KR20020011143A

KR20020011143A - 다중 투여형 에리트로포이에틴 제형

Info

Publication number: KR20020011143A
Application number: KR1020027000944A
Authority: KR
Inventors: 아테프 게이드
Original assignee: 게리 디. 스트리트, 스티븐 엘. 네스비트; 아벤티스 파마슈티칼스 인크.
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2002-02-07
Also published as: DE60022759T2; PL353569A1; DE60022759D1; HRP20020159B1; JP2003517462A; DK1200115T3; NZ516735A; NO20020303L; IL147755A; HUP0202246A2; BR0012667A; HUP0202246A3; RS50355B; EP1200115B9; CN101091792A; AU7137400A; EP1200115B1; CN1371284A; ES2248110T3; US7432360B2

Abstract

본 발명은 비경구 투여용 다중 투여형 에리트로포이에틴 제형에 관한 것이다. 상기 제형은 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜 1종 이상을 포함한다.

Description

다중 투여형 에리트로포이에틴 제형 {Multi-Dose Erythropoietin Formulations}

I. 기술분야

본 발명은 특히 이로운 방부제 또는 방부제들의 조합물을 포함하는, 에리트로포이에틴(이후 EPO라 함)의 다중 투여 제형에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다중 투여 EPO 제형중의 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜 단독 또는 그 조합물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에 개시된 본 발명은 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및(또는) 페닐에틸 알콜을 포함하는 EPO 함유 조성물로 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 제약 담체 조성물, 조성물을 포함하는 바이알, 및 용액중 미생물 성장 억제 방법에 관한 것이며, 여기서 모든 조성물 또는 용액은 EPO 및 1종 이상의 방부제 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜을 포함한다.

II. 배경기술

비경구 제제의 가장 중요한 특성의 하나가 멸균성이다. 멸균된 단일 투여 주사용 비경구 제제의 경우, 멸균성은 멸균 방법 및 포장 시스템의 무결성 모두의 작용으로 유지된다. 다중 투여형 비경구 제제의 경우, 항균제는 저장 및(또는) 사용중 우발적인 미생물 요염으로부터 제제를 보호하기 위하여 제제 제형에 첨가되어야 한다.

안정한 단백질 함유 다중 투여형 제약 제형은 특히 이롭고 상업적으로 흥미롭기 때문에 제약 산업에서 검토중이다. 다중 투여 제형은 항상은 아니지만 일반적으로 제형의 부분량을 여러번에 걸쳐 추출하게 되어 있는 바이알(다중 투여 용기)에 포함되어 있다. 이 종류의 시스템은 단일 용기로부터 다중 투여량을 얻을 수 있으며, 제형을 임의의 부분량으로 투여중지 및 투여할 수 있어 제약 조성물 투여를 보다 제어할 수 있기 때문에 바람직하다.

다중 투여 제형의 사용은 제형에 대하여 특별한 요구 사항을 부과한다. 예를 들어, 조성물의 멸균성 유지는 특히 제형내에 미생물 및 다른 오염원이 도입되는 많은 주어진 기회에 대한 도전이다. 다중 투여 용기내로 외부 물질, 예를 들어 바늘이 반복적으로 도입되는 것은 용기내에 미생물을 도입하는 결과를 가져온다. 또한 이와는 달리, 미생물은 용기의 충전 동안 또는 투여전에 냉동건조된 제형을 재구성(reconstitution)하는 중에 도입될 수 있다. 용기를 저장할 수 있는 기간의 연장은 특히 외부 물질의 다중 도입중 및(또는) 오염원의 도입 후에 내용물의 멸균성을 확실하게 하기 위하여 특정 첨가제를 제형에 포함시킬 것을 요구한다.

다중 투여 제형이 최적의 멸균성을 유지하는 것을 확실하게 하기 위하여, 미국 식품의약품안전청 (FDA) 및 다른 사법 규제 기관은 모든 다중 투여 제형이 제형내로 도입될 수 있는 임의의 미생물의 성장을 억제시키거나 확실하게 죽이는 방부제를 포함할 것을 요구한다. 단백질은 고유의 불안전성이 있으며 방부제 화합물과 불리하게 상호작용하는 경향이 있기 때문에 단백질 함유 다중 투여 제형의 개발은 특히 어려운 것으로 밝혀졌다. 방부제와 단백질간에 가능한 불리한 상호작용으로는 단백질의 분해, 특히 연장된 기간 동안 저장시 분해; 단백질의 불활성화; 단백질 응집물 형성; 및 제형을 불활성화시키거나, 인간에게 제형을 특히 주입, 주사 또는 다른 비경구로 투여하는 것을 곤란하게 하거나 고통스럽게 하거나 그렇지 않으면 바람직하지 않게 하는 다른 상호작용을 들 수 있다.

또한, 방부제 자체는 인간에게 비경구 투여시 알레르기 반응과 같은 급성 부작용을 일으키기 때문에 주의를 요한다. 이상적으로, 다중 투여 단백질 제약 조성물에 포함된 방부제는 광범위한 미생물에 대하여 저농도에서 효과적이고, 제형에 가용성이고, 무독성이고, 단백질과 상용성이 있으면서 비반응성이고, 장기간 저장에서 활성이고, 용기 또는 마개 성분과 비반응성이어야 한다.

산딥 네마(Sandeep Nema) 등은 미국에서 판매되는 주사가능한 제제의 제형에 포함된 각종 부형제 목록을 공개하였다. 이 비평 기사에 기재된 항균성 방부제의 목록은 하기 표 1에 포함되어 있다.

