KR20220035160A - 면역치료 구축물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220035160A
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cancer
immunotherapeutic
construct
tumor
cpg
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KR1020227004329A
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와사나 얀타시
워라폴 응암체르트라쿨
어맨더 런드
모아타즈 레다
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오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티
피디엑스 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

전달 입자, 적어도 하나의 아주반트, 및 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 하나 이상의 치료제/화합물을 포함하는 면역치료 구축물이 본원에 개시된다. 이들 면역치료 구축물은, 예를 들어 넓은 유형의 암을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있는 적응 면역 또는 항암 면역 반응(들)을 생성시킨다. 인간 및 동물에서 암을 예방 및 치료하는 것을 포함한, 면역치료 구축물의 용도가 추가로 개시된다.

Description

면역치료 구축물 및 그의 사용 방법
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에서 수여한 보조금 R44CA217534 및 R43TR001906 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
발명의 분야
본 개시내용은 암 및 기타 질환 및 병태의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 적어도 하나의 치료상 활성제 (종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정함) 및 적어도 하나의 아주반트 (또는 면역자극제)를 함유하는 전달 시스템 (예컨대 입자)을 포함하여, 대상체 자신의 전암 또는 암 세포에서 항원을 활용함으로써 적응 면역을 생성시키는 면역치료 구축물을 포함한다.
면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-L1, PD-1, CTLA-4 등에 대한 억제제는 임상에서 유망한 결과를 보여, 많은 암 유형에 대하여 FDA의 신속한 승인을 받았다. 그러나, 치료는 암 환자의 서브세트 (~10-40%)에서만 작동한다. 반응의 결여는 전형적으로 기존의 항종양 면역 (예를 들어, CD8+ T 세포)의 부재로 인해, 체내에서 항종양 T 세포의 수를 부스트하기 위한 백신의 필요성을 강화한다.
고전적 암 백신은 면역자극제 (아주반트라고 함)와 종양 단백질 (항원이라고 함)을 활용한다. 이상적으로는, 암 세포에만 존재하는 신생항원을 사용해야 한다. 그러나, 이러한 신생항원은 종양 유형과 환자에 따라 광범위하게 다르기 때문에, 각각의 환자에 맞는 맞춤형 백신을 개발하기 어렵고 비용이 많이 든다. 이러한 항원을 확인해야 할 필요성을 피하기 위해, 방사선, 화학요법, 및 조작된 바이러스 예컨대 탈리모젠 라헤르파렙벡 (T-VEC)을 사용하여 종양을 사멸시키고 항원을 방출시켜 계내에서 적응 면역 반응을 촉발하였다. 그러나 이러한 접근법은 면역억제 종양 미세환경에서의 바람직하지 않은 환경 (예를 들어, 산화제라고 하는 화학적 스트레스 요인을 증가시키거나 또는 면역억제 경로를 촉진함으로써 야기됨)을 생성하여 낮은 항종양 T 세포 계수 또는 비효과적인 항종양 T 세포를 초래한다. 또한, 계내 종양 백신 접종 전략은 종양의 면역억제 미세환경 및 표적 세포 (예를 들어, 항원 제시 세포)로의 효과적인 전달을 위한 백신 구성요소를 보유할 수 없다는 문제로 어려움을 겪어왔다.
전술한 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 계내 종양 백신 접종 전략을 활용하는 새로운 부류의 면역치료제를 개발하였다. 계내 종양 백신 접종은 종양에 대항한 전신 적응 면역을 함께 프라이밍하는 면역자극의 존재 하에 종양을 국소적으로 사멸시키고 종양 항원을 방출하는 전략이다. 특정 경우에는, 종양 미세환경 (TME)에 이미 존재하는 종양 항원이 활용된다. 이러한 전략은 기존의 암 백신 개발에서와 같이 종양 (신생)항원을 미리 확인할 필요가 없기 때문에 큰 가능성이 있다. 이것은 또한 독특한 종양 항원 세트가 방출되고 각각의 환자에 대한 특이적 면역을 프라이밍하기 때문에 개인 맞춤형 요법이다.
항원 방출을 유도할 수 있고/거나 면역억제 환경을 조정하여 CD8+ T 세포 레퍼토리를 부스트하고 전신 항종양 면역요법 효과를 유도할 수 있는 화합물 및 아주반트의 공동-전달을 위한 조작된 입자가 본원에 기재되어 있다. 이러한 기술은 면역 반응을 증강하고 종양의 억제 환경을 억제하는 것 (Augmenting Immune Response and Inhibiting Suppressive Environment of Tumors)의 약자로 AIRISE로서 지칭될 수 있다.
항원 방출을 유도할 수 있고/거나 (예를 들어, 암 세포를 사멸시킴으로써 야기됨) 면역억제 환경 (예컨대, 종양 미세환경, TME)을 조정할 수 있는 치료상 활성제(들) 및 아주반트(들)의 공동-전달을 가능하게 하는 조작된 입자에 기초한 새로운 부류의 면역치료제 (일반적으로, 면역치료 구축물)가 본원에 기재되어 있다. 이러한 면역치료 구축물은 또한 TME에 이미 존재하는 항원을 사용할 수 있다. 면역치료 구축물은 어떤 항원(들)이 치료 중인 암과 연관되어 있는지 알 필요 없이, CD8+ T 세포 레퍼토리를 부스트하고 전신 항종양 면역요법 효과를 유도한다. 세포성 면역이 본원에서 광범위하게 기재되지만, 체액성 면역 (항체 생성)이 또한 일정 역할을 하며 동일한 개념을 따른다.
제공된 조작된 면역치료 구축물에 의해 암 세포에 전달되는 치료상 활성제 (예를 들어, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, shRNA, DNA, 기타 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드, 소분자 억제제, 화학요법제, 항체 등)의 예는 암 세포를 사멸시켜, 공동-전달된 아주반트 (예를 들어, CpG, R848, 폴리 I:C 등)는 종양 항원에 대항하여 적응 면역 세포를 프라이밍 및 활성화시키는 동안, 종양 항원을 방출하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조작할 것이다. 활성화된 이펙터 세포는 신체 내의 임의의 부위 (면역치료 구축물의 국소화된 전달로부터 멀리 떨어진 부위 포함)에서 종양을 인식하고 공격할 수 있을 뿐만 아니라 처리된 종양과 동일한 종양 항원 중 하나 이상이 정착된 새로운 종양의 확산 또는 발달을 감소시키거나 또는 심지어 방지할 수 있다. 이러한 현상은 종종 압스코팔 효과로서 지칭된다. 암 세포의 사멸은 장기적 효과로 적응 면역 루프를 추가로 증폭시킨다. 지속적인 항종양 면역 감시를 위해 기억 적응 면역이 또한 확립될 것이다.
