MXPA05000662A - Composicion farmaceutica estable que comprende eritropoyetina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una nueva composicion farmaceutica estable de eritropoyetina (EPO) que es estabilizada con una combinacion de un poloxamero poliol y un alcohol polihidrico.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA ESTABLE QUE COMPRENDE ERITROPOYETINA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una nueva composición farmacéutica estable, la cual comprende eritropoyetina (EPO, según sus siglas en inglés). La eritropoyetina, EPO, es una hormona de glicoproteína que regula la formación de eritrocitos en mamíferos. Actúa como factor de crecimiento y/o diferencial para las células progenitoras eritroides en la médula ósea y ocasiona su proliferación y diferenciación a eritrocitos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La EPO humana de existencia natural es producida por el riñon y es el factor de plasma humoral que estimula la producción de glóbulos rojos. Estimula la división y diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea. (Goldwasseret y otros, J. Biol. Chem., 249, 4202-4211, 1974, Sherwoodet y otros, Endocrinology, 103, 866-870, 1978). Se produce en ríñones de adultos Sherwoodet y otros, Endocrinology, 103, 866-870, 1978) y en hígado fetal (Zanjan y otros, J. Lab. Clin. Med., 89, 640-644, 1977). La administración de una composición farmacéutica de EPO al organismo estimula y/o acelera la producción de eritrocitos. La composición farmacéutica de EPO se utiliza en el tratamiento de falla renal crónica, anemia secundaria para tratamiento con quimioterapia en cáncer y anemia asociada con tratamiento de infección de virus de inmunodeficiencia humana con zidovudina y en el tratamiento de otros tipos de anemias (Danna y otros, Erythropoietin in Clinical Applications - An Internacional Perspectiva. New Cork, NY: Marcel Dekker; 301-324, 1990; Eschbach in sod., N. England J. of Med., 316, 2, 73-78, 1987; Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31, 3, 177-181, 1983). La EPO recombinante, la cual es el producto de expresión del gen de eritropoyetina en células de mamífero, se utiliza en composiciones farmacéuticas de EPO (EP 148605, EP 205564, EP 255231). También algunos análogos y derivados de EPO se describen en la técnica; EP640619, EP 668351, WO 9412650, EP1064951, WO 0232957, WO 9533057, US 5916773, WO 09902710, US 5580853, US 5747446, US 5919758 y 6107272. Las composiciones farmacéuticas de eritropoyetina, las cuales comprende albúmina de suero humano, se describen en: EP 178665, EP 178576, US 5661125, WO 0061169. La albúmina de suero humano puede ocasionar reacciones alérgicas (Stafford CT y otros, Ann Allergy, 61 (2), 85-88, 1988). Además, existe el riesgo de infección con virus cuando una composición farmacéutica comprende productos de sangre humana. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas de EPO que son estables y están libres de productos de sangre humana, tales como albúmina, son necesarias. EP 306824, EP 607156, EP 528313 y EP 528314 describen composiciones farmacéuticas en donde se utiliza urea como un agente de estabilización de EPO. EP 306824, EP 178665, GB 2171304, EP 528314, EP 528313 y EP 1002547 describen formulaciones liofilizadas de EPO. La patente de E.U.A. 5376632 describe formulaciones farmacéuticas en donde se utilizan alfa y beta-ciclodextrinas. EP 607156, EP 528313 y EP 178665 describen composiciones farmacéuticas acuosas de eritropoyetina, las cuales comprenden conservadores antimicrobianos tales como alcohol bencílico, parabenes, fenoles y mezclas de los mismos. EP 909564, EP 528314, EP 430200 y WO 0061169 describen el uso de aminoácidos y/o la combinación de aminoácidos y detergentes no iónicos como agentes de estabilización. WO 0187329 describe diferentes composiciones farmacéuticas del análogo de eritropoyetina, pegilado. Las composiciones farmacéuticas descritas esencialmente se basan en el uso de un regulador de pH de sulfato. Algunas de las composiciones farmacéuticas de EPO se describen en: RU 2128517, WO 0061169, EP 528313, EP 607156, EP 528314, EP 178665, se preparan en un regulador de pH de citrato.