항균성 방부제
방부제	횟수	범위
염화벤잘코늄염화벤제토늄벤질 알콜클로로부탄올m-크레졸미리스틸 감마-피콜리늄 클로라이드파라벤 메틸파라벤 프로필페놀2-페녹시에탄올페닐 질산수은티메로살	147417325040483346	0.02 중량/부피％0.01％0.75-50.25-0.5％0.1-0.3％0.0195-0.169％0.05-0.18％0.01-0.1％0.2-0.5％0.50％0.001％0.003-0.01％

EPO는 골수에서 헤모글로빈 및 적혈구의 생성을 자극하는 작용을 하는 당단백질이다. EPO는 신장에서 생성되고, 예를 들어 신부전을 포함하여 각종 질환을 야기하는 빈혈의 치료에 광범위하게 사용된다. EPO의 아미노산 서열 및 일반적인 글리코실화 패턴은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미야까(Miyaka) 등의 문헌 및 미국 특허 4,703,008호 참조). 인간 조직 또는 유체로부터의 EPO의 단리 및 정제가 미야까 등의 문헌에 기재되어 있다.

상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 이 서열의 단리, 및 전통적 재조합 방법에 의한 상기 단백질의 생성은 또한 당분야에 공지되어 있다 [예를 들어, EPO를 코딩하는 핵산 서열이 기재되어 있는 린(Lin)의 미국 특허 4,703,008호, EPO를 생성하는 림프구모세포의 용도가 기재되어 있는 스기모또(Sugimoto) 등의 미국 특허 4,337,513호, 및 인간 신장 종양 세포주에 의한 EPO 생성이 기재되어 있는 셔우드(Sherwood) 등의 문헌 참조]. 또한, 단백질의 생성, 단리 및 정제는 유전자 활성화 또는 동종 재조합 후, 공지된 단리 및 정제 기술에 의해 성취될 수 있다.

EPO 함유 다중 투여 제형의 개발은 특히 EPO에 의해 나타난 불안정성, 및 보통의 제약 성분들과 쉽게 상호작용하는 EPO의 경향으로 인해 특히 어렵다 (미국 특허 4,806,524호). EPO 단백질의 안정화에 도움을 준다고 생각되는 접근법인 낮은 pH에서 제형을 유지시키거나 각종 아미노산 구조물을 포함시킴으로써, 또는 투여전에 제형으로부터 방부제가 승화되는 냉동건조 형태를 개발함으로써 상기 문제점들을 극복하기 위한 다중 투여형 EPO 제형을 개발하려는 시도를 해왔다 (우그(Woog)의 미국 특허 5,503,827호 (이후 '827 특허라 함)).

안정한 멸균 다중 투여형 EPO 함유 제약 제형은 거의 없다. 이는 '827 특허에 개시된 제형들을 포함한다. '827 특허는 방부제로서 클로레톤 (클로르부탄올, 1,1,1-트리클로로-2-메틸-2-프로판올), 염화벤잘코늄 또는 벤질 알콜을 개시하고 구체적으로 청구하고 있다. 우그는 구체적으로 알레르기 발생율을 감소시킨 다중 투여형 EPO 제형을 제공하는 것이 특히 어렵다는 것을 언급하고, 이에 대하여 특히 이로운 구체적으로 청구된 방부제의 사용을 촉구하였다. 이 문헌에는 또한 방부제의 분해 특성과 방부제와 단백질을 혼합시 단백질이 불활성화되는 경향으로 인하여 방부제와 단백질의 접촉을 최소화하는 것이 가장 바람직하다고 기재되어 있다. '827 특허에는 또한 여러 아미노산 구조물 및 용액중의 EPO 안정화에 필요하다고 생각되는 다른 첨가제의 사용이 개시되어 있다. 마지막으로, '827 특허에는 가장 바람직한 실시태양에서 초기 제형에 사용된 임의의 방부제는 조성물의 냉동건조시 승화된다고 개시되어 있다. 그 후, 정의된 바와 같은 개시된 클로로레톤, 염화벤잘코늄 및 벤질 알콜의 군에서 선택된 추가 방부제는 재구성시 도입될 수 있으나, 주사가능하도록 재구성된 용액은 30일 내에 사용되어야 한다.

EPO 함유 다중 투여 제형의 다른 예는 미국 특허 5,661,125호 ('125 특허)에 기재되어 있다. 이 특허는 "EPO가 특히 용액 형태에서 불안정한 물질이고, 공지된 안정화제와 혼합시 얻어지는 EPO의 안정성은 변하고 예측불가능하다"고 언급하는 다른 문헌을 명백하게 인정하고 지지한다. 이 문헌은 이어서 EPO 함유 용액중의 방부제로서 벤질 알콜, 파라벤 및(또는) 페놀 또는 이들의 조합물의 특정 용도를 보여주고 청구하고 있다. 또한, EPO 함유 다중 투여 제형에 사용하기 위한, 상용성있고 이로운 방부제를 식별하는 것이 어렵다는 것에 대한 이 문헌에는 다음과 같이 기재되어 있다:

"…(중량)…임의의 특히 보존된 에리트로포이에틴용 제형을 제시하는 다른 단백질과의 방부제의 용도로부터 특별한 어떠한 것도 유도될 수 없다 (예를 들어 문헌 [Geigert, J., 'Overview of the Stability and Handling of Recombinant Protein Drugs,'Journal of parenteral Science ＆ Technology, Vol. 43(5): 220-224(1989)])."

