JPH05304979A - モノクローナル抗体 - Google Patents

モノクローナル抗体

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JPH05304979A
JPH05304979A JP4051415A JP5141592A JPH05304979A JP H05304979 A JPH05304979 A JP H05304979A JP 4051415 A JP4051415 A JP 4051415A JP 5141592 A JP5141592 A JP 5141592A JP H05304979 A JPH05304979 A JP H05304979A
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JP
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cells
cell line
medium
rat
rats
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JP4051415A
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English (en)
Inventor
Cesar Milstein
シザー・ミルスタイン
Bruce W Wright
ブルース・ウィリアム・ライト
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BTG International Ltd
Original Assignee
British Technology Group Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines

Abstract

(57)【要約】 【目的】 親細胞由来の免疫グロブリン鎖が混入しな
い、ラット骨髄腫細胞のハイブリドーマにより生産され
るモノクローナル抗体を供給する。 【構成】 ８−アザグアニンに対し耐性であり、ヒポキ
サンチン／アミノプテリン／チミジンを含む培地におい
て死滅し、免疫グロブリン鎖を発現する能力を欠くラッ
ト骨髄腫セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０、またはそ
れを継代することにより得られかつ上記特性を有するそ
の変異株を、免疫原で感作された免疫細胞と細胞融合さ
せ、得られたヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジ
ンを含む培地中で死なないハイブリッド骨髄腫セルライ
ンによって生産されるモノクロナール抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセルラインおよびそのモ
ノクローナル抗体の生産への使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】適当な親セルラインから細胞融合技術に
よって誘導されるセルラインからの単クローン性の抗体
の生産が最近かなりの注目を集めてきた。まず、免疫を
有するマウスまたはラットからの細胞と融合させる親セ
ルラインとして一種または数種のマウス骨髄腫セルライ
ンを用いてハイブリッド骨髄腫を得、これを増殖させて
免疫化に使用された免疫原に対する抗原を生産する方法
がある。この方法の利点は非精製免疫原を用いて、極め
て特異的な抗体の生産に使用し得る点である。
【０００３】この方法は免疫法に使用するための重要な
新しい器具を提供するが、入手し得る親セルラインの性
質から生ずる或る種の限界を有している。しかしなが
ら、１９７９年、ガルフレ、ミルスタインおよびライト
らによってラット骨髄腫セルラインＹ３−Ａg１.２.３
が報告され(ネイチャー１９７９、２７７,１３１)、こ
のセルラインは英国特許出願第８０００５９５(第２０
３９９４８号として公告された)の主題であり、この出
願と関連して、１９７９年１月９日にインスチチュート
・パスツール(Ｉnstitut Ｐasteur)におけるＣ.Ｎ.Ｃ.
Ｍ.に寄託された(Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.Ｎo.Ｉ−０７８)。セル
ラインＹ３−Ａg１.２.３自体は現存するマウス骨髄腫
セルラインと比較してハイブリッド骨髄腫(またはハイ
ブリドーマ(hybridoma))を生成する単クローン性抗体の
生産における親セルラインとして使用するためのかなり
の利点を有している。本発明者らはＹ３−Ａg１.２.３
の誘導体であって、この目的にとってより適当な新しい
ラット骨髄腫セルラインを調製した。
【０００４】即ち、本発明はラット骨髄腫セルラインＹ
Ｂ２／３.０.Ａg.２０の細胞融合により作成されたハイ
ブリッド・セルラインにより生産されるモノクローナル
を提供する。
【０００５】ラット骨髄腫セルラインはマウス骨髄腫セ
ルラインより多くの利点を有する。抗体の生産用ハイブ
リッド・セルラインのインビボ培養はインビトロ組織培
養法と比較して或る種の利益−例えば培養基と比較して
動物血清中ではml当り著るしく高いレベルの抗体が得ら
れる−がある。インビボ培養のためのラットの使用はい
くつかの点でマウスの使用より優れている。例えば血清
および腹水流体の収率が高く、同腹子(litter)が一般に
大きく、ラットは抗原刺激に対しマウスよりよく応答す
る。さらにラットは単クローン性異種発生性抗マウスお
よび同種異系抗ラット抗原の生産に必要である。しかし
親マウス骨髄腫セルラインと免疫化されたラットからの
細胞の組合せによって生産されるハイブリッド・セルは
マウスまたはラットいずれにおいても容易に培養されな
いことがわかった。加えてラット骨髄腫セルラインは或
る種の異種融合(heterogeneous fusions)、例えばうさ
ぎ(rabbit)または人(human)の細胞との融合に利点があ
ることがわかった。
【０００６】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０はもと
のラット・セルラインＹ３−Ａg１.２.３によって分配
される上述の利点を有するのみならず、かなり有用な別
の性質を有している。Ｙ３−Ａg１.２.３は特有のカッ
パー型のライト・チェーン(light chain)、コード名Ｓ
２１０、を生成および分泌し、Ｙ３−Ａg１.２.３を用
いて生産したハイブリドーマもまた、ほぼ一定不変にこ
のライト・チェーンを含んでいることがわかった。しか
しながらその調製中に使用される免疫原に関する抗体活
性は免疫化動物から誘導され、通常ＨおよびＬとして指
示される免疫グロブリン・チェーンが存在するときしか
一般により完全には発現せず、かつ骨髄腫からの免疫グ
ロブリンは抗体の結合特性と干渉しかねないのでハイブ
リドーマ中にそれが存在することは不利である。
【０００７】ある種のマウス骨髄腫親セルラインの場合
において免疫グロブリンチェーンを発現しない突然変異
体をそこから直接単離することは可能であったが、その
後の研究にもかかわらず、同様の手かがりはＹ３−Ａg
１.２.３セルラインの場合にも可能であることは知られ
ていなかった。セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０がや
ゝ常套でない方法によってＹ３−Ａg１.２.３から得ら
れた。セルラインＹ３−Ａg１.２.３を用いた融合試験
の一つは、セルラインを生成する数種の抗−Ｃ３抗体を
生ずる人の補体Ｃ３に感作されたＡＯラットの脾臓セル
との融合を含むものである。その一つであるＹＢ２／３
ＨＬは、Ｙ３−Ａg１.２.３から誘導されるハイブリド
ーマ間では一般的ではなく、カッパー・ライトチェーン
を発現する能力を欠いている。一連のクローニング試験
によって、後に詳述するごとく、ＹＢ２／３ＨＬからセ
ルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０を選択することが可能
なことがわかった。そこではＨおよびＬチェーンを発現
する能力を欠き、それによって免疫グロブリン・チェー
ンを発現しないゼロ・セルラインを与える。
【０００８】即ち、本発明はさらに免疫グロブリン・チ
ェーンを発現しないラット骨髄腫セルラインを包含す
る。該セルラインはハイブリッド骨髄腫セルラインから
調製されるセルラインＹ３−Ａg１.２.３の誘導体であ
る。
【０００９】また本発明はセルラインＹ３−Ａg１.２.
３から誘導されるハイブリッド骨髄腫セルラインをクロ
ーニングして、それによって免疫グロブリン・チェーン
を発現しないＹ３−Ａg１.２.３のラット骨髄腫セルラ
イン誘導体を単離するラット骨髄腫セルラインの生産方
法を含む。この様なラット骨髄腫セルラインは、一般に
ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン(ＨＡＴ)に
敏感であり(リトウルフィールド、サイエンス、１９６
４、１４５,７０９)、これはこの性質を一般に有さない
ハイブリドーマから親細胞の分離を容易にし、この様な
感受性はしばしば８−アザグアニン抵抗性と協合する。
セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０がＨＡＴ感受性およ
び８−アザグアニン抵抗性の性質を有することが、これ
らの性質を有したことを確かめるための積極的な工程を
用いることなくわかった。しかしながら、他の場合では
これらの性質を有するセルラインを得るための積極的な
工程、例えば８−アザグアニン含有媒体中でＹ３−Ａg
１.２.３の融合からハイブリドーマ・セルを増殖させて
この化合物に抵抗性である細胞を選択する工程を採用す
る必要がある(上述したごとくＨＡＴ感受性はしばしば
８−アザグアニン抵抗性と協合し、後の性質はより容易
に選択される)。
【００１０】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０はその
製造に使用される二種類のラットの標識、即ち、Ｌou
(Ｙ３−Ａg１.２.３骨髄腫)およびＡＯ(人の補体Ｃ３感
作脾臓細胞)を有しているが、後者は弱くしか発現され
ないと思われる。この細胞はＹ３−Ａg１.２.３と同じ
一般的形態を有しているが(これもまたその親２１０.Ｒ
ＣＹ３.Ａg１と同じ一般的形態を有している)この細胞
(およびそれから誘導されるハイブリッド・セルも一般
に)Ｙ３−Ａg１.２.３セルよりも大きくかつより丸くな
っている。ＹＢ２／３.０.Ａg.２０の培養容器、特にプ
ラスチック容器に対する細胞粘着性はＹ３−Ａg１.２.