COMPENDIO DE LA INVENCION El objeto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende eritropoyetina, EPO, la cual es capaz de estabilizar benéficamente la EPO. La presente invención proporciona una nueva composición farmacéutica estable que comprende EPO de acuerdo con la reivindicación 1. Las modalidades preferidas se establecen en las sub-reivindicaciones. La presente invención también proporciona un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, y a un uso de acuerdo con la reivindicación 22. La composición farmacéutica se formula con un sistema regulador de pH farmacéuticamente aceptable, y comprende una combinación de dos estabilizadores: un poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno) y un alcohol polihídrico. La estabilización de EPO se logra aunque la composición de la invención preferiblemente esté libré de aditivos que se derivan de origen humano o animal distintos a la EPO (por ejemplo, proteínas de suero). La composición farmacéutica opcionalmente además comprende un agente de isotonificación y/o uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica de la presente invención es adecuada para uso en medicina de seres humanos y veterinaria y es farmacéuticamente aceptable en una forma de administración adecuada, especialmente para aplicación parenteral, por ejemplo, aplicación intramuscular, subcutánea y/o intravenosa. En una modalidad particularmente preferida, la composición farmacéutica de la presente invención está en forma de líquido, muy preferiblemente en una forma acuosa.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE de muestras de la invención y de referencia que comprenden EPO después de haber sido almacenadas a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes. La Figura 2 muestra un análisis de SDS-PAGE de muestras de referencia que comprende EPO cuando fueron almacenadas en el refrigerador durante 1 mes en comparación con las almacenadas a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes. La Figura 3 muestra el análisis de SDS-PAGE de muestras de la invención y de referencia comprendiendo EPO, cuando se almacenaron en el refrigerador durante 1 mes en comparación con las que se almacenaron a 40°C (±.2°C) durante 1 mes. La Figura 4 muestra un análisis de SDS-PAGE de muestras de la invención y de referencia comprendiendo EPO, cuando se almacenaron en el refrigerador durante 10 semanas. La Figura 5 muestra un análisis de SDS-PAGE de las muestras de la invención y de referencia comprendiendo EPO cuando se almacenaron a 25°C (+ 2°C) durante 10 semanas. La Figura 6 muestra la respuesta relativa de EPO-ELISA (en %) de muestras de la invención y de referencia cuando se almacenaron a 40°C (+_ 2°C) durante 1 mes (40) con las muestras respectivas cuando se almacenaron en el refrigerador durante 1 mes (HL). La Figura 7 muestra la respuesta relativa de EPO-ELISA (en %) de muestras de la invención y de referencia comprendiendo EPO, cuando se almacenaron a 25°C (+_ 2°C) durante 10 semanas (25) con las muestras respectivas cuando se almacenaron en el refrigerador durante 10 semanas (HL).

