ES2213760T3 - Preparacion de globulina de suero inmunizante inyectable por via intravenosa con virus inactivado. - Google Patents
Preparacion de globulina de suero inmunizante inyectable por via intravenosa con virus inactivado.Info
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Abstract
METODO PARA REDUCIR LA ACTIVIDAD ANTICOMPLEMENTARIA (ACA) RESULTANTE DEL TRATAMIENTO DE INACTIVACION VIRAL DE UNA SOLUCION DE ANTICUERPOS, EL METODO INCLUYE LA PUESTA EN CONTACTO DE UNA SOLUCION CON UN TRIALQUILFOSFATO, COMO FOSFATO TRI-N-BUTIL, Y UN DETERGENTE, COMO COLATO DE SODIO, BAJO LAS CONDICIONES NECESARIAS PARA REDUCIR SUSTANCIALMENTE LA ACTIVIDAD VIRICA, Y ENTONCES INCUBAR LA SOLUCION BAJO CONDICIONES CONTROLADAS DE TIEMPO, PH, TEMPERATURA Y FUERZA IONICA ASI COMO PARA REDUCIR LA ACTIVIDAD ANTICOMPLEMENTARIA A UN NIVEL ACEPTABLE. EN LA VERSION IDEAL, EL ACA SE REDUCE A MENOS DE 60CH{SUB,50} UNIDADES/ML, LA INCUBACION ES DE AL MENOS 10 DIAS A UN PH ENTRE 3.5 Y 5.0, LA TEMPERATURA SE MANTIENE ENTRE 2 Y 50 C, Y LA FUERZA IONICA DE LA SOLUCION ES INFERIOR A 0.001 APROXIMADAMENTE.
Description
Preparación de globulina de suero inmunizante
inyectable por vía intravenosa con virus inactivado.
Esta invención generalmente se ocupa de un
producto a base de inmunoglobulina inyectable intravenosamente, y
más específicamente se ocupa de una globulina inmune de suero
inyectable intravenosamente (GIIV), que ha sido sometida a una etapa
de inactivación de virus y que posee un nivel bajo de actividad
anticomplemento.
Las primeras preparaciones farmacéuticas de
globulinas inmunes de suero no se podían administrar
intravenosamente debido a una inaceptable elevada incidencia de
reacciones adversas. Estas reacciones adversas se asociaron con un
descenso en los niveles de complemento en suero, aparentemente
provocado por la unión del complemento a la gammaglobulina
administrada. (1) La capacidad de la gammaglobulina para unirse al
complemento, o su actividad anticomplemento (AAC), aumenta
considerablemente como resultado de la desnaturalización producida
durante el procedimiento de fraccionamiento. Se han considerado
varias propuestas para dirigir el problema de hacer que la GIS
resulte segura para administración intravenosa. (Véanse (2) y las
referencias en esta memoria descriptiva). Tenold presentó un
procedimiento para preparar una globulina inmune de suero (GIS) con
baja AAC que se podía administrar por inyección intravenosa. (2). El
procedimiento de la patente 4.396.608, de Tenold requiere formular
la globulina inmune de suero a baja fuerza iónica (preferiblemente
inferior a aproximadamente 0,001) y a pH bajo (3,5 a 5,0).
Se han presentado otros procedimientos para
preparar la globulina inmune de suero inyectable intravenosamente
(GIIV), incluyendo la estabilización con hidratos de carbono como
por ejemplo la maltosa (3). Un procedimiento que incluye la
incubación de GIS a pH 4,0 a 37ºC (4) da lugar a un producto con
baja AAC que se puede administrar por inyección intravenosa; sin
embargo, durante el almacenamiento el producto vuelve a recuperar su
elevada AAC. La GIIV se ha preparado también por modificación
covalente de la GIS, por ejemplo por proteolisis (5) o por reducción
de puentes disulfuro seguida de reacción con un agente de bloqueo
(1,6).
Las preparaciones de anticuerpos, como son
productos aislados de la sangre, tienen un riesgo inherente de
transmitir enfermedades mediadas por virus. La inactivación de los
virus es una etapa importante para producir productos sanguíneos
seguros y efectivos. La patente de EE.UU. 4.540.573 de Neurath
et al, describe un procedimiento de inactivación vírica
usando un procedimiento con trialquil fosfato y detergente (de aquí
en adelante, el procedimiento con disolvente/detergente o
procedimiento DD). (7) Ese procedimiento con disolvente/detergente
ha ganado aceptación ya que resulta eficaz en la inactivación de
virus con envuelta lipídica con efectos adversos limitados sobre la
actividad biológica o sobre el perfil del producto sanguíneo. (8,
15; véase también 12 para una discusión de varios procedimientos de
inactivación vírica).
