CZ302750B6

CZ302750B6 - Farmaceutická kompozice a ampulka na bázi erythropoietinu a zpusob inhibování mikrobiálního rustu v roztoku obsahujícím tuto látku

Info

Publication number: CZ302750B6
Application number: CZ20020264A
Authority: CZ
Inventors: Gayed@Atef
Original assignee: Aventis Holdings Inc.
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2011-10-19
Also published as: KR100693263B1; AU777397B2; EA006220B1; DE60022759D1; HRP20020159A2; HUP0202246A2; US20050267033A1; CN1371284A; WO2001007075A2; EP1200115B1; ATE304863T1; EP1200115B9; DK1200115T3; EE200200037A; NO20020303D0; AU7137400A; EP1200115A2; PL202945B1; EA200200073A1; IL147755A0

Abstract

Farmaceutická kompozice obsahující erythropoietin a úcinné množství benzethoniumchloridu pro inhibování mikrobiálního rustu v této kompozici, poprípade dále konzervacní látku vybranou z benzethoniumchloridu, fenoxyethanolu a fenylethylalkoholu. Ampulka, shodného složení jako kompozice, obsahující nekolik dávek erythropoietinu. Zpusob inhibování mikrobiálního rustu v roztoku obsahujícím erythropoietin, který zahrnuje pridávání benzethoniumchloridu k tomuto roztoku.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceutické kompozice obsahující erythropoietin (dále též EPO) a účinné množství benzethoniumchloridu pro inhibování mikrobiálního růstu v této kompozici, popřípadě dále s konzervační látkou vybranou z benzethoniumchloridu, fenoxyethanolu a fenylethylalkoholu. Vynález se dále týká ampulky shodného složení jako kompozice, která obsahuje několik dávek erythropoeietmu a slouží k uchovávání kompozice. Způsob inhibování mikrobiálního růstu v roztoku obsahujícím erythropoietin zahrnuje přidávání benzethoniumchloridu k tomuto roztoku.

Dosavadní stav techniky

Sterilita je jednou z nejdůležitějších vlastností parenterálních produktů. U sterilovaných parenterálních produktů určených pro injektování jedné dávky závisí udržení sterility jak na způsobu sterilace, tak i na neporušenosti obalového systému. U parenterálních produktů určených pro vícenásobné dávkování musí být přidávány antimikrobiální činidla z důvodu ochrany produktu před náhodnou mikrobiální kontaminací během jeho skladování a/nebo použití.

Stálé vícedávkové farmaceutické kompozice sobsahem proteinu jsou hodnoceny farmaceutickým průmyslem jako zvláště výhodné a komerčně atraktivní. Vícedávkové kompozice jsou většinou, ačkoli ne vždy, dávkovány do ampulek (vícedávkové obaly), které dovolují odebírání určitého množství přípravku v různém čase. Tento systém je žádoucí, neboť dovoluje odebírání více dávek zjednoho obalu a dále dovoluje lépe kontrolovat podávání farmaceutické kompozice jako přípravku, který může být uzavřen a podáván v určitém množství.

Povaha použití vícedávkových kompozic klade speciální požadavky na kompozice. Například udržení sterility kompozice je zvláště náročné kvůli mnoha možnostem zavedení mikroorganismů a jiných kontaminantů do těchto kompozic. Opakované zavádění cizích prvků, jako například jehel, do vícedávkového obalu zvyšuje pravděpodobnost zavedení mikroorganismů do takového obalu. Dále mikroorganismy mohou být zavedeny do obalů během plnění kompozic do obalů, během rekonstituce kompozic po lyofilizaci a před podáváním. Delší období možného skladováni prostředku v obalu a zejména vícenásobné zavádění cizích prvků, a s tím spojená možnost zavedení kontaminantů vyžaduje, aby přípravek obsahoval speciální přísady pro zajištění sterility obsahu.

Pro zajištění optimálně sterilních vlastností vícedávkových přípravků vyžaduje americký Úřad pro potraviny a léčiva (FDA) a jiné kontrolní agentury vjiných zemích, aby všechny vícedávkové přípravky obsahovaly konzervační látky k zabránění růstů nebo k usmrcení jakýchkoliv mikroorganismů, které mohou kontaminovat přípravky. Vývoj vícedávkových kompozic s obsahem proteinu se ukázal jako zvláště obtížný z důvodu přirozené nestability proteinů a kvůli jejich sklonu nepříznivě interagovat s konzervačními sloučeninami. Mezi možné nepříznivé interakce mezi konzervačními látkami a proteiny patří degradace proteinů, zejména při dlouhodobém skladování, inaktivace proteinů, tvorba proteinových agregátů a jiné interakce, které způsobují inaktivaci nebo činí podávání této kompozice lidem, zvláště infuzí, injekcí nebo jiným parenterálním podáváním, obtížné, bolestivé nebo jinak nežádoucí.

Dále bylo zaznamenáno, že samotné konzervační látky způsobují akutní nepříznivé reakce, jako jsou alergické reakce u lidí po parenterálním podávání. V ideálním případě by konzervační látka obsažená ve vícedávkové proteinové farmaceutické kompozici měla být účinná v nízké koncentraci vůči široké řadě mikroorganismů, rozpustná v přípravku, netoxická, kompatibilní, neměla by reagovat s proteiny, dále by měla být aktivní s dlouhodobou stabilitou a nemela by reagovat se složkami obalu nebo uzavíracího systému.