면역치료 구축물은 국부적으로, 종양내로, 비강내로, 복강내로, 뇌척수강내로, 피하로, 관절내로, 활액강내로, 척추강내로, 경구로, 국소적으로, 피부로, 정맥내로, 또는 흡입에 의해, 예를 들어 쉽게 접근가능한 종양, 예컨대 흑색종, 두경부암, 유방암, 결장암, 난소암, 방광암 및 림프종에 투여될 수 있거나; 또는 다른 암, 예컨대 폐암, 간암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 신장암, 혈액암 및 전이성 암에 대해 전신으로 투여될 수 있다.
조작된 면역치료 구축물은 나노미터 또는 마이크로미터 범위의 직경을 가질 수 있으며, 치료제/아주반트 카고를 로딩하여 표적 부위 (암 세포, 면역 세포, 세포외 매트릭스 등)에 전달할 수 있고 이들이 원하는 기능을 갖도록 허용할 수 있는 임의의 물질 (예를 들어, 지질, 무기 물질, 중합체 및 그의 조합)로 만들 수 있다.
임의로, 면역치료 구축물은 또한 표적 암 세포 및/또는 다양한 면역 세포 유형 (예를 들어, 수지상 세포 (DC), 대식세포, 단핵구, T 세포)에 우선적으로 전달되게 할 수 있고/거나 그에 의해 흡수될 수 있게 하는 하나 이상의 귀소 작용제 (항체, 압타머, 리간드, 펩티드 등)를 함유한다.
본원에 제공된 면역치료 구축물은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 면역 체크포인트 억제제, 화학요법, 수술, 표적화 요법 및 방사선 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표준 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 체크포인트 억제제 (PD-L1/PD-1, CTLA-4 등에 대항한 siRNA, 억제제 또는 항체), 기타 표적화 치료제 (예를 들어, 소분자 억제제, 또는 다른 종양단백질 또는 의료 방사성 동위원소를 표적으로 하는 항체)는 치료상 활성제로서 면역치료 구축물 상에/내에 직접 로딩될 수 있다.
국소 전달을 위해, 면역치료 구축물은 임의로 국소 또는 마이크로니들 제형으로 제형화될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 적어도 하나의 치료제; 및 적어도 하나의 아주반트를 포함하는 전달 시스템을 포함하는 면역치료 구축물이 제공된다. 면역치료 구축물은 종양-특이적 항원 또는 오브알부민을 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역치료 구축물은 하나의 치료제 또는 적어도 하나의 아주반트 이외의 단백질을 포함하지 않는다 (둘 중 하나가 단백질인 경우). 치료제 및 아주반트는 전달 시스템 내로 로딩되거나, 그의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 그 내에 봉입되거나, 또는 그 내에 함유될 수 있다. 제공된 면역치료 구축물의 특정한 실시양태에서, 전달 시스템은 수성 매질 (예컨대, PBS, 트리스-완충액 또는 물)에서 측정된 바와 같이, 5 nm 내지 999 nm (예를 들어, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 130 nm)의 유체역학적 크기를 갖는 나노입자이다. 또 다른 예에서, 면역치료 구축물은 1 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터의 유체역학적 크기를 갖는 마이크로입자이다. 일부 실시양태에서, 전달 시스템은 약 5 nm 내지 약 200 nm, 약 5 nm 내지 약 90 nm, 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 80 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 또는 약 100 nm의 크기를 갖는다.
면역치료 구축물의 다양한 실시양태에서, 치료제는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, DNA, shRNA, 또는 sgRNA (CRISPR-cas9 요소)), 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 화학요법 약물, 독소, 항산화제, 소분자 억제제, 항체, 또는 방사선치료제를 포함한다.
면역치료 구축물의 예에서, 아주반트 화합물은 면역자극 활성을 갖는다. 예를 들어, 아주반트 화합물은 TLR-결합 DNA 치환기, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, ISS 1018; 앰플리백스(Amplivax); CpG ODN 7909, CpG ODN 1826, CpG ODN D19, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, ODN 1668, ODN 1826, ODN 2006, ODN 2007, ODN 2395, ODN M362, 또는 SD-101); CpG 서열을 함유하는 DNA TLR 효능제 (예를 들어, dSLIM); 비-CpG DNA TLR 효능제 (예를 들어, EnanDIM); RNA TLR 효능제 (예를 들어, 폴리 I:C 또는 폴리-ICLC); 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 염화알루미늄, 또는 황산칼륨 알루미늄); 항-CD40 항체 (예를 들어, CP-870,893); 시토카인, 예컨대 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF); 양이온성 펩티드-접합된 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, IC30, IC31); 소분자 TLR 효능제 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가르디퀴모드 또는 3M-052); 융합 단백질 (예를 들어, ImuFact IMP321 및 ONTAK); 오일/계면활성제-기반 아주반트, 예컨대 MF59, 몬타니드(Montanide) IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V 및 몬타니드 ISA-51; 사포닌으로부터 유래되는 QS21 자극제 [아퀼라 바이오텍 (Aquila Biotech; 미국 매사추세츠주 우스터)]; 미코박테리아 추출물 또는 합성 박테리아 세포 벽 모방체, 예컨대 리포폴리사카라이드 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, OM-174, OM-197-MP-EC 또는 Pam3Cys); 크산테논 유도체 [예를 들어, 바드메잔(vadmezan)]; 그의 혼합물 (예를 들어, AS-15); 또는 독점 아주반트, 예컨대 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 퀼(Quil), 또는 슈퍼포스 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 암 또는 또 다른 과다증식성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 본원에 기재된 면역치료 구축물을 사용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 흑색종의 경우, 면역치료 구축물은 다수의 비정형 모반 또는 기타 겉보기에 양성인 점이 있는 환자 (특히 유전적 소인이 있는 환자 포함)의 예방 백신으로서 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 면역치료 구축물은 외과적 제거 (즉, 네오아주반트 설정) 전에 종양내/병변내 주사를 통해 접근가능한 종양/병변에 제공되어 재발가능성을 줄이고/거나 임의의 검출가능하거나 검출불가능한 전이를 사멸시키기 위해 면역 체계를 동원할 수 있다. 또 다른 예로서, 면역치료 구축물은 종양이 절제불가능하더라도 종양내 주사를 통해 종양에 제공될 수 있다. 이것은 신체의 다른 곳에서 처리된 종양과 미처리된 종양 둘 다를 공격하기 위해 면역 체계를 활성화시키고 동원할 것이다. 또 다른 예로서, 면역치료 구축물은 항종양 적응 면역 반응을 개시하기 위해 전신으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역치료 구축물은 종양 주변 영역 (종양주위) 또는 종양 제거 후 남은 영역 (아주반트 설정)에 제공될 수 있다. 또 다른 예로서, 면역치료 구축물은 전신으로 제공될 수 있으며, 이는 신체의 어느 곳에서나 암에 대항한 적응 면역을 발달시킬 것이다. 특정 실시양태에서, 면역치료 구축물은 림프절 (검출가능한 종양을 동반하거나 동반하지 않음) 내로 직접 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태는 암의 증상을 나타내는 대상체로부터 수득된 세포를 처리하는 방법으로서, 이러한 방법은 상기 세포를 상기 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 예에서, 대상체로부터 수득된 세포는 암 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 암 세포가 아니며; 예를 들어, 일부 경우에 비-암 (예를 들어, 정상) 세포는 면역학/면역 세포이다. 세포를 처리하는 방법의 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 처리된 세포를 대상체에게 다시 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 적어도 하나의 다른 치료, 예를 들어 암 또는 또 다른 과다증식성 질환 또는 병태에 대한 치료와 함께 면역치료 구축물의 투여를 조합하는 방법 실시양태가 제공된다.