３で見られるものよりずっと小さくＮＳＩ／１Ａg４−
１で見られるものに似ている。セルラインＹＢ２／３.
０.Ａg.２０はＹ３−Ａg１.２.３と似て、８−アザグア
ニンに対して抵抗性であり(但し３０μg／ｍlのより高
いレベルにおいて)、ＨＡＴ(リトルフイールド,サイエ
ンス、１９６４、１４５,７０９)含有培地中で死ぬ。セ
ルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０は優れた融合能力を保
有し、典型的にはラットの脾臓細胞との融合において細
胞１０6当り１の効果のレベルを与える。さらに軟質寒
天(soft agar)中での細胞のクローン化性(clonabilit
y)は良好であり、確かに、クローンがより密である限り
Ｙ３−Ａg１.２.３セルのそれよりも良好であり、それ
によって一般にＹＢ２／３.０.Ａg.２０から誘導される
ハイブリドーマをＹ３−Ａg１.２.３からのものより精
製を容易にする。
【００１１】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０株はケ
ンブリッジのメデイカル・リサーチ・カウンスルズ・ラ
ボラトリー・オブ・モレキュラー・バイオロジーに保存
されており、そのセルラインは１９８０年６月２５日に
パリのインスチチュート・パスツールのＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に
Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.Ｎo.Ｉ.１２６の番号で寄託された。
【００１２】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０は種々
の形態の栄養培地で増殖できる。即ち、本発明はセルラ
インＹＢ２／３.０.Ａg.２０の細胞をそれ用の栄養培地
に含む細胞培養システムにも及ぶ。この様な細胞培養シ
ステムは常套のインビトロであり、培地は本質的には合
成培地であるが、もちろん血清のごとき天然源から得ら
れる成分を含んでいてもよい。この様な培地の例は、熱
で不活性化した馬の血清または好ましくは仔牛の胎児血
清を例えば１０％（ｖ／ｖ）補給した、ダルベッコ（Du
lbeccos）変性イーグル（Eagle)最小必須培地（例えば
ジブジ・バイオカルト社；パイスリー、スコットランド
から入手可能)である。この細胞をこれより低い血清レ
ベルの使用または血清を含まないアイソコブ(Ｉsocove)
変性品(アイソコブおよびメルチャーズ、ジャーナル・
オブ・エクスペリメンタル・メデイシン、１９７８、１
４７、９２３)の使用に条件づけしてもよい。抗生物質
の補給は培地中に使用してもよい。この様な培地中で増
殖した細胞は短期間の条件づけで、仔牛の胎児血清を有
するＲＰＭＩ１６４０および細胞培養に一般に用いら
れ、この技術分野の文献に記載されているごとき他の種
々の培地中で増殖させることができる。懸濁培地中では
一般に約２４時間の培化時間(doubling time)が得ら
れ、この様な培地を好適には、細胞および培地の一部を
除去し、これを新鮮な培地で置き換えることによって一
週間に３回供給する。一般に、低血清含量の培地、例え
ば約５％(v／v)ないしそれ以下、例えば血清供給量２.
５％を含有する培地中で増殖するよう細胞を条件づける
ことは融合中に曝される条件を容易に受け入れる丈夫な
細胞を調製する点で価値がある。
【００１３】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０は液体
窒素中で良好な貯蔵安定性および該セルラインの多数の
世代にわたってインビトロ培養における良好な安定性を
示す。但し、通常のごとくルーチンチェックを時々実施
するのが望ましい。融合能力のごとき細胞のある種の性
質は連続培養によって改良される得ることが理解される
であろう。確かに、例えば連続した継代(passage)およ
び／またはクローニングを通して、殆んどの点でＹＢ２
／３.０.Ａg.２０に実質上類似するが、ある種の変わっ
た性質を有する種々のセルラインを得ることを可能に
し、融合に使用するための親セルラインとしての最初の
使用に加えて、セルラインの第二の使用はその様な変異
種の製法にある。この様な変異株は自然発生的に生じ、
インビトロでの継代、しばしばこれに続くクローニング
または特に直接クローニングすることによって、もとの
ＹＢ２／３.０.Ａg.２０のバルクから選定される。この
クローニングは例えば軟質寒天上で行なわれる。しかし
ながらこの様な工程はむしろ単調であって、多数のクロ
ーンの研究を含み、変異株の生産は、後述するごとく変
異株の生産にセルラインの細胞を適応(adaption)させる
条件、特に細胞の継代における使用により、しばしばよ
り好適に達成される。
【００１４】変異種は都合のよいことにはハイブリドー
マの生産におけるその使用に関連するセルラインＹＢ２
／３.０.Ａg.２０の一ないしそれ以上の性質における変
化を示す。この様な性質は融合特性および増殖特性を含
み、後者はハイブリドーマの増殖特性に関係をもってい
る点で特に興味深い。特に興味のある変異株はこの様な
一種ないしそれ以上の性質の向上を示すものであり、あ
る種の特に興味ある特殊なタイプの変異株については後
述する。従って、本発明はさらにセルラインＹＢ２／
３.０.Ａg.２０から誘導される親骨髄腫セルライン、特
に上述の変異株に関するものである。
【００１５】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０および
本発明に従う他の親セルライン特有の価値は単クローン
性抗体の調製用に使用し得るハイブリッド・セルライン
の製造にある。この目的に使用される方法は種々の親セ
ルライン、即ちＹＢ２／３.０.Ａg.２０それ自体のみで
なくＹ３−Ａg１.２.３から誘導されるゼロ・セルライ
ンおよびＹＢ２／３.０.Ａg.２０の変異株に対し広い範
囲で類似しているが、便宜上特にＹＢ２／３.０.Ａg.２
０に言及して記載する。親セルラインからハイブリッド
・セルラインを製造する方法は脾臓、リンパ線または他
のセルラインの細胞で免疫原に感作した免疫細胞(即ち
免疫学的に適応性を有する細胞)を融合する工程を含
む。この感作した免疫細胞は種々のソースから採取して
もよいが、最良の結果はラットの細胞を用いて得られ、
これが他のホスト、即ちマウスや人から得られたものよ
り好ましいことがわかった。ＹＢ２／３.０.Ａg.２０セ
ルラインはＬouおよびＡＯラットの両方に対して標識を
有しているので、後続のインビボ増殖によるハイブリド
ーマからの抗体の生産を意図しているときは免疫細胞を
生産するために使用するラットはＡＯまたはＬouラット
のいずれかであるのが好ましい。本発明に従う他の親セ
ルラインは後述するごとく広く選択できる。免疫細胞の
感作は正常に発生してよく、自然発生的な免疫化によっ
て、しかし好ましくは直接免疫化によって感作させる。
必要な免疫原を免疫化工程でホスト動物に積極的に投与
する。
【００１６】セルラインの細胞と適当な免疫細胞の融合
は融合を促進する試薬を含む適当な培地での混合を必要
とする。即ち、本発明はセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.