DESCRIPCION DE LA INVENCION Y DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Sorprendentemente se encontró que una composición farmacéutica que comprende un agente de superficie no iónico, poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno) y alcohol polihidrico y que de preferencia está libre de aditivos distintos a la EPO derivados de origen humano y/o animal, benéficamente estabiliza la EPO. La presente invención proporciona la composición farmacéutica de EPO que comprende: a. una cantidad de EPO terapéuticamente efectiva, b. un sistema regulador de pH farmacéuticamente aceptable, c. un poloxámero poliol, y d. un alcohol polihidrico. La presente invención también proporciona la composición farmacéutica de EPO que opcionalmente además comprende demás de los componentes a-d: e. un agente de isotonificación y/o f. uno o más de otros excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición de la invención preferiblemente está libre de aditivos derivados de origen humano o animal. El término "eritropoyetina (EPO)" se refiere a una proteína que con la actividad biológica in vivo de ocasionar que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y se selecciona del grupo que consiste de EPO humana y derivados y análogos que son definidos más adelante. El término "cantidad de EPO terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de EPO que permite un efecto terapéutico de la EPO. El término "estabilizador" se refiere a un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual tiene un efecto de estabilización sobre la EPO. El término "estabilidad de EPO" se refiere al mantenimiento del contenido de EPO y al mantenimiento de la actividad biológica de EPO. La estabilidad de EPO puede ser influenciada entre otras cosas por los siguientes procedimientos: adsorción de EPO en las paredes de recipiente, desnaturalización o degradación de EPO y formación de agregado de, por ejemplo, dimeros de EPO y/o multímeros de EPO, y/o moléculas similares con alto peso molecular. Estos procedimientos ocurren debido a la exposición de las muestras a diferentes condiciones, por ejemplo, temperatura más alta, recipientes inapropiados, uso de estabilizadores de EPO erróneos, sol, forma inapropiada de almacenamiento y/o procedimiento de aislamiento inapropiado. El término "libre de aditivos derivados de origen humano y/o animal" se refiere a la condición en la que los aditivos se originan de humanos y/o animales y los cuales son diferentes de EPO, tales como albúminas de suero de tipo HSA o BSA, no se agregan intencionalmente a la composición, o si originalmente están presentes en una preparación de EPO se separan o reducen durante la purificación y/o aislamiento de EPO a un nivel de huellas inevitable, de preferencia un nivel que es típicamente no detectable a través de métodos analíticos estándares. Se ha encontrado sorprendentemente que la formulación de EPO en la composición de la invención mejora su estabilidad a temperaturas por arriba de la temperatura del refrigerador (por ejemplo, 2-8°C), especialmente temperatura ambiente (es decir, por debajo de 25°C), y aún a temperaturas más altas (por ejemplo, 40°C). Esto significa que la composición puede ser almacenada sin enfriamiento durante un periodo prolongado de tiempo (más de 10 semanas a temperatura ambiente), sin perder cantidades importantes de actividad y sin degradación importante. Aunque no está restringido de esta manera, la composición farmacéutica de la presente invención preferiblemente puede consistir solo de los constituyentes antes mencionados, a.-d., u opcionalmente a.-e., a.-d., más f., o a.-f. En algunas composiciones farmacéuticas conocidas en la técnica anterior, los detergentes no iónicos, como el polisorbato 80, se utilizan como estabilizadores de EPO. El uso de un poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno) y/o alcohol polihídrico es ventajoso sobre el uso de polisorbatos, ya que se puede utilizar filtración de gel como ei método analítico para la determinación de dímeros de EPO, multímeros de EPO y sustancias relacionadas con masa molecular más alta, que resultan de la agregación de moléculas de EPO. Los polisorbatos son eluidos al mismo tiempo como los dímeros de EPO. Por lo tanto, la filtración de gel no puede ser utilizada como un método de detección para los dímeros de EPO para las composiciones farmacéuticas que comprenden polisorbatos. El uso de una combinación de poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno) y alcohol polihídrico, por lo tanto, constituye una forma más fácil de proporcionar la estabilidad de EPO, a una seguridad incrementada y un control más fácil de la calidad de la composición farmacéutica de EPO. La composición farmacéutica de la presente invención de preferencia es un líquido y particularmente es una composición farmacéutica acuosa. Dicha composición líquida puede ser directamente utilizada para aplicación parenteral, tal como aplicación subcutánea, intravenosa o intramuscular sin pasos de reconstitución, de dilución o de preparación adicionales, los cuales pueden conducir a una reducción o a una pérdida de la actividad biológica de EPO, y también pueden contribuir a editar los problemas técnicos adicionales que ocurren al mismo tiempo de la aplicación. El uso de una composición farmacéutica líquida, por lo tanto es más práctico como el uso de formulaciones liofilizadas. Generalmente se prefieren las formulaciones líquidas y particularmente acuosas de EPO, con respecto a la formulación liofilizada para preparar la formulación clínica de EPO, ya que el proceso de reconstitución de las composiciones liofilizadas es consumidor de tiempo, posee riesgos de un manejo inapropiado de la formulación de proteína, o puede ser reconstituido ¡napropiadamente, y usualmente se requieren de ciertos aditivos tales como estabilizadores, para retener una actividad suficiente del fármaco. La composición farmacéutica de la presente invención muy preferiblemente está libre de aditivos derivados de origen humano o animal, como proteínas de suero humano las cuales, a pesar de la tamización de sangre, poseen un riesgo de infección con un agente transmisible. Además, aunque la EPO recombinante generalmente es bien tolerada, se han observado erupciones en la piel y urticaria, sugiriendo una hipersensibilidad alérgica a algunos componentes de la formulación de EPO, probablemente la albúmina de suero humano.

