JP2005535673A

JP2005535673A - エリスロポイエチンを含む安定な薬剤組成物

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Publication number: JP2005535673A
Application number: JP2004521371A
Authority: JP
Inventors: ビクミロビイツチ，アンドレイア; ローズマン，ターニヤ; スベテツク，イエルカ; パリ，アレンカ
Original assignee: レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-11-24
Also published as: MXPA05000662A; US20050202091A1; US7534870B2; SI21258A; EP1524998A1; WO2004006958A1; AU2003251284B2; AU2003251284B9; ATE499114T1; WO2004006958A8; DE60336142D1; CN1668333A; CA2492485A1; AU2003251284A1; EP1524998B1

Abstract

本発明はポロキサマーポリオールと多価アルコールの組合せを用いて安定化されたエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の新規な安定した薬剤組成物を提供する。

Description

本発明はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む新規な安定した薬剤組成物に関係する。

ＥＰＯは哺乳動物における赤血球の形成を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、骨髄における赤血球系前駆細胞に対する成長及び／又は分化因子として作用し、これらの前駆細胞の増殖及び赤血球への分化をもたらす。

天然に生じるヒトＥＰＯは、腎臓で産生され、赤血球生成を刺激する体液性血漿因子である。ＥＰＯは、骨髄における委任赤血球系前駆体の分裂及び分化を刺激する（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９、４２０２−４２１１、１９７４年、Ｓｈｅｒｗｏｏｄｅｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）。ＥＰＯは成体の腎臓（Ｓｈｅｒｗｏｏｄｅｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）及び胎児の肝臓（Ｚａｎｊａｎｉら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８９、６４０−６４４、１９７７年）において産生される。

生体へのＥＰＯの薬剤組成物の投与は赤血球の生成を刺激及び／又は促進する。ＥＰＯの薬剤組成物は、慢性腎不全、癌における化学療法による治療に続発性の貧血、及びヒト免疫不全性ウイルス感染症のジドブジン治療と連合した貧血の治療、ならびに他の種類の貧血の治療に使用される（Ｄａｎｎａら、臨床用途におけるエリスロポイエチン−国際的展望（ＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ：ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ；３０１−３２４、１９９０年；Ｅｓｃｈｂａｃｈｉｎｓｏｄ．、Ｎ．ＥｎｇｌａｎｄＪ．ｏｆＭｅｄ．、３１６、２、７３−７８、１９８７年；Ｋｒａｎｅ、ＨｅｎｒｙＦｏｒｄＨｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．、３１、３、１７７−１８１、１９８３年）。

哺乳動物細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝子の発現の生成物である組換えＥＰＯがＥＰＯの薬剤組成物において使用されている（ＥＰ第１４８６０５号、ＥＰ第２０５５６４号、ＥＰ第２５５２３１号）。また、幾つかのＥＰＯ類似体及び誘導体も当技術分野において開示されている：ＥＰ第６４０６１９号、ＥＰ第６６８３５１号、ＷＯ第９４１２６５０号、ＥＰ第１０６４９５１号、ＷＯ第０２３２９５７号、ＷＯ第９５３３０５７号、ＵＳ第５９１６７７３号、ＷＯ第０９９０２７１０号、ＵＳ第５５８０８５３号、ＵＳ第５７４７４４６号、ＵＳ第５９１９７５８号及びＵＳ第６１０７２７２号。

ヒト血清アルブミンを含むＥＰＯの薬剤組成物が：ＥＰ第１７８６６５号、ＥＰ第１７８５７６号、ＵＳ第５６６１１２５号、ＷＯ第００６１１６９号に開示されている。ヒト血清アルブミンはアレルギー反応を引き起こす可能性がある（ＳｔａｆｆｏｒｄＣＴら、ＡｎｎＡｌｌｅｒｇｙ、６１（２）、８５−８８、１９８８年）。その上、薬剤組成物がヒト血液製剤を含んでいるときにはウイルスに感染する危険性が存在する。従って、安定しており、アルブミンなどのヒト血液製剤を含まないＥＰＯの薬剤調合物が必要とされている。

ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第５２８３１４号は、ＥＰＯ安定剤として尿素を用いる薬剤組成物を開示している。

ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第１７８６６５号、ＧＢ第２１７１３０４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第１００２５４７号はＥＰＯの凍結乾燥調合物を開示している。