따라서, (1) 제제의 연장된 사용 기간 동안 단백질 성분 및 조성물의 안정성을 유지시키고, (2) 제형의 멸균성을 유지시켜 미국, 유럽 및 일본 약전의 방부제 요구 시험을 충족하고, (3) 사용되는 농도에서 안전하고, (4) 임의의 비경구 또는 경구 경로로 투여가능하고, 이 방법에서 유효하며, 환자의 통증 및 부작용, 예를 들어 알레르기 반응 발생을 최소화하는, EPO 함유 보존된 다중 투여 제약 제형에 대한 필요성이 여전히 남아있다.

III. 발명의 요약

본 발명은 에리트로포이에틴 및 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜 단독 또는 그 조합물을 포함하는, 신규하고 특히 이로운 다중 투여 제형을 제공한다.

본 발명의 제형은 다양한 투여량을 위한 다양한 바이알 크기중에 다양한 농도로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 제형은 EPO를 10,000, 20,000, 40,000 또는 그 이상, 또는 100,000 단위/㎖의 농도로 포함할 수 있다.제형은 또한 5,000, 15,000, 25,000 단위/㎖ 농도 등과 같은 예시적 농도내의 임의의 농도를 포함할 수 있다. 또한, 투여량은 1/2, 1 또는 2 ㎖ 바이알, 또는 임의의 다른 크기 바이알 또는 제제화에 바람직한 다른 용기에 제제화될 수 있다. 제제화의 필요 사항에 따라 투여량 및 바이알의 임의 조합이 사용될 수 있다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다. 예를 들어, 당업자는 본 명세서에 개시된 제형을 1 ㎖ 바이알중에 10,000 단위/½㎖ 농도, 2 ㎖ 바이알중에 40,000 단위/㎖ 용량, 또는 임의 크기의 바이알중에 임의의 다른 EPO 농도의 조합으로서 제조할 수 있다. 조성물은 수용액, 현탁액의 형태일 수 있거나 냉동건조될 수 있다.

본 발명은 다른 실시태양에서 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 또는 페닐에틸 알콜 단독 또는 그 조합물을 담체 중에 포함하는, EPO의 담체로서 사용하기 위한 제약 담체 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜을 단독으로 또는 그 조합물의 유효량 및 EPO를 포함하는, EPO 다중 투여량을 포함하는 바이알을 제공한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜 단독 또는 그 조합물을 EPO 함유 용액에 첨가하는 것을 포함하는, EPO 함유 용액중의 미생물 성장 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 EPO 다중 투여 제형의 추가 성분으로는 계면활성제, 완충제, 삼투압 조절제 및 흡착방지제를 들 수 있다. 특히 이로운 첨가제로는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80, 인산나트륨, 염화나트륨 및 게나폴(genapol)을 들 수 있다.

본 발명의 제형은 고체, 반고체, 액체 또는 유체 형태, 예를 들어 정제, 수용액 또는 현탁액이거나, 냉동건조되고 환자에게 투여하기 전에 재구성될 수 있다. 제형은 정맥내, 피하, 근육내, 경피, 동맥내, 복강내 또는 폐흡입을 포함하는 임의의 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 제형은 경구로 투여될 수 있다.

IV. 발명의 상세한 설명

본 발명은 당분야의 현 상태에서 유의적으로 개선된 것을 제공한다. 안정하고 쉽게 투여되는 멸균 조성물을 위하여 각각 제공된 방부제를 포함하는 신규 EPO 함유 다중 투여 제약 제형을 제공한다. 추가로 그리고 가장 예측불가능하게도, 본 발명에는 페녹시에탄올 및 염화벤제토늄이 EPO 함유 다중 투여 제약 조성물에 사용시 조성물에 특히 이로운 양성적인 상승 효과를 갖는다는 것이 개시되어 있다. 구체적으로, 이 방부제의 조합물은 다음과 같은 특성을 나타낸다: (1) 항균성 상승 효과는 사용되는 방부제의 농도를 낮출 수 있고, (2) 연장된 기간 동안 다양한 저장 조건에서 EPO의 우수한 저장성을 가지며, (3) 페녹시에탄올은 국소 마취 효과를 가지므로 조성물의 피하 투여에 특히 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 하기 용어는 하기 의미를 갖는다.

에리트로포이에틴 - 생물학적으로 활성이고 글리코실화된 형태로, 골수에서 헤모글로빈 및 적혈구의 생성을 유도할 수 있는 당단백질. 전통적 재조합 방법 또는 유전자 활성화에 의해 인간 조직 또는 유체로부터 단리함으로써 얻을 수 있다.

비경구 - 위장관 통로 이외의 경로를 의미하며, 정맥내, 피하, 근육내, 골수내, 동맥내, 복강내 및 폐흡입을 들 수 있다.

제약상 허용되는 (약리상 허용되는) - 동물 또는 인간에게 적절하게 투여시 부작용, 알레르기 또는 다른 부적합 반응을 일으키지 않는 분자 단위(entity) 및 조성물을 말한다.

제약상 허용되는 담체 - 제약상 허용되는 물질을 위한 매질로서 사용될 수 있는 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 들 수 있다.

단위 - 비저산소증 폴리에이세믹(exhypoxic polyeythemic) 마우스 생물분석에 의해 결정되고 세계 보건 기구의 기준과 비교되는 생물학적 활성 단위.