Sandeep Nemá a kol. publikovali seznamy různých vehikul, které byly použity pri přípravě 5 injektovatelných přípravků prodávaných v SA. Antimikrobiální konzervační látky zjejich přehledového článku jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka I: Antimikrobiální konzervační látky

Konzervační látka	Četnost použiti	Rozsah
Benzalkoniumchlorid	1	0,02 % hmotn./obj.
Benzethoniumchiorid	4	0,01 %
Benzylalkohol	74	0,7 4 až 5 %
Chlorbutanol	17	0,25 až 0,5 %
m-Kresol	3	0,1 už 0,3 %
Myristil-y-pikoliniumchlorid	2	0,0195až 0, 169 %
MethyIparaben	50	0, 05 í,ž 0,18%
Propylparaben	40	0,01 až 0,1 %
Fenol	48	0,2 až 0,5 %
2-Fenoxyethanol	3	0, 50 %
Fenylmerkuriumnitrát	3	0,001 %
Thimerosal	46	0,003 - 0,01 %

EPO je glykoprotein, jehož úkolem je stimulovat produkci hemoglobinu a červených krvinek v kostní dřeni. Je vytvářen v ledvinách aje široce používán pri léčbě chudokrevnosti, která je způsobena různými zdravotními stavy, jako například selháním činnosti ledvin. Aminokyselinová sekvence a obecný gly kosy lační vzory EPO jsou známy odborníkům v oboru a byly například publikovány v Miyake a kol. a v patentovém US spise 4 703 008. Izolace a přečištění EPO z lidských tkání a kapalin byla popsána v Mizake a kol.

2ϋ Sekvence nukleové kyseliny kódující protein, izolace této sekvence a příprava proteinu tradičními rekombinačními metodami jsou známy odborníkům v oboru nukleovýeh kyselin kódujících EPO, Sugimoto a kol. v patentu US 4 337 513 popisuje použití lymfoblastoidních buněk k produkci EPO a Sherwood a kol., popisuje tvorbu EPO buněčnou linií z lidských renálních karcinomů. Produkce, izolace a purifíkace tohoto proteinu je dosažitelná rovněž genovou aktivací nebo homologní rekombinací, po kterých následují dobře známé izolační a purifíkační pracovní postupy.

Vývoj vícedávkových přípravků obsahujících EPO se ukázal být zvláště obtížný z důvodu určité nestability EPO a kvůli jeho tendencím snadno interagovat s běžnými farmaceutickými složkami so (patentový US spis 4 806 524). V patentovém US spise 5 503 827 (patent '827 - Woog) jsou popsány postupy při vývoji vícedávkových přípravků na bázi EPO, které se snažily obejít tyto problémy udržováním přípravků při nízkém pH nebo použitím různých konstruktů aminokyselin. Ve dvou postupech se autoři snažili napomoci při stabilizaci EPO proteinu nebo vyvíjeli lyofílizované formy přípravků, ze kterých konzervační látky sublimují před podáváním.

Stálých sterilních vícedávkových farmaceutických přípravků obsahujících EPO je málo a lze k nim řadit přípravky popsané v patentu '827 popisuje a výslovně nárokuje chloreton (chlorbutanol, I,I,l-trichlor-2-methyl-2-propanol), benzalkoniumchlorid nebo benzylalkohot jako konzervační látky. Woog si zvláště všímá určitých obtíží při přípravě vícedávkových přípravků na bázi EPO z hlediska četnosti alergií a navrhuje používání specificky nárokovaných konzervačních látek, které jsou z tohoto hlediska zvláště výhodné. Autor dále zdůrazňuje, že je velmi žádoucí minimalizovat kontakt mezi konzervační látkou a proteinem kvůli tendenci konzervačních látek degradovat proteiny, které jsou po spojení inaktivovány. Patent '827 popisuje použití několika konstruktů aminokyselin a jiných pomocných složek nezbytných pro stabilizaci EPO v roztoku. Dále patent '827 popisuje v nej výhodnějším provedení, že jakákoliv konzervační látka použitá v původním přípravku je sublimována při lyofilizaci této kompozice. Po rekonstituci kompozice může být přidána další konzervační látka vybraná ze skupiny obsahující chloreton, benzalkoniumchlorid a benzylalkohol, ale injektovatelné rekonstituované roztoky by měly být použity během 30 dnů.

Další příklad vícedávkové kompozice na bázi EPO je popsán v patentovém US spise 5 661 125 (patent Ί25). Tento patent výslovně potvrzuje další reference konstatující, že EPO je nestabilní látka zejména v roztoku a v případě přidání známého stabilizátor se výsledná stabilita EPO mění a je nepředvídatelná. Tento patent dále nárokuje specifické použití benzy(alkoholu, parabenu, fenolu nebo jejich kombinací jako konzervačních látek v roztocích obsahujících EPO. Dalším potvrzením obtížnosti rozpoznání kompatibilních a výhodných konzervačních látek pro použití ve vícedávkových přípravcích obsahujících EPO je citace z tohoto patentu:

„... z použití konzervačních látek ve spojení s jinými proteiny nelze odvodit nic určitého, co by určovalo jakýkoliv konkrétní konzervovaný přípravek pro erytropoietin. Viz. například Geigert, J., „OverView of the Stability and Handl ing of Recombinant Protein Drugs,“ Journal of Parenteral Science & Technoloty, Vol. 43(5): 220 až 224 (1989)7

Z výše uvedených důvodů existuje potřeba chráněného vícedávkového přípravku obsahujícího EPO, a který

1. udržuje stabilitu proteinové složky a kompozice v delší skladovací době;

2. udržuje sterilitu přípravku a splňuje kritéria srovnávacích testů pro konzervační látky lékopisů USA, Evropy a Japonska;

3. je bezpečný v používaných koncentracích;

4. je aplikovatelný jakoukoliv parenterální nebo orální cestou - způsobem, který je účinný a minimalizuje bolest a riziko nepříznivé reakce, jako je například alergická reakce u pacientů.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá vtom, že obsahuje erythropoietin a účinné množství benzethoniumchloridu pro inhibování mikrobiálního růstu v této kompozici.

Předmětem tohoto vynálezu je také ampulka pro několik dávek erythropoeietinu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje roztok erythropoietinu a množství benzethon i umch loridu účinné pro inhibování mikrobiálního růstu v této kompozici.

- j CZ 302750 Β6

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob inhibování mikrobiálního růstu v roztoku obsahujícím erythropoietin, jehož podstata spočívá v tom, že tento způsob zahrnuje přidávání benzethoniumchloridu k tomuto roztoku.