La composición farmacéutica de la presente invención puede ser convenientemente preparada en una solución isotónica, y se espera que sea farmacéuticamente aceptable y no ocasione ningún efecto lateral como hipersensibilidad alérgica. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser utilizada para todas las formas de EPO, que comprenden EPO-alfa, EPO-beta, EPO-omega, y otras preparaciones de EPO que tienen diferentes perfiles de isoforma, así como isoformas de EPO específicas, muteínas de EPO, fragmentos de EPO, análogos de EPO tales como dimeros de EPO, NESP (análogo hiperglicosilado de EPO humana recombinante), EPO activada por gen, EPO pegilada, moléculas híbridas con EPO, fragmentos de EPO, proteínas de fusión (oligómeros y multímeros) con EPO, EPO con perfiles de glicosilación modificados sin considerar la actividad biológica de EPO y además sin considerar el método de síntesis o su fabricación, dicho método puede incluir, pero no se limita al aislamiento de EPO de existencia natural y EPO recombinante si se produce a partir de ADNc o ADN genómico, métodos activados con gen, transgénicos y sintéticos. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender de 500 a 100,000 unidades de EPO por dosis (1 IU corresponde a aproximadamente 10 nanogramos de EPO recombinante). En general, se contempla que una cantidad efectiva será de 1 a 500 lU/kg del peso del cuerpo, y muy preferiblemente de 50 a 300 lU/kg del peso del cuerpo, especialmente cuando la EPO es proporcional subcutáneamente. La cantidad efectiva además dependerá de la especie y tamaño del sujeto que está siendo tratado, la condición o enfermedad particular que va a ser tratada y su severidad y la ruta de administración. En modalidad preferidas, la cantidad farmacéutica se formula para proporcionar una cantidad por dosis seleccionada, del grupo que consiste de aproximadamente 1000 IU, aproximadamente 2000 IU, aproximadamente 3000 IU, aproximadamente 4000 IU, aproximadamente 10000 IU, aproximadamente 20000 IU, aproximadamente 25000 IU, aproximadamente 40000 IU, aproximadamente 50000 IU, aproximadamente 60000 IU, y aproximadamente 100000 IU. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser colocada como relleno en ampollas, jeringas de inyección, cartuchos de dosis múltiples y frascos. Estos permiten la aplicación en volúmenes en la escala preferida de 0.2 a 20 mi por dosis. La escala preferida de pH para soluciones es de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 con un escala preferida de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.5, y un pH de aproximadamente 7.0 siendo muy preferido. El uso de un sistema regulador de pH con fosfato, especialmente fosfato de sodio dibásico y fosfato de sodio monobásico, tal como aH2P04x2H2O/Na2HPO4 x2H20, es preferido. Otros sistemas reguladores de pH adecuados para mantener la escala de pH deseada de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 incluyen, pero no se limitan a, citrato de sodio/ácido cítrico, acetato de sodio/ácido acético y cualquier otro agente regulador de pH farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica. El regulador de pH de citrato puede ocasionar dolor en el sitio de inyección. Por lo tanto, el regulador de pH de fosfato es más preferible para la aplicación parenteral. La concentración del sistema regulador de pH, especialmente el regulador de pH de fosfato, depende del pH deseado de la formulación. La concentración preferida está en la escala de 10 a 50 mM, de preferencia de 15 a 35 mM, muy preferiblemente de 15 a 25 mM. Se puede agregar un agente de ajuste de pH tal como, pero no limitándose a, HCI, NaOH, ácido cítrico o citrato de sodio. La composición farmacéutica de la presente invención comprende una combinación de una sustancia activa en la superficie no iónica, poloxámero poliol, y un alcohol polihídrico. Entre los poloxámeros polioles se utiliza preferiblemente Pluronic F68. La concentración preferida del poloxámero poliol comprende la escala de 1% (m/v), de preferencia de entre 0.05% (m/v) y 0.5% (m/v), muy preferiblemente 0.1% (m/v). El alcohol polihídrico se selecciona del grupo que comprende glicerol, sorbitol, manitol, xilitol, y otros. Entre ellos se utilizan preferiblemente ei sorbitol y glicerol, muy preferiblemente se utiliza glicerol. La concentración preferida de un alcohol polihídrico comprende la escala entre 0.1% (m/v) y 10% (m/v), muy preferido de entre 0.5% (m/v) y 6% (m/v), muy preferiblemente de 1% a 3% (m/v). La composición farmacéutica de la presente invención opcionalmente además comprende un agente capaz de hacer que las formulaciones de la presente invención sean iso-osmóticas con la sangre humana. Los agentes de isotonificación adecuados típicos son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, agentes seleccionados del grupo que consiste de manitol, glicina, glucosa y sales orgánicas tales como NaCI, CaCI2. El uso de NaCI como un agente de isotonificación se prefiere en las formulaciones de la presente invención. Aunque la formulación con una combinación de un poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y oxido de propileno) y un alcohol polihídrico como los estabilizadores de EPO, se prefiero como se mencionó anteriormente, la composición farmacéutica de la presente invención opcionalmente puede comprender más de un tipo de estabilizador además de los componentes antes mencionados, a., b., y opcionalmente e., y f., si se desea. Este estabilizador de EPO adicional preferiblemente se selecciona del grupo que comprende agentes activos en la superficie tales como ésteres de glicol y de glicerol, ásteres y éteres de macrogol, derivados de sorbitán/polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80) y polímero (PVP). Entre ellos, se prefieren los polímeros en una concentración al 1%. El muy preferido es el polímero PVP K12 en una concentración de 0.5%. La composición farmacéutica de la presente invención opcional además puede comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen glicol polietilénico, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, y aminoácidos tales como glicina, L-isoleucina, L-leucina, L-ácido glutámico, L-2-fenilalanina, L-treonina. La composición de la presente invención puede ser utilizada para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades que son indicadas para EPO. Ejemplos de usos médicos incluyen una variedad de terapias en donde la estimulación de la proliferación de glóbulos rojos (RBC) es deseada, en donde existe una deficiencia de hormona endógena, en donde la sangre se pierde o en donde un paciente tiene indicaciones de anemia, o tiene hipo-sensibilidad de médula ósea a la hormona endógena. Estas indicaciones médicas, por ejemplo, son anemia de enfermedad maligna (es decir, cualquier tipo de cáncer sólido, o cáncer hematológico incluyendo leucemia, linfoma y mieloma múltiple), anemia que resulta de un tratamiento quimioterapéutico/con radiación de una enfermedad maligna, anemia de enfermedad crónica incluyendo, por ejemplo, enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide y hepatitis, anemia en pacientes con SIDA, especialmente aquellos tratados con AZT, anemia de prematuros, anemia asociada con falla renal (crónica), anemia de talasemia, anemia hemolítica autoinmune, anemia aplástica, y anemia asociada con cirugía (por ejemplo, para mejorar la donación de sangre pre-operatoria para autotransfusión para estimular e incrementar los niveles de hemoglobina para representar una pérdida de sangre sustancial o para incrementar la eritropoyesis en sujetos que experimentan trasplante de médula ósea), el tratamiento de fatiga, dolor, falla cardiaca crónica, disritmia o demencia, uso pre-operatorio para reducir la necesidad de transfusión de sangre alogénica en cirugía no vascular y no cardiaca, y otras indicaciones indicadas para EPO. Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención, sin embargo, sin limitar la misma a éstos.