２０の細胞と免疫細胞、例えばマウスまたは特に人、就
中、ラットからの脾臓細胞を該細胞の融合を促進する試
薬を含む栄養培地で融合するシステムを含む。この様な
培地は好適には合成物であってもよいが、もちろん、所
望ならば天然源から得られる成分を含んでいてもよい。
しかしながら、この場合以上のごとき可能性は少ない。
この様な培地の例はイーグルの最小必須培地(Ｅagle's
minimum essential medium)、そのダルベッコ変性
培地(Ｄulbecco modification)、ＲＰＭＩ１６４０お
よび細胞培養に一般に使用され、当該技術文献に記載さ
れた他の種々の培地であり、細胞の培養には上述したご
とく、抗菌性助剤がしばしば用いられる。種々の融合試
剤を用いてもよく、例えばセンダイ・ウイルス(Ｓendai
uirus)のごときウイルス、ポリエチレングリコール、
例えばＰＥＧ１５００が好ましい。これらの試薬での細
胞の融合は文献に記載され、本件実施例に説明されてい
るが、ガイダンスとしてはポリエチレングリコールの約
４０から約５５％(v／v)がしばしば使用され、その最適
濃度は分子量により、例えばＰＥＧ１５００では約５０
％(v／v)である。所望ならばジメチルスルホキシドをポ
リエチレングリコールに加えてもよい。ハイブリドーマ
単離を好適にはもとの培地を、親セルラインに対しては
毒性であるがハイブリッド・ラインに対しては一般に毒
性のないＨＡＴ培地と置き換えることによって補助して
もよい。これに続いてクローニングとサブ・クローニン
グを用い、抗体生産用試験に照らして適当なハイブリッ
ドを選ぶ。
【００１７】上に示したごとく、要求される免疫原に感
作された免疫細胞は別の方法によって得ることもでき
る。即ち、該細胞は要請される型の自然発生免疫細胞を
選択することによって、あるいは一連の投与量で免疫原
をフロインド・アジュバンドのごときアジュバンド(こ
こでは適当である)と共に動物(ここでは人を含む)に投
与し次いで脾臓または他の免疫細胞を採取することを含
む当該技術において記載された方法によってうまく得ら
れる。
【００１８】免疫細胞の自然発生法の採用は人の免疫細
胞に関して特に興味深く、ここでは免疫原の投与はあま
り魅力的ではなく、患者の感染した病気から自然に生産
された免疫細胞がもっと適当である。自然の免疫細胞に
関し特に興味のある領域は自動抗体(auto antibody)の
生産である。
【００１９】本発明は蛋白質と糖蛋白、オリゴおよびポ
リサッカライド、リポサッカライド、パプテンおよび類
似物、例えばペプチド、神経伝達物質およびホルモン類
のごとき抗原を含む広範囲の免疫原に対して感作された
直接または自然に感作された動物からの免疫細胞に適用
できる。表面標識であって、腫瘍性の物質、特に充実性
腫瘍(Ｓolid tumour)から誘導される免疫原はかなり興
味深いが、本発明は細菌性およびウイルス性抗原に対し
および原生類および菌類から誘導される免疫原に適用し
てもよい。
【００２０】即ち、本発明は更にラット骨髄腫セルライ
ンＹＢ２／３.０.Ａg.２０または前述した本発明の他の
親セルラインと動物、例えばマウス、特に人、就中ラッ
トからの免疫原に感作した脾臓または免疫細胞間のハイ
ブリッドである細胞を含む。
【００２１】ハイブリッド・セルは親ＹＢ２／３.０.Ａ
g.２０細胞と、および前述のものと同じ一般的な型の培
地での培養によって維持してもよい。
【００２２】本発明のセルラインによる抗体の製法はそ
れ用のインビトロまたはインビボ培地いずれかでセルラ
インを培養することによって行なってもよい。即ち、本
発明はセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０または本発明
に従った他の親セルラインから誘導されるハイブリッド
・セルをインビトロまたはインビボ培地で培養し、その
後該培地から抗体を単離する工程を含む抗体の生産方法
を提供する。
【００２３】インビトロとインビボの選定は種々の因子
による。即ち、インビトロ培養は、抗体が必要とされる
用途が化学的な性質よりむしろ免疫学的であり、かつラ
ット中でのインビボ増殖からのラット免疫グロブリン汚
染物の存在が望ましくないところで必要とされる。イン
ビトロ増殖はまた免疫細胞が得られるラットの素質(str
ain)は重要でないと云う利点を有する(インビボ増殖で
は重要である)。さらにハイブリドーマ・セルはインビ
ボでは増殖しない場合がある。しかしながら、インビボ
培養はインビトロ培地と比較してｍl当り著るしく高い
抗体のレベルが一般に得られる(血清および／または腹
水中)。インビボ培養は好ましくはラット中で行ない、
セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０の場合には(これは
前述のごとくラットのＡＯまたはＬou種からの免疫細胞
とうまく融合し、そこでは得られた抗体生産用ハイブリ
ドーマのインビボ培養が意図されている)ラットは好ま
しくはＬou×ＡＯハイブリッドである(ラットのＡＯま
たはＬou純潔種においては増殖の容易さが劣る場合があ
る)。加えて、放射線照射および／または免疫抑制剤の
使用によってラットの不適合種中でハイブリドーマの生
育を達成することも可能であろう。
【００２４】ラットの単一種、例えばラインＹ３−Ａg
１.２.３の場合における種Ｌouから親骨髄腫セルライン
が誘導されるときは、ハイブリドーマを生産する親セル
ラインと融合する免疫細胞を供給するためラットのどの
純潔種を使用してもよく、また親セルラインと免疫細胞
の誘導に相当する株のハイブリッド中でハイブリドーマ
の易インビボ増殖が起るであろうと云う利点がある。従
って前に言及したごとくセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.
２０の変異株の典形はセルラインがラットの純潔種、特
にＡＯまたはＬou(後者の場合、ＡＯ標識が失われてい
るかマスクされたもの)中での増殖に適応(adapt)された
ものである。この方法でセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.
２０を適応するための好ましい方法はラインがそれに適
応されるべき種である多数のラット(例えば少なくとも
５匹、特に約１０匹)を通してそれを継代することであ
る。この方法ではセルラインによって誘発された腫瘍の
明らかな退行が生じている一連の二、三の速いラットに
最初にみられる増殖のモードから、退行なしに容易に増
殖する一連の遅いラットにみられるモードにセルライン
を適応することが可能である。最後のラットから単離さ
れた腫瘍細胞を次いで培養し、所望ならばクローンし、
変異株と融合するための免疫細胞を提供するために都合
よく使用されるラットの種類のある範囲に関して高めら
れた性質を示すべく適応されたセルラインＹＢ２／３.
０.Ａg.２０の変異株を提供する。この形の種々の適応
されたセルラインを調製してもよく、好ましい例はＹＢ
２／３.０.Ａg.２０の融合特性の保持または改良に対し
て選ばれる。
【００２５】インビトロの系の場合は用いられる培地は
細胞培養システムに関連して上記したものと同じであっ
てもよいが、血清レベルはできるだけ低く、例えば５％
(v／v)ないしそれ以下、好ましくは約２.５％(v／v)よ
り多くなく、好適には０.５％(v／v)程度であるのが好
ましい。アイソコブ血清(Ｉsocove)−微変性を使用して
もよい。この細胞は都合のよいことには対数相を越えて
うまく増殖させることができ、これによって最終生存度
を犠牲にして最大最終濃度を達成できる。細胞の定常相
(stationary phase)における短期間の生育は、抗体の
最終収量を改良するので好ましい。抗体生産の適当な組
織培養法の例は紡すい状容器(spinner container)中で
の塊状増殖(massive growth)および当該技術分野にお
いてよく知られた大量培養法である。インビボ法は好ま
しくはラットに接種して充実または腹水腫瘍を生産する
方法を含む。接種に先立ってラットを免疫抑制するかお
よび／または腹水の分泌をうながすプリスタン(Ｐrista
ne)のごとき薬剤で処理してもよい。腫瘍を適当な期間
増殖させた後、動物を殺し、抗体単離のために腹水およ
び／または血清を集め、腹水腫瘍の場合はその期間後生
きた動物から腹水を集めてもよい。即ち腹水腫瘍はより
多量の液を生産する能力を有するが、この技術の価値は
腹水および／または血清中に存在する抗体の濃度にあ
る。インビトロまたはインビボ法いずれかからの抗体の
単離は、沈澱、透柝、免疫−吸着剤(immuno−absorben
t)の使用を含むクロマトグラフィー、および膜濾過を含
む当該技術において記載された方法によってうまく達成
できる。
【００２６】即ち、本発明は動物、特にラットに本発明
に従うＹＢ２／３.０.Ａg.２０または他の親セルライン
から誘導されるハイブリッド・セルを接種し、充実性ま
たは腹水腫瘍をラット中に増殖させ、次いでラットの血
清および／または腹水から抗体を単離する工程を含む単
クローン性抗体の生産法を含む。
【００２７】本発明は本発明に従うセルラインＹＢ２／
３.０.Ａg.２０または他の親セルラインから誘導される
ハイブリッド・セルを用いて調製される抗体にも及ぶ。
この様に抗体は治療および特に診断、および親和クロマ
トグラフィー(affinity chromatography)等の種々の用
途を有する。生産される単クローン性抗体の一例は人の
細胞の亜個体群(subpopulation)を認知する種々の人原
発性腫瘍細胞に対する抗体であり、これは血液学的診断
に有用である。他の形の用途として自然に発生する物
質、例えばこの物質の精製用蛋白質に対する抗体の使用
が例示される。
【００２８】本発明を以下の実施例で説明する。
【実施例１】ハイブリッド・セルラインＹＢ２／３ＨＬからのセルラ
インＹＢ２／３.０.Ａg.２０の調製 セルラインＹ３−Ａg１.２.３から誘導されるハイブリ
ッド・セルラインＹＢ２／３ＨＬの細胞をダルベッコ変
性イーグルス培地にもとづく培地(これはＤＭＭと同じ
であり、ＤＭＭはダルベッコ変性イーグルス培地にある
種の添加物を加えた市販調製品であり、以下の成分を含
む:
【００２９】５００ｍlダルベッコＭＥＭ(４５００ｍg
グルコース／lを含みピルビン酸Ｎaは含まない)−ジブ
コ−バイオカルト・カタログＮo.３２０−１９６５、５
ｍlピルビン酸Ｎa ＭＥＭ(１００mＭ)−ジブコ・カタ
ログＮo.３２０−１３６０ １０ｍlペニシリン／ストレプトマイシン(５０００単位
ペニシリン／５００mcgストレプトマイシン／ｍl)
【００３０】培地はＮaＨＣＯ3含量３,７００ｍg／l、p
Ｈ７.２〜７.５である)に牛の胎児血清[ＦＣＳ;異なっ
たバッチから選ぶ(セラ−ラブ・カタログＮo.５−００
０−１a)１０％(v／v)を補給した培地から得、本質的に
コットンらによりヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー、１９７３、３,１３６に記載されたごとき
軟質寒天中でクローンした。総計１１６のランダム・ク
ローンを培養し、この培養上澄液を、塩化クロムと結合
した羊の赤血球(ＳＲＢＣ)の羊中に生じた抗ラットＩg
に対する間接凝集により、ラットＩgの生産に対してス
クリーンする(ケーラーら、ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・イムノロジー、１９７６,６,２９２)。各ケー
スにおいて、上澄液をＳＲＢＣと混合し、１０分間静置
後、遊離抗ラットＩgを加えると上澄液中にラットＩgの
存在するものは凝集する。１１６クローンからラット免
疫グロブリン生産に関し陰性であるかごく弱い陽性を示
す３クローンが選択され、これらの３クローンはＰ１.