Nalezený vynález je dále popsán podrobněji, včetně jeho výhodných provedení.

Tento vynález poskytuje nový a zvláště výhodný vícedávkovou kompozici (dále též přípravek, obsahující erythropoietin a následující konzervační látky:

benzethoniumchlorid, fenoxyethanol a fenylethylenalkohol, buď samotné, nebo v kombinaci.

Přípravky podle tohoto vynálezu mohou být připravovány v mnoha koncentracích v různě velkých ampulkách s různým dávkováním. Například přípravky popsané v tomto vynálezu mohou obsahovat 10 000, 20 000, 40 000 nebo dokonce až nebo více než 100 000 jednotek/ml EPO. Tyto přípravky mohou dále obsahovat jakoukoliv koncentraci v rozmezí výše uvedených koncentrací jako je 5 000, 15 000, 25 000 jednotek/ml a podobně. Dále tato dávkování mohou být připravena v 0,5, 1 a 2ml ampulkách nebo v jakýchkoliv jiných velikostech ampulek nebo mohou být plněny do nádobek, které lze používat v zařízení pro přípravu léčiv. Odborníkům bude zřejmé, že jakákoliv kombinace dávkování a použitých ampulek závisí na možnostech zařízení pro přípravu léčiv. Například lze připravit popsané přípravky o koncentraci

000 jednotek/0,5 ml v Iml ampulce,

000 jednotek/ml v 2mi ampulce nebo jakoukoliv jinou kombinací koncentrace EPO s odpovídající velikostí ampulky. Tyto kompozice mohou být připraveny ve formě vodného roztoku, suspenze nebo mohou být lyofílizované.

Tento vynález poskytuje v alternativním provedení farmaceutickou nosičovou kompozici, která slouží jako nosič EPO a obsahuje konzervační látky benzethoniumchlorid, fenoxyethanol nebo fenylethylalkohol. které jsou v kompozici samotné nebo v kombinaci. Tento vynález také poskytuje ampulku pro vícenásobné dávkování EPO, kde tato ampulka obsahuje EPO a účinné množství jedné nebo kombinaci následujících konzervačních látek: benzethoniumchlorid, fenoxyethanol a fenylethylalkohol.

V dalším provedení tento vynález poskytuje způsob inhibování mikrobiálního růstu u roztoků obsahujících EPO, přičemž tento způsob zahrnuje přidávání jedné nebo kombinace následujících konzervačních látek: benzethoniumchlorid, fenoxyethanol a fenylethylalkohol k roztoku obsahujícím EPO,

Mezi další složky vícedávkových přípravků obsahujících EPO podle tohoto vynálezu patří detergenty, pufry, činidla upravující osmolalitu a látky zabraňující adsorpci. Mezi zvláště výhodné přísady patří polysorbát-20, polysorbát-80, fosforečnan sodný, chlorid sodný a genapol.

Přípravky podle tohoto vynálezu mohou být ve formě tuhé, polotuhé nebo kapalné nebo tekuté, jako jsou například tabletky, vodné roztoky a suspenze nebo mohou být lyofilizovány a rekonstituovány před podáním pacientům. Přípravky mohou být podávány parenterální cestou, která zahrnuje podávání intravenózní, subkutánní, intramuskulámí, transdermální, intraarteriální, intraperitoneální nebo plicní inhalaci. Tyto přípravky mohou být také podávány orálně.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález poskytuje významné zlepšení znalostí v oboru. Poskytuje nové vícedávkové farmaceutické přípravky na bázi EPO. které obsahují konzervační látky a jsou stálé, sterilní a snadno aplikovatelné. Dále a velmi neočekávané tento vynález popisuje, že společné použití fenoxyethanolu a benzethoniumchloridu ve vícedávkové farmaceutické kompozici obsahující EPO vyvolává pozitivní synergícké účinky, což má za následek vznik zvláště výhodné kompozice. Konkrétně tato kombinace konzervačních látek má následující charakteristické vlastnosti: 1.

-4CZ 302750 B6 synergický antimikrobiální účinek, který umožňuje použití nižších koncentrací konzervačních látek; 2. výborná stálost EPO za proměnlivých skladovacích podmínek během delšího časového období; 3. fenoxy ethanol má potenciál pro lokální anestetický účinek a vytváří kompozice zvláště výhodné pro podkožní podávání,

Následující pojmy, jak jsou zde použity, mají následující význam:

Erythropoietin - glykoprotein, který v biologicky aktivní a glykosylované formě má schopnost vyvolávat vznik hemoglobinu a červených krvinek v kostní dřeni. Může být získán izolací z lidských tkání a tekutin, tradičními rekombinačními metodami nebo genovou aktivací.

io

Parenterální podávání - podávání jiným způsobem než gastrointestinálním traktem. Mezi parenterální podávání patří podávání intravenózní, subkutánní, intramuskulámí, intramedulámí, intraarteriální, intraperitoneální a plicní inhalace.

Farmaceuticky (nebo farmakologicky) přijatelný ~ týká se molekulárních entit a kompozic, které nezpůsobují nepříznivé alergické ajiné nepředvídatelné reakce po podání zvířatům nebo lidem.

Farmaceuticky přijatelný nosič - tento výraz zahrnuje všechna rozpouštědla, disperzní média, povlaky, anti bakteriální a antifungální činidla, izotonická činidla, činidla zpomalující absorpci a

2o podobně, která mohou být použita jako prostředí pro farmaceuticky přijatelnou látku.

Jednotka - jednotka biologické aktivity, která byla stanovena exhypoxickou polyeythemickou biologickou zkouškou na myších a dále byla srovnána se standardy Světové zdravotnické organizace.