Las preparaciones de anticuerpos actuales
disponibles en el mercado generalmente se han considerado seguras
con respecto a la contaminación vírica. (9) Se piensa que esto es
debido a las características de los procedimientos de
fraccionamiento usados para aislar estos productos sanguíneos. Sin
embargo, sería deseable asegurar además la seguridad de las
preparaciones de anticuerpos incluyendo una etapa de inactivación
vírica distinta en el procedimiento de producción. Se presentó una
reducción de actividad vírica exitosa en una solución de GIIV usando
varios procedimientos de inactivación vírica diferentes para una
serie de virus. (16,17) Se ha presentado un procedimiento para la
preparación de inmunoglobulinas sustancialmente libres de retrovirus
que requiere la incubación de la GIS en condiciones controladas de
tiempo, temperatura y pH. El procedimiento conlleva aislar la GIS a
través de un procedimiento de fraccionamiento de plasma con etanol
frío y, luego, el almacenamiento de la GIS en una o dos condiciones
de almacenamiento: (a) a pH \leq 4,25 a una temperatura de 27ºC
durante al menos tres días, o (b) a pH \leq 6,8 a una temperatura
de 45ºC durante al menos seis horas. (10).
Se ha encontrado que usando el procedimiento DD
para tratar las preparaciones de GIS, especialmente aquellas
formuladas posteriormente según la patente 4.396.608 de Tenold, da
lugar a un producto con una inactivación vírica aceptable pero con
inaceptables niveles elevados de AAC. Los niveles elevados de AAC
se detectaron siempre en la etapa de masa estéril (es decir,
después de combinar GIIV al 5% o al 10% y de la filtración con
filtros estériles de
0,2 \mum) de todas las preparaciones de GIIV tratadas con tri-n-butil fosfato (TNBP, tri-n-butyl phosphate)/detergente, sin tener en cuenta la escala del procedimiento. Las preparaciones de GIS con niveles elevados de AAC no son adecuadas para inyección intravenosa y en su lugar, se deben administrar a través de otras rutas, por ejemplo, por inyección intramuscular (IM). Sin embargo, las preparaciones de GIIV resultan más deseables ya que están inmediatamente disponibles en el torrente sanguíneo y no están sometidas a la pérdida asociada a la inyección intramuscular. De esta forma, resulta deseable tener un producto a base de GIIV que tenga una baja AAC y que haya sido sometido a una etapa de inactivación vírica.
0,2 \mum) de todas las preparaciones de GIIV tratadas con tri-n-butil fosfato (TNBP, tri-n-butyl phosphate)/detergente, sin tener en cuenta la escala del procedimiento. Las preparaciones de GIS con niveles elevados de AAC no son adecuadas para inyección intravenosa y en su lugar, se deben administrar a través de otras rutas, por ejemplo, por inyección intramuscular (IM). Sin embargo, las preparaciones de GIIV resultan más deseables ya que están inmediatamente disponibles en el torrente sanguíneo y no están sometidas a la pérdida asociada a la inyección intramuscular. De esta forma, resulta deseable tener un producto a base de GIIV que tenga una baja AAC y que haya sido sometido a una etapa de inactivación vírica.
La invención es un procedimiento para producir
una preparación de globulina inmune de suero inyectable
intravenosamente (GIIV) con baja actividad anticomplemento, que ha
sido tratada químicamente para dejarla sustancialmente libre de
virus con envuelta lipídica. El procedimiento comprende una etapa de
inactivación vírica por disolvente/detergente, seguida de una etapa
de incubación. Se ha descubierto que la etapa de incubación es
necesaria para alcanzar un nivel aceptable de AAC suficientemente
bajo para permitir que la GIS sea administrada por inyección
intravenosa. La etapa de incubación se debería llevar a cabo con
tiempo, pH, temperatura y fuerza iónica controlados.
Preferiblemente el pH se debería mantener entre 3,5 y 5,0, la
temperatura debería estar dentro de un intervalo de 2 a 50ºC y la
fuerza iónica debería ser inferior a 0,001. En una realización
preferida la AAC de la preparación de GIS disminuye gradualmente
durante un período de al menos aproximadamente diez días cuando la
GIS se mantiene a un pH de aproximadamente 4,25 a baja concentración
iónica (inferior a aproximadamente 0,001) y la etapa de
inactivación vírica (en un sistema modelo) da lugar a una reducción
sustancial (es decir, al menos 4 logaritmos) en el título de virus
con envuelta lipídica.
La Figura muestra una comparación de los niveles
medios típicos observados de AAC de soluciones de GIIV al 5%
tratadas según el procedimiento DD y con o sin la incubación
complementaria de la presente invención.
El material de partida para el procedimiento de
esta invención es globulina inmune humana no modificada de suero.
En la especificación y reivindicaciones se usa el término
"globulina inmune de suero" para definir la sustancia a la que
también se hace referencia en la bibliografía en varias ocasiones
como gammaglobulina, IgG e inmunoglobulina G. Consta
predominantemente y preferiblemente de al menos aproximadamente un
85% de la especie 7S de gammaglobulina, la cual tiene un peso
molecular de aproximadamente 160.000. Cualquier cosa que quede es
preferiblemente la especie 9S, con un peso molecular de
aproximadamente 300.000. Se pueden emplear globulinas inmunes
convencionales e hiperinmunes de suero, por ejemplo, globulinas
inmunes de suero contra el tétanos, rabia y hepatitis, siendo el
producto tratado con disolvente/detergente, GIS inmune e hiperinmune
respectivamente. De esta forma, un material de partida adecuado para
el procedimiento de esta invención es el filtrado de la Fracción II
o Fracción III de Cohn. (Véanse las referencias 13, 14).
