CN111596073A - 一种检测羊早期妊娠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测羊早期妊娠的方法，包括：在母羊配种后的第7‑‑14天，采集羊血或尿液；将羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入血清或者尿液中5‑‑10秒，于15‑18分钟后，试纸质控线C未显色、检测线T显色，检测结果无效；质控线C显色，检测线T未显色，母羊的HCG水平低下；质控线C及检测线T都显色，与HCG比色卡进行对比；HCG＜10mIU/ml,母羊没有怀孕；HCG≧10mIU/ml,母羊可能怀孕，需要连续检测两次，两次检测的HCG在上升，且后一次是前一次的1‑2倍，母羊怀孕，且为活胎；两次检测的HCG维持不变或下降，表明母羊怀孕，但胚胎停育，采取保胎措施或停止妊娠。

Description

一种检测羊早期妊娠的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种检测羊早期妊娠的方法，属于动物检测方法技术领域。
背景技术
目前，羊的妊娠检测主要通过外部观察法和试情法来完成，即在母羊配种后17至21天，观察母羊是否返情来判断该母羊是否妊娠，但在实际观察中，当羊胚胎停止发育，母羊在短时间内是不会发情的，即处于假妊娠状态。现有技术也有超声波检测、免疫学检测、红细胞凝集检测、血清酸滴定检测等等，其中：超声波检测是利用超声波的物理特性，把超声波的物理特性和动物组织结构的声学特点密切结合进行检测，该法需要在羊配种40天后才能测出羊是否妊娠，60天后准确率才能达到100%；免疫学检测是利用妊娠前后母羊血清、粪便和尿液中的激素和一些未知物质进行检测，根据其含量来判断母羊是否妊娠，由于这些激素在妊娠和未妊娠羊血清中，会因品种、个体差异等因素的影响，目前还很难在生产中推广；红细胞凝集检测是将妊娠早期母羊体内特异性抗原与红细胞相结合，用其制备抗血清，与妊娠10---15天的母羊红细胞混合时会发生红细胞凝集现象，如未妊娠，则不发生红细胞凝集现象，此法对母羊妊娠28---60天的准确率为90%，但母羊胚胎停止发育后也会发生红细胞凝集现象，容易导致母羊长期处于假妊娠状态；血清酸滴定检测是母羊在胚胎快速生长过程中，机体生产出一种特有的免疫球蛋白，在酸性环境中与其它蛋白质形成低溶性复合物（絮状物）的特性，准确率可达90.81%，但母羊胚胎停止发育后也会发生与其它蛋白质形成低溶性复合物（絮状物）的特性，仍然会导致母羊处于假妊娠状态，同时操作过程繁琐，并且需要在18--25度的室温环境下才能进行，不利于现场检测。因此，有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明正是为解决现有技术存在的上述不足，提供一种检测检测羊早期妊娠的方法，以准确掌握羊是否妊娠以及其胚胎是否存活，减少羊假妊娠、空怀胎所造成的经济损失，缩短母羊的非繁殖天数，及时对妊娠母羊进行合理的饲养和管理，提高繁殖效率，促进羊的集约化管理，提高羊的生产效益。
本发明通过下列技术方案完成：一种检测羊早期妊娠的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第7---14天，采集1--10 ml母羊血于阴凉处静置1-2小时，分离出血清，或者收集母羊在上次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；
2）将羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清或者尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母羊的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，需要隔日进行检测；
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡进行下列对比；
31）当促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml,表明母羊没有怀孕；
32）当促绒毛膜性腺激素HCG≧10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
33）当步骤32）的两次检测结果的HCG在上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母羊怀孕，且为活胎；
34）当步骤32）的两次检测结果的HCG维持不变或下降，表明母羊怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊娠。
所述步骤2）羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
HCG包被液：将100-200mg羊的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将HCG包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；
23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可在母羊配种后的第7---14天，取血样或尿样，对羊的早期妊娠进行简单、方便、快速、准确的检测，比现有技术更早地知道羊是否妊娠以及胚胎是否存活，弥补了现有技术仅能判断羊是否妊娠，却不能反应羊胚胎是否存活，进而带来假妊娠、空怀胎所造成的经济损失，以便尽快消除假妊娠、空怀胎，让母羊尽早恢复正常，缩短母羊的非繁殖天数，同时对正常的妊娠母羊进行对应的饲养和管理，一方面提高羊的繁殖效率，另一方面减少种羊哺乳之后的死亡率，促进羊的集约化管理，提高羊的养殖效益。
附图说明
图1为HCG检测试纸条的结构示意图；
图2为HCG比色卡图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：
1）按下列制备各组分：
11）金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
12）封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
13）样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
14）胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
15）HCG包被液：将100-200mg羊的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；
16）IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
上述各组分的量是用于5块6cm×30cm的PVC板，每块PVC板切为100条6cm× 3mm的试纸条；
2）在底板上划膜
2A）将NC膜贴分别贴在5块PVC板上表面的中部，得底板；
2B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将步骤16）的IgG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将步骤15）的HCG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
3）金垫制备
3A）在100ml步骤11）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul步骤12）的封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 步骤14）的胶体金结合物稀释液混匀，得45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液；
3B）将45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液均匀铺在5块玻璃纤维素膜RB65上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为6mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
4）样本垫制备