Jakékoliv číselné hodnoty uvedené v tomto textu zahrnují všechny hodnoty od nejnižší hodnoty do nejvyšší hodnoty s navyšováním o jednu jednotku, za předpokladu, že mezi jakoukoli nižší a vyšší hodnotou je rozdíl alespoň 2 jednotek. Jestliže je v příkladu uvedeno, že koncentrace složky nebo hodnota procesní proměnné, jako je například osmolalita, teplota, tlak, čas a podobně, je od só 1 do 90, výhodně od 20 do 80, výhodněji od 30 do 70, je myšleno, že hodnoty od 15 do 85, od 22 do 68, od 43 do 51, od 30 do 32 jsou výslovně uvedeny v této specifikaci. Pro hodnoty, které jsou menší než 1 za jednu jednotku může být pokládána hodnota 0,0001, 0,001, 0,01 nebo 0,1. Toto jsou pouze příklady toho, co je specificky zamýšleno a všechny možné kombinace numerických hodnot mezi nejnižší a nejvyšší uvedenou hodnotou mají být pokládány za výslovně uvedené, jak je uvedeno v této přihlášce.

A. Konzervační látky; fenoxyethanol a benzethoniumchlorid

Konzervační látky zamýšlené pro použití podle tohoto vynálezu jsou výhodně benzethonium40 chlorid, fenoxyethanol, feny lethy lalkohol, jakékoliv varianty těchto konzervačních látek ajejich strukturální analogy. V tomto vynálezu je výslovně zamýšleno, že kterákoliv z těchto konzervačních látek může být použita jako jediná konzervační látka v popisovaných přípravcích nebo výhodně mohou být tyto konzervační látky použity společně. Kombinace fenoxyethanolu a benzethoniumch loridu použitá v přípravcích podle tohoto vynálezu se ukazuje jako zvláště výhodná.

Benzethoniumchlorid, fenoxyethanol a feny lethy lalkohol mohou být používány v popisovaných přípravcích v jakémkoliv účinném množství. Celková koncentrace konzervačních látek v přípravku je výhodně v koncentračním rozsahu od asi 0,001 do asi 4 %. Zvláště výhodnými koncentracemi konzervačních látek jsou co možná nejnižší koncentrace umožňující dosažení požadované50 ho antimikrobiálního účinku s minimálním potenciálem pro nepříznivé reakce. Jednotlivé použití benzethoniumch loridu, fenoxyethanolu a feny [ethylalkoholu jako konzervačních látek vyžaduje vyšší koncentraci konzervační látky oproti použití kombinace konzervačních látek.

Ve výhodnějším provedení podle tohoto vynálezu jsou společně použity benzethoniumchlorid a fenoxyethanol. Překvapivě bylo zjištěno, že společné použití těchto konzervačních látek vyvolává

CZ 302750 Β6 jejich vzájemný synergický účinek. Pro dosažení odpovídajícího anti mikrobiálního účinku při použití jednotlivých konzervačních látek musí být koncentrace benzethoniumchloridu a fenoxyethanolu vyšší než celková koncentrace obou konzervačních látek, obecně lze říci, že při použití jednotlivých konzervačních látek musí být použito přinejmenším dvojnásobku konzervační látky. Například pri použití samotného benzethoniumchloridu nebo fen oxy ethanolu bude potřeba k dosažení stejného účinku jaký vyvolává společné použití benzethonium chloridu a fenoxycthanolu přibližně alespoň dvojnásobné množství benzethoniumchloridu nebo fenoxyethanolu. Dokonce ani pri těchto vyšších koncentracích benzethoniumchloridu a fenoxyethanolu by možná přípravky sjednou konzervační látkou nesplnily antimikrobiální zákonná kritéria USA, evropských zemí a Japonska. Výhodné přípravky obsahují benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od asi 0,001 do 0,1 v kombinaci s fenoxyethanolem v koncentračním rozsahu od asi 0,01 do asi 1.0%. Výhodnější přípravky obsahují benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od asi 0,01 do 0,02 % a fenoxyethanol v koncentračním rozsahu od asi 0,25 do asi 0,5 %.

V dalším provedení tento vynález zahrnuje benzethoniumchlorid v kombinaci s fenylethylal koho lem. Výhodné přípravky obsahují benzethoniumchloridu v koncentračním rozsahu od asi 0,001 do asi 0,1 % společně s feny lethy lalkoholem v koncentračním rozsahu od asi 0,01 do asi 1,0 %. Výhodnější přípravky obsahují benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od asi 0,15 do asi 0,25 % a fenylethylalkohol v koncentračním rozsahu od asi 0,2 do asi 0,5 %. Nejvýhodnější přípravek používající společně benzethoniumchlorid a fenylethylalkohol obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci asi 0,02 % a fenylethylalkohol v koncentraci asi 0,25 %.

B. Erythropoietin

Odborníkům v oboru je známa sekvence nukleových kyselin, sekvence aminokyselin, trojrozměrná struktura a typické glykosylační vzory EPO. Jsou známy izolované a purifikované EPO z různých zdrojů. Podle odborníků lze získat EPO pro použití podle tohoto vynálezu izolací a purifikaci EPO z lidských tkání a tekutin, ačkoliv též existují tradiční rekombinační pracovní postupy a způsob genové aktivace. Všechny tyto pracovní postupy jsou zahrnuty do rozsahu tohoto patentu. Kromě toho jakýkoliv jiný EPO získaný z kteréhokoliv zdroje je zahrnut do použití podle tohoto vynálezu.

C. Další aktivní složky

Nejvýhodnější přípravek podle tohoto vynálezu se může lišit podle faktorů, jako je doba skladování přípravku, podmínek za kterých bude přípravek skladován a používán, které konkrétní skupině pacientů bude podáván atd. Přizpůsobení přípravku může být provedeno podle potřeb zařízení pro přípravu léčiv, výrobce nebo pacienta úpravou složek přípravků ajejich relativních koncentrací, jiných než výše popsaných konzervačních látek (benzethoniumchlorid, fenoxyethanol a fenylethylalkohol) a EPO, jak je popsáno výše. Dalšími základními složkami vícedávkových přípravků na bázi EPO podle tohoto vynálezu mohou být voda, pufr, detergent nebo činidlo zabraňující adsorpci, smáčedlo a činidlo upravující osmolalitu. Charakteristické vlastnosti přípravků mohou být modifikovány (například pH a osmolalita) tak, aby přípravek měl pH a osmolalitu podobnou lidské krvi a tkáním.