EJEMPLOS Métodos Analíticos Se utilizaron los siguientes métodos analíticos para el análisis de la composición farmacéutica de la presente invención: SDS-PAGE con inmunodeteccion, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), EPO-ELISA y ensayo de actividad biológica in vivo en ratones.

SDS-PAGE con inmunodetección: Las muestras de carga se prepararon en el regulador de pH de carga libre de agente de reducción. La SDS-PAGE vertical se utilizó: gel NuPAGE Bis-Tris 12%, 8 x 8 cm, espesor 1.0 mm, 15 carriles (Invitrogen) en regulador de pH de electroforesis de MOPS-SDS (Invitrogen). La electroforesis corrió durante 1 hora a un voltaje constante de 200 V. Después de la electro-transferencia del gel hacia la membrana de nitrocelulosa, la inmunodetección se realizó en dos pasos. En el primer paso, se utilizaron anticuerpos primarios (anti-huEPO, ratón, monoclona). En el segundo paso, los anticuerpos secundarios (IgG de anti-ratón, conejo, policlonal) conjugados con peroxidosa de rábano, se utilizaron. La adición del sustrato de peroxidasa activo la reacción de enzima para formar un complejo de color azul.

EPO-ELISA: el sistema de EPO-ELISA Quantikine IVD, R & D Systems, se basó en el método de emparedado de anticuerpo doble. Las cavidades de la microplaca, precubiertas con anticuerpo monoclonal (murino) específico para EPO se incubaron con el espécimen no estándar. La EPO se une al anticuerpo inmovilizado sobre la placa. Después de la remoción del espécimen no estándar, las cavidades se incubaron con un anticuerpo policlonal de anti-EPO (conejo) conjugado a peroxidasa de rábano. Durante la segunda incubación, el conjugado de anticuerpo-enzima se unió a la EPO inmovilizada. Se agregó un cromogen a las cavidades y se oxido a través de la reacción de enzima para formar un complejo de color azul. La cantidad de color generado fue directamente proporcional a la cantidad de conjugado unido al complejo del anticuerpo EPO, el cual, a su vez, fue directamente proporcional al tratamiento de EPO en el espécimen o estándar.

SEC: se utilizó SEC para determinar la proporcionar de dímeros de EPO y sustancias relacionadas de masa molecular más alta en las muestras de FP1 a FP8 con el contenido de EPO de 2000 lU/ml a 10000 lU/ml. El ensayo de límite siguiendo los protocolos de European Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia 2002, 4o. edición, solución concentrada de eritropoyetina).

Actividad biológica in vitro Se utilizó el protocolo para la determinación in vivo de la actividad biológica en ratones hipóxicos descritos en Eur. Ph. Se realizó la estimación de la actividad biológica de acuerdo con los protocolos de Eur. Ph también (Eur. Pharmacopoeia - 1997; Statistical Analysis de Results of Biological Assays and Test; The parallel-line model). De acuerdo con las demandas de Eur. Ph, el valor estimado de la actividad biológica debe estar en la escala de entre 80% y 120% de la actividad marcada. El objetivo del método es alcanzar la escala de entre 80% y 120% considerando el contenido (valor) de la EPO inyectada (10000 lU/ml) y los resultados obtenidos representan la estimación de la actividad biológica y no su valor preciso. El límite confidencial debe estar en la escala de entre 64% y 156% de la actividad marcada.