Ｆ１１、Ｐ２.Ｇ１１およびＰ.Ｈ１２として同定され
る。この３個のクローンによる細胞外および細胞内[14
Ｃ]−リジン取込みを、通常のリジン含量の培地を
[14Ｃ]−リジンで置き替えたＤＭＭ−５％ＦＣＳ(使用
されるＦＣＳは透柝されたもの)中でインキュベートす
ることにより研究した。上澄液をケーラーおよびミルス
タインのヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー、１９７６、６、５１１に記載されているごとく、総
減数(total reduction)後、ドデシルサルフェートＮa
塩／ポリアクリルアミド電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を
用いて分析した。得られた結果を表に示す。
【００３１】 表クローン(YB2／3HL ) 外部細胞取込 内部細胞取込 Ｐ１.Ｆ１１ 非常に弱いHL ＨＬ Ｐ２.Ｇ１１ チェーンなし Ｈ Ｐ２.Ｈ１２ チェーンなし Ｌ
【００３２】この３個のクローンを更に研究するため、
フルオレッセン・イソチオシアネートラビット抗ラット
Ｉg(ブラッドストックらジャーナル・オブ・ナショナル
・カンサー・インスチチュート、６５、Ｎo.７,８１)を
用いる内部細胞蛍光顕微鏡法によりスクリーンし、ゼロ
・セルラインの単離に対し最も有望なものとしてクロー
ンＰ２.Ｇ１１が現われ、これは４０％の強い陽性に対
しほぼ６０％の陰性の個体数を示した。
【００３３】従ってクローンＹＢ２／３ＨＬ Ｐ２.Ｇ１
１を軟質寒天でクローンし、得られた４３クローンを内
部細胞蛍光顕微鏡法でスクリーンし、２２の明らかな陰
性体が９の明らかな陽性体および１２の明瞭でないクロ
ーンまたは混合クローンと共に見出された。内部細胞蛍
光顕微鏡法によるスクリーニングにおいて陰性であるこ
の２２個のクローンをさらにスクリーンし、継続するＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、クローンＹＢ２／３ＨＬ
Ｐ２.Ｇ１１.１６(Ｏ)が内部細胞[14Ｃ]−リジン取込
み上にチェーンを有さないものとして選択された。これ
らの細胞は３０μg／mlの８−アザグアニンに対し抵抗
性であることは既に見出されているので、この細胞を８
−アザグアニンに対し適応させる必要はない。これらの
細胞、即ちＹＢ２／３ＨＬ.Ｐ２.Ｇ１１.１６(Ｏ)Ａgを
８−アザグアニン３０μg／mlの存在下に軟質寒天中で
クローンし、このクローンをクローンが密に増殖した基
体上で選定する。さらにクローンＹＢ２／３ＨＬ.Ｐ２.
Ｇ１１.１６(Ｏ)Ａg.２０をその増殖速度の速さの観点
で選定し、試料をＨＡＴ感受性に対して試験した。
【００３４】即ちＹＢ２／３ＨＬ.Ｐ２.Ｇ１１.１６
(Ｏ)細胞はハイブリドーマを生産する単クローン性抗体
に導く融合において親骨髄腫細胞として使用し、セルラ
インＹＢ２／３.Ｏ.Ａg.２０を構成するのに適した性質
を示す。この細胞を寒天から採取し、２０％(v／v)ＦＣ
Ｓ含有ＤＭＭ培地を加えたリンブロ・プレート(Ｌinbro
plate)の２mlの穴に入れた。この細胞を増殖し、徐々に
より大きな容器で増殖し、かつ培養器に供給する代替培
地の血清レベルを減少させる通常の方法によって低い血
清レベルに条件づけした(培養は３７℃、ＣＯ2１０％(v
／v)／空気９０％(v／v)、雰囲気下)。この方法で、細
胞は[２.５％(v／v)ＦＣＳ／２.５％(v／v)熱で不活性
化した馬の血清]、次いで[５％(v／v)ＦＣＳ]および最
後に[２.５(v／v)ＦＣＳ]中で増殖するよう条件づけら
れ、最終的に１l紡錘状フラスコ中、３７℃、１０％(v
／v)ＣＯ2／９０％(v／v)空気の雰囲気下および９５％
湿度で培養した。
【００３５】セルラインの凍結試料(カルチュアー・コ
レクションに寄託したものを含めて)を５×１０5／mlの
細胞数を越えない段階で指数的に増殖する細胞から調製
した。１×１０7より多い細胞を含む培地を７分間で６
００gの割合で遠心分離した。細胞ペレットを４℃に冷
却し、これを９０％(v／v)ＦＣＳ−１０％ジメチルスル
ホキシドに懸濁して濃度５％１０6(細胞)／mlにした。
この懸濁液１ml(４℃)をアンプルに入れ、シールして、
４℃から１℃／時間の割合で冷却して凍結した。細胞が
−５０℃に達したとき液体窒素中に浸漬した。この様な
凍結アンプルから細胞を再生するにはアンプルの内容物
を急速に４℃にし、次いで迅速に冷(４℃)DMM-10%(v／
v)ＦＣＳで２０mlの容積まで稀釈した。次いで細胞を７
分間で６００gの割合で遠心し、２ml培地中に各１／
２、１／４、１／８、１／１６および１／３２ペレット
化細胞を含むよう再懸濁した。その後、培地を３７℃、
１０％(v／v)ＣＯ2／９０％(v／v)空気の雰囲気下で増
殖させ、さらに凍結前の細胞に対して記載したのと同様
に増殖させる。新しい凍結株を調製するためには解凍後
最少１週間、最大３週間の間に得られた培養物を増殖す
る必要がある。その間に細胞は２４時間の培化時間で指
数的に増加する。
【００３６】ハイブリッド・セルラインＹＢ２／３ＨＬ
源 ＹＢ２／３ＨＬセルを以下のごとく調製した。イヌリン
(ブリティシュ・ドラッグ・ハウシズ)のりん酸塩バッフ
ァ・ザリーン(１００mg／ml)懸濁液を１分間超音波処理
し、次いで懸濁液０.５mlを正常な人の血清(エチレング
リコールビス(β−アミノエチルエーテル)Ｎ,Ｎ'−テト
ラ酢酸(ＥＧＴＡ)１０mＭおよびＭgＣl2でＭg７mＭにし
たもの)１０mlで３７℃で１５分間処理し、イヌリンに
対するＣ３の固定および補体経路(complement pathwa
y)のいずれかを活性化させる。懸濁液を生理食塩水、２
ＭＮaＣlおよび再び生理食塩水で遠心分離して洗浄し、
生理食塩水で原容量１mlとする。
【００３７】ペニシリン／ストレプトマイシン溶液(ペ
ニシリン５０００単位−ストレプトマイシン５００mcg
／ml)２５０μl、正常なラットの血清５０μlをフロイ
ンド完全アジュバンド(ＣＦＡ)約１ml中に加えた液で抗
原補体１mlを乳化して最終容量２.４mlとした。この調
製品０.１mlを２匹のＡＯラットそれぞれに各４箇所(合
計ラット１匹に０.４ml)筋肉注射した。３週間後、各ラ
ットにＣＦＡを含まないがビー・ペルツシス５×１０9
を含む類似の抗原調製物０.５mlを骨膜内(intraperisto
neal)注射する。４週間後、いかなる形態のアジュバン
ドも有さない抗原調製品０.５mlを静脈注射し次の月の
間にさらに５回類似の静脈注射を行なった。
【００３８】最後に静脈注射３日後にラットを殺した。
各ラットにつき、滅菌条件下で脾臓を除去し、補給血清
を含まない新しく調製したＤＭＭ培地５mlを入れた氷冷
した小さなペトリ皿に置いた。脾臓を切った後、前述の
血清を含まないＤＭＭ培地４mlを含む１０mlプラスチッ
ク製丸底チューブに移し、うまく適合しない(２mmのク
リアランス)テフロン製乳棒で潰した。得られた混合物
を１分間氷の上に放置し、上層３.５mlをプラスチック
製の普通のチューブに移した。潰した脾臓の残りをＤＭ
Ｍ５mlで洗い、混合物を１分間立てて、大部分の破片を
沈澱させた。上澄液を破片から傾瀉し、チューブ中の細
胞に加えた。このチューブをＤＭＭで満たし、ベンチ遠
心機を用い６００rpmで７分間回転した。次いで上澄液
を傾瀉し、細胞をＤＭＭ中に再分散した。細胞１０8を
含むこの懸濁液の１アリコートをケンブリッジにあるエ
ム・アール・シーズ・ラボラトリー・オブ・モレキュー
ラ・バイオロジーに保存されている株から得られる洗浄
したＹ３−Ａg１.２.３細胞１０7と５０ml円錘遠心管中
で混合した。次いでＤＭＭ培地を細胞混合物に加え全体
を遠心分離した。
【００３９】液を切った細胞ペレットを含むチューブを
３７℃に水浴中に置き軽くたたいた。ポリエチレングリ
コール(ＰＥＧ)１５００のＤＭＭ５０％(w／v)溶液０.