ＵＳ第５３７６６３２号は、アルファ及びベータシクロデキストリンを使用した薬剤調合物を開示している。

ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第１７８６６５号におけるＥＰ第５２８３１３号は、ベンジルアルコール、パラベン、フェノール及びこれらの混合物などの抗菌保存剤を含むＥＰＯの水性薬剤組成物を開示している。

ＥＰ第９０９５６４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第４３０２００号及びＷＯ第００６１１６９号は、安定剤としてアミノ酸及び／又はアミノ酸と非イオン性界面活性剤の組合せの使用を開示している。

ＷＯ第０１８７３２９号は、ポリエチレングリコール化（ペグ化）されたＥＰＯ類似体の種々の異なる薬剤組成物を開示している。ここで開示されている薬剤組成物は、実質的に硫酸塩緩衝剤の使用に基づくものである。

ＲＵ第２１２８５１７号、ＷＯ第００６１１６９号、ＥＰ第５２８３１３号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第１７８６６５号：において開示されているＥＰＯの幾つかの薬剤組成物はクエン酸塩緩衝剤中において調製される。

本発明の目的は、ＥＰＯを有益に安定化させることができる、ＥＰＯを含む薬剤組成物を提供することである。

本発明は、請求項１に記載の、ＥＰＯを含む新規な安定した薬剤組成物を提供する。好適な実施態様は従属項で説明されている。また、請求項２１に記載のプロセス、及び請求項２２に記載の使用も提供する。

本薬剤組成物は、医薬適合性のｐＨ緩衝系と共に調合され、２種類の安定剤の組合せ：ポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）及び多価アルコール；を含む。

ＥＰＯの安定化は、本発明の組成物が好適には人間または動物起源から誘導されたＥＰＯ以外の添加剤（例えば血清タンパク質）を含まない状態でありながら達成される。本薬剤組成物は、等張化剤及び／又は１つもしくはそれ以上の医薬適合性の賦形剤を場合によって更に含む。本発明の薬剤組成物は人間及び獣医学において使用するのに適しており、適切な投与形態において、特に非経口的適用、例えば筋肉内、皮下及び／又は静脈内適用に対して医薬適合性である。一つの特に好適な実施態様では、本発明の薬剤組成物は液体の形態、より好適には水溶液の形態を為している。

驚くべきことに、非イオン性界面活性剤ポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）及び多価アルコールを含み、好適にはＥＰＯ以外には人間及び／又は動物起源から誘導された添加剤を含まない薬剤組成物はＥＰＯを有益に安定化させることが判明した。

本発明は：
ａ．治療学的に有効量のＥＰＯ、
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、
ｃ．ポロキサマーポリオール及び
ｄ．多価アルコール
を含む、ＥＰＯの薬剤組成物を提供する。

また、本発明は、成分ａ−ｄに加え：
ｅ．等張剤及び／又は
ｆ．１つまたはそれ以上の他の薬学的に許容し得る賦形剤
を場合によって更に含む、ＥＰＯの薬剤組成物も提供する。

本発明の組成物は、好適には人間または動物起源から誘導された添加剤を含んでいない。

「エリスロポイエチン（ＥＰＯ）」という用語は、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生成を高めさせるインビボにおける生物学的活性を有するタンパク質を表し、ヒトＥＰＯ及び誘導体ならびに類似体からなるグループから選択され、これらについては以下で定義される。

「治療学的に有効量のＥＰＯ」という用語は、ＥＰＯの治療学的な効果を可能にする量のＥＰＯを表す。

「安定剤」という用語は、ＥＰＯに対する安定化効果を有する薬学的に許容し得る賦形剤を表す。

「ＥＰＯ安定性」という用語は、ＥＰＯ含量の維持及びＥＰＯの生物学的活性の維持を表す。ＥＰＯ安定性はとりわけ以下のプロセスにより影響を受け得る：容器壁へのＥＰＯの吸着、ＥＰＯの変性または劣化、及び例えばＥＰＯダイマー及び／又はＥＰＯマルチマー及び／又はもっと高い分子量を有する同様な分子などの凝集体形成。これらのプロセスは、サンプルが例えば比較的高い温度、不適切な容器、誤ったＥＰＯ安定剤の使用、日光、不適切な保管方法及び／又は不適切な単離手順などの種々の異なる条件に晒されることにより起こる。