본 명세서에서 언급되는 임의의 수치 값은 낮은 값부터 1 단위씩 증가로 높은 값까지의 모든 값을 포함하되, 임의의 낮은 값과 임의의 높은 값 사이에 2 단위 이상의 차이가 있다. 예를 들어, 성분의 농도, 또는 예를 들어 삼투압, 온도, 압력, 시간 등과 같은 가변적 공정 값이, 예를 들어 1 내지 90, 바람직하게는 20 내지 80, 보다 바람직하게는 30 내지 70이다라고 말하는 경우, 15 내지 85, 22 내지 68, 43 내지 51, 30 내지 32 등과 같은 값이 명백히 본 명세서에 열거되어 있는 것을 의미한다. 1 미만의 값에 대하여, 1 단위는 적절하게는 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1라고 여겨진다. 구체적으로 언급된 것의 예만이 기재되어 있으며, 열거된 최저치와 최고치 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합은 유사한 방법으로 본 출원에 기재된 것으로 여겨진다.

A. 방부제: 페녹시에탄올 및 염화벤제토늄

본 발명에 따라 사용될 수 있는 방부제는 바람직하게는 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜, 이들 방부제의 임의의 변형체 및 그의 구조 유사체이다. 구체적으로는, 이들 방부제는 본 명세서에 개시된 제형중에 단독으로 사용되거나, 이롭게는 다른 방부제와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 페녹시에탄올 및 염화벤제토늄의 조합물을 사용하는 본 발명의 제형은 특히 바람직하다고 증명되었다.

염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜은 본 명세서에 개시된 제형중에 임의의 유효량으로 사용될 수 있다. 총 방부제 농도는 바람직하게는 총 제형의 약 0.001％ 내지 약 4.0％이다. 특히 이로운 총 방부제의 농도는 부작용을 최소화하는 동시에 필요한 항균성을 얻기 위하여 가능한 한 낮게 유지된다. 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜은 각각 방부제로서 사용될 수 있지만, 이들 방부제의 조합물을 사용하는 경우보다 더 높은 방부제 농도를 필요로 한다.

본 발명의 보다 바람직한 실시태양에서, 염화벤제토늄 및 페녹시에탄올은 함께 사용된다. 놀랍게도, 함께 사용되는 경우 이들 방부제는 서로에 대하여 상승 효과를 갖는다. 단독으로 사용하는 경우에 동일한 항균성을 얻기 위해서는 염화벤제토늄 또는 페녹시에탄올의 농도를 함께 사용한 경우의 총 방부제 농도보다 각각 더 높여야하며, 일반적으로 단독으로 사용한 경우에는 방부제의 2배 이상을 사용해야 한다. 따라서, 예를 들어 염화벤제토늄 또는 페녹시에탄올을 단독으로 사용하는 경우, 페녹시에탄올과 조합된 염화벤제토늄과 동일한 효과를 얻기 위해서는 염화벤제토늄 또는 페녹시에탄올의 약 2배 이상의 양이 필요할 것이다. 또한, 염화벤제토늄 및 페녹시에탄올의 농도가 더 높더라도, 각 방부제 제형은 미국, 유럽 또는 일본의 항균 규제 기준을 충족할 수 없다. 바람직한 제형은 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도의 페녹시에탄올과 조합된 약 0.001 내지 약 0.1％ 농도의 염화벤제토늄을 포함한다. 보다 바람직한 제형은 약 0.01％ 내지 약 0.02％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.25％ 내지 약 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 페닐에틸 알콜과 조합된 염화벤제토늄을 포함한다. 바람직한 제형은 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도의 페닐에틸 알콜과 조합된 약 0.001 내지 약 0.1％ 농도의 염화벤제토늄을 포함한다. 보다 바람직한 제형은 약 0.15 내지 약 0.25％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.2 내지 약 0.5％ 농도의 페닐에틸 알콜을 포함한다. 염화벤제토늄 및 페닐에틸 알콜이 함께 사용된 가장 바람직한 제형은 약 0.02％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.25％ 농도의 페닐에틸 알콜을 포함한다.

B. 에리트로포이에틴

EPO의 핵산 서열, 아미노산 서열, 3차원 구조 및 전형적 글리코실화 패턴은 당분야에 공지되어 있다. 또한, 각종 공급원으로부터 단리되고 정제된 EPO는 공지되어 있다. 따라서, 당업자들은 전통적 재조합 기술 및 유전자 활성화 방법을 통해 인간 조직 또는 유체로부터 EPO를 단리하고 정제함으로써 본 발명에 따라 사용하기 위한 EPO를 얻을 수 있다. 이들 방법 모두는 본 발명의 범위내에서 구체적으로 고려된다. 또한, 임의의 공급원으로부터 얻은 임의의 다른 EPO는 본 발명에 따라서 사용하는데 고려된다.

C. 다른 활성 성분들

본 발명에 따른 최적의 제형은 제형이 저장될 시간, 제형이 저장되고 사용될 조건, 특히 제형이 투여될 수 있는 특정 환자군 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 상기 기재된 방부제인 염화벤제토늄, 페녹시에탄올 및 페닐에틸 알콜 및 EPO 이외에 제형의 성분들 및 그의 상대 농도를 조절함으로써 제조자, 투약자 또는 환자의 필요에 따라서 조절할 수 있다. 본 발명의 다중 투여 EPO 제형의 추가 성분들로는 물, 완충제, 계면활성제, 흡착방지제, 습윤제 및 삼투압 조절제를 들 수 있다. 변화될 수 있는 제형 특성으로는 예를 들어 pH 및 삼투압을 들 수 있으며, 이에 의해 인간 혈액 또는 조직과 유사한 pH 및 삼투압을 갖는 제형을 제조할 수 있다.