Las condiciones para probar la estabilidad de las composiciones farmacéuticas de EPO son las siguientes HL-referencia 2 a 8°C, refrigerador 40 40°C + 2°C, 75% + 5% humedad relativa, cámara climática 25 · 25°C + 2°C, 60% + 5% humedad relativa, cámara climática EJEMPLO 1 Pruebas de Estabilidad Se prepararon las siguientes composiciones de las formulaciones FP1 a FP8: FP1: polisorbato 80 (0.03% (peso/volumen (p/v))), glicina (0.5% (p/v)), regulador de pH 20 (mmoles/l), NaCI (100 mmoles/l). FP2: glicina (0.5% (p/v)), glicerol (1.4% (p/v)), regulador de pH de fosfato (32 mmoles/l). FP3: glicina (0.5% (p/v)), Pluronic F69 (0.1% (p/v)), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l), NaCI (90.6 mmoles/l). FP4: sorbitol (4.5% (p/v)), Pluronic F68 (0.1% (p/v)), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l). FP5: dextrana 70 (1% (p/v)), NaCI (123 mmoles/l), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l). FP6: glicerol (2% (p/v)), Pluronic F68 (0.1% (p/v)), NaCI (17.1 mmoles/l), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l). FP7: glicerol (2% /p/v)), PVP K12 (0.5% (p/v)), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l). FP8: PVP K12 (0.5% (p/v)), NaCI (123 mmoles/l), regulador de pH de fosfato (20 mmoles/l). El contenido de EPO en las formulaciones se fijó en 2000 IU/ml o 10000 IU/ml, como se describe más adelante. Las muestras de FP1 a FP8, con un contenido respectivo de EPO de 10000 IU/ml, fueron almacenadas a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes (40). El volumen de EPO en el regulador de pH de fosfato almacenado a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes se tomó como un control positivo (PK) para la determinación del contenido de dímeros de EPO. Las muestras fueron sometidas a SDS-PAGE; se cargaron 0.4 µg en cada carril. La Figura 1 muestra los resultados.

Leyendas de la Figura 1: Carril Muestra 1 carril vacío 2 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? 3 carril vacío 4 EPO-BRP (EPO estándar de la European Pharmacopoeia) 5 FP1 40 6 FP2 40 7 FP3 40 8 FP4 40 9 FP5 40 10 FP6 40 11 FP7 40 12 FP8 40 13 PK 40 14 carril vacío 15 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? La Figura 2 muestra la SDS-PAGE de las muestras de FP1 a FP4, con un contenido de EPO respectivo de 10000 lU/ml, almacenada en el refrigerador (HL) y almacenada a 40°C (+_ 2°C) durante 1 mes (40). El volumen de EPO en el regulador de pH de fosfato almacenado a 40°C (+.2°C) durante 1 mes se tomó como un control positivo (PK) para la determinación del contenido de dímeros de EPO. Se cargaron 0.4 pg en cada carril.

Leyendas de la Figura 2: Carril Muestra 1 carril vacío 2 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? 3 carril vacío 4 EPO-BRP (EPO estándar de la European Pharmacopoeia) 5 FP1 HL 6 FP2 HL 7 FP3 HL 8 FP4 HL 9 FP1 40 10 FP2 40 11 FP3 40 12 FP4 40 3 P K 14 carril vacío 15 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? La Figura 3 muestra la SDS-PAGE de las muestras de FP5 a FP8, con un contenido de EPO respectivo de 10000 lU/ml, almacenada en el refrigerador (HL) y almacenada a 40°C (+_ 2°C) durante 1 mes (40). El volumen de EPO en el regulador de pH de fosfato almacenado a 40°C (+_ 2°C) durante 1 mes se tomó como un control positivo (PK) para la determinación del contenido de dímeros de EPO. Se cargaron 0.4 µ9 en cada carril.

Leyendas de la Figura 3: Carril Muestra 1 carril vacío 2 estándares de W de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? 3 carril vacío 4 EPO-BRP (EPO estándar de la European Pharmacopoeia) 5 FP5 HL 5 FP6 HL 7 FP7 HL 8 FP8 HL 9 FP5 40 10 FP6 40 11 FP7 40 12 FP8 40 13 PK 40 14 carril vacío 15 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? La Figura 4 muestra la SDS-PAGE de las muestras de FP1 a FP8, con un contenido de EPO respectivo de 10000 lU/ml, almacenada en el refrigerador (HL) durante 10 semanas. El volumen de EPO en el regulador de pH de fosfato almacenado a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes se tomó como un control positivo (PK) para la determinación del contenido de dímeros de EPO. Se cargaron 0.4 pg en cada carril.

Leyendas de la Figura 4: Carril Muestra 1 carril vacío 2 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? 3 carril vacío 4 EPO-BRP (EPO estándar de la European Pharmacopoeia) 5 FP1 HL 6 FP2 HL 7 FP3 HL 8 FP4 HL 9 FP5 HL 10 FP6 HL 11 FP7 HL 12 FP8 HL 13 PK 14 carril vacío 15 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Blo-Rad, carga de 4 µ? La Figura 5 muestra la SDS-PAGE de las muestras de FP1 a FP8, con un contenido de EPO respectivo de 10000 lU/ml, almacenada a 25°C (+_ 2°C) durante 10 semanas (25). El volumen de EPO en el regulador de pH de fosfato almacenado a 40°C (+. 2°C) durante 1 mes se tomó como un control positivo (PK) para la determinación del contenido de dímeros de EPO. Se cargaron 0.4 pg en cada carril.