La Fracción II, por estudios de
ultracentrifugación, es predominantemente (aproximadamente un 85%)
la especie 7S (constante de sedimentación de 7) de la gammaglobulina
con un peso molecular medio de 160.000. La proteína que queda es
esencialmente material 9S con un peso molecular de aproximadamente
300.000. La pasta húmeda de la Fracción II (aproximadamente un 30%
en sólidos) se liofiliza comúnmente para obtener polvo seco de GIS
que luego se disuelve y se prepara para inyección intramuscular en
forma de una solución estéril al 16,5%. Tanto la pasta húmeda de la
Fracción II como el polvo seco de GIS son un material de partida
adecuado para el procedimiento de esta invención.
La gammaglobulina obtenida por cualquier
procedimiento, que tenga esencialmente la misma composición de
componentes proteicos que la encontrada en el filtrado de la
Fracción II o Fracción III de Cohn, se puede usar como material de
partida en el presente procedimiento. La globulina inmune
convencional de suero y la globulina hiperinmune de suero se pueden
emplear como materiales de partida. Tal y como es bien conocido, la
última es producida a partir de plasma o de suero obtenidos de
donantes seleccionados, quienes tienen títulos mucho más elevados
para un anticuerpo específico que lo que normalmente se encuentra en
la población media. Estos donantes han sido inmunizados
recientemente con una vacuna en particular si no se han recuperado
recientemente de una infección o enfermedad. Estos sueros o plasmas
de título elevado se juntan y se someten a los procedimientos
normales de fraccionamiento de Cohn hasta el punto de aislar la
Fracción II.
Además, como la cantidad de anticuerpo requerida
para alcanzar una respuesta inmunológica deseada es sustancialmente
menor cuando se administra intravenosamente, quedará claro que la
dosis intravenosa será sustancialmente menor que la dosis
intramuscular, la cual producirá el mismo título de anticuerpos en
suero. De esta forma, la dosis de GIS intramuscular y de globulina
hiperinmune de suero debe ser más alta que la requerida para
alcanzar el mismo título de anticuerpos en suero cuando la
globulina de la misma actividad anticuerpo se administra
intravenosamente.
La pasta húmeda o el polvo liofilizado de partida
se disuelven en un volumen de agua u otro vehículo fisiológicamente
aceptable para proporcionar una solución proteica de una
concentración de aproximadamente un 0,5 a un 20%, preferiblemente de
aproximadamente un 5 a un 10%. Si se emplea el filtrado de la
Fracción III, la solución acuosa se debe concentrar por técnicas
convencionales hasta la concentración de proteína deseada. En este
procedimiento se puede usar cualquier concentración proteica; sin
embargo, se prefiere el intervalo anterior desde un punto de vista
práctico.
Después de que la proteína se haya disuelto o
concentrado, la solución se ajusta a un pH de aproximadamente 3,5 a
5,0, preferiblemente de aproximadamente 3,8 a 4,2, por adición de un
ácido fisiológicamente aceptable, como por ejemplo ácido
clorhídrico. En general, el pH se ajusta hasta un punto en el que
el material monomérico en la solución proteica se mantiene en un
máximo. Sin embargo, el pH no debe ser tan bajo como para dar lugar
a gelificación. La temperatura no debería ser perjudicial para el
material de GIS. Se obtienen buenos resultados dentro del intervalo
de temperaturas de 0 a 20ºC. No es necesario colocar en un soporte
el material ajustado de esa forma durante ningún período de tiempo
previo a la siguiente etapa; sin embargo, el material se puede
colocar en un soporte, si se desea, sin efectos perjudiciales.
La solución proteica al pH apropiado
(preferiblemente 3,8 a 4,2) se puede filtrar por diálisis con al
menos 4 intercambios de volumen de agua para reducir la
concentración de alcohol de aproximadamente un 17% (Filtrado III) a
aproximadamente un 2% de alcohol. La eficacia de la mezcla
disolvente/detergente como un procedimiento de inactivación vírica
es mucho mejor a temperatura ambiente o por encima; sin embargo,
elevadas concentraciones de alcohol a estas temperaturas
desnaturalizarán las moléculas de IgG. De esta forma, esta
inactivación se puede llevara a cabo a baja concentración de
alcohol.