완충제는 다른 목적 중에서도 제약 제형의 총 pH의 조절을 위하여 본 발명에 유용하다. 시트르산염, 인산염, 타르타르산염, 숙신산염, 아디프산염, 말레산염, 락트산염, 아세트산염, 중탄산염 또는 탄산염 이온의 각종 형태를 포함하여 유기산 또는 무기산, 염기 또는 아미노산의 각종 염과 같은 당분야에 공지된 각종 완충제는 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 특히 이로운 완충제로는 나트륨 또는 칼륨 완충제, 특히 인산나트륨을 들 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 인산나트륨은 약 20 mM의 농도로 사용된다. 특히 효과적인 인산나트륨 완충계는 인산나트륨 일염기 일수화물 및 인산나트륨 이염기 오수화물을 포함한다. 일염기 및 이염기 인산나트륨의 조합물이 사용되는 경우, 각각의 이로운 농도는 약 0.5 내지 약 1.5 ㎎/㎖(일염기) 및 약 2.0 내지 약 4.0 ㎎/㎖(이염기)이고, 바람직하게는 약 0.9 ㎎/㎖(일염기) 및 약 3.4 ㎎/㎖(이염기)이다. 제형의 pH는 사용되는 완충제의 양에 따라서 변한다. 제형의 바람직한 pH 수준은 pH 5.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 pH 약 6.0 내지 약 7.5, 가장 바람직하게는 pH 약 7.0이다.

또한, 본 명세서에 개시된 제형에 계면활성제를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 계면활성제 또는 흡착방지제로는 폴리옥시에틸렌소르비탄, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 트윈(Tween)-20™과 같은 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80, 히드록시셀룰로오스 및 게나폴을 들 수 있다. 바람직한 실시태양에서는 폴리소르베이트-20이 사용된다. 임의의 계면활성제가 본 발명에서 사용되는 경우, 약 0.01 내지 약 0.5 ㎎/㎖의 농도로 사용되는 것이 이롭다. 특히 유용한 실시태양에서, 폴리소르베이트-20은 약 0.1 ㎎/㎖의 농도로 사용된다.

추가의 유용한 첨가제는 특히 개시된 다중 투여 EPO 제형의 필요성 및 의도하는 용도에 따라서 당업자들에 의해 쉽게 결정된다. 특히 유용한 이런 추가 성분의 하나는 염화나트륨이고, 이는 원하는 삼투압을 얻기 위하여 제형의 삼투압을 조절하는데 유용하다. 특히 바람직한 삼투압은 약 270 내지 약 330 mOsm/㎏의 범위이다. 본 발명에 개시된 제형의 최적의 삼투압은 약 300 mOsm/㎏이다. 이 삼투압을 얻는데는 약 6.5 내지 약 7.5 ㎎/㎖ 농도의 염화나트륨이 효과적이며, 특히 약 7.0 ㎎/㎖ 농도의 염화나트륨이 특히 효과적이다. 또는, 염화나트륨을 첨가하거나 조절하여 약 270 내지 약 330 mOsm/㎏, 바람직하게는 300 mOsm/㎏의 삼투압을 얻을 수 있다. 다른 유용한 삼투압 조절제로는 만니톨 및 소르비톨을 들 수 있다.

D. 조성물의 제조

본 명세서에 기재된 EPO 제형은 히드록시프로필셀룰로오스 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄과 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어 슈가 또는 상기 기재된 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 일스테아르산알루미늄 또는 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 연장될 수 있다. 사용할 수 있는 다른 제제로는 렉시틴, 우레아, 산화에틸렌, 산화프로필렌, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 기재된 수성 조성물 (이노큘라(inocula))은 제약상 허용되는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 EPO를 포함할 수 있다. 이러한 조성물을 이노큘라라고도 한다. 제약 활성 물질을 위한 제약상 허용되는 담체 매질 및 제제의 용도는 당분야에 공지되어 있다. 상기 범위내에서 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 성분과 상용성이 없는 것를 제외하고는 치료학적 조성물에 사용되는 것이 고려된다. 보조 활성 성분들이 또한 상기 기재된 조성물에 혼입될 수 있다.

EPO와 같은 프로테오글리칸은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염으로는 산부가 염 (단백질의 유리 아미노기와 형성됨), 및 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성된 염을 들 수 있다. 유리 카르복실기와 형성된 염은 또한 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 이롭게는 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사가능한 조성물의 형태로 투여되고, 또한 주사전의 액체중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다. 이를 위한 전형적 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 인산 완충 식염수 ㎖당 인간 혈청 알부민 10 ㎎, 25 ㎎, 50 ㎎ 또는 약 100 ㎎ 이하를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 제형은 단일 또는 다중 투여용 바이알, 병, 관, 주사기 또는 다른 용기에 포함될 수 있다. 이러한 용기들은 유리, 또는 예를 들어 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 중합체 물질로 제조될 수 있다. 바람직한 용기는 단일 용량을 취하기 위하여 바늘에 의해 관통된 후, 바늘 제거시 재밀봉될 수 있는 고무 마개와 같은 밀봉장치 또는 다른 마개 장치를 포함할 수 있다. 주사용으로 당분야에 공지되어 있는 주사가능한 액체, 냉동건조된 제형, 재구성 냉동건조된 제형 또는 재구성가능한 분말은 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

V. 실시예

하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

A. 실시예 1: 방부제 선별 및 안정성 시험

재료 및 방법:

인산나트륨 일염기 일수화물 USP, 인산나트륨 이염기 오수화물 USP, 염화나트륨 USP/EP 및 폴리소르베이트 20 USP/NF를 제이.티. 베이커 (J.T. Baker, a division of Mallinckordt Baker, Inc., Phillipsburg, NH 08865)로부터 얻었다.