상기 기재된 방법 실시양태 중 임의의 것에서 면역치료 구축물을 투여하는 것은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 대상체 내의 종양으로의 직접 주사; 대상체 내의 전신 주사; 대상체에 대한 국소 적용; 대상체에 의한 흡입; 대상체에 대한 간 동맥 주입; 대상체 내의 대류 강화 전달; 또는 대상체에 대한 마이크로니들 적용.
제공된 방법 실시양태 중 임의의 것의 예에서, 대상체 (치료 중이거나, 구축물 또는 조성물이 투여되거나, 또는 그로부터 세포가 수득됨)는 포유동물이고; 예를 들어, 특정 실시양태에서 포유동물은 인간이다.
제공된 면역치료 구축물 실시양태 중 임의의 것, 및 이러한 구축물을 사용하는 방법의 실시양태가, 면역치료 구축물이 종양-특이적 항원 또는 오브알부민을 포함하지 않는 예를 포함하는 것이 본원에서 구체적으로 고려된다.
도 1. 암 치료. 표적화 요법은 비-특이적 독성 화학요법에 비해 암 예후를 상당히 개선시켰다. 그러나, 그 효과가 지속되지 않는다. 면역 체크포인트 억제제 (ICI)는 신체의 자체 면역 체계를 활성화시켜 암을 공격하여, 잠재적으로 치유될 수 있다. 그러나, 소수의 환자만이 이러한 치료에 반응한다. 본 발명자들의 목표는 종양 미세환경 (TME)을 조작하여 항종양 T 세포 레퍼토리를 부스트하는 새로운 면역치료 구축물 (면역 반응을 증강하고 종양의 억제 환경을 억제하는 것 - AIRISE))을 개발하여, ICI로 치료받는 암 환자의 치유율을 증가시키는 것이다.
도 2. 본 발명자들의 새로운 면역치료 구축물의 계내 종양 백신 접종 메커니즘. 종양 (예를 들어, 흑색종 또는 유방 종양) 중 단 하나에 면역치료 구축물 AIRISE를 종양내로 주사한다. 한 가지 예, 즉 AIRISE-01 또는 CpG/DTX-NP에서, 아주반트 특성을 또한 갖는 화학요법 약물인 도세탁셀 (DTX)은 종양 항원을 방출하기 위해 국소 암 세포를 사멸시킬 것이고, CpG 올리고뉴클레오티드 (아주반트)는 국소 항원 제시 세포 (APC) (주로 수지상 세포 (DC))를 활성화시킬 것이다. 또 다른 예, 즉 AIRISE-02 또는 siSTAT3-CpG-NP에서, siSTAT3은 일부 암 세포를 사멸시킬 수 있는 반면, STAT3를 녹다운하면 항종양 적응 면역 반응의 프라이밍, 활성화 및 기능을 방지하는 면역억제 종양 미세환경을 감소시킬 수 있다. 이미 종양 미세환경 (TME; 암, 면역 세포 등을 포함함)에 있거나, 또는 본 발명자들의 치료에 의해 방출된 종양 항원은 종양 및 종양 배출 림프절(들)에서 AIRISE-활성화된 APC에 의해 흡수될 것이다. 그런 다음 APC는 종양 항원-특이적 T 세포를 프라이밍하기 위해 이들 항원을 제시한다. 이러한 활성화된 세포독성 (이펙터 CD8+) T 세포는 증식하여 전신 순환계 내로 유입될 것이다. 그들은 신체의 어디에 위치하든지 간에 처리된 종양과 동일한 항원 중 일부를 가진 종양에 특이적으로 귀소할 것이다 (예를 들어, 처리된 종양과 미처리된 전이성 종양 둘 다로 귀소함). 세포독성 T 세포에 의한 더 많은 암 세포의 사멸은 더 많은 종양 항원을 추가로 방출하여, 양성 피드백 루프에서 이펙터 (이미 프라이밍된) T 세포의 증식을 증폭시킨다. 항종양 체액성 면역 또한 동일한 개념에 따라 활성화된다. 이들 예에서 메소다공성 실리카 나노입자는 또한 항산화 특성을 가지며 (문헌 [Morry, J. Biomaterials, 66:41-52, 2015]), 이는 또한 면역억제성 TME를 추가로 조정하여 종양 유발 활성을 억제할 수 있다. 종양 부위에서 국소적으로 유도된 이러한 백신 접종은 전신의 전신 항종양 면역 반응을 생성한다.
도 3. CpG보다 CpG-NP로 처리한 후 수지상 세포 (MHCII+ CD80+ CD11c+ 세포)의 더 큰 활성화. CpG 또는 CpG-NP를 발바닥 주사로 마우스에 투여하였다. 처리 후 1일에, 배출 (DLN) 및 비-배출 림프절 (NDLN)을 수집하고 유동 세포계수법 분석을 위해 단일 세포로 프로세싱하여 활성화된 수지상 세포 %를 확인하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001. CpG ODN 1826 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 7)은 달리 명시되지 않는 한 실시예 전반에 걸쳐 사용되었다.
도 4a-4d. 국소 처리된 종양 (도 4b) 및 원격 미처리된 종양 (도 4c)의 억제된 종양 성장 곡선 및 마우스의 연장된 생존 곡선 (도 4d)에 의해 지시된 바와 같이 계내 종양 백신 접종을 유도하는데 있어서 (도 4a, 양측 종양이 이식된 마우스)에서와 같이 흑색종 마우스 모델에 투여된 CpG-NP의 유효성. 250,000개 및 100,000개의 B16F10 세포를 각각의 마우스 (C57BL/6) 내로 이식하여 국소 및 원격 종양을 각각 확립하였다. 종양 이식 후 8일에, CpG-NP 또는 염수를 3일마다 국소 종양에 총 3회 용량으로 종양내로 투여하였다. 용량 (각각의 주사당)은 20 μg CpG 및 0.2 mg NP였다. 종양 용적은 평균 및 SEM으로서 플롯팅된다. 통계적 차이 (*)는 CpG-NP와 염수 간에 평가되었다. *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 5a-5d. 국소 처리된 종양 (도 5b) 및 원격 미처리된 종양 (도 5c)의 억제된 종양 성장 곡선 및 마우스의 연장된 생존 곡선 (도 5d)에 의해 지시된 바와 같이 계내 종양 백신 접종을 유도하는데 있어서 (도 5a)에서와 같이 흑색종 마우스 모델에 투여된 CpG 및/또는 도세탁셀 (DTX)이 로딩된 NP (AIRISE-01)의 유효성. 마우스 (도 4와 동일한 모델)를 CpG-NP, CpG-DTX-NP 또는 염수로 처리하였다. 용량 (각각의 주사당): 20 μg CpG; 2 μg DTX; 0.2 mg NP. 종양 용적은 평균 및 SEM으로서 플롯팅된다. *는 염수와 CpG-NP 간의 통계적 차이를 나타낸다. $는 염수와 CpG-DTX-NP 간의 통계적 차이를 나타낸다. **p 및 $$p<0.01; ****p 및 $$$$p<0.0001.
