛死亡率等指标进行评估。现有技术的弊端在于：一头母牛从出生至初次发情期需要16---22个月，公牛性成熟需大于24--36个月，当公牛或母牛至配种年龄时，如不能正常配种，就会带来经济损失。由于灵长类及其它多种哺乳动物胚胎期的血浆中，促卵泡生成素含量要在胚胎中期才会出现一个峰值，到了胚胎后期又会逐渐下降，并持续到生产期。刚出生的犊牛生殖器官处于静止状态，下丘脑促性腺激素对卵巢或睾丸激素的负反馈作用敏感。
发明内容
鉴于牛的上述生理特征，本发明提供一种检测牛生育能力的方法，以准确检测牛的生育能力，以便进行早期遗传选育，为后期配种成功率提供可靠技术支持，减少牛的空怀率，提高牛的生产效益。
本发明通过下列技术方案实现：一种检测牛生育能力的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）收集母牛的晨尿或在上次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；
2）将牛的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
试纸质控线C显色，检测线T未显色，仅表明牛的促卵泡生成素FSH水平正常，需要隔日检测；
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
当FSH＜5mIU/ml，表明牛生育能力正常；
当FSH为5--10mIU/ml，表明牛生育能力下降；
当FSH＞10mIU/ml，表明牛无生育能力。
所述步骤2）牛的促卵泡生成素FSH检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
FSH包被液：将100-200mg牛的促卵泡生成素单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将FSH包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；
23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得牛的促卵泡生成素FSH检测试纸。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可方便、简单、快速、准确地检测出牛是否具备生育能力，以便更早地在出生后就能检测牛是否具备正常的生育能力，弥补现有技术不能直接检测牛的生育能力，仅能通过成年牛是否发情来作出生育能力的判断，进而失去更多配种机会而造成经济损失，同时解决无生育能力牛按有生育能力牛进行饲养和管理所造成的经济损失，一方面可有效提高繁殖率，另一方面可大大减少无生育能力牛不必要的经济损失，促进牛的集约化管理，提高牛的生产效益。
附图说明
图1为FSH检测试纸条的结构示意图；
图2为FSH比色卡图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
牛的促卵泡生成素FSH检测试纸经过下列方法制备：
1）按下列制备各组分：
11）金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
12）封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
13）样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
14）胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
15）FSH包被液：将100mg牛的促卵泡生成素单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
16）IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
上述各组分的量是用于5块6cm×30cm的PVC板，每块PVC板切为100条6cm× 3mm的试纸条；
2）在底板上划膜
2A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
2B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将步骤16）的IgG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将步骤15）的FSH包被液均匀地划在5块底板上的NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
3）金垫制备
3A）在100ml步骤11）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul步骤12）的封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 步骤14）的胶体金结合物稀释液混匀，得45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液；
3B）将步骤3A）的45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液均匀铺在5块玻璃纤维素膜RB65上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为6mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
4）样本垫制备
4A）按30ml/张的量，将步骤13）的样本垫处理液均匀铺在5块玻璃纤维素膜SB06上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为20mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，装盒，得牛的促卵泡生成素FSH检测试纸。
实施例2
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集母牛的晨尿8ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中6秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效；
次日重复步骤1）、2），观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色，显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
FSH＜5mIU/ml，表明该牛生育能力正常。
实施例3
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集母牛上次小便后1-2小时再小便的尿液7ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中9秒，取出，于17分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母牛的促卵泡生成素FSH水平低下，于第三日重复步骤1）、2）进行检测，结果显示：试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；FSH为10mIU/ml，表明该牛的生育能力下降。
实施例4
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集牛的晨尿8ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中10秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
FSH为25mIU/ml，表明该牛无生育能力。
实施例5
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集牛上次小便后2小时再小便的尿液9ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中9秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
FSH为2mIU/ml，表明该牛的生育能力正常。
实施例6
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集牛的上次小便后1小时再小便的尿液7ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中6秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
FSH=5mIU/ml，表明该牛的生育能力在下降。
实施例7
检测牛生育能力的方法，包括下列步骤：
1）收集母牛的晨尿6ml；
2）将实施例1的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中8秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效；
次日重复步骤1）、2），观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色，显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
FSH为2mIU/ml，表明该牛的生育能力正常。
下面通过对比实验证明本发明的效果：
采用实施例3-6的方法，分别对120头牛进行检测，其中将120头牛分为四组，每组30只，分别用与实施例3-6相同的方法进行检测，检测结果如下：
第一组有24头具有生育能力，通过发情期配种后，有22头受孕，之后产小牛；第二组有26头具有生育能力，通过发情期配种后，有24头受孕，直到产小牛；第三组有25头具有生育能力，通过发情期配种后，25头全部受孕，直到产小牛；第四组有27头具有生育能力，通过发情期配种后，有25头受孕，直到产小牛，准确率为95%。
Claims (2)
1.一种检测牛生育能力的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）收集母牛的晨尿或在上次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；
2）将牛的促卵泡生成素FSH检测试纸插入步骤1）的尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
试纸质控线C显色，检测线T未显色，仅表明牛的促卵泡生成素FSH水平正常，需要隔日检测；
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与FSH比色卡进行下列对比；
当FSH＜5mIU/ml，表明牛生育能力正常；
当FSH为5--10mIU/ml，表明牛生育能力下降；
当FSH＞10mIU/ml，表明牛无生育能力。
2.根据权利要求1所述的检测牛生育能力的方法，其特征在于所述步骤2）牛的促卵泡生成素FSH检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
FSH包被液：将100-200mg牛的促卵泡生成素单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将FSH包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；
23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得牛的促卵泡生成素FSH检测试纸。
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