4A）按30ml/张的量，将步骤13）的样本垫处理液均匀铺在5块玻璃纤维素膜SB06上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为20mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）每一块贴板的制备
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤5C）的每一块贴板切割成100条6cm×3mm的试纸条，装盒，共得500条促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸，每一条促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸的结构如图1。
实施例2
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第7天，利用采血针与抗凝血管从母羊颈脖静脉处采集1ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效；
当即重复步骤1）、2），观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色，显色结果如下：
试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母羊的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，母羊没有怀孕，等待下一个发情期再配种。
实施例3
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第7天，利用采血针与抗凝血管从母羊颈脖静脉处采集1ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C显色，检测线T未显色，仅表明羊的促绒毛膜性腺激素HCG水平正常，二天后重复步骤1）、2）进行检测，结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml,表明母羊没有怀孕，等待下一个发情期再配种。
实施例4
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第8天，利用采血针与抗凝血管从母羊颈脖静脉处采集5ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清中10秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG=10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
32）步骤31）的两次检测结果的HCG在上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母羊怀孕，且为活胎，即按常规对母羊进行妊娠饲养，直至半年后产小羊。
实施例5
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第14天，收集母羊在上次小便后2小时再小便的尿液5ml；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
32）步骤31）的两次检测结果的HCG不变，表明母羊怀孕，但胚胎停育，按常规采取保胎措施，之后恢复妊娠，并按常规对母羊进行妊娠饲养，直至半年后产小羊。
实施例6
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第10天，收集母羊在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
32）步骤31）的两次检测结果的HCG下降，表明母羊怀孕，但胚胎停育，按常规采取措施终止妊娠。
实施例7
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第12天，利用采血针与抗凝血管从母羊颈脖静脉处采集10ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清中6秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG=10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
32）步骤31）的两次检测结果的HCG在上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母羊怀孕，且为活胎，即按常规对母羊进行妊娠饲养，直至半年后产小羊。
实施例8
检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第9天，收集母羊在上次小便后1.5小时再小便的尿液3ml；
2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；
31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
32）步骤31）的两次检测结果的HCG上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母羊怀孕，且为活胎，按常规对母羊进行妊娠饲养，直至半年后产小羊。
上述HCG比色卡均为常规产品。
下面通过对比实验证明本发明的效果：
采用实施例4-7的方法，分别对120只母羊进行检测，其中将120只羊分为四组，每组30只，分别用与实施例4-7相同的方法进行检测，检测结果如下：
第一组有26只怀孕，且为活胎，4只没有怀孕；第二组有22只怀孕，有18只活胎受孕，4只胚胎停育，8只没有怀孕；第三组有25只怀孕，有20只活胎，5只胚胎停育，5只没有怀孕；第四组有27只怀孕，有25只活胎，2只胚胎停育，3只没有怀孕。准确率为100%。

Claims (2)

1.一种检测羊早期妊娠的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）在母羊配种后的第7---14天，采集1--10 ml母羊血于阴凉处静置1-2小时，分离出血清，或者收集母羊在上次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；
2）将羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清或者尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母羊的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，需要隔日进行检测；
试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡进行下列对比；
31）当促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml,表明母羊没有怀孕；
32）当促绒毛膜性腺激素HCG≧10mIU/ml, 表明母羊可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；
33）当步骤32）的两次检测结果的HCG在上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母羊怀孕，且为活胎；
34）当步骤32）的两次检测结果的HCG维持不变或下降，表明母羊怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊娠。
2.根据权利要求1所述的检测羊早期妊娠的方法，其特征在于所述步骤2）羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
HCG包被液：将100-200mg羊的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将HCG包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；
23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得羊的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸。
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