Leyendas de la Figura 5: Carril Muestra 1 carril vacío 2 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? 3 carril vacío 4 EPO-BRP (EPO estándar de la European Pharmacopoeia) 5 FP1 25 6 FP2 25 7 FP3 25 8 FP4 25 9 FP5 25 10 FP6 25 1 FP7 25 12 FP8 25 13 PK 14 carril vacío 15 estándares de MW de SDS-PAGE preteñido, baja escala, Bio-Rad, carga de 4 µ? La Figura 6 muestra la respuesta relativa EPO-ELISA (en %) de las muestras de FP1 a FP8, con un contenido de EPO respectivo de 10000 lU/ml, almacenado a 40°C (+ 2°C) durante 1 mes (40), con las muestras de FP1 a FP8 almacenadas en el refrigerador durante 1 mes (HL). La Figura 7 muestra la respuesta relativa de EPO-ELISA (en %) de las muestras de FP1 a FP8, con un contenido de EPO respectivo de EPO 10000 lU/ml, almacenadas a 24°C (+ 2°C) durante 10 semanas (25), con las muestras de FP1 a FP8, almacenadas en el refrigerador durante 10 semanas (HL).

Resultados de pruebas de estabilidad La SDS-PAGE con inmunodetección muestran que los agregados de EPO, por ejemplo, dímeros de EPO y sustancias relacionadas de masa molecular más alta, no ocurren en la composición farmacéutica de la presente invención (FP6) a temperatura ambiente (Figuras 1-5). A temperaturas elevadas, están presentes en pequeñas cantidades. La comparación de la estabilidad de EPO a temperatura elevada (1 mes a 40°C) de la composición farmacéutica de la presente invención con la composición farmacéutica FP1, en donde la combinación de polisorbatos y el aminoácido glicina se utiliza (Figura 1, 2, 3), muestra que se forman dímeros de EPO en FP1. La formación de dímeros de EPO es uno de los factores cruciales para la estabilidad de EPO. También es posible que los agregados de EPO, por ejemplo, los dímeros de EPO y sustancias relacionadas de masa molecular más alta medida, ocasionan efectos laterales no deseados después de la aplicación y no comodidad del paciente tratado con la composición farmacéutica. También es posible que estos agregados ocasionen una respuesta inmunológica del organismo y el tratamiento con EPO tenga que ser detenido. La composición farmacéutica de la presente invención (FP6) en comparación con otras composiciones farmacéuticas preparadas (FP1-FP5, FP7, FP8) a temperatura elevada (40°C, 1 mes; Figura 6) muestra que la adsorción de EPO en los frascos de FP6 es menor o igual cuando se compara con otras formulaciones. A temperaturas ambientes, las adsorciones son comparables o mejores (Figura 7). Una adsorción incrementada en los frascos pudiera reducir la estabilidad de EPO, y toda la actividad biológica puede ser disminuida. Se han utilizado aminoácidos como agentes de estabilización de EPO en las formulaciones descritas en la técnica anterior. Pero los aminoácidos no siempre exhiben un efecto de estabilización sobre EPO. En las Figuras 6 y 7 se puede ver que la estabilidad a temperatura ambiente (25°C, 10 semanas) y a temperaturas elevadas (40°C, 1 mes) de las composiciones farmacéuticas FP2 y FP3 que comprenden glicina, es menor que la estabilidad de las preparaciones farmacéuticas FP4, FP5, FP6 y FP8, que no contienen glicina, y también es menor que FP1 que comprende glicina. Una alta estabilidad de EPO puede ser obtenida con el uso de la combinación correcta de diferentes agentes de estabilización, pero su composición apropiada no puede ser pronosticada. Con la composición farmacéutica de la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que la combinación de un poloxámero poliol (copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno) y alcohol polihídrico, estabilizaron la EPO. La proporción de dímero de EPO y sustancias relacionadas de masa molecular más alta medida a través de SEC se comparó con soluciones diluidas de las muestras (a una concentración de 2%). Los resultados del ensayo límite se presentan en el Cuadro 1 a continuación.

CUADRO 1 * denota que la determinación de la proporción de dimeros no fue posible debido a los polisorbatos de placebo. ** denota que la determinación de la proporción de dimeros no fue posible debido a la dextrana.

También se detectaron pequeñas cantidades de sustancias relacionadas con masa molecular más alta en la mayoría de las muestras, pero no se incluyeron en la presentación. La actividad biológica in vivo se midió en la muestra FP6 con un contenido de EPO de 10000 IU/ml, almacenada a 25°C durante 10 semanas. Los resultados obtenidos se presentan en el Cuadro 2 a continuación.

CUADRO 2 Los resultados muestran que la actividad biológica estimada está en la escala demanda y corresponde a las demandas de Eur. Ph. Los límites confidenciales también están en la escala de mandada.

EJEMPLOS 2 Y 3 Composiciones de composiciones farmacéuticas de EPQ Las composiciones de la invención (composiciones farmacéuticas presentadas en) Ejemplos 2. y 3 se establecen en los Cuadros 3 y 4, respectivamente.