도 6. CpG-DTX-NP (본 도면에서 NP로서 표시됨)에 의해 촉발된 국소 및 원격 종양, 국소 (처리된) 및 원격 종양의 DLN, 및 비-DLN에서의 세포독성 CD8+ T 세포의 증가. 모든 조건은 도 5a와 동일하다. 종양 및 림프절 (종양 배출 및 비-배출)은 제1 주사 후 7일에 수집되었다 (도 5a 참조). 림프 세포 집단 및 활성을 평가하기 위해 세포를 항체 패널로 염색하였다. p-값; *p<0.05. **p<0.01, ***p<0.001.
도 7a-7d. 국소 처리된 종양 (도 7b) 및 원격 미처리된 종양 (도 7c)의 억제된 종양 성장 곡선 및 마우스의 연장된 생존 곡선 (도 7d)에 의해 지시된 바와 같이 계내 종양 백신 접종을 유도하는데 있어서 (도 7a)에서와 같이 흑색종 마우스 모델에 투여된 siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02)의 유효성. 종양 용적은 평균 및 SEM으로서 플롯팅된다. 용량 (각각의 주사당): 20 μg CpG; 4 μg siSTAT3; 0.2 mg NP. 통계적 차이 (지정된 바와 같은 p-값, *)는 CpG-NP와 siSTAT3-CpG-NP (가장 잘 반응하는 2개의 군) 간에 평가되었다.
도 8a-8d. siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02) 효과의 CD8-의존성. B16F10 종양을 보유하는 C57/BL6 마우스를 확립하고 도 8a에서와 같이 처리하였으며, CD8 고갈 항체 (클론 2.43, 바이오엑스셀(BioXcell), 200 μg/마우스, 매주 2회, 복강내)를 AIRISE-02의 제1 종양내 치료 1일 전에 시작하여 전체 연구 전반에 걸쳐 마우스 군에게 제공하였다. CD8 고갈은 국소 종양 (도 8b), 원격 미처리된 종양 (도 8c)을 억제하고 마우스의 생존을 연장하는데 (도 8d) 있어서 AIRISE-02의 효능을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 AIRISE-02의 효과가 직접적인 세포독성보다는 면역-의존적이라는 것을 나타낸다.
도 9a-9d. siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02)는 체크포인트 억제제 (PD1 및 CTLA4 항체)의 효과를 증강시켰다. B16F10 종양을 보유하는 C57/BL6 마우스를 확립하고 (도 9a)에서와 같이 처리하였다. 체크포인트 억제제 (200 μg PD1 mAb/마우스 및 100 μg CTLA4 mAb/마우스, 복강내)가 2개 군의 마우스에 제공되었는데, 하나의 군에서는 종양내 AIRISE-02와 공동으로 제공되었고 다른 하나의 군에서는 단독으로 제공되었다 (즉, 3일 간격으로 3회 용량). AIRISE-02는 체크포인트 억제제 칵테일의 효과를 크게 증강시켰으며; 그러한 조합은 AIRISE-02 또는 체크포인트 억제제 칵테일 단독보다 더 우수하게 국소 (도 9b) 및 원격 미처리된 종양 (도 9c) 둘 다를 제어하였고 마우스의 생존을 연장시켰다 (도 9d). 그 조합을 받은 8마리 마우스 중 5마리가 치유되었다 (종양이 없음).
도 10a-10b. siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02)는 실험적인 전이성 폐 종양을 보유하는 마우스의 생존을 연장시켰다. C57/BL6 마우스에 200,000개의 루이스 폐 암종 (LLC-JSP) 세포를 (꼬리 정맥을 통해) 주사하여 마우스의 폐에 폐암을 확립시켰다. 처리는 (도 10a)에 나타낸 바와 같이 정맥내로 제공되었다. 생존은 (도 10b)에 나타낸 바와 같이 정맥내 AIRISE-02로 유의하게 연장되었다.
도 11a-11d. 양이온성 지질 입자 [다르마펙트(DharmaFECT)]와 함께 전달된 CpG 및 siSTAT3은 계내 백신 접종 효과를 산출한다. B16F10 종양을 보유하는 C57/BL6 마우스를 확립하고 도 11a에서와 같이 처리하였다. 치료 구축물은 처리된 종양 (도 11b) 및 원격 종양 (도 11c)을 감소시킬 뿐만 아니라 마우스의 생존을 연장시켰다 (도 11d). 용량 (각각의 주사당): 20 μg CpG; 4 μg siSTAT3. 치료 구축물은 DLS에 의해 측정된 바와 같이 평균 크기가 1068 nm (1.1 마이크로미터)이다.
도 12a-12c. 암 및 면역 세포에 대한 siRNA 및 CpG의 NP-매개된 공동-전달. B16F10 세포 (도 12a) 및 J774 세포 (도 12b) (둘 다 마우스 세포주임) 및 (도 12c) C3H/HEJ 마우스 (BMDC)의 골수로부터 수거된 수지상 세포를 STAT3 또는 스크램블된 siRNA (siSCR)에 대항한 siRNA를 운반하는 NP 또는 CpG 로딩된 NP (CpG-NP)로 처리하였다. 각각의 siRNA의 용량은 50 nM, 및 2.0 wt%의 NP였고, CpG의 용량은 B16F10 및 J774의 경우 2 wt%의 NP였고, BMDC의 경우 4 wt%의 NP였다. mRNA는 처리 후 48시간에 qRT-PCR로 분석되었다. 데이터는 암 및 면역 세포 둘 다에서 siRNA (예를 들어, siSTAT3)를 형질감염시키는 나노입자의 효능을 나타내며, 이는 NP 상에 로딩된 CpG에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 실시예 전반에 걸쳐 달리 언급되지 않는 한, "NP"는 문헌 [Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015] 및 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0173169에 기재된 바와 같이 가교된 PEI 및 PEG로 코팅된 메소다공성 실리카 나노입자를 나타낸다.