Pufry v tomto vynálezu jsou užitečné mezi jiným i úpravou celkového pH farmaceutického přípravku. Řada pufrů známých v oboru může být použita v těchto přípravcích. Mezi tyto pufry patří různé soli organických nebo anorganických kyselin, zásady nebo aminokyseliny a různé formy citrátů, fosforečnanů, vinanů, jantaranů, adipátů, malátů, laktátů, acetátu, hydrogenuhličitanů nebo uhličitanových iontů. Zvláště výhodnými pufry pro použití podle tohoto vynálezu jsou sodné a draselné pufry, zejména fosforečnan sodný. Ve výhodném uspořádání je použit fosforečnan sodný mající přibližně koncentraci 20 mM. Zvláště účinný pufrovací systém fosforečnanu sodného obsahuje monohydrát d i hydrogenfosforečnan u sodného a heptahydrát monohydrogenfosforečnanu sodného. Když je použita tato kombinace dihydrogen- a monohydrogenfosforečnanu sodného, výhodná koncentrace dihydrogenfosforečnanu je v rozsahu od asi 0,5 do asi

-6CZ 302750 B6

1,5 mg/ml a hydrogenfosforečnanu v rozsahu od asi 2,0 do asi 4,0 mg/ml, výhodnější koncentrace dihydrogenfosforečnanu je asi 0,9 mg/ml a hydrogenfosforečnanu je asi 3,4 mg/ml. Podle množství použitého pufru se mění pH přípravku. Výhodné je upravit pH mezi 5,0 a 8,0, výhodnější je mít pH v rozsahu od asi 6,0 do asi 7,5 a nej výhodnější je vyvinout přípravek, který má pH asi 7,0.

V těchto popisovaných přípravcích může být také výhodné použít detergenty. Mezi detergenty nebo činidla zabraňující adsorpcí, které se ukázaly být výhodné podle tohoto vynálezu, patří polyoxyethylensorbitany, polyoxyethylen sorbitan monolaurát, póly sor bát-20 jako je Tween— io 20™, polysorbát-80, hydroxycelulóza a genapol. Ve výhodném provedení je používán polysorbát-20. Pokud je používán v tomto vynálezu jakýkoliv detergent, je výhodné ho použít v koncentračním rozsahu od asi 0,01 do asi 0,5 mg/ml. Ve zvláště vhodném provedení je použit polysorbát-20 v koncentraci asi 0,1 mg/ml.

is Další užitečné přídavné látky snadno určí odborník v oboru podle specifických potřeb nebo zamýšleného použití vícedávkových přípravků na bázi EPO. Jednou takovou zvláště užitečnou přídavnou látkou je chlorid sodný, který je vhodný pro nastavení osmolality přípravků, aby mohlo být dosaženo požadované výsledné osmolality. Zvláště výhodné osmolality jsou v rozsahu od asi 270 do asi 330 mOsm/kg. Nejvýhodnější osmolalita popisovaných přípravků je přibližně

3 00 mOsm/kg. Této osmolality lze dosáhnout koncentrací chloridu sodného v rozsahu od asi 6,5 do asi 7,5 mg/ml, zvláště účinná je koncentrace chloridu sodného asi 7,0 mg/ml. Nebo množství chloridu sodného může být přidáno k dosažení osmolality v rozsahu od asi 270 do asi 300 mOsm/kg, a výhodně pro dosažení 300 mOsm/kg. Další užitečná činidla pro úpravu osmolality jsou sorbitol a mannitol.

D. Příprava kompozic

Zde popsané přípravky na bázi EPO mohou být připraveny ve vodě vhodným mícháním s detergentem, jako je hydroxypropylcelulóza nebo polyoxyethylensorbitany. V mnoha případech bude výhodné použít izotonická činidla jako jsou například cukry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injektovatelných kompozic může být vyvolána použitím činidel zpomalujících absorpci například mono stearátem hlinitým nebo želatinou. Mezi další Činidla, které lze použít, například patří lecithin, močovina, ethylenoxid, propylenoxid, hydroxypropylcelulóza, methylcelulóza nebo polyethylenglykol.

Vodné kompozice (inokula), jak jsou popsány v tomto patentu, mohou obsahovat účinné množství EPO rozpuštěné nebo dispergované ve farmaceuticky přijatelném vodném médiu. Takové kompozice jsou také označovány jako inokula. Použití farmaceuticky přijatelných nosičových médií a činidel pro farmaceuticky aktivní látky je dobře známo odborníkům v oboru. Mimo těch běžných médií nebo činidel, která jsou neslučitelná s aktivní složkou, se předpokládá jejich použití v terapeutických kompozicích. Jak je popsáno výše, mohou být také přidány do kompozic doplňkové aktivní složky.

Proteoglykan stejně jako EPO může být přidáván do kompozice v neutrální formě nebo ve formě soli. Mezi farmaceuticky přijatelné soli patří kyselé adiční soli (tvořené svolnými aminoskupinami proteinů) a ty, které jsou tvořeny anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo kyseliny fosforečné, nebo takovými organickými kyselinami, jako jsou kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová a podobně. Soli mající volné karboxylové skupiny mohou také být odvozeny od anorganických zásad, jako jsou hydroxidy sodný, draselný, amon50 ný, vápenatý nebo železitý a také od organických zásad jako je isopropylamin, trimethylamin, histidin, prokain a podobně.

Terapeutické kompozice podle tohoto vynálezu jsou výhodně podávány ve formě injektovatelných kompozic, buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze nebo mohou být připraveny v tuhé formě vhodné pro rozpouštění nebo vytvoření suspenze v kapalině před injektováním. Typická kompozice pro takové účely obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Například může obsahovat 10, 25,50 nebo až 100 mg lidského sérového albuminu na mililitr PBS („phosphate buffered šalině) - fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem.