８mlを３７℃において、１分間かけて該細胞中に加え、
ピペットを用いてゆるくかき混ぜた。ゆるやかな撹拌を
さらに１分間続け、ＤＭＭ培地２mlを２分間にわたって
加え、次いで３分間かけてＤＭＭ８mlを加え、さらにＤ
ＭＭ１０mlを滴下した。この細胞を回転し、次いで別の
バッチ(セルーラボ カタログＮo.５−０００−１a)か
らの牛の胎児血清(ＦＣＳ)２０％(v／v)を補給しておい
た予備加温(３７℃)ＤＭＭ培地に初めはその２、３滴中
に次いでその２５mlにゆっくりと再懸濁させた。容積を
予め加温した同じ培地で５０mlにした(この段階および
以下のインキュベーション中に使用されたＦＣＳを５６
℃で３０分間熱不活性化処理した)。
【００４０】二匹のラットから得られた細胞含有培地を
リンブロ・プレートの２mlの穴９６個に分配し、同じ培
地１ml中に約１×１０5個の洗浄脾臓細胞を含む液を各
穴にフイーダー(feeder)として加え、全体を３７℃でイ
ンキュベイトした。次の日、培地２mlのうち１mlを各穴
から除き、２０％ＦＣＳおよびＨＡＴ(リトルフイール
ド、サイエンス、１９６４、１４５、７０９)を含むＤ
ＭＭ培地１mlで置換する。インキュベイションを３７℃
で２週間続け、その培地の半分を最初の置換後２日目お
よびその後は２〜３日間隔を置いてＨＡＴ培地で同様に
置換した。
【００４１】２週間後に８０個の穴に活性な増殖が観察
され、この増殖はハイブリッド骨髄腫の存在を示した。
８０個の培養基それぞれの使用済みの培地を以下のごと
き間接的な結合アッセイにより抗体生産用に試験した。
複合体をラックマンおよびホバート、１９７８、コンプ
リメント・テクノロジー、ザ・ハンドブック・オブ・エ
クスペリメンタル・イムノロジー、著者デイー・エム・
ワイヤー(ブラックウエル・サイエンテイフイック・パ
プリケイション)の方法に本質的に従って、３７℃で酵
母処理した人の血清(Ｒ３)でエリスロサイト(ＥＡ)を有
する羊の抗体を処理し次いで洗浄することによって製造
する。複合体(ＥＡＣと云う)のこの中間物はＣ３b、Ｃ
３biおよびある種のＣ３dをその表面に有するが、Ｃ５
は有さないか或はその上の後の成分はＲ３として“非反
応"(non−reactor)血清から得られた。ＥＡとＥＡＣの
両者は各穴からの使用済培地の稀釈液で処理し、洗浄
し、[125Ｉ]ラベル化抗ラット免疫グロブリン抗体とイ
ンキュベートした。さらに洗浄した後細胞の放射能を測
定した。この間接結合アッセイで測定したときこの８０
培養基のうちわずか３例が明瞭な抗体生産活性を示し、
２匹のラットの１匹から誘導されたこれらの培養基の一
つがハイブリッド骨髄腫ＹＢ２／３９を含んでいた。
【００４２】ハイブリッド骨髄腫ＹＢ２／３９を上記コ
ットンらの文献に記載されたのと本質的に同じ方法を用
いて軟質寒天中でクローンした。クローニングを数種の
細胞濃度において実施し、クローンを最低クローン濃度
から選んだ。この最初のクローニング段階でのクローニ
ング効果は約１０％であったが最初に単離された活性ク
ローンの率は１００％(２１／２１)であった。クローン
３９−１１を選択し、軟質寒天中でクローンして、４／
４陽性クローンを得、そこからクローン３９−１１−１
−７を選び、軟質寒天中でクローンしてセルラインＹＢ
２／３ＨＬを構成するクローン３９−１１−１−７を得
た。この細胞を低いクローン／プレート数(≪１００)を
含む寒天プレートから採取した。クローン当りの細胞の
数は約１００であった。ＦＣＳ２０％(v／v)含有ＤＭＭ
１mlを加えたリンブロ・プレートの２mlの穴に細胞を移
した。次いで細胞を２０％(v／v)ＦＣＳ含有ＤＭＭ中で
増殖し、培養基を補給するために用いる培地の血清濃度
を１０％(v／v)に薄めた。より大きい培養基を種々の大
きさの平底組織培養容器に移すことにより作り、空気中
に１０％(v／v)ＣＯ2を含む雰囲気を封ずるため、容器
を気密にシールし、細胞を３７℃、懸濁培養基として、
通常の方法で増殖した。
【００４３】
【実施例２】 セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０とイースト・チュー
ブリン(yeast tubulin)で高度免疫化されたラットから
の脾臓細胞との融合によるハイブリドーマの製造: ラットのＬou株を次のスケジュールに従って免疫化し
た: 第１日目:フロインド完全アジュバンド中の２０μgイー
スト・チューブリンを腹膜内(i.p.)注射する、 第２２日目:フロインド不完全アジュバンド中の２０μg
イースト・チューブリンを腹膜内注射する、 第５３日目:２２日目と同じ、 第８５日目:イースト・チューブリン２０μgを静脈内
(i.v.)する。
【００４４】８９日目にラットを殺し、その脾臓を滅菌
条件下に除き、２％(v／v)ＦＣＳ血清補剤を含むＤＭＭ
培地を用いて融合を行ない、最終品を満たして６００r.
p.mで７分間まわし、血清補剤を含まないＤＭＭで再懸
濁した。１０8個の細胞を含む再懸濁脾臓細胞の１アリ
コートを同じ培地中でセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２
０の６×１０7個の細胞と混合した。この混合物を５０m
lプラスチック製円錘チューブ中で６００gで７分間遠心
にかけ、次いで上澄液を除去し、細胞ペレットをチュー
ブの底をゆるくかき混ぜて粉砕した。さらに操作を約３
７℃で行なった。ＤＭＭ培地(pＨ７.６−７.８:フェノ
ール・レッドで指示)中にポリエチレングリコール(ＰＥ
Ｇ)１５００(新たに調製し暗所に保存)５０％を含む液
１mlを用いて、この液を１分間かけて加えながら、細胞
をゆっくりと懸濁させた。この懸濁液を３７℃で１分間
保持し、ＤＭＭ培地１mlをさらに１分間かけて加えた。
ＤＭＭ培地を更に２０ml、５分間かけて加え、この細胞
を遠心分離しＦＣＳ２０％(v／v)含有ＤＭＭ培地中にゆ
るやかに再懸濁し、総容積２５mlとした。
【００４５】この懸濁液を２ml穴４８個を有するリンブ
ロＢＣＬ−５０４１トレイ中に０.５ml中に以下のごと
く分配した。もとの容積２５mlのうち１８mlを３６個の
穴に分配し、残りの７mlを１４mlに稀釈した(この、お
よび後の稀釈を２０％(v／v)ＦＣＳ含有ＤＭＭ培地で行
なった)。１４mlのうち６mlを１２の穴に分配し、残り
の８mlを１６mlに稀釈した。１６mlのうち６mlを１２の
穴に分配し、残りの１０mlを２０mlに稀釈した。２０ml
のうち１８mlを３６の穴に分配し残り２mlを捨てた。９
６の穴それぞれを、２０％(v／v)ＦＣＳ含有ＤＭＭで容
積２mlにした。この細胞を培養し、２４時間後に培地の
１／２を２０％(v／v)ＦＣＳおよびＨＡＴ(リトルフイ
ールド、サイエンス、１９６４,１４５,７０９)含有Ｄ
ＭＭ培地で置き換える。この操作を２日後およびその後
２日毎に繰り返した。
【００４６】１５〜２０日後に穴中で激しい増殖がみら
れ、これはハイブリッド・クローンの成功を示す。合計
５２の穴がハイブリッド増殖を示した(稀釈が増す順番
に３６／３６, ６／１２, ３／１２および９／３６)。
【００４７】２の段階でもとのおよび非稀釈の培養基の
分析を行ない、高率の３６の増殖培養基をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した(技術上の理由から全ての培養基
の分析はできなかった)。分析した２８培養基の培養基
当りのハイブリッド・クローンの平均数は１であり、ハ
イブリッドの９０％はＩgヘビー・チェーンを分泌(secr
ete)していた。(詳細な分析は、ヘビー・チェーンなし;
３,μヘビー・チェーンのみ;２４,δヘビー・チェーン
のみ;１,μおよびδヘビー・チェーン;０であった)。
【００４８】各ハイブリッド培養基の使用済み培地は以
下の方法を用いて結合アッセイにも試験される(イエン
センおよびウイリアムス、ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・イムノロジー、１９７４,４,９１)。イースト・
チューブリン溶液(５０μg／ml)２５μlをステリリン平
底９６穴微量滴定プレートの穴に入れ４℃で一晩保持し
た。イースト・チューブリンを除去し、各穴にpＨ７.２
の０.１Ｍヘペス(Ｈepes)、０.１５Ｍ ＮaＣl,０.８％
(v／v)ボビン血清アルブミンおよび０.１％(w／v)ナト
リウムアジドを含むpＨ７.５の０.５Ｍりん酸カリウム
塩バッファー１００μlを加え、次いでこのプレートを
室温で１時間放置した。穴を同じバッファー溶液(２倍)
１００μlで洗浄し、使用済み培地２５μlを加えプレー
トを４℃で１時間維持した。穴をさらにりん酸塩バッフ
ァー・ザリーン(３倍)、次いで２ＮＮaＯＨ水溶液１０
０mlで洗浄した。放射能レベルをカウントし、[125Ｉ]
−活性度が陽性の反応を示す穴を取りあげた。この試験
で５２の穴のうち６個が陽性を示した。
【００４９】この６個の陽性培養基のうち４個のＹＯＬ
１／５,ＹＯＬ１／１９,ＹＯＬ１／３４およびＹＯＬ１
／３８(ＹＯＬ１／３４はチューブリンに対し特に高い
親和性を有する)と命名し、これらを上記コットンらに
よって記載されたのと本質的に同じ方法を用いて軟質寒
天上でクローンした。各ケースにおいて得られた１また
はそれ以上のクローンを再び軟質寒天上でクローンし
た。このクローンを第１および第２クローニング後、予
め使用されたものに類似のアッセイによってイースト・
チューブリン・バインディグを測定した。結果は以下の
通りである。
【００５０】
【００５１】培養基ＹＯＬ１／３４の場合１δ３個の陽
性クローンの一種(ＹＯＬ１／３４,１０)を再びクロー
ンし、１２個の陽性のクローン(ＹＯＬ１／３４.１０.