도 13. HCC1954 세포 (인간 HER2+ 암 세포)를 HER2 또는 STAT3에 대항한 siRNA를 운반하는 트라스투주맙-접합된 NP (T-NP)로 처리하였다. 각각의 siRNA의 용량은 30 nM이었고 전체에 걸쳐 2.0 wt%의 NP였다. 단백질은 처리 후 72시간에 웨스턴 블롯으로 분석되었으며, STAT3의 80% 녹다운이 달성된 것으로 나타났다. 데이터는 나노입자가 단일 siRNA와 비교하여 효능을 상실하지 않으면서 적어도 2개의 siRNA 서열 (예를 들어, siHER2 및 siSTAT3)을 전달할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14a-14c. 귀소 표적 인자로서 항체를 함유하는 나노입자의 우선적 흡수. 1시간 노출 후, EGFR 항체 (세툭시맙) 접합된 나노입자 (C-NP)는 도 14a에 도시된 바와 같이 정상 폐 세포 (NL20)에 비해 EGFR을 과다발현하는 폐암 세포 (A549 및 H460)에 의해 우선적으로 흡수되었다. 도 14b는 유동 세포계수법에 의해 측정된 바와 같이 이들 세포주의 EGFR 발현 수준을 보여준다. 마찬가지로, 도 14c는 HER2 항체 (트라스투주맙) 접합된 나노입자 (T-siSCR-NP)가 MCF7 (웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 바와 같이 낮은 HER2 발현을 가짐 (도 14c의 삽입도))에 비해 HER2를 과다발현하는 유방암 세포 (BT474, SKBR3)에 의해 우선적으로 흡수되었다는 것을 보여준다. 리툭시맙 (CD20 항체) 접합된 나노입자 (R-siSCR-T)를 사용한 경우에는 우선적인 효과가 관찰되지 않았다. siSCR은 스크램블된 siRNA로 나타낸다.
도 15. PLK1 억제제를 함유하는 나노입자 (p-iPLK1-NP)에 CpG (서열식별번호: 7)를 부가하면 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선에 의해 입증된 바와 같이 치료 혜택이 증강된다. 100K LLC-JSP 세포 (폐암 세포)를 C57BL/6 마우스의 우측 측복부에 주사하고 40K 세포를 좌측 측복부에 주사하였다. 종양 접종 후 제12일에, 마우스의 우측 (국소) 종양에 염수, PD-L1 항체 코팅된 나노입자 (p-NP), PLK1 억제제가 로딩된 나노입자 (iPLK1-NP), PLK1 억제제가 로딩된 p-NP (p-iPLK1-NP), 또는 PLK1 억제제 및 CpG가 로딩된 p-NP (p-iPLK1-NP-CpG)의 종양내 처리를 받았다. 50 μl 중 0.5 mg NP (2.5 μg iPLK1, 20 μg PD-L1 항체, 20 μg CpG)를 3일마다 총 3회 용량으로 투여하였다.
도 16a-d. 국소 처리된 종양 (도 16b) 및 원격 미처리된 종양 (도 16c)의 억제된 종양 성장 곡선 및 마우스의 연장된 생존 곡선 (도 16d)에 의해 지시된 바와 같이 계내 종양 백신 접종을 유도하는데 있어서 (도 16a)에서와 같이 흑색종 마우스 모델에 투여된 CpG 및 미톡산트론 (MTX)이 로딩된 NP의 유효성. 마우스를 CpG-MTX-NP 또는 염수로 처리하였다. 용량 (각각의 주사당): 20 μg CpG; 2 μg MTX; 0.2 mg NP. 종양 용적은 평균 및 SEM으로서 플롯팅된다. 종양 용적의 경우, CpG-MTX-NP vs. 염수에 대한 **p<0.01.
도 17a-c. AIRISE-02는 국소 (처리됨) 및 미처리된 종양 및 이들의 종양 배출 림프절 (DLN)에서 CD8+ T 세포의 증식을 증강시켰다. 모델, 처리 용량 및 일정은 도 7에서와 같았다. 제1 처리 후 7일에, 종양으로부터 수거된 세포 및 국소 (처리됨) 및 원격 (미처리됨) 종양 둘 다의 DLN를 분석하여, 림프절 (c)에서 이펙터 (CD44+) CD8+ T 세포의 증식 상태 (Ki-67)와 함께, 종양 (a) 및 DLN (b)의 살아있는 CD45+CD3+ T 세포 집단에서 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포에 대한 CD8+ T 세포의 비를 결정하였다. 대괄호가 달리 지정하지 않는 한, AIRISE-02 vs. 염수에 대한 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (n=3/군).
도 18. TME에서의 NP 세포 흡수. 마우스 (도 7에서와 동일한 모델, ~ 100 mm3의 B16F10 종양 크기 n=3/군, 평균 및 SD로서 플롯됨)에게 알렉사(Alexa) 488-siRNA-CpG-NP를 종양내 주사하였다. 주사 후 2시간에, 처리된 종양의 세포를 프로파일링하고 각각의 집단에서 siRNA-CpG-NP (NP+)의 존재에 대해 분석하였다.
도 19. siSTAT3-NP는 다수의 종의 다수의 세포에서 STAT3를 녹다운할 수 있다. D-17 (개 골육종), BMDC (마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포), J774 (마우스 대식세포), B16F10 (마우스 흑색종) 및 HCC1954 (인간 유방암)를 siSTAT3-NP (50 nM)로 48시간 동안 처리하였다. STAT3 및 HPRT mRNA에 대한 qRT-PCR 분석은 상응하는 종의 프라이머로 수행되었다. 단일 siSTAT3 서열이 전체적으로 사용되었다. siSCR = 스크램블된 siRNA 대조군. ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 20. AIRISE-02 (siSTAT3-CpG-NP) + ICI는 CT26 양측 종양을 보유하는 마우스에서 완전한 반응을 초래하였다. 250K 및 100K CT26 세포를 각각의 마우스 (Balb/c)의 양측 복부에 이식하였다. 종양 이식 후 15일에, 마우스를 설명된 바와 같이 처리하였다. 국소 처리된 종양 및 원격 미처리된 종양의 종양 성장 곡선은 스파이더 플롯으로서 플롯팅된다 (각각의 라인은 개별 마우스를 나타냄). 주사 용량: 16 μg CpG; 5 μg siSTAT3; 0.25 mg NP. 체크포인트 억제제 (200 μg PD1 mAb/마우스 및 100 μg CTLA4 mAb/마우스, 복강내)가 2개 군의 마우스에 제공되었는데, 하나의 군에서는 종양내 AIRISE-02와 공동으로 제공되었고 다른 하나의 군에서는 단독으로 제공되었다.
도 21. AIRISE-02 (siSTAT3-CpG-NP) + ICI는 또한, 공격적인 4T1 유방 양측 종양을 보유하는 마우스에서 효과적이다. 100K 및 40K 4T1 세포를 각각의 마우스 (Balb/c)의 양측 유방 지방 패드 내로 이식하였다. 종양 이식 후 11일에, 마우스를 설명된 바와 같이 처리하였다. 국소 처리된 종양 및 원격 미처리된 종양의 종양 성장 곡선은 스파이더 플롯으로서 플롯팅된다 (각각의 라인은 개별 마우스를 나타냄). 용량은 도 20과 동일하다.