「人間及び／又は動物起源から誘導された添加剤を含まない」という用語は、人間及び／又は動物に由来し、ＥＰＯとは異なるＨＳＡまたはＢＳＡのような血清アルブミンなどの添加剤が本組成物に意図的に加えられていない状態、または、ＥＰＯ調製物中に元々存在している場合には、前述の添加剤が、ＥＰＯの精製及び／又は単離中に、不可避的な痕跡量のレベルにまで、好適には標準的な分析方法によって典型的には検出できないレベルにまで分離または低減されている状態を表す。

驚くべきことに、本発明の組成におけるＥＰＯの調合は、冷蔵庫内の温度（例えば２から８℃）以上の温度、特に室温（即ち、２５℃以下）、更には比較的高い温度（例えば４０℃）においてさえ、安定性を改善することが判明した。これは、本組成物が、有意な量の活性を失うことなく、及び有意な劣化を伴うことなく、冷却せずに長期間（室温で１０週間以上）保管できることを意味している。

従って、本発明の薬剤組成物は、この様式に限定されるものではないが、好適には前述の構成成分ａ．−ｄ．のみ、または場合によってａ．−ｅ．、ａ．−ｄ．プラスｆ．、もしくはａ．−ｆ．からなっていてよい。

先行技術から既知の幾つかの薬剤組成物においては、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０のような非イオン性界面活性剤がＥＰＯの安定剤として使用されている。ポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）及び／又は多価アルコールの使用は、ＥＰＯダイマー、ＥＰＯマルチマー、及びＥＰＯ分子の凝集から生じるもっと高い分子質量を有する関連物質を決定するための分析法としてゲル濾過法を用いることができるため、ポリソルベートを用いる場合よりも有利である。ポリソルベートは、ＥＰＯダイマーと同じ時間で溶出される。それ故、ポリソルベートを含む薬剤組成物の場合には、ＥＰＯダイマーに対する検出法としてゲル濾過法を使用することができない。従って、ポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）と多価アルコールの組合せの使用は、ＥＰＯ安定性をもたらす一層簡単な様式、高められた安全性、及びＥＰＯの薬剤組成物の質の一層簡単な制御に寄与する。

本発明の薬剤組成物は好適には液体、特に水性の薬剤組成物である。このような液体組成物は、ＥＰＯの生物学的活性の低下を招く可能性があり、更には消失させることさえあり得る再構成、希釈または付加的な調製ステップを伴うことなく、皮下、静脈内または筋肉内適用などの非経口的な適用で直接的に使用することができ、また、適用時に生じる付加的な技術的問題を回避することにも寄与することができる。従って、液体薬剤組成物の使用は、凍結乾燥調合物を使用する場合よりも実用的である。ＥＰＯの液体、特に水性調合物は、凍結乾燥組成物の再構成プロセスが時間の掛かるプロセスであり、このタンパク質調合物を不適切に取り扱う危険性をもたらし、または不適切に再構成される可能性があり、更にこの薬剤の充分な活性を保持するために通常は安定剤などの特定の添加剤を必要とするため、ＥＰＯの臨床的調合物を調製する上で、凍結乾燥調合物よりも一般的に好適である。

本発明の薬剤組成物は、最も好適には、血液スクリーニングにもかかわらず伝染性物質での感染の危険性をもたらすヒト血清タンパク質のような人間または動物起源から誘導された添加剤を含んでいない。更に、組換えＥＰＯは一般的に良好に許容されるが、時折、このＥＰＯ調合物のある成分に対するアレルギー性過敏症を示唆する皮膚発疹及び蕁麻疹が観測されており、この成分はヒト血清アルブミンである可能性が高い。