CUADRO 3 CUADRO 4 Calidad de las sustancias Epoyetina: calidad según demandada por European Pharmacopoeia (pH. Eur. quality), Pluronic F68, Sorbitol, Glicerol, NaCI, Na2HP04 x2H20, NaH2P04 x2H20, NaOH, agua para inyección: PH. Eur. quality.

Preparación de composición farmacéutica que comprende EPO Preparación de solución de placebo con Pluronic F68: En el agua para inyección a temperatura ambiente entre el mezclado en el regulador de pH con agitador magnético (Na2HP04 x2H20, NaH2P04 x2H20) primero se disolvió con NaCI, uno del poliol (glicerol o sorbitol) y al final el agente de estabilización Pluronic F68 fue agregado. Después, el pH se ajustó con 1 M de NaOH a 7.0-7.1. Se obtuvo una solución clara y sin color. Preparación de la solución de EPO: El volumen calculado de la solución de EPO (los cálculos se realizaron considerando la actividad de EPO) se agregó a la solución de placebo. Justo antes de este paso, el mismo volumen de solución de placebo se retiró. La solución se agitó utilizando un agitador magnético a bajas revoluciones. Se obtuvo una solución clara incolora. La soluciones de las composiciones farmacéuticas que comprenden EPO a ambas concentraciones después fueron asépticamente filtradas en forma estéril (nivel de limpieza del aire de clase 100) a través de un filtro de membrana con una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno), tamaño de poro 0.2 µ? , y 0.8 mi de las soluciones filtradas se colocaron como relleno es frascos de 2 mi (frascos del tipo I hidrolítico de vidrio tubular incoloro) lavados y esterilizados, y cerrados con cierres elásticos de hule de bromobutilo, y sellados con tapas de aluminio.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. - Una composición farmacéutica estable de eritropoyetina (EPO), en donde la composición comprende: a. una cantidad terapéuticamente efectiva de EPO, b. un sistema regulador de pH farmacéuticamente aceptable, c. un poloxámero poliol, y d. un alcohol polih ¡drico.

2. - La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición está libre de aditivos derivados de origen humano y/o animal.

3. - La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición opcionalmente comprende: e. un agente de isotonificación, y/o f. uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

4. - La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición es acuosa.

5. - La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cantidad farmacéutica de EPO se formula para proporcionar una cantidad por dosis en la escala de 500 a aproximadamente 100000 IU de EPO.

6. - La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la cantidad farmacéutica se formula para proporcionar una cantidad por dosis seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 1000 IU, aproximadamente 2000 IU, aproximadamente 3000 IU, aproximadamente 4000 11), aproximadamente 10000 IU, aproximadamente 20000 IU, aproximadamente 25000 IU, aproximadamente 40000 IU, aproximadamente 50000 IU, aproximadamente 60000 IU, y aproximadamente 100000 IU. 7.- La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sistema regulador de pH proporciona una escala de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. 8.- La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el sistema regulador de pH proporciona la escala de pH de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.5. 9. - La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el sistema regulador de pH proporciona un pH de aproximadamente 7.0. 10. - La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el sistema regulador de pH es un regulador de pH de fosfato. 11. - La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el poloxámero poliol se selecciona del grupo de agentes activos en la superficie no iónicos. 12. - La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el poloxámero poliol es Pluronic F68. 13. - La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el poloxámero poliol está comprendido en una escala de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 0.5%. 14.- La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la concentración de poloxámero poliol es de aproximadamente 0.1%. 15.- La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el alcohol polihidrico se selecciona del grupo que comprende glicerol, sorbitol, manitol y/o xilitol. 16.- La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el alcohol polihidrico es glicerol. 17.- La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la concentración de alcohol polihidrico está en la escala de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%. 18. - La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la concentración de alcohol polihidrico está en la escala de aproximadamente 2% a aproximadamente 5%. 19. - La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el agente de isotonificación se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas. 20. - La composición de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el agente de isotonificación es NaCI. 21. - Un procedimiento para preparar una composición que contiene eritropoyetina (EPO), que comprende mezclar la EPO con un poloxámero poliol y un alcohol polihidrico, en donde se prepara la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20. 22.- El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades seleccionadas de anemia de enfermedad maligna, es decir, cualquier tipo de cáncer sólido o cáncer hematologico incluyendo leucemia, linfoma y mieloma múltiple, anemia que resulta de un tratamiento quimioterapéutico/radiación de una enfermedad maligna, anemia de enfermedad crónica incluyendo, por ejemplo, enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide y hepatitis, anemia en pacientes con SIDA, especialmente aquellos tratados con AZT, anemia de prematuros, anemia asociada con falla renal (crónica), anemia de talasemia, anemia hemolítica autoinmune, anemia aplástica, y anemia asociada con cirugía, el tratamiento de fatiga, dolor, falla cardiaca crónica, disritmia o demencia, uso preoperatorio para reducir la necesidad de transfusión de sangre alogénica en cirugía no vascular y no cardiaca.