염화벤잘코늄 USP/NF, 2-페녹시에탄올 BP, 페닐에틸 알콜 USP/NF, 티메로살 USP/NF, 페놀 결정 USP, 염화벤제토늄 USP/NF, m-크레졸 USP, 페닐 질산수은 USP/NF, 벤질 알콜 USP, 클로로부탄올 USP, 메틸파라벤 USP/NF 및 프로필파라벤 USP/NF를 스펙트럼 퀄리티 프로덕츠 인크. (Spectrum Quality products INC., Gardena, CA 90248)로부터 얻었다.

미리스틸 감마-피콜리늄 클로라이드를 파마시아 앤드 업죤 캄파니 (Pharmacia ＆ Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan 49001)로부터 얻었다.

다중 투여 EPO 함유 용액을, 멸균되고 비발열원성이며 무색인, 주사용수 중의 수용액으로서 10,000 단위 및 20,000 단위 농도로 제제화하였다. 제조된 용액은 20 mM의 인산염 완충제 (인산나트륨 일염기 일수화물 및 인산나트륨 이염기 오수화물), 흡착방지제로서 0.01 중량/부피％의 폴리소르베이트 20, 0.45 내지 0.8 중량/부피％의 염화나트륨 (사용된 방부제 시스템에 따라, 염화나트륨의 양은 삼투압이 약 300 mOsm/kg이 되도록 조정함), 및 방부제 시스템을 포함하였다. 제조된 용액의 pH는 약 7.0이었고, 삼투압은 약 300 mOsm/kg이었다.

용액을 멸균된 0.22 ㎛ 밀리포어 (Millipore) 필터를 통해 여과하여 멸균시켰다. 용액을, 화학 안정성 시험용은 멸균 투명한 2 ml의 USP 1형 유리 바이알에 넣어 5℃ 및 25℃에 보관하였으며, 미생물 시험용은 멸균된 250 내지 500 ml의 HDPP (고밀도 폴리프로필렌) 병에 보관하였다.

연구된 방부제는 벤질 알콜 1.0 중량/부피％, 염화벤잘코늄 0.01 중량/부피％, 2-페녹시에탄올 0.5 중량/부피％, 페닐에틸 알콜 0.5 중량/부피％, 티메로살 0.005 및 0.01 중량/부피％, 페놀 결정 0.4 중량/부피％, 염화벤제토늄 0.01 및 0.02 중량/부피％, m-크레졸 0.4 중량/부피％, 페닐 질산수은 0.002 중량/부피％, 메틸파라벤 0.1 및 0.18 중량/부피％, 프로필파라벤 0.03 및 0.035 중량/부피％, 및 미리스틸-감마-피콜리늄 클로라이드 0.02 중량/부피％를 포함하였다. 또한, 하기 조합을 연구하였다: (1) 염화벤제토늄 0.005 중량/부피％와 페녹시에탄올 0.25 중량/부피％, (2) 염화벤제토늄 0.005 중량/부피％와 페녹시에탄올 0.5 중량/부피％, (3) 염화벤제토늄 0.01 중량/부피％와 페녹시에탄올 0.5 중량/부피％, 및 (4) 페닐에틸 알콜 0.25 중량/부피％와 염화벤제토늄 0.02 중량/부피％.

논의:

메틸 파라벤, 프로필 파라벤, m-크레졸 및 페놀은 EPO 제형 (완충 용액)에 첨가시 흐린 용액 내지 혼탁한 용액을 생성하였다. 이 혼탁도로 인하여 흡수성 폴리소르베이트 20과 각각의 방부제를 함께 사용할 수 없다는 문제점이 발생하였다 (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1994).

클로로부탄올을 이 제형에 사용하면 투명한 용액이 생성되기는 하지만, 이는 pH가 3이 넘을 경우에 불안정할 뿐 아니라, pH 7.5에서의 반감기가 약 3개월 (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1994)이기 때문에 평가를 중지하였다.

페닐 질산수은의 존재시, 혼탁한 용액이 생성되었다. 이 혼탁도로 인하여 삼투압 조절제 염화나트륨과 페닐 질산수은을 함께 사용할 수 없다는 문제점이 발생하였다 (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1994).

티메로살을 EPO 제형에 사용시 투명한 용액이 생성되었다. 또한, 이는 양호한 방부제 효능을 나타냈다. 추가로, 티메로살의 존재시 EPO 제형은 양호한 화학 안정성을 나타냈다. 그러나, 티메로살은 수은을 함유하기 때문에, 유럽, 일본 및 미국에서 약제로서 허용될 수 없다.

벤질 알콜, 염화벤제토늄, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 염화벤잘코늄 및 염화 미리스틸-감마-피콜리늄 클로라이드를 함유하는 제형은 투명한 용액을 생성하였다. 이들 방부제에 대한 최소 억제 농도, 안정성 및 사용 빈도를 기초로, 하기 방부제를 선별하여 EPO 제형의 단백질 안정성 및 항균성 효능을 화학적으로 평가하였다: 벤질 알콜, 염화벤제토늄, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 및 염화벤제토늄과 페녹시에탄올의 몇가지 조합.