Posteriormente, la concentración proteica del
material tratado de esa forma se ajusta al nivel deseado para
incubación con TNBP/detergente, generalmente inferior a un 10% de
proteína para una inactivación vírica máxima. Este ajuste se lleva
a cabo por técnicas convencionales no perjudiciales para GIS, por
ejemplo, ultrafiltración, ósmosis inversa, sublimación, evaporación,
etcétera. Antes de la adición del TNBP/detergente, se puede ajustar
el pH dentro de un amplio intervalo, dependiendo del detergente que
se vaya a usar. Con Tween 80, el pH puede ser tan bajo como 3,5,
donde la IgG comienza a ser inestable. Con colato, el pH se ajusta
dentro del intervalo de 5,0 a 6,4, preferiblemente 5,6, antes de la
adición de TNBP/detergente. Se alcanzó una solubilidad
satisfactoria del colato durante la incubación ajustando las
soluciones de inmunoglobulina a un pH de 5,5 o superior, antes de la
adición de TNBP y de colato de sodio. No resulta conveniente
ajustar la solución de IgG a valores de pH inferiores a 5,5 por que
la solubilidad del colato de sodio es altamente dependiente del pH
(pK del ácido cólico = 6,4), con una escasa solubilidad a pH 5,5 o
inferior. Además, la inactivación vírica máxima durante la
incubación con TNBP/colato se observó a valores de pH inferiores a
6,0 en los experimentos que emplearon virus modelos añadidos en
soluciones de IgG. La inactivación de VIH-1 y VDVB
(virus de la diarrea vírica en bóvidos, el cual se emplea como un
modelo para hepatitis C) se aceleró a pH 5,8, teniendo lugar la
inactivación hasta el límite de detección en 1 a 2 horas, mientras
que la inactivación hasta el límite de detección requirió un mínimo
de 6 horas cuando se usaron las condiciones de pH 7.
Posteriormente, se añade TNBP/detergente a la
solución proteica (preferiblemente menos de un 8% [peso/peso], pH
5,8), se mezcla completamente y luego se incuba a temperaturas por
encima de la temperatura ambiente, por ejemplo 30ºC, con agitación o
mezcla continua. Los niveles objetivo de TNBP/colato para una
inactivación vírica óptima durante la etapa de incubación deberían
ser > 3 mg/ml de TNBP y > 2 mg/ml de colato tal y como se
define en Edwards et al. (8) Además, para una inactivación
vírica efectiva, es importante que la solución esté esencialmente
libre de partículas para facilitar una mezcla completa de
disolvente/detergente y de la solución de IgG. Después de la
incubación con TNBP/colato en estas condiciones, se detectaron una
reducción de VIH-1 mayor que el logaritmo decimal de
5,2 y una reducción de VDVB mayor que el logaritmo decimal de
4,0.
Después de completar la incubación que
proporciona la inactivación vírica, las moléculas de disolvente y de
detergente se deben eliminar para alcanzar un producto final con
bajos niveles residuales de TNBP y colato, lo cual sería adecuado
para administración intravenosa. Generalmente, los procedimientos
para eliminar el detergente resultan también efectivos para eliminar
el TNBP y viceversa. Se pueden alcanzar niveles muy bajos de TNBP y
colato en el contenedor final por una combinación de filtración,
filtración por diálisis y cromatografía hidrofóbica. Después de
completar la incubación, la mayor parte del colato (y del TNBP) se
puede eliminar de la solución proteica por filtración, con la
condición de que la solución se hubiera ajustado previamente a un
valor de pH más bajo, como por ejemplo 4,0, porque el colato de
sodio es escasamente soluble en soluciones acuosas a tales valores
de pH. Además, todas las etapas de procesado que siguen a la
incubación con disolvente/detergente se llevan a cabo a valores de
pH más bajos (es decir, 4,0) porque las moléculas de IgG son más
estables a valores de pH entre 3,5 a 5,0, en soluciones de fuerza
iónica baja. (2) De esta forma, después de la incubación con
TNBP/colato, la solución proteica se ajusta a aproximadamente pH
4,0 y se incuba de 0 a 8ºC para promover la precipitación del
colato. Posteriormente, se emplea la filtración para eliminar el
colato precipitado de la solución de IgG.
La solución tratada de esa forma se filtra por
diálisis con al menos cuatro intercambios de volumen de agua para
reducir la fuerza iónica y para eliminar el TNBP y colato
adicionales. Después o durante el tratamiento anterior, el pH se
mide y se mantiene dentro del intervalo de aproximadamente 3,5 a
5,0. La concentración proteica del material tratado de esa forma se
ajusta de un 10 a un 30%, normalmente a un 13% (peso/volumen)
empleando técnicas convencionales no perjudiciales para GIS, por
ejemplo, ultrafiltración, ósmosis inversa, sublimación,
evaporación, etcétera. De nuevo el pH de la preparación se mantiene
dentro del intervalo de aproximadamente 3,5 a 5,0, preferiblemente
aproximadamente 3,8 a 4,2.
En la presente invención, la cromatografía
hidrofóbica se emplea para eliminar el TNBP y el colato no
eliminados en las etapas de filtración y filtración por diálisis; y
de esta forma proporciona un producto final con bajos niveles
residuales de TNBP y colato, lo cual es adecuado para administración
intravenosa. La cromatografía hidrofóbica es un procedimiento para
eliminación de TNBP de las soluciones proteicas que tiene menos
desventajas y limitaciones que otros procedimientos disponibles como
por ejemplo la cromatografía de extracción de aceite, de intercambio
iónico o de afinidad. En parte, esto es porque la proteína de
interés (IgG) permanece en la solución a lo largo del procedimiento
de eliminación de TNBP. Se usaron resinas a base de poliestireno
(típicamente PLRP-S de Polymer Laboratories,
Amherst, MA) para eliminar la mezcla disolvente/detergente de la
solución ya que se ha encontrado que las resinas a base de
poliestireno son superiores a otras resinas, como por ejemplo
resinas C-18 a base de sílice.