도 22. 도 21에서 마우스의 생존 곡선.
도 23. siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02)의 안전성 프로파일. AIRISE-02는 3마리의 암컷 Balb/c 마우스에 근육내 투여되었다. 마우스를 제모하고 꼬리 대퇴부 근육에 1회 주사하였다. 주사 부위의 영상은 주사 전, 주사 후, 주사 후 24시간, 및 주사 후 72시간에 촬영되었다. 주사 용량: 16 μg CpG; 5 μg siSTAT3; 0.25 mg NP.
도 24a-b. 마우스에서 AIRISE-02의 안전성 프로파일. 유방 지방 패드에 이식된 양측 MM3MG-HER2d16 종양을 보유하는 마우스 (Balb/c) (문헌 [Tsao et al., JCI Insight, 4(24):e131882, 2019]에 기재된 바와 같음)는 2주에 걸쳐 5회 각각의 마우스의 2개의 종양 중 하나에 종양내 주사함으로써 AIRISE-02로 처리하였다. 체중은 (a)에서와 같이 모니터링되며; 종양이 직경 2 cm를 초과하거나 마우스가 통증 또는 고통의 징후를 나타낼 때 마우스를 안락사시켰다 (처리 후 15-55일). 안락사 시, 혈액을 수집하고 혈청으로 프로세싱하였다. 혈청 바이오마커는 베크만(Beckman) AU680 [IDEXX 바이오애널리틱스 (IDEXX BioAnalytics; 미국 캘리포니아주 웨스트 새크라멘토)]에 의해 측정되었고 (b)에 보고되었다. 용량은 도 20과 동일하다.
도 25. 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이에서 AIRISE-02의 안전성 프로파일을 설명하는 개략도. 시노몰구스 원숭이 (~2연령, 3.1±0.2 kg, n = 3)에게 AIRISE-02를 표에 기재된 바와 같이 3개의 단계적 상승 용량으로 피하 주사하였다. CpG 7909/2006 (인간 서열)을 사용하였다 (서열식별번호: 8). 체중, 음식 섭취, 케이지 쪽 및 자세한 관찰, 사망률, 이환율, 주사 부위에서의 반응, PK, 임상 병리학, 시토카인 수준, 보체 분할 산물, 및 항약물 항체를 모니터링하였다.
도 26. 상이한 양의 siRNA 및 CpG가 로딩된 가교된 PEI 및 PEG (NP)로 코팅된 메소다공성 실리카 나노입자의 유체역학적 크기 (전체 구축물의 wt%로서 명시됨). 평균 크기 (Z-평균) 및 다분산 지수 (PDI)는 말번 제타사이저(Malvern Zetasizer)를 사용한 3회 측정으로부터 표시된다.
도 27. CpG-NP는 항원의 존재 하에 항원-특이적 (적응) 면역 반응을 생성할 수 있다. 본 도면은 SF (SIINFEKL 펩티드)의 존재 하에 인큐베이션 후 IFNγ 활성화된 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 세포는 미처리된 마우스, SF 및 CpG가 로딩된 NP (CpG-SF-NP)로 처리된 마우스, SF가 로딩된 NP (SF-NP)로 처리된 마우스, CpG가 로딩된 NP (CpG-NP)로 처리된 마우스, 및 불완전 프로인트 아주반트로 제형화된 SF (IFA/SF)로 처리된 마우스의 림프절로부터 수득되었다. *p<0.05. 사용된 용량: 16 μg CpG 및 40 μg SF. 마우스에서 투여 경로는 발바닥 주사이다.
도 28. PBS에서 측정된, 약 2 wt% 및 9 wt%의 폴리 I:C가 로딩된 나노입자 (MSNP-PEI-PEG)의 유체역학적 크기.
도 29a-c. AIRISE-02. (a) 메소다공성 실리카 나노입자 코어의 TEM 영상, (b) PEI로 코팅된 메소다공성 실리카 나노입자를 포함하는 AIRISE-02의 개략도, 이는 이전에 기재된 바와 같이 가교되고 (문헌 [Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015]), PEG와 접합되어 나노입자 구축물 (NP)을 초래한다. PBS에서 10-40분 혼합하여 정전기적 상호작용에 의해 NP에 siSTAT3 및 CpG를 로딩하였다. (c) AIRISE-02의 유체역학적 크기 ((2%)siSTAT3-(6%)CpG-NP).
도 30. 마이크로니들 롤러 전처리를 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우 돼지 피부에서의 국소 siRNA-NP. 마이크로니들 롤러로 피부를 전처리하면서 및 전처리하지 않으면서 1시간 동안 아쿠아포르(Aquaphor)에서 Dy677-siSCR-NP를 1회 국소 적용하여 처리된 돼지 피부의 형광 영상. siRNA 신호는 화살표로 표시된다. 조직은 또한 훽스트(Hoechst) 33342로 핵에 대해 염색되었다.
도 31. 마이크로니들 롤러 전처리를 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우 마우스에서의 국소 siRNA-NP/트윈-아쿠아포르. 마이크로니들 롤러로 피부를 전처리하거나 전처리하지 않고 1.5시간 동안 트윈/아쿠아포르에서 Dy677-siSCR-NP를 1회 국소 적용하여 처리된 마우스 피부의 형광 영상. siRNA 신호는 화살표로 표시된다. 조직은 또한 훽스트 33342로 핵에 대해 염색되었다.
도 32a-b. 주사된 siRNA-NP 대비 마이크로니들 롤러를 사용한 국소 siRNA-NP의 EGFR 녹다운 효능. 마이크로니들 롤러 적용으로 트윈/아쿠아포르에서 siEGFR-NP 또는 siSCR-NP를 1회 국소 처리한 후 3일 (a) 또는 염수 중 siEGFR-NP 또는 siSCR-NP를 1회 주사한 후 3일 (b)에 마우스 피부를 수거하였다. 피부 조직을 고정하고 EGFR 신호 정량화를 위해 형광 표지된 EGFR 항체로 염색하였다. 4-8개의 영상 (20X)은 조건에 따라 프로세싱되었고 군당 3마리의 동물이 사용되었다.
도 33. Dy677-siRNA가 로딩된 NP를 함유하는 덱스트란-기반 마이크로니들.
도 34a-b. 상이한 양의 CpG 및 2 wt% siSTAT3를 함유하는 AIRISE-02로 처리한 후 2일에, 마우스 (a) 골수 유래 수지상 세포 및 (b) J774 세포의 생육력. 용량: 50 nM siRNA.