Přípravky popsané v tomto vynálezu mohou být plněny do ampulek, lahviček, lékovek, injekčních stříkaček nebo jiných obalů určených pro jedno či vícenásobné podávání. Takové obaly mohou být vyrobeny ze skla nebo polymerního materiálu, jako je například polypropylen, polyethylen nebo póly viny Ichlortd. Výhodné obaly mohou mít uzávěr nebo jiný uzavírací systém, jako je gumová zátka, která může být propíchnuta jehlou z důvodu odebírání jednotlivých dávek a po odstranění jehly je uzávěr znovu uzavřen. Všechny takové obaly pro injektovatelné kapaliny, lyofil i zo vane přípravky, rekonstituované lyofi lizované přípravky nebo rekonstituovatelné prášky pro injekce jsou známy v oboru ajsou určeny pro použití v předkládaných kompozicích a způsobech.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a v žádném případě neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Příklad 1

Výběr konzervační látky a testování stability

Materiály a metody:

Dihydrogenfosforečnan sodný.monohydrát USP, mono hydrogenfosforečnan sod ný.heptahy drát, USP, chlorid sodný USP/EP a polysorbát-20 USP/NF byly zakoupeny od firmy J. T. Baker, divize Mallinckrodt Baker, lne, Phillipsburg, NH 08865.

Benzalkoniumchlorid USP/NF, 2-fenoxy ethanol BP, feny lethy lal koho I USP/NF, thimerosal USP/NF, krystaly fenolu USP, benzethoniumchlorid USP/NF, m-kresol USP, fenylmerkuriumnitrát USP/NF, benzylalkohol USP, chlorbutanol USP, methylparaben USP/NF a propylparaben USP/NF byly zakoupeny od firmy Spectrum Quality products INC., Gardena CA 90248.

Myristyl-y-pikolinium chlorid byl zakoupen od firmy Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan 49001.

Víccdávkové roztoky na bázi EPO byly vytvořeny jako sterilní, nepyrogenní, bezbarvé vodné roztoky pro injektování 10 000 a 20 000 koncentračních jednotek. Připravené roztoky obsahovaly 20mM fosforečnanový pufr (dihydrogenfosforečnan sodný.monohydrát a monohydrogenfosforečnan sodný.heptahydrát) 0,01 % hmotn./obj. polysorbát 20 jako činidlo zabraňující adsorpci, 0,45 až 0,8 % hmotn./obj. chlorid sodný a systém konzervačních látek. V závislosti na použitém systému konzervačních látek bylo množství chloridu sodného upraveno tak, aby osmolalita byla přibližně 300 mOsm/kg. Připravené roztoky měly pH přibližně 7,0 a jejich osmolalita byla přibližně 300 mOsm/kg.

Roztoky byly sterilovány filtrací přes sterilní filtry firmy Millipore o velikosti pórů 0,22 mikronů. Pro testování chemické stability byly roztoky plněny do sterilních čistých 2 ml skleněných ampulek typu USP 1 a byly skladovány při 5 a 25 °C. Pro mikrobiální testování byly roztoky plněny do 250 až 500 ml sterilních lahví z tvrzeného polypropylenu.

Ve studii byly testovány následující konzervační látky s následujícími koncentracemi: benzylalkohol 1,0% hmotn./obj., benzalkoniumchlorid 0,01% hmotn./obj., 2-fenoxy ethanol 0,5%

-8CZ 302750 B6 hmotn./obj., fenylethylalkohol 0,5% hmotn./obj., thimerasol 0,005% hmotn./obj. a 0,01% hmotn./obj., krystaly fenolu 0,4 % hmotn./obj., benzethoniumchlorid 0,01% a 0.02 % hmotn./obj., m-kresol 0,4% hmotn./obj., fenylmerkuriumnitrát 0,002% hmotn./obj., methylparaben 0,1 a 0,18 % hmotn./obj., propylparaben 0,03 a 0,035 % hmotn./obj. a myristyl-y-piko5 liniumchlorid 0,02 % hmotn./obj.. Dále byly testovány následující kombinace konzervačních látek:

1. enzethoniumchlorid 0,005 % hmotn./obj. a fenoxyethanol 0,25 % hmotn./obj.;

2. enzethoniumchlorid 0,005 % hmotn./obj. a fenoxyethanol 0,5 hmotn./obj.;

3. enzethoniumchlorid 0,01 % hmotn./obj. a fenoxyethanol 0,5 hmotn./obj.;

ío 4. eny lethy lalkohol 0,25 % hmotn./obj. a benzethoniumchlorid 0,02 hmotn./obj..

Diskuse:

Methy lparaben, propylparaben, m-kresol a fenol vytváří zakalené roztoky po přidání přípravku na bázi EPO, neboť tento přípravek je rozpuštěn v pufrovaném roztoku. Tento problém se zákaly je způsoben neslučitelností mezi absorbentem polysorbátem 20 a výše uvedenými konzervačními látkami (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1094).

Ačkoliv chlorbutanol vytváří čirý roztok s přípravkem na bázi EPO, jeho hodnocení bylo ukon2o čeno, protože není stabilní při pH větším než 3 ajeho poločas životnosti při pH 7,5 je přibližně 3 měsíce (Handbook of Pharmaceutical Excipient, 1994).

Kompozice na bázi EPO vytváří za přítomnosti fenyImerkuriumnítrátu zakalený roztok. Toto zakalení je způsobeno neslučitelnosti mezi osmotickým činidlem - chloridem sodným a fenylmerkuriumnitrátem (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1994).

Thimerasol vytváří s přípravkem na bázi EPO čirý roztok, vykazuje dobrou konzervační účinnost a dále tento přípravek má za přítomnosti thimerosalu dobrou chemickou stabilitu. Ale protože obsahuje rtuť, je jeho použití pravděpodobně nepřijatelné pro úřady v Evropě, Japonsku a USA.