本発明の薬剤組成物は好ましくは等張液中において調製することができ、薬学的に許容可能であり、アレルギー性過敏症のような副作用をもたらさないことが期待される。

本発明の薬剤組成物は、ＥＰＯの生物学的活性にかかわりなく、更には合成または製造方法にかかわりなく、ＥＰＯアルファ、ＥＰＯベータ、ＥＰＯオメガ、及び種々の異なるイソ型プロフィールを有する他のＥＰＯ調製物を含むあらゆる形態のＥＰＯに対して、ならびに特定のＥＰＯイソ型、ＥＰＯムテイン、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯダイマーなどのＥＰＯ類似体、ＮＥＳＰ（組換えヒトＥＰＯの超グリコシル化類似体）、遺伝子活性化ＥＰＯ、ペグ化ＥＰＯ、ＥＰＯとのハイブリッド分子、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯとの融合タンパク質（オリゴマー及びマルチマー）、及び修飾されたグリコシル化プロフィールを有するＥＰＯに対して使用することができ、上述の合成または製造方法は、これらに限定するものではないが、天然に生じたＥＰＯ及び（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのどちらから生成されたかにかかわりなく）組換えＥＰＯの単離、合成による方法、形質転換による方法及び遺伝子活性化による方法を含むことができる。

本発明の薬剤組成物は、１回の用量当たり５００単位から１０００００単位まで、またはそれ以上のＥＰＯ（１ＩＵは約１０ナノグラムの組換えＥＰＯに相当する）を含んでいてよい。一般的に、有効量は、特にＥＰＯが皮下的に与えられる場合には、１ＩＵ／ｋｇ体重から５００ＩＵ／ｋｇ体重まで、より好適には５０ＩＵ／ｋｇ体重から３００ＩＵ／ｋｇ体重までであろうと推測される。有効量は、更に、治療される被検者の種及びサイズ、治療される個々の状態または疾患及びそれの重症度、ならびに投与経路に依存する。好適な実施態様では約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ、約４００００ＩＵ、約５００００ＩＵ、約６００００ＩＵ及び約１０００００ＩＵからなるグループから選択される１回の用量当たりの量をもたらすべく、薬学的な量が調合される。

本発明の薬剤組成物はアンプル、注射器、多回用量カートリッジ及びバイアルに充填することができる。これらは、１回の用量当たり０．２ｍｌから２０ｍｌまでの適切な範囲における容量での適用を可能にする。

これらの溶液に対する好適なｐＨ範囲は約６から約８までであり、約６．８から約７．５までの範囲がより好適であり、約７．０のｐＨが最も好適である。リン酸塩緩衝系、特にＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ／Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏなどのリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの使用が好適である。約６から約８までの望ましいｐＨ範囲を維持するのに適した他の緩衝系は、これらに限定するものではないが、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、及び当該技術分野において既知の他のあらゆる薬学的に許容し得るｐＨ緩衝剤を含む。クエン酸塩緩衝剤は注入部位に痛みをもたらす可能性がある。従って、非経口的な適用ではリン酸塩緩衝剤の方が好適である。

ｐＨ緩衝系、特にリン酸塩緩衝剤の濃度は本調合物の望ましいｐＨに依存する。好適な濃度は１０ｍＭから５０ｍＭまで、より好適には１５ｍＭから３５ｍＭまで、最も好適には１５ｍＭから２５ｍＭまでの範囲である。ｐＨ調節剤、例えば、これらに限定するものではないが、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、クエン酸またはクエン酸ナトリウムなどが加えられてよい。

本発明の薬剤組成物は、非イオン性界面活性剤ポロキサマーポリオールと多価アルコールの組合せを含む。ポロキサマーポリオールの中でもＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８が好適に使用される。ポロキサマーポリオールの好適な濃度は１％（ｍ／ｖ）までの範囲、より好適には０．０５％（ｍ／ｖ）から０．５％（ｍ／ｖ）までの間、最も好適には０．１％（ｍ／ｖ）である。多価アルコールはグリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどからなるグループから選択される。これらの中でも好適にはソルビトール及びグリセロールが使用され、最も好適にはグリセロールが使用される。多価アルコールの好適な濃度は０．１％（ｍ／ｖ）から１０％（ｍ／ｖ）までの間の範囲、より好適には０．５％（ｍ／ｖ）から６％（ｍ／ｖ）までの間、最も好適には１％から３％（ｍ／ｖ）までの間の範囲を含む。

本発明の薬剤組成物は、本発明の調合物をヒト血液と等浸透圧に為すことができる物質を場合によって更に含む。典型的な適切な等張化剤は当該技術分野において広く知られており、これらに限定するものではないが、マンニトール、グリシン、グルコース、及びＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２などの無機塩からなるグループから選択される物質を含む。本発明の調合物における等張化剤としてＮａＣｌを使用することが好適である。