Posteriormente, la preparación de GIS se ajustó a
un 5% o a un 10% de proteína y se trató para hacerla tónica, es
decir, hacerla compatible con las condiciones fisiológicas, o para
hacerla fisiológicamente aceptable para inyección. En una
realización preferida, la tonicidad se ajusta a aproximadamente 230
a aproximadamente 490 mosmol/kg de disolvente. Más preferiblemente,
el intervalo de tonicidad va de aproximadamente 250 a
aproximadamente 350 mosmol/kg de disolvente y, de la forma más
preferible, el intervalo de tonicidad va de aproximadamente 260 a
aproximadamente 325 mosmol/kg de disolvente. La formulación al 5%
(5% de GIIV) se hace tónica por adición de maltosa al 10%. La
formulación al 10% contiene glicina 0,2 M para obtener una
preparación isotónica sin grandes cantidades de azúcar. El producto
con cualquiera de las dos formulaciones (Gaminune®N al 5% o
Gaminune®N al 10%) experimenta cambios en la distribución molecular
(agregación de anticuerpos) cuando se aumenta la fuerza iónica de
la solución de pH bajo. Por lo tanto, no se debería usar cloruro de
sodio, el cual se usa a menudo para alcanzar la tonicidad.
La solución tratada de esa forma se incuba a pH
4,25 en condiciones de fuerza iónica baja (preferido NTL, 21 días a
20-27ºC) para proporcionar una disminución de los
niveles de AAC. La fuerza iónica se determina según Perrin (18), y
en una realización preferida la fuerza iónica debería ser inferior a
aproximadamente 0,001. Siempre se detectaron los niveles elevados de
AAC en esta etapa de todas las preparaciones de GIIV tratadas con
TNBP/colato (sin tener en consideración la escala del
procedimiento); sin embargo, los niveles de AAC disminuyen
gradualmente por incubación a pH 4,25 en condiciones de fuerza
iónica baja (Tablas 3, 5-7). Mientras que no hay
normas estrictas para determinar cuando el nivel de AAC es
suficientemente bajo como para ser un nivel aceptable adecuado para
administración intravenosa, las preparaciones de GIIV deberían
tener niveles de AAC tan bajos como fuera posible.
La Figura describe la reducción media de AAC
típica observada en soluciones de GIIV al 5% después del tratamiento
DD. Para una formulación de GIS al 5%, el nivel aceptable adecuado
para administración intravenosa sería preferiblemente inferior a
aproximadamente 45 unidades de CH_{50}/ml, y más preferiblemente
inferior a aproximadamente 30 unidades de CH_{50}/ml. Para una
formulación de GIS al 10%, el nivel aceptable adecuado para
administración intravenosa sería preferiblemente inferior a
aproximadamente 60 unidades de CH_{50}/ml, y más preferiblemente
inferior a aproximadamente 45 unidades de CH_{50}/ml. Tal y como
se usa en esta memoria descriptiva, una unidad de AAC (una unidad
de CH_{50}) se define como la cantidad de proteína capaz de
activar un 50% del complemento en un sistema de complemento y
células rojas de la sangre/hemolisina titulado de forma óptima. El
ensayo mide la cantidad de complemento que une la mezcla de
cantidades de complemento y proteína llevadas a una concentración
conocida. Véanse las referencias 19 a 20 para una discusión del
ensayo. Brevemente, las células rojas de la sangre que han sido
sensibilizadas por preincubación con anticuerpos de células rojas de
la sangre se añaden a la mezcla de complemento/proteína. En
presencia de complemento libre (no unido ya por la proteína), estas
células sensibilizadas se lisarán liberando hemoglobina, la cual se
puede cuantificar como una medida del grado de lisis. En paralelo,
se añaden también células rojas de la sangre sensibilizadas a una
mezcla de tampón control/complemento, cuyo grado de lisis se define
como un 100%. La diferencia entre la cantidad real de complemento
que se necesita para dar un 100% de lisis y la cantidad de
complemento que queda no unida en presencia de proteína es igual a
la cantidad de complemento realmente unida por la proteína, o
actividad anticomplemento.
Para establecer el efecto del procedimiento DD de
inactivación vírica en soluciones que contienen GIS, las cuales se
formulan según la patente 4.396.608 de Tenold, se llevaron a cabo
los experimentos descritos en la Tabla 1. El material de partida
(MP) fue el Filtrado III del procedimiento de Cohn, el cual se
había ultrafiltrado hasta aproximadamente un 5% de proteína y
entonces se filtró por diálisis con cuatro volúmenes de agua.