Přípravky obsahující benzy lalkohol, benzethoniumchlorid, fenoxyethanol, fenylethylalkohol, benzalkoniumchlorid a myristyl-Y-pikoliniumchlorid vytváří čiré roztoky. Na základě minimálních inhibičních koncentrací, bezpečnosti a četnosti jejich použití byly vybrány následující konzervační látky pro další hodnocení proteinové stability a antimikrobiální účinnost přípravků na bázi EPO: benzylalkohol, benzethoniumchlorid, fenoxyethanol, fenylethylalkohol a několik kombinací benzethoniumchloridu s fenoxyethanolem.

Příklad 2

Stabilita testovaných proteinů

Materiály a metody:

Pro testování stability byly připraveny prototypové vzorky s vybranými konzervačními látkami a ty byly umístěny do prostředí s teplotou 5 a 25 °C. Vzorky byly testovány metodou HPLC na reverzní fázi. Výsledky této zkoušky (% deklarované hodnoty) u kompozic na bázi EPO za přítomnost těchto konzervačních látek jsou uvedeny v tabulce 2.

Deklarovaná hodnota byla stanovena HPLC s reverzními fázemi za použití kolony Waters DeltaPak 08 a gradientově eluce. Mobilní fázi tvořil vodný roztok obsahující 0,05% TFA a acetonitril se vzrůstající koncentrací od 23 do 86 %. Detekce EPO proteinu byla prováděna při vlnové délce 210 nm.

ábulka 2: Výsledky zkoušky ve smyslu koncentrace (% deklarované hodnoty - LC, label claim)

Konzervační lát ka	Měsíce	Síla U/ml	Chemická zkouška (¾ LC) ¹ 5 °C 25 °C
Benzylalkohol	7	10000 U/ml	98, 6	90,0
Benzylalkohol	7	20000 U/ml	99,7	93,7
Benzethonium	4	10000 U/ml	99, 9	88, 9
Benzethonium	4	200C0 U/ml	101, 5	94,4
Fenoxyethanol	4	10000 U/ml	100,5	96, 9
Fenoxyethanol	4	20000 U/mi	102,6	97,5
Benzethonium + Fenoxyethanol (0,005%+0,5%)	3	20000 U/mi	98,3	97,0

¹ stanovení bylo prováděno HPLC na reverzní fázi

Jak je vidět z výsledků HPLC na reverzní fázi uvedených v tabulce 2, během skladování připravených vzorků v časovém rozmezí 3 až 7 měsíců při teplotě 5 °C nedochází k žádným ztrátám koncentrace EPO. Avšak u vzorků obsahujících pouze benzylalkohol nebo benzethoniumchlorid io dochází až k 10% ztrátám během skladování při teplotě 25 °C v časovém rozmezí 3 až 7 měsíců.

Vzorky obsahující fenoxyethanol nebo fenoxyethanol s benzethoniumchloridem nevykazují až 3 až 4 měsíce. Tyto výsledky ukazují, že fenoxyethanol a fenoxyethanol v kombinaci s benzethoniumchloridem mají stabilizační účinek na EPO. Tento účinek je překvapivý, neočekávaný a rovněž i velmi výhodný.

Příklad 3

Porovnávací testy konzervačních látek

Testy účinnosti konzervačních látek jsou souhrnně řízené testy, které určují účinnost konzervačních systémů ve vícedávkových farmaceutických přípravcích. V těchto zkouškách jsou testované přípravky podrobovány působení se standardními suspenzemi indikátorových aerobních bakterií a plísní. Přežívání mikroorganismů je sledováno v časovém období 28 dní.

Tabulka 3 ukazuje výsledky porovnávacích testů konzervačních látek podle lékopisu USA (the

United States Pharmacopia - USP) a evropského lékopisu (European Pharmacopia -EP).

Všechny testované vzorky splnily kritéria lékopisu USA pro porovnávací testy konzervačních látek. Vzorky obsahující 0,01 % hmotn./obj. benzethon i u meh loridu, 0,5 % hmotn./obj. fenoxy50 ethanolu nebo 0,5% hmotn./obj. fenylethylalkohoiu nesplnily kritéria evropského lékopisu pro porovnávací testy konzervačních látek. Vzorky obsahující různé kombinace benzethon i umchloridu a fenoxyethanolu a vzorky obsahující různé kombinace benzethoniumchloridu a fenylcthylalkoholu splnily kritéria lékopisu USA i evropského lékopisu. Z výsledků uvedených v tabulce 3 vyplývá, že antimikrobiální aktivita benzethoniumchloridu byla neočekávaně zvýšena přídavkem fenoxyethanolu. Zvýšení antimikrobiální aktivity je způsobeno synergickým účinkem testovaných látek.

- 10 CZ 302750 B6

Tabulka 3: Porovnávací testy konzervačních látek

Konzervační látka	Síla	Porovnávací test -USP	Porovnávací test - EP
0/	'ml
Ben2ylalkohol ( 1,0%)	20000	U/ml	splněn	neuskutečněn
Benzethonium	20000	U/ml
¢0,01%)		splněn	nesplněn
(0,02%)		splněn	splněn
Fenoxyethanol (0,5%)	20000	U/ml	splněn	nesplněn
Benzethonium + Fenoxyethanol (0/005 +0,25%) {0, 005 + 0,5%) (0,01+0,5%)	20000	U/ml	splněn	splněn
Fenylethylalkohol 0,5%	20000	U/ml	splněn	nesplněn
Benzethonium + Fenylethylalkohol (0,02%+0,25%)	20000	U/ml	splněn	splněn

Literatura:

Patent US 4 377 573 - Sugimoto a kol.

Patent US 4 703 008-Lín.

Patent US 4 806 524 - Kawagacchi a kol.

io Patent US 5 503 827 - Woog a kol.

Patent US 5 661 125 - Stricklan a kol.

Handbook of Pharmaceutical Excipients, druhé vydání, 1994.

L. A. Trissel, „Handbook of Injectable Drugs“ Ed. 8,

American Society of Hospital Pharmacists, Inc„ 1994.

Miyaka a kol., „Purification of Human

Erythropoietin,“ J. Biol. Chem., 252(15):5558 až 5564, 1997.

PhysiciansDesk Reference, ed. 48, 1994.