上述のように、ＥＰＯ安定剤としてポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）と多価アルコールの組合せを伴う調合物が好適であるが、本発明の薬剤組成物は、望ましい場合には、前述の成分ａ．、ｂ．及び場合によってｅ．ならびにｆ．のほかに、１つより多くのタイプの安定剤を場合によって含んでよい。

この付加的なＥＰＯ安定剤は、好適には、グリコール及びグリセロールエステル、マクロゴールエステル及びエーテル、ソルビタン誘導体／ポリソルベート（例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、ならびにポリマー（ＰＶＰ）などの界面活性剤を含むグループから選択される。これらの中でもとりわけ、濃度が１％までのポリマーが好適である。最も好適なものは濃度が０．５％のポリマーＰＶＰＫ１２である。

本発明の薬剤組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容し得る賦形剤を場合によって更に含んでよい。薬学的に許容し得る適切な賦形剤は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、及びグリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−２−フェニルアラニン、Ｌ−トレオニンなどのアミノ酸を含む。

本発明の組成物はＥＰＯを必要とする疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するために使用することができる。医学的な用途の例は、赤血球増殖（ＲＢＣ）の刺激が望まれる場合や、内因性ホルモン欠損症が存在する場合、失血している場合、または患者が貧血の徴候を有している場合、もしくは患者が内在ホルモンに対する骨髄の低応答性を有している場合などにおける様々な療法を含む。これらの医学的な適応は、例えば悪性疾患（即ち、あらゆるタイプの充実性癌、または白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む血液癌）の貧血、悪性疾患の化学療法／放射線療法による治療に由来する貧血、例えばリウマチ様関節炎及び肝炎などの自己免疫疾患を含む慢性疾患の貧血、ＡＩＤＳ患者、特にＡＺＴによる治療を受けているＡＩＤＳ患者における貧血、早産の貧血、（慢性）腎不全との関連性を有する貧血、タラセミアの貧血、自己免疫性溶血性貧血、無形成性貧血、及び（例えば、実質的な失血を阻止すべくヘモグロビンレベルを刺激及び増加するために行われる、または骨髄移植を受ける被検者の赤血球生成を増大させるために行われる自己輸血用の術前供血を改善するための）手術との関連性を有する貧血、疲労、疼痛、慢性心不全、律動異常または痴呆の治療、非血管及び非心臓手術における同種異系輸血の必要性を低減するための術前使用、ならびにＥＰＯを必要とする他の適応症である。

以下の実施例により本発明を例証するが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない。

分析方法
以下の分析法を用いて本発明の薬剤組成物を分析した：免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ、及びマウスでのインビボにおける生物学的活性アッセイ。

免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ：還元剤を含まないローディング緩衝液中においてローディングサンプルを調製した。垂直式ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた：ゲルＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％、８×８ｃｍ、厚み１．０ｍｍ、ＭＯＰＳＳＤＳ電気泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中における１５レーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。電気泳動は、２００Ｖの一定電圧で１時間実行した。ゲルからニトロセルロース膜へのエレクトロトランスファー後、免疫学的検出を２段階で実施した。最初のステップでは一次抗体（抗−ｈｕＥＰＯ、マウス、モノクローナル）を使用した。第二ステップでは、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された二次抗体（抗−マウスＩｇＧ、ウサギ、ポリクローナル）を用いた。ペルオキシダーゼ基質の付加は酵素反応を惹起し、青色に着色された複合体を形成する。

ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ：システムＥＰＯ−ＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＩＶＤ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）は二重抗体サンドイッチ法に基づいている。ＥＰＯに特異的なモノクローナル（マウス）抗体で予め被覆されたマイクロプレートウェルを試料または標準と共にインキュベートする。ＥＰＯはプレート上の固定化抗体に結合する。試料または標準の除去後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された抗−ＥＰＯポリクローナル（ウサギ）抗体と共にインキュベートする。この二回目のインキュベーション中に、抗体−酵素接合体が上述の固定化されたＥＰＯに結合する。色原体がウェルに加えられ、酵素反応により酸化されて青色に着色した複合体を形成する。この発生した色の量は、ＥＰＯ抗体複合体に結合された接合体の量に直接的に比例し、これは、更に、試料または標準中のＥＰＯの量に直接的に比例する。