B. 실시예 2: 시험된 단백질의 안정성

재료 및 방법:

선별된 방부제를 이용하여 원형 배치 (prototype batch)를 만들고, 이를 5℃ 및 25℃에서 안정하게 놓아 두었다. 역상 HPLC법에 의해 샘플을 시험하였다. 이들 방부제 존재하의 EPO 함유 제형의 분석 결과 (％ 함량)를 표 2에 나타내었다.

함량은 워터스 델타-팩 (Waters Delta-Pak) C18 컬럼과, 0.05 ％ TFA 및 아세토니트릴 농축액을 함유하는 수용액이 23％에서 86％로 증가하는 구배 용출을 이용하는 역상 HPLC에 의해 측정하였다. EPO 단백질의 검출을 210 nm에서 모니터링하였다.

농도 기준의 분석 결과 (％ 함량)
방부제	개월	농도	화학 분석 (％ LC)¹
방부제	개월	농도	5℃	25℃
벤질 알콜	7M	10,000 U/ml	98.6	90.0
벤질 알콜	7M	20,000 U/ml	99.7	93.7
벤제토늄	4M	10,000 U/ml	99.9	88.9
벤제토늄	4M	20,000 U/ml	101.5	94.4
페녹시에탄올	4M	10,000 U/ml	100.5	96.9
페녹시에탄올	4M	20,000 U/ml	102.6	97.5
벤제토늄 및페녹시에탄올(0.005％ 및 0.5％)	3M	20,000 U/ml	98.3	97.0
¹역상 HPLC에 의해 측정

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 역상 HPLC 데이타는 5℃에서 3 내지 7개월 동안 보관시 모든 제형에 대한 EPO의 농도 손실이 없음을 보여준다. 그러나, 벤질 알콜 또는 염화벤제토늄을 단독으로 함유하는 제형은 25℃에서 3 내지 7개월 동안 보관시 10％ 이하의 EPO 손실이 나타났다. 페녹시에탄올을 함유하는 제형 또는 페녹시에탄올과 염화벤제토늄의 조합을 함유하는 제형은 25℃에서 3 내지 4개월 동안 보관시 EPO의 손실이 없었다. 이들 결과는 페녹시에탄올 및 페녹시에탄올과 염화벤제토늄의 조합이 EPO의 안정화에 효과가 있음을 보여주며, 이 효과는 놀랍고 기대 이상이며, 또한 매우 유리하다.

C. 실시예 3: 방부성 시험

방부제의 효과는 다중 투여 제약 제형에서의 방부제 시스템에 대한 효능을 측정하는 콤펜디알 (Compendial)-지침 분석법으로 시험하였다. 이 분석법에서, 지표 생물인 호기성 세균 및 곰팡이의 표준화된 현탁액으로 시험 제형을 시험하여, 28일 동안 미생물의 생존을 모니터링하였다.

표 3은 미국 약전 (USP) 및 유럽 약전 (EP)의 방부성 시험 결과를 보여준다. 시험된 모든 제형은 방부성 시험에 대한 USP 기준을 통과하였다. 염화벤제토늄 0.01 중량/부피％, 페녹시에탄올 0.5 중량/부피％ 또는 페닐에틸 알콜 0.5 중량/부피％를 함유하는 제형은 방부성 시험에 대한 EP 기준을 통과하지 못하였다. 염화벤제토늄과 페녹시에탄올을 상이한 조합으로 함유하는 제형, 및 염화벤제토늄과 페닐에틸 알콜의 조합을 함유하는 제형은 USP 기준과 EP 기준을 모두 통과하였다. 표 3에 기재된 데이타를 기초로 판단해 보면, 염화벤제토늄의 항균성은 페녹시에탄올을 첨가함으로써 상승적으로 놀랍게 증가한 것 같다.

방부성 시험
방부제	농도	방부성 시험
방부제	농도	USP	EP
벤질 알콜(1.0 ％)	20,000 U/ml	통과	시험하지 않음
벤제토늄(0.01 ％)(0.02 ％)	20,000 U/ml	통과통과	통과 못함통과
페녹시에탄올(0.5 ％)	20,000 U/ml	통과	통과 못함
벤제토늄과페녹시에탄올(0.005 및 0.25％)(0.005 및 0.5％)(0.01 및 0.5％)	20,000 U/ml	통과	통과
페닐에틸 알콜0.5 ％	20,000 U/ml	통과	통과 못함
벤제토늄 및페닐에틸 알콜(0.02％ 및 0.25％)	20,000 U/ml	통과	통과

참고문헌:

스기모또 등의 미국 특허 4,377,573호

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가와가찌(Kawagachi) 등의 미국 특허 4,806,524호

우그 등의 미국 특허 5,503,827호

스트릭클란(Stricklan) 등의 미국 특허 5,661,125호

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트리셀(L.A. Trissel)의 문헌 ["Handbook on Injectible Drugs." Ed. 8, American Society of Hospital Pharmacists, Inc. 1994]