１からＹＯＬ１／３４.１０.１２)を得た。陽性の抗体
生産に関する培養基の最初の不安定性は、第１のクロー
ニングの結果で示したごとく、第２のクローニングで克
服されたことがわかる。クローンＹＯＬ１／３４.１０.
１からＹＯＬ１／３４.１０.１２の全てはもとの培養基
と同様、チューブリンに対し非常に高い結果親和性を有
する抗体を生産した。
【００５２】注記:同じ脾臓細胞を用いた正確な比較試
験においては親ラット骨髄腫セルラインＹ３−Ａg.１.
２.３はハイブリッド増殖に対し陽であるより高いレベ
ルの穴を与えるのみでなく、直接血球凝集アッセイで陽
性である同じ数の穴を与え、これによってＹＢ２／３.
０.Ａg.２０に対しより高い効果を予測させる。
【００５３】
【実施例３】 セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０とヒトの脾臓細胞と
の融合によるハイブリドーマの製造 正常なヒトの脾臓細胞を実施例２に記載のようにして融
合用に調製し、血清補液(supplement)が存在しないＤＭ
Ｍ培地内の脾臓細胞１０8個のアリクオートを同一の培
地内のセルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０の細胞６×１
０7個と混合した。次いでこの細胞混合物を実施例２に
記載の手順によって処理してその融合をおこない、実施
例２に記載のように類似の２０％v／vＦＣＳ含有ＤＭＭ
内細胞懸濁液２５mlを得た。
【００５４】この懸濁液をＬinbro ＢＣＬ−５０４１ト
レイの４８個のくぼみの中へ０.５mlずつ分配し、各く
ぼみ内の液は２０％v／vＦＣＳ含有ＤＭＭ培地を用いて
２mlに埋合せた。次いで細胞を培養し、２４時間後に培
地の半分を２０％v／vＦＣＳおよびＨＡＴ{リトルフイ
ールド・サイエンス(Ｌittlefield science)、第１４
５巻、第７０９頁(１９６４年)}を含有するＤＭＭ培地
で置き換えた。この操作をその後２日おきにおこなっ
た。
【００５５】１５〜２０日後にくぼみ内では活発な増殖
がみられ、好結果のハイブリッド・クローンが示され４
８個のすべてのくぼみにおいてハイブリッド増殖が示さ
れることが認められた。各ハイブリッド培養に使用され
た培地はシープの赤血球凝集反応の抑制に依存する方法
において試験した。使用された細胞はヒトのガンマグロ
ブリンを用いて被覆し、単クローン性抗ヒューマンカッ
パＩgおよび単クローン性抗ヒューマンガンマＩgを用い
る凝集反応に対して試験した。遊離のヒューマンＩgの
存在は抗体との結合を妨げ、このような妨害は４８個の
すべての培養について発生し、このことはこれらがヒュ
ーマンＩgに対して陽性であることを示すものである。
【００５６】セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０とヒト
の脾臓細胞を用いる融合方法は成功したが、この特別な
方法によって得られたハイブリドーマは約２週間後には
その抗体産生能力を失なう。
【００５７】
【実施例４】 セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０とヒトの末梢血液リ
ンパ細胞との融合によるハイブリドーマの生産 (Ａ)Ｒh因子陽性(rhesus positive)細胞投与によって
さらに感作された生まれつきＲh因子陰性(抗−Ｄ陽性)
患者からのヒトの末梢血液リンパ細胞によって正常なヒ
トの脾臓細胞を置きかえる以外は実施例３の手順に従っ
た。ＬinbroＢＣＬ−５０４１トレイを用いて全体で９
６個の培養をおこなったところ、このうちの３４個はハ
イブリッド・クローンの存在を示す活発な増殖を呈し
た。３４個のハイブリッドのいずれも抗−Ｄ陽性ではな
かったが、実施例３に記載の試験におけるヒューマンカ
ッパＩgに対して陽性のものが１つ認められた。
【００５８】ハイブリドーマを生産する抗−ヒューマン
カッパＩgを、初期濃度２０％(v／v)から最終濃度２.５
％(v／v)まで減少するレベルでＦＣＳを含有するＤＭＭ
培地内で２カ月間培養し、次いで実施例１に記載の手順
により軟アガール内でクローンした。得られた２０個の
クローンのうち、１８個のヒューマンカッパＩgに対し
て陽性で、これらのクローンは８−アザグアニンに適応
させると(生産されたクローンはＨＡＴにも感作性があ
る)１８個のうちの１２個は陽性を保持した。これらの
１２個うちの１つを、初期濃度２０％(v／v)から最終濃
度２.５％(v／v)まで減少するレベルでＦＣＳを含有す
るＤＭＭ培地内でのスピナー培養において６カ月間保持
しても陽性が保たれた。
【００５９】(Ｂ)上記手順の変形法においては融合に先
だち、イムノグロブリン生産を高める物質であるアメリ
カやまごぼうミトゲン(poke weed mitogen)を用いて
末梢血液リンパ細胞を刺激した。(Ａ)において用いられ
たリンパ細胞の同一試料のフラクションに適用されたこ
の手順によって全体で３７個のハイブリッドを生産した
ところ、このうちの２３個が蛋白質Ａで被覆されたシー
プ赤血球の使用に基づくブロードスペクトル試験におけ
るヒューマンＩgに対して陽性であった。これらの細胞
はラビット抗−ヒューマンＩg、次いで培養培地上澄み
を用いて培養し、続いてヒューマンＩgが該上澄みによ
って系内へ導入されたなら赤血球を溶解させるモルモッ
ト補体を用いて処理した。しかしながら３７個のうち２
３個が陽性となったが、これらのハイブリドーマのいず
れも１カ月以上にわたってその抗体生産能を維持しなか
った。
【００６０】
【実施例５】 酵母チューブリンに対する単クローン性抗体の生体内生
産 実施例２に記載のようにして生産されたＹＯＬ１／３
４.１０.１セルをＦ１ハイブリッド(Ｌou×ＡＯ)ラット
内で腫瘍として増殖させた。この手順は最初は一匹のラ
ットを用いるが、次いでこのラットから得られた腫瘍を
他のラットに移植させ、そこから得られた腫瘍をさらに
２回移植させて、全体で４世代のラットを使用した。
【００６１】全体で４世代を結びつけたラットをそれぞ
れ１７匹、１９匹および９匹使用する３つの別々の実験
においては、細胞(５×１０7)を皮下注射によって投与
した。各ラットにおいては約１０日後に注射した部分に
充実性の腫瘍がみられ、ラットが苦痛の徴候を示しはじ
めたら全身麻酔した後、動脈から全身出血させることに
よって殺した(上述のようにある場合には腫瘍細胞の一
部は次の世代のラットへの移植用に使用した)。補集さ
れた血液は３７℃で３０分間凝固させ、血清は遠心分離
によって澄ませた。３つの実験において補集された血液
量は１７匹のラットからは１３５ml,１９匹のラットか
らは１６９ml,９匹のラットからは１００mlであった(血
清の収量はこれらの量の約２／３であった)。
【００６２】第４の実験においては全体で４世代を結び
つけた１１匹のラットを用いて腫瘍は腹水腫瘍として増
殖させた。細胞(５×１０7)は腹腔内注射によって投与
し、次いで約２週間以前にプリスタン０.５mlを腹腔内
注射し、殺して腹腔内を切り開いて抗体源として血液と
腹水液を補集した。補集された血液と腹水液の全収量は
２７１mlであった。
【００６３】ラット１匹あたりの抗体含有液体の収量は
腹腔内に注射された腹水腫瘍ラットに対しては高いが、
抗体力価はこれらの動物からの液体においては一般に低
く、典型的な力価は皮下注射された充実性腫瘍ラットに
対しては５×１０5〜１０6であるが、腹水腫瘍ラットに
よる力価のほんのわずかのもののみがこれと同じぐらい
の高い値を示すにすぎなかった。充実性腫瘍ラットに対
するＩgＧ含量は典型的には１０〜１５mg／mlである
が、腹水腫瘍ラットに対してはしばしば８mg／ml以下と
なった。
【００６４】得られた血清または血清腹水液は当該技術
分野で既知の手段例えば実施例６に記載の方法を用いる
ことによってそれらの使用目的に適した程度にまでさら
に精製してもよい。
【００６５】
【実施例６】 単クローン性抗体の生体外生産 ハイブリドーマセル、例えば実施例２で生産されたもの
を最小量の血清(０.５％v／v)の存在下で増殖させた。
これらの細胞は、胎児性子牛血清０.５％(v／v)で補充
されたＤＭＭ培地を含む５lスピナーフラスコ内におい
てＣＯ2１０％、空気９０％の雰囲気下で増殖させた。
細胞は、懸濁液が典型的には１mlあたり抗体１０〜５０
μg含有する定常相に達するまで増殖する。
【００６６】抗体調製品を精製するには硫酸アンモニウ
ムを懸濁に添加して５０％飽和溶液とし、得られた沈澱
を補集する。沈澱を最小容量の燐酸塩バッファーサーリ
ンに溶解させ、この溶液を同一媒体に対する透析に付し
て精製された抗体調整品を得る。
【００６７】(１)第２の変形法では細胞を最小の血清濃
度を用いて対数相(logarithmic phase)で増殖させ、次
いで血清を含まないがイスコブ(Ｉscove)によって推奨
されているような増殖添加剤を含有する媒体で直接希釈
する。
【００６８】(２)第３の変形法では精製手順をＤＥＡＥ
クロマトグラフィーまたは免疫吸着剤、例えば抗−ラッ
トイムノグロブリンを用いて続けるか、膜フィルターの
使用でこの手順を置きかえる。
【００６９】
【実施例７】 セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０の適応生産 標準的なサーリン中のＹＢ２／３.０.Ａg.２０セル１０
8〜１０9個を皮下注射によってラウラット(Ｌou rat)
に投与したところ注射した場所に充実性腫瘍が徐々に発
現した。腫瘍退化の第１の徴候がみられた時点でラット
を殺して腫瘍を剔出した。腫瘍を粉砕し、標準サーリン
中の腫瘍細胞１０8〜１０9個を皮下注射によって第２の
ラウラットに投与した。全体で１０匹のラウラット内に
おいて細胞が増殖するまでこの手順をくり返した。腫瘍
退化の徴候が最初の数匹において検出されたが、このよ
うな徴候はセルラインがラウラット内での増殖によりよ
く適応するようになるとその後のラットではみられなか
った。これらのその後のラットは苦痛の徴候を示しはじ
めたら殺した。腫瘍の増殖が徐々に容易になることは、
最初の数匹の後の各ラット内における増殖期間が短くな
ることによって示される。１０匹のラットに注射をおこ
なった日付は次の通りである:９月９日、１０月１６
日、１０月２８日、１１月１２日、１１月２０日、１１
月２８日、１２月６日、１２月１５日、１２月２２日お
よび１２月３１日。
【００７０】１０匹のラットからの腫瘍細胞は１０％(v
／v)ＦＣＳ含有ＤＭＭ内へ入れ、プランジャーを用いて
微細なナイロン網を押し通すことによって粉砕して細胞
懸濁液を得た。この懸濁液を種々の希釈度で２０％v／v
ＦＣＳ含有ＤＭＭ中に分配させ、培地内のＦＣＳ濃度が
徐々に減少するＬinbroプレート内でくり返して二次培
養した。
【００７１】３週間後、２.５％(v／v)ＦＣＳ含有ＤＭ
Ｍ内での二次培養増殖物(ＹＢＯ)を得た。このセルライ