PhysiciansDesk Reference, ed. 50, 1996.

SandeepNema, R. J. Washkuhn a r.J.Brendel, „Excipients and Their Use in Injectable Products“,

PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 51(4), červenec - srpen 1997.

Sherwoos a kol., „Erythropoeietin Production by Human Renal Carcinoma Cells in Culture.“,

Endocrinology, Vol. 99(2): 504 až 510, 1976.

Shewood a kol., „Establíshment of a Human Erythropoietin - Producting Renal Carcinoma Cell line.“, Clinical Research, 31:323A, 1983.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje erythropoietin a účinné množství benzethoniumchloridu pro inhibování mikrobiálního růstu v této kompozici.
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že tato kompozice dále obsahuje fenoxyethanol.
3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že tato kompozice dále obsahuje fenylethylalkohol.
4. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinné množství benzethoniumchloridu je v koncentračním rozsahu od 0,001 do 1,0 %.
5. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinné množství benzethoniumchloridu je v koncentračním rozsahu od 0,01 do 0,1 %.
6. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,005 %.
7. Kompozice podle nároku 1. vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,01 %.
8. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,02 %.
9. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od 0,001 do 1,0 % a fenoxyethanol v koncentračním rozsahu od 0,01 do 1,0%.
10. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od 0,01 do 0,1 % a fenoxyethanol v koncentračním rozsahu od 0,1 do 0,75%.
11. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,25 %.
12. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,5 %.
13. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumehlorid v koncentraci 0,01 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,5 %.
14. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,02 % a fenylethylalkohol v koncentraci 0,25 %.
15. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím. že dále obsahuje sůl.
16. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že touto solí je chlorid sodný.
17. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje pufr.

- 12 CZ 302750 B6
18. Kompozice podle nároku 17, vyznačující se tím, že tímto pufrem je fosforečnan sodný.
19. Ampulka pro několik dávek erythropoietinu, vyznačující se tím, že obsahuje 5 roztok erythropoietinu a množství benzethoniumchloridu účinné pro inhibování mikrobiálního růstu v této kompozici.
20. Ampulka podle nároku 19, vyznačující fenoxyethanol.

se tím, že tento roztok dále obsahuje
21. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím feny lethy lalkohol.
22. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, níumchloridu je v koncentračním rozsahu od 0,001 do 1,0 %.

že tento roztok dále obsahuje že účinné množství benzetho
23. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že účinné množství benzethoniumchloridu je v koncentračním rozsahu od 0,01 do 0,1 %.

2o
24. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,005 %.
25. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,01 %.
26. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že účinná koncentrace benzethoniumchloridu je 0,02 %.
27. Ampulka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid 30 v koncentračním rozsahu od 0,001 do 1 % a fenoxyethanol v koncentračním rozsahu od 0,01 do

1,0%.
28. Ampulka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentračním rozsahu od 0,01 do 0,1 % a fenoxyethanol v koncentračním rozsahu od 0,1 do

35 0,75 %.
29. Ampulka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,25 %.

40
30. Ampulka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,5 %.
31. Ampulka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentrací 0,01 % a fenoxyethanol v koncentraci 0,5 %.
32. Ampulka podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje benzethoniumchlorid v koncentraci 0,02 % a fenylethylalkohol v koncentraci 0,25 %.
33. Ampulka podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje 0,02 % benzetho50 níumchloridu a 0,25 % fenylethylalkoholu.
34. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený roztok dále obsahuje sůl.

- 1355
35. Ampulka podle nároku 34, v y z n a č uj í c í se tím, že touto solí je chlorid sodný.
36. Ampulka podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený roztok dále obsahuje pufr.
37. Ampulka podle nároku 36, vyznačující se tím, že tímto pufrem je fosforečnan sodný.
38. Způsob inhibování mikrobiálního růstu v roztoku obsahujícím erythropoietin, vyznačující se t í m , že tento způsob zahrnuje přidávání benzethoniumchloridu k tomuto roztoku.
39. Způsob podle nároku 38, vyznačující dání fenoxyethanolu k tomuto roztoku.
40. Způsob podle nároku 38, vyznačující dání feny lethy lal koho! u k tomuto roztoku.
41. Způsob podle nároku 38, vyznačující k roztoku v koncentraci od 0,001 do 1,0 %.
42. Způsob podle nároku 38, vyznačující k roztoku v koncentraci od 0,01 do 0,1 %.
43. Způsob podle nároku 38, vyznačující k roztoku v koncentraci 0,005 %.
44. Způsob podle nároku 38, vyznačující k roztoku v koncentraci 0,01 %.
45. Způsob podle nároku 38, vyznačující k roztoku v koncentraci 0,02 %.

se tím, že tento způsob dále zahrnuje přis e tím, že tento způsob dále zahrnuje přís e tím, že benzethoniumchlorid je přidán se tím, že benzethoniumchlorid je přidán se tím, že benzethoniumchlorid je přidán se tím, že benzethoniumchlorid je přidán se tím, že benzethoniumchlorid je přidán
46. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentračním rozsahu od 0,001 do 1,0 % a ťenoxyethanol je přidán v koncentračním rozsahu od 0,01 do 1,0%.
47. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentračním rozsahu od 0,01 do OJ % a fenoxyethanol je přidán v koncentračním rozsahu od OJ do 0,75%.
48. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol jc přidán v koncentraci 0,25 %.
49. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentraci 0,005 % a fenoxyethanol je přidán v koncentraci 0,5 %.
50. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentraci 0,01 % a fenoxyethanol je přidán v koncentraci 0,5 %.
51. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že benzethoniumchlorid je přidán v koncentraci 0,02 % a fenylethylalkohol je přidán v koncentraci 0,25 %.
52. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přidání soli k tomuto roztoku.
53. Způsob podle nároku 52, v y z n a č u j í c í se t í m , že touto solí je chlorid sodný.

- 14 CZ 302750 B6
54. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přidání pufru k tomuto roztoku.
55. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že tímto pufrem je fosforečnan 5 sodný.