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Claims

에리트로포이에틴 및 조성물중의 미생물 성장 억제 유효량의 염화벤제토늄을 포함하는 제약 조성물.
제1항에서, 페녹시에탄올을 추가로 포함하는 조성물.
제1항에서, 페닐에틸 알콜을 추가로 포함하는 조성물.
제1항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도인 조성물.
제1항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도인 조성물.
제1항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.005％ 농도인 조성물.
제1항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.01％ 농도인 조성물.
제1항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.02％ 농도인 조성물.
제2항에서, 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 조성물.
제2항에서, 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.1 내지 약 0.75％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 조성물.
제2항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 조성물.
제2항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 조성물.
제2항에서, 약 0.01％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 조성물.
제3항에서, 0.02％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페닐에틸 알콜을 포함하는 조성물.
제3항에서, 약 0.02％ 염화벤제토늄 및 약 0.25％ 페닐에틸 알콜을 포함하는 조성물.
제1항에서, 염을 추가로 포함하는 조성물.
제16항에서, 염이 염화나트륨인 조성물.
제1항에서, 완충제를 추가로 포함하는 조성물.
제18항에서, 완충제가 인산나트륨인 조성물.
조성물중의 미생물 성장 억제 유효량의 염화벤제토늄을 포함하는 에리트로포이에틴의 담체로서 사용하기 위한 제약 담체 조성물.
제20항에서, 페녹시에탄올을 추가로 포함하는 제약 담체.
제20항에서, 페닐에틸 알콜을 추가로 포함하는 제약 담체.
제20항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도인 제약 담체.
제20항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도인 제약담체.
제20항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.005％ 농도인 제약 담체.
제20항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.01％ 농도인 제약 담체.
제20항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.02％ 농도인 제약 담체.
제21항에서, 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 제약 담체.
제21항에서, 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.1 내지 약 0.75％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 제약 담체.
제21항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 제약 담체.
제21항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 제약 담체.
제21항에서, 약 0.01％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 제약 담체.
제22항에서, 0.02％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페닐에틸 알콜을 포함하는 제약 담체.
제20항에서, 완충제, 염, 흡착방지제 및 계면활성제로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 제약 담체.
에리트로포이에틴 및 조성물중의 미생물 성장 억제 유효량의 염화벤제토늄을 포함하는 용액을 함유하는, 다중 투여량의 에리트로포이에틴을 포함하기 위한 바이알.
제35항에서, 용액이 페녹시에탄올을 추가로 포함하는 바이알.
제35항에서, 용액이 페닐에틸 알콜을 추가로 포함하는 바이알.
제35항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도인 바이알.
제35항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도인 바이알.
제35항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.005％ 농도인 바이알.
제35항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.01％ 농도인 바이알.
제35항에서, 염화벤제토늄의 유효량이 0.02％ 농도인 바이알.
제36항에서, 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 바이알.
제36항에서, 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.1 내지 약 0.75％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 바이알.
제36항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 바이알.
제36항에서, 0.005％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 바이알.
제36항에서, 약 0.01％ 농도의 염화벤제토늄 및 약 0.5％ 농도의 페녹시에탄올을 포함하는 바이알.
제37항에서, 0.02％ 농도의 염화벤제토늄 및 0.25％ 농도의 페닐에틸 알콜을 포함하는 바이알.
제37항에서, 약 0.02％ 염화벤제토늄 및 약 0.25％ 페닐에틸 알콜을 포함하는 바이알.
제1항에서, 용액이 염을 추가로 포함하는 바이알.
제50항에서, 염이 염화나트륨인 바이알.
제35항에서, 용액이 완충제를 추가로 포함하는 바이알.
제52항에서, 완충제가 인산나트륨인 바이알.
에리트로포이에틴을 포함하는 용액에 염화벤제토늄을 첨가하는 것을 포함하는, 상기 용액중의 미생물 성장 억제 방법.
제54항에서, 용액에 페녹시에탄올을 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제54항에서, 용액에 페닐에틸 알콜을 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제54항에서, 염화벤제토늄을 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도로 첨가하는 방법.
제54항에서, 염화벤제토늄을 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도로 첨가하는 방법.
제54항에서, 염화벤제토늄을 0.005％ 농도로 첨가하는 방법.
제54항에서, 염화벤제토늄을 0.01％ 농도로 첨가하는 방법.
제54항에서, 염화벤제토늄을 0.02％ 농도로 첨가하는 방법.
제55항에서, 염화벤제토늄을 약 0.001 내지 약 1.0％ 농도로 첨가하고, 페녹시에탄올을 약 0.01 내지 약 1.0％ 농도로 첨가하는 방법.
제55항에서, 염화벤제토늄을 약 0.01 내지 약 0.1％ 농도로 첨가하고, 페녹시에탄올을 약 0.1 내지 약 0.75％ 농도로 첨가하는 방법.
제55항에서, 염화벤제토늄을 0.005％ 농도로 첨가하고, 페녹시에탄올을 0.25％ 농도로 첨가하는 방법.
제55항에서, 염화벤제토늄을 0.005％ 농도로 첨가하고, 페녹시에탄올을 0.5％ 농도로 첨가하는 방법.
제55항에서, 염화벤제토늄을 약 0.01％ 농도로 첨가하고, 페녹시에탄올을 약 0.5％ 농도로 첨가하는 방법.
제56항에서, 염화벤제토늄을 0.02％ 농도로 첨가하고, 페닐에틸 알콜을 0.25％ 농도로 첨가하는 방법.
제56항에서, 염화벤제토늄을 약 0.02％ 농도로 첨가하고, 페닐에틸 알콜을 약 0.25％ 농도로 첨가하는 방법.
제54항에서, 용액에 염을 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제69항에서, 염이 염화나트륨인 방법.
제54항에서, 용액에 완충제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제71항에서, 완충제가 인산나트륨인 방법.