ＳＥＣ：ＳＥＣを用いて、２０００ＩＵ／ｍｌから１００００ＩＵ／ｍｌまでのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプル中におけるＥＰＯダイマー及びもっと高い分子質量を有する関連物質の割合を決定した。ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのプロトコルによる限界アッセイを用いた（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２００２年、第４版、エリスロポイエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ））。

インビボにおける生物学的活性：
低酸素症マウスでの生物学的活性をインビボにおいて決定するためのＥｕｒ．Ｐｈに記載されているプロトコルを用いた。生物学的活性の推定もＥｕｒ．Ｐｈからのプロトコルの下で実施した（Ｅｕｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ−１９９７年；生物学的なアッセイ及び試験の結果の統計解析；平行線モデル（ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｅｓｕｌｔｓｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓａｙｓａｎｄＴｅｓｔｓ；Ｔｈｅｐａｒａｌｌｅｌ−ｌｉｎｅｍｏｄｅｌ））。Ｅｕｒ．Ｐｈの要求の下では、生物学的活性の推定値はマークされた活性の８０％から１２０％までの間の範囲に入っていなければならない。本方法の目的は、注入されたＥＰＯの含量（値）（１００００ＩＵ／ｍｌ）に関して８０％から１２０％までの間の範囲に到達することであり、得られた結果は生物学的活性の推定値であって正確な値ではない。信頼限界はマークされた活性の６４％から１５６％までの間の範囲に入っていなければならない。

ＥＰＯの薬剤組成物の安定性試験条件
ＨＬ−対照標準：２℃から８℃、冷蔵庫
４０：４０℃±２℃、相対湿度７５％±５％、気候室
２５：２５℃±２℃、相対湿度６０％±５％、気候室
（実施例１）
安定性試験
調合物ＦＰ１からＦＰ８までの以下の組成物を調製した：
ＦＰ１：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（０．０３％（重量／容量（ｗ／ｖ））、グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤２０（ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ２：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、グリセロール（１．４％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（３２ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ３：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（９０．６ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ４：ソルビトール（４．５％（ｗ／ｖ））、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ５：デキストラン７０（１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ６：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１７．１ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ７：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、ＰＶＰＫ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ８：ＰＶＰＫ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）。

これらの調合物におけるＥＰＯの含量は、以下で説明されているように、２０００ＩＵ／ｍｌまたは１００００ＩＵ／ｍｌに設定される。

それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルを４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した（４０）。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した；各レーンに０．４μｇがローディングされた。図１はこれらの結果を示している。

図１の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１４０
６：ＦＰ２４０
７：ＦＰ３４０
８：ＦＰ４４０
９：ＦＰ５４０
１０：ＦＰ６４０
１１：ＦＰ７４０
１２：ＦＰ８４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。

図２は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ４までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。

図２の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ＨＬ
６：ＦＰ２ＨＬ
７：ＦＰ３ＨＬ
８：ＦＰ４ＨＬ
９：ＦＰ１４０
１０：ＦＰ２４０
１１：ＦＰ３４０
１２：ＦＰ４４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。

図３は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ５からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。

図３の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのＥＰＯ標準）
５：ＦＰ５ＨＬ
６：ＦＰ６ＨＬ
７：ＦＰ７ＨＬ
８：ＦＰ８ＨＬ
９：ＦＰ５４０
１０：ＦＰ６４０
１１：ＦＰ７４０
１２：ＦＰ８４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。

図４は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。

図４の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ＨＬ
６：ＦＰ２ＨＬ
７：ＦＰ３ＨＬ
８：ＦＰ４ＨＬ
９：ＦＰ５ＨＬ
１０：ＦＰ６ＨＬ
１１：ＦＰ７ＨＬ
１２：ＦＰ８ＨＬ
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。

図５は、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。

図５の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａのＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１２５
６：ＦＰ２２５
７：ＦＰ３２５
８：ＦＰ４２５
９：ＦＰ５２５
１０：ＦＰ６２５
１１：ＦＰ７２５
１２：ＦＰ８２５
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。

図６は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１ヶ月間４０℃（±２℃）で保管（４０）された、それぞれＥＰＯ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。

図７は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれＥＰＯ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。