도 35. NP 또는 다르마펙트에 의한 비-표적화 스크램블된 siRNA (siSCR) 및 CpG를 C3H/HEJ 마우스로부터 수거된 수지상 세포로 공동-전달함. 각각의 siRNA의 용량은 50 nM 및 2.0 wt%의 NP였고, CpG의 용량은 4 wt%의 NP였다. siRNA-다르마펙트 제형은 제조업체의 프로토콜에 따라 제조되었다. mRNA는 처리 후 48시간에 qRT-PCR로 분석되었다. "NP"는 문헌 [Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015] 및 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0173169에 기재된 바와 같이 가교된 PEI 및 PEG로 코팅된 메소다공성 실리카 나노입자를 나타낸다.
도 36. siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP + ICI는 공격적인 4T1 유방 종양을 보유하는 마우스에서 효과적이다. 100K 및 40K 4T1 세포를 각각의 마우스 (Balb/c)의 양측 유방 지방 패드 내로 이식하였다. 종양 이식 후 8일에, 마우스를 도 20 및 21과 유사한 방식으로 siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP를 수반하면서 또는 수반하지 않으면서 ICI로 처리하였다 (3회 용량, 3일 간격). 국소 처리된 종양 및 원격 미처리된 종양의 종양 성장 곡선은 스파이더 플롯으로서 플롯팅된다 (각각의 라인은 개별 마우스를 나타냄). 주사 용량: 16 μg CpG; 5 μg siSTAT3; 5 μg siCXCR4; 0.25 mg NP.
서열 목록에 대한 참조
본원에 기재된 핵산 서열은 37 C.F.R. §1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 표시된다. 각각의 핵산 서열의 단 하나의 가닥만 제시되지만, 상보적 가닥은 그것이 적절한 실시양태에 포함되는 것으로 이해된다. 2020년 7월 13일경에 생성된 "51127-004WO2_Sequence Listing_07.13.20_ST25.txt"라는 제목의 컴퓨터 판독가능 텍스트 파일은 파일 크기가 2 KB이며, 본 출원에 대한 서열 목록을 함유하며 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열식별번호: 1은 STAT3에 특이적인 siRNA (siSTAT3)의 대표적인 센스 서열이다: 5' GGAUCUAGAACAGAAAAUGdTdT 3' (그 중 마지막 2개의 위치는 데옥시 염기임).
서열식별번호: 2는 STAT3에 특이적인 siRNA (siSTAT3)의 대표적인 안티센스 서열이다: 5' CAUUUUCUGUUCUAGAUCCdTdG 3' (그 중 마지막 2개의 위치는 데옥시 염기임).
서열식별번호: 3은 HER2에 특이적인 siRNA (siHER2)의 대표적인 센스 서열이다: 5' CACGUUUGAGUCCAUGCCCAAUU 3'.
서열식별번호: 4는 HER2에 특이적인 siRNA (siHER2)의 대표적인 안티센스 서열이다: 5' UUGGGCAUGGACUCAAACGUGUU 3'.
서열식별번호: 5는 SCR에 특이적인 siRNA (siSCR)의 대표적인 센스 서열이다: 5' UGGUUUACAUGUCGACUAA 3'.
서열식별번호: 6은 SCR에 특이적인 siRNA (siSCR)의 대표적인 안티센스 서열이다: 5' UUAGUCGACAUGUAAACCA 3'.
서열식별번호: 7은 실시예 (마우스 시스템) 전체에 걸쳐 사용된 CpG ODN 1826의 서열이다: 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'. 이러한 ODN은 전체 포스포로티오에이트 백본을 함유하며 뉴클레아제 저항성이다.
서열식별번호: 8은 원숭이 및 인간 시스템을 사용한 실시예에서 사용된 CpG ODN 2006/7909의 서열이다: 5'- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'. 이러한 ODN은 전체 포스포로티오에이트 백본을 포함하며 뉴클레아제 저항성이다.
암 치료를 위한 AIRISE (면역 반응을 증강하고 종양의 억제 환경을 억제하는 것)라고 하는 본원에 기재된 면역치료 접근법 (도 1 및 2)은 개인 맞춤형 종양 항원 세트를 위한 저장소로서 환자 자신의 종양을 활용한다 (계내 종양 백신 접종). 제공된 면역치료 구축물은 적어도 하나의 아주반트 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드) 및 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 하나 이상의 치료제/화합물 (예를 들어, siRNA, 안티센스, 올리고뉴클레오티드, 약물, 소분자, 항체 등)을 보유한다. 이러한 치료제의 구체적 예는 STAT3에 대항한 siRNA 및 도세탁셀이다.
종양 부위에 제공된 면역치료 구축물의 투여 시 (예를 들어, 전신 전달을 통한 종양 귀소 또는 종양내 주사를 통함), 종양 항원(들)은 면역자극 (공급된 아주반트(들)에 의해 제공됨)의 존재 하에 방출된다. 이러한 항원 방출과 면역자극은 함께, 항원-특이적 적응 면역을 개시하고 지원한다. 종양 항원은 나이브 T 세포에 항원을 제시하는 기존의 항원 제시 세포 (APC)에 의해 흡수될 수 있다. T 세포 (종양 항원에 대항함)는 이에 따라 이펙터 T 세포 (림프절 내 또는 종양 부위 내)로 프라이밍 및 활성화되고 신체 전체에 증식하여, 처리된 종양 뿐만 아니라 초기 투여로부터 멀리 떨어진 다른 종양 (예를 들어, 전이성 부위)에 대한 증가 및 개선된 면역 반응을 제공한다. 초기 투여 부위로부터 멀리 떨어진 종양에서의 효능은 또한 압스코팔 효과로서 관련 분야에 공지되어 있다.
특이적 종양 항원을 인식하도록 훈련된 이들 항종양 T 세포는 주사된 부위 및 신체의 다른 곳 둘 다에서 종양을 제어할 것이다 (도 2 참조). 카고 조합은 임의의 유형의 마이크로/나노입자 상에 적용될 수 있으며, 즉 면역치료 구축물 및 그의 사용 방법의 실시양태는 전달 비히클 불가지론적이다. 구체적인 예시적인 전달 비히클이 본원에 기재되어 있다.