ンをＹＢ２／３.０.Ａg.２０自体に関する実施例１に記
載の手順と同様にしてＤＭＭ／２.５％(v／v)ＦＣＳ内
でのスピナー培養に付した。セルラインＹＢＯの特性は
実質上はＹＢ２／３.０.Ａg.２０の特性と同様である
が、ハイブリッドＬou×ＡＯラットにおけると同様に純
粋なＬouにおける増殖にも容易に適応し、ＡＯマーカー
はこのセルラインにおいては明らかに失なわれている
か、完全に抑制されている。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ブルース・ウィリアム・ライト イギリス国イングランド、ケンブリッジ、 コンバートン、ブッシュ・クロース48番

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】８−アザグアニンに対し耐性であり、ヒポ
    キサンチン／アミノプテリン／チミジンを含む培地にお
    いて死滅し、免疫グロブリン鎖を発現する能力を欠くラ
    ット骨髄腫セルラインＹＢ２／３.０.Ａg.２０、または
    それを継代することにより得られかつ上記特性を有する
    その変異株を、免疫原で感作された免疫細胞と細胞融合
    させ、得られたヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ
    ジンを含む培地中で死なないハイブリッド骨髄腫セルラ
    インによって生産されるモノクロナール抗体。
  2. 【請求項２】細胞融合に用いる免疫細胞が脾臓細胞であ
    る請求項１記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】細胞融合に用いる免疫細胞がマウス由来で
    ある請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】細胞融合に用いる免疫細胞がラット由来で
    ある請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
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Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) * 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4987079A (en) * 1982-07-06 1991-01-22 Wilbur D. Smith Composition and method for in vitro cell culture
JPH0679553B2 (ja) * 1983-01-20 1994-10-12 サントリー株式会社 新規な雑種細胞
GB8318575D0 (en) * 1983-07-08 1983-08-10 Cobbold S P Antibody preparations
US5639639A (en) * 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
US4634666A (en) * 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US4562003A (en) * 1984-10-26 1985-12-31 California Biotechnology, Inc. Monoclonal antibodies against alveolar surfactant protein
DE3668186D1 (de) * 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US5981216A (en) * 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4808532A (en) * 1985-07-01 1989-02-28 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Continuous human cell lines and method of making same
US5292636A (en) * 1986-03-31 1994-03-08 T Cell Diagnostics, Inc. Therapeutic and diagnostic methods using soluble T cell surface molecules
JPS63180059U (ja) * 1987-05-11 1988-11-21
EP0329184A3 (en) * 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
AU623698B2 (en) 1988-09-02 1992-05-21 Chiron Corporation Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-2)
CA2002067A1 (en) * 1988-11-09 1990-05-09 Tamotsu Fukuda Parent cell line for producing human hybridomas
JPH0727946Y2 (ja) * 1989-03-14 1995-06-28 トーコー衛材株式会社 簡易マスク
US5567594A (en) * 1991-04-26 1996-10-22 Enteron, L.P. Methods and compositions for the detection and treatment of diseases associated with antigens of microorganisms
US6190864B1 (en) 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
ATE249838T1 (de) 1993-05-12 2003-10-15 Chiron Corp Konserviertes motiv der hepatitis c virus e2/ns1 region
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6124448A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockfeller University Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6124439A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockefeller University OB polypeptide antibodies and method of making
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5759776A (en) * 1995-06-05 1998-06-02 California Pacific Medical Center Targets for breast cancer diagnosis and treatment
US5776683A (en) * 1996-07-11 1998-07-07 California Pacific Medical Center Methods for identifying genes amplified in cancer cells
US6893636B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US7314711B2 (en) 1997-05-23 2008-01-01 Bioveris Corporation Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers
US6528271B1 (en) 1997-06-05 2003-03-04 Duke University Inhibition of βarrestin mediated effects prolongs and potentiates opioid receptor-mediated analgesia
US5891646A (en) * 1997-06-05 1999-04-06 Duke University Methods of assaying receptor activity and constructs useful in such methods
US7541151B2 (en) 1997-06-05 2009-06-02 Duke University Single-cell biosensor for the measurement of GPCR ligands in a test sample
PT2363488E (pt) 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
EP1816200B1 (en) 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
US6087128A (en) 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
US6369201B1 (en) 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
WO2000016804A1 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 Dynavax Technologies Corporation METHODS OF TREATING IgE-ASSOCIATED DISORDERS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREIN
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6773911B1 (en) * 1998-11-23 2004-08-10 Amgen Canada Inc. Apoptosis-inducing factor
US6156514A (en) * 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
ES2350306T3 (es) 1999-02-26 2011-01-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de bioadhesivos y adyuvantes para la administración de antígenos por vía mucosa.