En el experimento control, incubación (-)/DD(-),
el material de partida no se sometió a ninguna incubación o
tratamiento con disolvente/detergente. En el experimento de
incubación (+)/DD(-), el pH del material de partida se ajustó a
7,0, la solución se incubó a 30ºC durante 10 horas y el pH se redujo
entonces a 4,0. En el experimento de incubación (+)/DD, TNBP &
Tween 80 (+), el pH del material de partida se ajustó a 7,0, se
añadieron a la solución 3 mg/ml de TNBP y 2 mg/ml de Tween 80, la
solución se incubó a 30ºC durante 10 horas y el pH se redujo
entonces a 4,0. En el experimento de incubación (+)/DD, TNBP &
colato (+), el pH del material de partida se ajustó a 7,0, se
añadieron a la solución 3 mg/ml de TNBP y 2 mg/ml de colato, la
solución se incubó a 30ºC durante 10 horas y el pH se redujo
entonces a 4,0. Las soluciones se filtraron por diálisis después en
cada experimento con cuatro volúmenes de AFPI (agua fría por
inyección) y se concentraron por ultrafiltración. Después de la
adición de maltosa seca al 10% peso/volumen, la solución de GIIV al
5% (pH 4,25) se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum.
Los resultados recogidos en la Tabla 1 muestran
que los niveles de AAC aumentaron en las muestras de IgG después de
la incubación con TNBP/colato o con TNBP/Tween 80. Los niveles de
AAC no subieron en las muestras de IgG que se incubaron durante 10
horas a 30ºC en ausencia de disolvente/detergente. Estos resultados
sugieren que los niveles de AAC de muestras de GIIV no subieron ni
por manipulaciones de procesado ni por incubación durante 10 horas a
30ºC en ausencia de disolvente/detergente.
| AAC (CH_{50}/ml) | |
| GIIV al 5%, no TNBP/colato | 12 |
| GIIV al 5% con 100g/ml de TNBP, 100 g/ml de colato de sodio | 13 |
Además los experimentos de adición (con TNBP y
colato de sodio, Tabla 2) han demostrado que los niveles elevados
de actividad anticomplemento no fueron artefactos provocados por
llevar a cabo el ensayo de anticomplemento en presencia de niveles
del orden de trazas de TNBP/colato de sodio. De esta forma, usar el
procedimiento DD de la técnica anterior para inactivación vírica de
una solución que contiene GIS, posteriormente formulada según la
patente 4.396.608 de Tenold, proporciona un producto que tiene una
elevada AAC y que no es adecuado para administración intravenosa. En
un experimento similar, las muestras tratadas con DD que no fueron
incubadas (Tabla 3, ensayo inicial) tuvieron niveles de AAC
superiores a 100 unidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, cuando se incubaron muestras
duplicadas tratadas con DD durante períodos largos de tiempo (6
semanas a 5ºC y 3 semanas a 22ºC), el nivel de AAC se redujo
marcadamente (Tabla 3, después de incubación). Esto condujo a una
investigación adicional de esta sorprendente observación.
Las muestras del experimento previo (Tabla 3,
ensayo inicial) se analizaron por HPLC de exclusión por tamaños
(exclusión molecular) inmediatamente después de la combinación para
determinar el alcance de la agregación de la GIIV en el tiempo
inicial. El análisis por HPLC muestra casi un contenido completo en
monómeros en las muestras. (Tabla 4).
Previamente, se mostraron niveles elevados de
agregados de IgG para correlacionarse con una actividad
anticomplemento elevada. Sin embargo, los resultados del análisis de
las muestras muestran que el nivel de AAC en las muestras es
superior a 100 unidades (Tabla 3, `Ensayo Inicial'). El análisis por
HPLC muestra que la AAC elevada que sigue al tratamiento con
TNBP/colato no fue debida a la presencia de moléculas agregadas de
IgG.
El material de partida fue el mismo que en el
experimento anterior y las condiciones experimentales fueron
similares, con los siguientes cambios. Las soluciones se trataron
con TNBP/colato a pH 7,0 y después se combinaron con GIIV al 5%,
maltosa al 10%, a pH 4,25, como anteriormente. La AAC fue sometida a
ensayo inmediatamente después de la combinación final, después de
una primera incubación durante nueve días a 5ºC y después de una
segunda incubación durante 21 días tanto a 22ºC como a 5ºC. Los
resultados se presentan en la Tabla 5.
En la muestra de masa estéril inicial, la cual
fue tratada con TNBP/colato a pH 7,0, el nivel de AAC fue de nuevo
superior a 100 unidades para el tiempo inicial, confirmando las
observaciones recogidas en la Tabla 3. Durante la incubación a 5ºC
durante nueve días, la AAC permaneció superior a 100 unidades. La
etapa final de incubación tanto a 5ºC como a 22ºC muestra que la
reducción en AAC es dependiente de la temperatura, con una reducción
más rápida en la AAC observada a temperaturas más elevadas.