安定性試験の結果：
免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥは、本発明の薬剤組成物（ＦＰ６）の場合、室温において、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子質量を有する関連物質などのＥＰＯ凝集体が生じないことを示している（図１−５）。高められた温度の場合には、凝集体が少量存在する。高められた温度（４０℃で一ヶ月間）における本発明の薬剤組成物のＥＰＯ安定性と、ポリソルベートとアミノ酸グリシンの組合せを用いた薬剤組成物ＦＰ１との比較（図１、２、３）は、ＦＰ１でＥＰＯダイマーが形成されることを示している。ＥＰＯダイマーの形成は、ＥＰＯの安定性にとって一つの決定的なファクターである。また、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子質量が測定される関連物質などのＥＰＯ凝集体は、適用後の望ましくない副作用及びこの薬剤組成物で治療された患者の不快感の原因となる可能性もある。更に、これらの凝集体が生体の免疫応答を引き起こし、ＥＰＯを用いる治療を中止しなければならなくなる可能性もある。

本発明の薬剤組成物（ＦＰ６）は、別な具合に調製された薬剤組成物（ＦＰ１−ＦＰ５、ＦＰ７、ＦＰ８）との高められた温度（４０℃、１ヶ月間；図６）での比較において、ＦＰ６のバイアルへのＥＰＯの吸着が、他の調合物と比較したときに、それ以下または同等であることを示す。室温の場合には、これらの吸着は同様であり、またはもっと良好である（図７）。バイアルへの吸着の増加はＥＰＯの安定性を低減させ、全体的な生物学的活性が低下することとなる。

先行技術において説明されている調合物では、ＥＰＯの安定剤としてアミノ酸が使用されてきた。しかし、アミノ酸は必ずしもＥＰＯに安定化効果をもたらさない。図６及び７において、グリシンを含む薬剤組成物ＦＰ２及びＦＰ３の室温（２５℃で１０週間）及び高められた温度（４０℃で１ヶ月間）における安定性は、グリシンを含んでいない薬剤組成物ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６及びＦＰ８の安定性よりも低く、グリシンを含むＦＰ１よりも低いことが分かる。種々の異なる安定剤の正しい組合せを用いれば高いＥＰＯ安定性を得ることができるが、これらの適切な組成は予測することができない。本発明の薬剤組成物の場合には、驚くべきことに、ポロキサマーポリオール（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）と多価アルコールの組合せがＥＰＯを安定化させることが判明した。

ＥＰＯダイマー及びＳＥＣにより測定されたもっと高い分子質量を有する関連物質の割合をこれらのサンプルの希釈された溶液と（２％の濃度において）比較した。これらの限界アッセイの結果が以下の表１に提示されている：

インビボにおける生物学的活性を、２５℃で１０週間保管された、１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するサンプルＦＰ６で測定した。得られた結果が以下の表２に提示されている：

これらの結果は、生物学的活性の推定値が要求された範囲内にあり、Ｅｕｒ．Ｐｈの要件を満たしていることを示す。信頼限界も要求された範囲内にある。

（実施例２及び３）
ＥＰＯの薬剤組成物の組成
本発明の実施例２及び３（において提示されている薬剤組成物）の組成が、それぞれ表３及び４に示されている。

物質の品質：
エポエチン：ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａによる要求通りの品質（Ｐｈ．Ｅｕｒ．品質）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、ソルビトール、グリセロール、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、ＮａＯＨ、注射用水：Ｐｈ．Ｅｕｒ．品質。

ＥＰＯを含む薬剤組成物の調製
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を伴うプラシーボ溶液の調製：磁気攪拌機で混合しながら、室温における注射用水に先ず緩衝剤（Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ）、次いでＮａＣｌ及びポリオリ（ｐｏｌｙｏｌｙ）（グリセロールまたはソルビトール）のうちの１つを溶解し、最後に安定剤ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を加えた。この後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０−７．１に調節した。透明で無色の溶液が得られた。

ＥＰＯ溶液の調製：ＥＰＯ溶液の計算された容量（計算は、ＥＰＯ活性に関して行われた）を上述のプラシーボ溶液に加えた。このステップの直前に、同じ容量のプラシーボ溶液を採取した。磁気攪拌機を低回転数で用いることにより、この溶液を攪拌した。透明で無色の溶液が得られた。