US6399759B1 (en) 1999-05-27 2002-06-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Ant proteases and methods of inhibition
US6262265B1 (en) 1999-06-18 2001-07-17 Microgenics Corporation Non-hydrolyzable analogs of heroin metabolites suitable for use in immunoassay
ATE426016T1 (de) 1999-09-24 2009-04-15 Cybios Llc Pluripotent embryonale stammzellen-ahnliche zellen, zusammensetzungen und ihre vervendungen
DE19957065B4 (de) 1999-11-26 2005-01-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Screening-Verfahren für Arzneistoffe
AU2001230912A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-24 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Identification of virulence determinants
AU2016204535C1 (en) * 2000-04-12 2017-02-23 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anti-D monoclonal antibodies
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
CA2409515C (en) 2000-05-10 2015-11-24 Mayo Foundation For Medical Education & Research Human igm antibodies with the capability of inducing remyelination, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
US7250294B2 (en) 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
EP1734050A3 (en) 2000-06-12 2012-12-05 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection
US7163800B2 (en) * 2000-11-03 2007-01-16 Molecular Devices Corporation Methods of screening compositions for G protein-coupled receptor desensitization inhibitory activity
US20050136431A1 (en) * 2000-11-03 2005-06-23 Oakley Robert H. Methods of screening compositions for G protein-coupled receptor desensitization inhibitory activity
US7018812B2 (en) * 2000-11-03 2006-03-28 Duke University Modified G-protein coupled receptors
FR2817875B1 (fr) * 2000-12-07 2005-03-18 Technopharm Procede de preparation d'un anticorps monoclonal humain, de fragments de celui-ci ou d'anticorps comprenant de tels fragments, les anticorps ainsi obtenus et leur utilisation
PT2163256E (pt) 2001-05-11 2015-11-20 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US20110313230A1 (en) 2001-05-11 2011-12-22 Terrance Grant Johns Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
WO2002099069A2 (en) * 2001-06-05 2002-12-12 The Regents Of The University Of California Modulating neuronal outgrowth via the major histocompatibility complex class i (mhc i) molecule
US20090324612A1 (en) * 2001-06-05 2009-12-31 Kaufman Daniel L Modulating neuronal outgrowth via the major histocompatibility complex class i (mhc i) molecule
EP1978108A3 (en) 2002-01-08 2009-01-07 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy
US20030182669A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 Rockman Howard A. Phosphoinositide 3-kinase mediated inhibition of GPCRs
WO2003080649A2 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Regents Of The University Of Minnesota Induction of hepatocyte proliferation in vitro by inhibition of cell cycle inhibitors
US7290215B2 (en) * 2002-06-03 2007-10-30 Microsoft Corporation Dynamic wizard interface system and method
US7514233B2 (en) 2002-09-26 2009-04-07 K.U. Leuven Research & Development Integrase cofactor
AU2002953431A0 (en) * 2002-12-19 2003-01-09 Murdoch University BmpB Novel Nucleotide and Amino Acid Sequences and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof
EP1590438A2 (en) * 2003-01-24 2005-11-02 Duke University Modified trafficking patterns for arrestin and g-protein-coupled receptors via arrestin-ubiquitin chimera
EP1648427B1 (en) 2003-05-16 2013-12-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research Low dose IgM antibody treatment of demyelinating disorders
US20060035242A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
US7138504B2 (en) * 2004-08-12 2006-11-21 Microgenics Corporation Reagents and methods for mycophenolic acid immunoassay
US20060240496A1 (en) * 2005-04-21 2006-10-26 Lakshmi Anne Immunogens, derivatives and immunoassay for ethyl glucuronide
CN101175856A (zh) 2005-05-12 2008-05-07 诺瓦提斯公司 猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用于诊断和治疗的用途
KR101529317B1 (ko) 2005-06-22 2015-06-16 아스테리아스 바이오세라퓨틱스, 인크. 영장류 다능성 줄기 세포의 심근세포 계통 세포로의 분화
US7780969B2 (en) * 2005-07-15 2010-08-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Trypanosoma cruzi proteome compositions and methods
CA2621236A1 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Centocor, Inc. Host cell lines for production of antibody constant region with enhanced effector function
CN101627111A (zh) * 2005-08-31 2010-01-13 森托科尔公司 用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系
WO2007115059A2 (en) 2006-03-29 2007-10-11 Merial Limited Vaccine against streptococci
EP3147365B1 (en) 2006-04-21 2019-12-04 Intervet International B.V. Pestivirus species
EP2190481B1 (en) 2007-07-17 2014-12-24 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
CN101821284B (zh) 2007-08-03 2014-11-19 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用途
EP2363407A1 (en) 2008-02-28 2011-09-07 Murdoch University Novel sequences of Brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof
WO2009117773A1 (en) 2008-03-27 2009-10-01 Murdoch University Novel sequences of brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof
US8093049B2 (en) 2008-03-27 2012-01-10 Geron Corporation Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells
WO2010120374A2 (en) 2009-04-17 2010-10-21 New York University Peptides targeting tnf family receptors and antagonizing tnf action, compositions, methods and uses thereof
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US9005579B2 (en) 2010-01-05 2015-04-14 Contrafect Corporation Methods and compositions for enhanced immunological therapy and targeting of gram-positive bacteria
WO2011113118A1 (en) 2010-03-19 2011-09-22 Katholieke Universiteit Leuven Drug tolerance/persistence of fungal biofilms
EP2576622A4 (en) 2010-06-01 2013-11-27 Univ Monash ANTIBODIES AGAINST RECEPTOR TYROSINE KINASE C-MET
US9297813B2 (en) 2010-11-11 2016-03-29 Agency For Science, Technology And Research Targeting metabolic enzymes in human cancer
EP2691512B1 (en) 2011-03-29 2019-05-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Enriched populations of cardiomyocyte lineage cells from pluripotent stem cells
GB201107467D0 (en) 2011-05-05 2011-06-15 Univ Leuven Kath Novel treatment of pain
AU2012385228B2 (en) 2012-07-12 2016-10-06 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Conjugates of cell binding molecules with cytotoxic agents
AU2012395148B2 (en) 2012-11-24 2016-10-27 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
EP3013857B1 (en) 2013-06-28 2021-06-23 Singapore Health Services Pte Ltd Trpm4 channel inhibitors for stroke treatment
WO2015028850A1 (en) 2013-09-02 2015-03-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Novel cytotoxic agents for conjugation of drugs to cell binding molecule
CA2959117C (en) 2013-09-19 2023-08-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for producing hepatocyte-like cells
FI3122757T3 (fi) 2014-02-28 2023-10-10 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Varautuneita linkkereitä ja niiden konjugointikäyttötapoja
WO2016140799A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 Ark Diagnostics, Inc. Pregabalin immunoassays
WO2015151081A2 (en) 2015-07-12 2015-10-08 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
KR102459468B1 (ko) 2016-11-14 2022-10-26 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
US11578140B2 (en) 2019-03-26 2023-02-14 Microgenics Corporation Immunoassay for mitragynine
BR112021025984A2 (pt) 2019-06-29 2022-04-12 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Conjugado de anticorpo-derivado de tubulisina b (análogo), composto, composição farmacêutica, e, usos do conjugado, dos compostos e das composições farmacêuticas
EP3862023A1 (en) 2020-02-05 2021-08-11 Hangzhou DAC Biotech Co, Ltd Conjugates of cell-binding molecules with cytotoxic agents
CN115397848A (zh) 2020-02-05 2022-11-25 拉利玛生物医药公司 Tat肽结合蛋白及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1142466A (en) * 1979-01-09 1983-03-08 Cesar Milstein Cell lines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF IMMUNOLOGY=1980 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE3167442D1 (en) 1985-01-10
EP0043718A3 (en) 1982-01-20
JPH02291298A (ja) 1990-12-03
EP0043718A2 (en) 1982-01-13
CA1173379A (en) 1984-08-28
JPH0372271B2 (ja) 1991-11-18
EP0043718B1 (en) 1984-11-28
US4472500A (en) 1984-09-18
JPH0538B2 (ja) 1993-01-05
JPS5739777A (en) 1982-03-05

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