Los niveles de AAC fueron evaluados después de la
incubación con TNBP/colato a pH 5,8 porque la mejor actividad
viricida se observó a valores de pH de menos de 6,0. Generalmente,
las muestras de masa estéril no incubadas de material incubado a pH
5,8 tuvieron niveles de AAC inferiores que las muestras a pH 7,0,
pero la tendencia de disminuir AAC durante la incubación se repitió
en las muestras a pH 5,8. De hecho, los niveles de AAC continúan
para disminuir más allá del día 21 de incubación en muestras que
inicialmente tenían niveles elevados de AAC después de la
incubación con TNBP/colato a pH 5,8 (Tabla 6). Tal y como se
observó previamente para las muestras incubadas a pH 7,0, la
disminución de AAC no fue debida a los niveles decrecientes de
moléculas agregadas de IgG por que el material tratado a pH 5,8 era
esencialmente IgG monomérica antes de la incubación a 22ºC (análisis
por HPLC, muestra A4, Tabla 8).
| Incubación a 22ºC (días) | CH_{50}/ml |
| 0 | 122 |
| 10 | 73 |
| 19 | 55 |
| 25 | 56 |
| 28 | 45 |
| 30 | 40 |
| 34 | 39 |
(Tabla 6
continuación)
| Incubación a 22ºC (días) | CH_{50}/ml |
| 41 | 33 |
| 48 | 30 |
| 55 | 29 |
Se alcanzaron resultados similares con muestras
formuladas con GIIV al 10%, glicina 0,2 M en la etapa de masa
estéril. Durante la incubación con baja fuerza iónica a pH 4,25
durante 10 y 21 días, se vio que los niveles de AAC disminuían en
las muestras de GIIV al 5% y en las muestras de GIIV al 10%. (Tabla
7) De esta forma, se puede observar la disminución en AAC a lo largo
de un intervalo de concentraciones de GIS y a lo largo de un
intervalo de valores de pH para el tratamiento con
disolvente/detergente. (Tablas 3, 5, 7) El análisis por HPLC (Tabla
8) de las muestras de masa estéril presentadas en la Tabla 7
confirmó que los niveles elevados de AAC no eran debidos a la
agregación de moléculas de IgG.
Tomados juntos, los resultados anteriores
sugieren que los productos a base de GIS, que han sido sometidos a
un procedimiento de inactivación vírica con disolvente/detergente
que da lugar a un aumento indeseable de AAC, pueden hacerse
adecuados para administración intravenosa incorporando una etapa
adicional de incubación en las condiciones aquí descritas para
reducir la AAC hasta un nivel aceptable.
| Muestra | Agregado (%) | Dímero (%) | Monómero (%) | Fragmento (%) |
| A2 | 0,140 | 0,00 | 99,86 | 0,00 |
| A3 | 0,146 | 0,00 | 99,85 | 0,00 |
| A4 | 0,124 | 0,00 | 99,88 | 0,00 |
El aumento de AAC que resulta del tratamiento con
disolvente/detergente de la solución de GIIV (anticuerpo) parece ser
un efecto secundario inevitable del tratamiento con TNBP/detergente
para inactivar virus en la solución. Se ha descubierto que incubando
la solución de GIIV a pH bajo (4,25) y con fuerza iónica baja
(0,001) durante un período de tiempo relativamente largo (al menos,
aproximadamente 10 días), la AAC disminuye de manera gradual durante
el período de incubación.
La técnica anterior describe un procedimiento
para producir GIIV (la patente 4.396.608 de Tenold) usando pH bajo
y fuerza iónica baja. El procedimiento en la patente 4.396.608 de
Tenold omite la etapa de inactivación vírica, y de esta forma evita
el problema de la AAC elevada, pero permanece la posibilidad de la
actividad vírica. A diferencia de Tenold, la incubación es un
aspecto esencial de la presente invención para reducir la AAC.
La patente 4.540.573 de Neurath et al.
Muestra la etapa de inactivación vírica por disolvente/detergente.
Sin embargo, la patente 4.540.573 de Neurath no menciona el control
del pH y tampoco menciona ninguna consecuencia del procedimiento en
relación a la AAC. Se detectaron niveles elevados de AAC en la etapa
de masa estéril de preparaciones de GIIV tratadas con TNBP/colato.
Sin embargo, los niveles de AAC disminuyeron durante la incubación
durante al menos aproximadamente 10 días a pH 4,25, fuerza iónica
baja, y no menos de aproximadamente 20ºC. (Véanse la Tablas 5 a 7)
La técnica anterior describe varias aproximaciones para reducir los
niveles de AAC de preparaciones de IgG purificada, incluyendo la
eliminación de agregados de IgG. (11) Se ha visto que los agregados
de IgG activan in vivo el sistema del complemento. (1) En la
presente invención, sin embargo, la disminución de la AAC de IgG no
fue debida a la disminución de los niveles de agregados de IgG
porque estas preparaciones de GIIV tratadas con TNBP/colato
contenían niveles bajos de agregados de IgG (tal y como se midió por
HPLC, Tablas 4, 8) antes de la incubación en tales condiciones.