この後、両濃度でＥＰＯを含む薬剤組成物の溶液を、細孔径が０．２μｍのＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜を用いる膜濾過により、無菌的（クラス１００の空気清潔レベル）に無菌濾過した。０．８ｍｌの濾液を、洗浄及び滅菌された２ｍｌ用バイアル（無色の管状ガラス製加水分解タイプＩからのバイアル）に充填した後、ブロモブチルゴムでできた弾性栓で蓋をし、アルミニウム製のキャップで密封した。

図１は、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した後のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。図２は、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。図３は、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。図４は、冷蔵庫内で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。図５は、２５℃（±２℃）で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。図６は、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管したとき（４０）の本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。図７は、冷蔵庫内で１０週間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、２５℃（±２℃）で１０週間保管したとき（２５）のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。

Claims

エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の安定な薬剤組成物において、当該組成物が：
ａ．治療学的に有効量のＥＰＯ、
ｂ．薬学的に許容し得るｐＨ緩衝系、
ｃ．ポロキサマーポリオール及び
ｄ．多価アルコール
を含む、ＥＰＯの安定な薬剤組成物。
当該組成物が人間及び／又は動物起源から誘導された添加剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
当該組成物が：
ｅ．等張化剤及び／又は
ｆ．１つまたはそれ以上の薬学的に許容し得る賦形剤
を場合によって更に含む、請求項１または２記載の組成物。
当該組成物が水性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
ＥＰＯの薬学的な量が、１回の用量当たり約５００ＩＵＥＰＯから約１０００００ＩＵＥＰＯまでの範囲の量をもたらすべく調合される、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
上記薬学的な量が、１回の用量当たり約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ、約４００００ＩＵ、約５００００ＩＵ、約６００００ＩＵ及び１０００００ＩＵからなるグループから選択される量をもたらすべく調合される、請求項５に記載の組成物。
上記ｐＨ緩衝系が約６から約８までのｐＨ範囲をもたらす、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
上記ｐＨ緩衝系が約６．８から約７．５までのｐＨ範囲をもたらす、請求項７に記載の組成物。
上記ｐＨ緩衝系が約７．０のｐＨをもたらす、請求項７に記載の組成物。
上記ｐＨ緩衝系がリン酸塩緩衝剤である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
上記ポロキサマーポリオールが非イオン性界面活性剤のグループから選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
上記ポロキサマーポリオールがＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８である、請求項１１に記載の組成物。
上記ポロキサマーポリオールが約０．０５％から約０．５％までの範囲で含まれる、請求項１１に記載の組成物。
上記ポロキサマーポリオールの濃度が約０．１％である、請求項１１に記載の組成物。
上記多価アルコールがグリセロール、ソルビトール、マンニトール及び／又はキシリオール（ｘｙｌｉｏｌ）を含むグループから選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
上記多価アルコールがグリセロールである、請求項１５に記載の組成物。
上記多価アルコールの濃度が約０．１％から約１０％までの範囲にある、請求項１５に記載の組成物。
上記多価アルコールの濃度が約２％から約５％までの範囲にある、請求項１５に記載の組成物。
上記等張化剤が無機塩からなるグループから選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
上記等張化剤が塩化ナトリウムである、請求項１９に記載の組成物。
ＥＰＯをポロキサマーポリオール及び多価アルコールと混合することを含み、請求項１から２０までのいずれかの組成物が調製される、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含有する組成物の調製プロセス。
悪性疾患、即ち、あらゆるタイプの充実性癌、または白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む血液癌の貧血、悪性疾患の化学療法／放射線療法による治療に由来する貧血、例えばリウマチ様関節炎及び肝炎などの自己免疫疾患を含む慢性疾患の貧血、ＡＩＤＳ患者、特にＡＺＴによる治療を受けているＡＩＤＳ患者における貧血、早産の貧血、（慢性）腎不全との関連性を有する貧血、タラセミアの貧血、自己免疫性溶血性貧血、無形成性貧血、及び手術との関連性を有する貧血から選択される疾患の治療用及び／又は予防用の薬剤、疲労、疼痛、慢性心不全、律動異常または痴呆の治療用の薬剤、ならびに非血管及び非心臓手術における同種異系輸血の必要性を低減するために手術前に使用される薬剤を調製するための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物の使用。