Sería deseable producir GIIV sustancialmente
libre de virus, pero después de la técnica anterior da lugar a un
producto con un nivel inaceptable de AAC. Obsérvese que la patente
4.396.608 de Tenold establece que el producto está sustancialmente
libre de AAC, pero el uso del procedimiento DD junto con la patente
4.396.608 de Tenold da lugar a elevados niveles de AAC: los
resultados experimentales aquí presentados muestran que tratar
soluciones de GIS con el procedimiento DD y luego la formulación
según la patente '608 de Tenold conduce a un producto con elevada
AAC. (Véanse Tablas 1, 3, 5-7) El sorprendente
resultado aquí presentado es que una etapa incubación complementaria
(terminal) disminuye la AAC de la solución tratada con
disolvente/detergente. En la Figura se comparan los niveles medios
observados típicos de AAC de las soluciones de GIIV al 5% tratadas
según el procedimiento DD y con o sin la incubación complementaria.
La presente invención incluye de esta forma un procedimiento no
observado previamente para reducir la AAC incubando en condiciones
controladas de pH, temperatura y fuerza iónica durante un período
de tiempo, permitiendo de esta forma administrarse el producto por
inyección intravenosa.
La patente 4.762.714 de Mitra no sugiere el uso
de un procedimiento D/D, pero, en su lugar, informa que una
incubación relativamente breve de un producto a base de GIS en
condiciones similares da lugar a una preparación sustancialmente
libre de virus. (10) Sin embargo, emplear incubación en tales
condiciones para proporcionar una disminución de la actividad
anticomplemento es una aplicación novedosa de estas condiciones de
incubación, que fueron previamente empleadas en el procedimiento de
GIIV para inactivación de virus con envuelta.
El recién desarrollado procedimiento de GIIV aquí
presentado, el cual incluye un procedimiento de inactivación vírica
adicional internacionalmente aceptado (tratamiento con TNBP/colato),
genera preparaciones de IgG que tienen bajos niveles de AAC y que
son adecuados para administración intravenosa. La ventaja más
importante es que se puede obtener un producto a base de GIIV con
seguridad aumentada por un procedimiento de dos etapas que incluye
un tratamiento con TNBP/colato para una inactivación vírica e
incubación en condiciones que proporcionen niveles bajos de AAC que
son adecuados para administración intravenosa.
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Claims (16)
1. Un procedimiento para la preparación de una
solución de anticuerpos que tiene baja actividad vírica y baja
actividad anticomplemento, comprendiendo el procedimiento:
- a)
- poner en contacto una primera solución de anticuerpos con un trialquil fosfato y un detergente hasta que el título de los virus con envuelta lipídica presentes en la primera solución de anticuerpos se reduzca en al menos 4 logaritmos decimales para producir una segunda solución de anticuerpos;
- b)
- eliminar el trialquil fosfato y el detergente de la segunda solución de anticuerpos para producir una tercera solución de anticuerpos, e
- c)
- incubar la tercera solución de anticuerpos durante un período de al menos diez días a un pH mantenido entre 3,5 y 5,0, una temperatura dentro del intervalo de 2ºC a 50ºC y con una fuerza iónica inferior a 0,001 para producir la solución de anticuerpos que tiene baja actividad vírica y baja actividad anticomplemento.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la actividad anticomplemento de la solución de anticuerpos es
inferior a 60 unidades de CH_{50}/ml.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la solución de anticuerpos comprende un 5% en peso/peso de
anticuerpos y tiene una actividad anticomplemento inferior a 45
unidades de CH_{50}/ml.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el
que la solución de anticuerpos comprende un 5% en peso/peso de
anticuerpos y tiene una actividad anticomplemento inferior a 30
unidades de CH_{50}/ml.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la solución de anticuerpos comprende un 10% en peso/peso de
anticuerpos y tiene una actividad anticomplemento inferior a 60
unidades de CH_{50}/ml.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que la solución de anticuerpos comprende un 10% en peso/peso de
anticuerpos y tiene una actividad anticomplemento inferior a 45
unidades de CH_{50}/ml.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos un 99% de los
anticuerpos en la solución de anticuerpos son monoméricos.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que entre las etapas b) y c), la tonicidad de la tercera solución
de anticuerpos se ajusta a un valor fisiológico en condiciones
tales que la fuerza iónica de la tercera solución de anticuerpos no
se altere de forma apreciable.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que la tonicidad de la solución se ajusta añadiendo un hidrato de
carbono a la tercera solución de anticuerpos.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el hidrato de carbono es maltosa.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la tonicidad de la tercera solución de anticuerpos se ajusta
a un intervalo de 230 a 490 mosmol/kg de disolvente.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la tonicidad de la tercera solución de anticuerpos se ajusta
a un intervalo de 274 a 309 mosmol/kg de disolvente.
13. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la tonicidad de la tercera solución de anticuerpos se ajusta
añadiendo un aminoácido a la tercera solución de anticuerpos.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el aminoácido es glicina.
15. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que el trialquil fosfato es
tri-n-butil fosfato y el detergente
se selecciona entre polisorbato 80 y colato de sodio.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la primera solución de
anticuerpos se pone en contacto con trialquil fosfato y detergente
a un pH entre 3,5 y 6,0.
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