본 발명은 CpG 및 siSTAT3 (siSTAT3-CpG-NP), 또는 CpG 및 도세탁셀 (CpG/DTX-NP)이 로딩된 면역치료 구축물로 예시되는, 본원에 기재된 면역요법을 사용하는 계내 종양 백신 접종 효과(들)를 제공한다. 이러한 2가지 예시적인 치료상 활성제의 경우, 도세탁셀 (DTX)은 국소 암 세포를 사멸시켜 종양 항원을 방출하고, CpG는 국소 항원 제시 세포 (APC, 주로 DC)를 활성화시킬 것이며; siSTAT3은 일부 암 세포를 사멸시키지만, 그의 주요 역할은 항종양 적응 면역 반응의 프라이밍 및 작용을 방지하는 면역억제 종양 미세환경 (TME)을 감소시키는 것이다. siSTAT3-CpG-NP는 암과 APC 둘 다에 의해 흡수되도록 설계된다는 것에 주목해야 한다. 그것이 일부 암 세포에서 약간의 사멸 효과를 나타낼 수 있지만, 사멸시키지 않고 오히려 STAT3을 녹다운시킴으로써 APC를 활성화시킬 것이다. 종양 항원 (이미 TME에 있거나 제공된 처리에 의해 방출됨)은 종양 및 종양 배출 림프절에서 CpG-활성화된 또는 AIRISE-활성화된 APC에 의해 흡수된다. 그런 다음 APC는 종양 항원-특이적 T 세포를 프라이밍하기 위해 이들 항원을 (교차) 제시한다. 이러한 활성화된 세포독성 (이펙터) T 세포는 증식하여 전신 순환계 내로 유입될 것이다. 그들은 신체의 어디에 위치하든지 간에 처리된 종양과 동일한 항원 중 일부를 가진 종양에 특이적으로 귀소할 것이다 (예를 들어, 처리된 종양과 원격 (미처리된) 종양 둘 다로 귀소함). 세포독성 T 세포에 의한 더 많은 암 세포의 사멸은 더 많은 종양 항원을 추가로 방출하여, 양성 피드백 루프에서 이펙터 (이미 프라이밍된) T 세포의 증식을 증폭시킨다. 특정 실시양태에서, 항산화제 메소다공성 실리카 나노입자 (MSNP)는 국소 면역억제성 TME를 추가로 조정하여, 종양 유발 활성을 억제할 수 있다. 종양 부위에 국소적으로 유도된 이러한 백신 접종은 전신의 전신 항종양 면역을 생성한다.
특정 실시양태에서, 전달 비히클은 올리고 로딩 및 엔도솜 탈출을 위해 생체환원성 가교된 양이온성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌이민 (PEI)으로 코팅된 약물 로딩을 위한 MSNP 코어 (예를 들어, ~50 nm); 및 나노입자 응집을 방지하고, 올리고 카고를 혈액 효소에 의한 분해로부터 보호하며 (문헌 [Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015]), PEI의 전하를 차폐하여 안전성을 증강시키는 안정제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 올리고 (siRNA 및/또는 CpG)는 실온 하에 PBS에서 혼합하면서 몇 분 (예를 들어, 5분)으로 구축물에 마지막으로 로딩되고; 이는 올리고 서열-비의존적 방식으로 PEI와 정전기적으로 결합하고 효소 분해로부터 PEG 층 아래를 보호한다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015). 그 결과로 생성된 나노입자 (NP)는 MSNP 크기, PEI 및 PEG 분자량 및 조성, PEI 가교 조건 (완충 용량을 증강시키고 전하를 낮추기 위함), 올리고 및 (임의로) 항체 로딩의 관점에서 siRNA 전달 효능에 대해 고도로 최적화되었다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015). siRNA-NP의 이러한 실시양태는 좁은 크기 분포를 갖는 50 nm의 단단한 MSNP 코어 크기 (TEM에 의함) 및 100 nm의 유체역학적 크기 (중합체 코팅이 있는 NP)를 갖는다. 이것은 13.5 wt% PEI, 18.2 wt% PEG를 포함하고 2-4 wt% siRNA 또는 최대 10 wt%의 CpG 올리고를 로딩할 수 있다. 약물 (예를 들어, 탁산)은 MSNP 코어 내에 또는 중합체 상에 0.5-3 wt%로 로딩될 수 있다. 본 단락의 모든 값은 나노구축물의 중량 기준이다. 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0172923을 또한 참조한다.
제1 구체적 실시양태에서, 하기를 포함하는 면역치료 구축물이 제공된다: 전달 시스템; 예를 들어, 전달 시스템 내로 로딩되거나, 그의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 그 내에 봉입되거나, 또는 그 내에 함유된 적어도 하나의 치료제로서, 종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 치료제; 및 예를 들어, 전달 시스템의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 그 내에 봉입되거나, 또는 그 내에 함유된 적어도 하나의 아주반트 화합물.
이러한 실시양태의 예에서, 전달 시스템은 리포솜, 지질-기반 입자, 중합체 입자, 무기 입자, 중합체 또는 지질로 코팅된 무기 입자, 또는 그의 혼성체를 포함하거나, 또는 다른 실시양태에서 상기이다.
면역치료 구축물의 다양한 예에서, 전달 비히클은 무기 입자이고 메소다공성 실리카, 금, 알루미늄, 인산칼슘, 산화철, 또는 항산화제 입자 (예컨대 산화세륨) 중 하나 이상을 포함한다.
면역치료 구축물의 또 다른 예에서, 전달 비히클은 풀러렌, 내면체 메탈로풀러렌, 3금속성 질화물 주형화 내면체 메탈로풀러렌, 단일벽 및 다중벽 탄소 나노튜브, 분지형 및 수지상 탄소 나노튜브, 금 나노막대, 은 나노막대, 단일벽 및 다중벽 붕소/질산염 나노튜브, 탄소 나노튜브 피포드, 탄소 나노혼, 탄소 나노혼 피포드, 리포솜, 나노쉘, 덴드리머, 마이크로입자, 양자점, 초상자성 나노입자, 나노막대, 셀룰로스 나노입자, 실리콘, 실리카 및 중합체 마이크로- 및 나노-구체, 실리카-쉘, 생분해성 PLGA 마이크로- 및 나노-구체, 금 입자, 산화세륨 입자, 산화아연 입자, 은 입자, 알루미늄 입자, 탄소 입자, 철 입자, 산화철 입자, 아주반트 입자 (예를 들어, 바이로솜 또는 기타 바이러스 유사 입자), 및/또는 변형된 미셀 중 하나 이상을 포함한다. 임의로, 전달 비히클은 중합체를 포함하고; 구체적 예에서, 중합체 입자는 PLGA, PLL, 폴리아르기닌, PEG, PEI, 또는 키토산 중 하나 이상을 포함한다.
제공된 면역치료 구축물 실시양태 중 임의의 것에서, 그 예는 수성 매질 (예컨대 PBS, 트리스-완충액 또는 물)에서 측정된 바와 같이, 5 nm 내지 999 nm (예를 들어, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 150 nm)의 유체역학적 크기를 갖는 나노입자인 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 면역치료 구축물은 수성 매질 (예컨대 PBS, 트리스-완충액, 또는 물)에서 측정된 바와 같이, 150 nm 미만의 유체역학적 크기를 갖는다. 또 다른 예에서, 면역치료 구축물은 수성 매질 (예컨대 PBS, 트리스-완충액, 또는 물)에서 측정된 바와 같이, 1 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터 (예를 들어, 1 마이크로미터 내지 50 마이크로미터)의 유체역학적 크기를 갖는 마이크로입자이다.
기재된 면역치료 구축물의 다양한 실시양태에서, 치료제는 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, DNA, sgRNA (CRISPR-cas9 요소), 기타 올리고뉴클레오티드, 기타 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 화학요법 약물, 독소, 항산화제, 소분자 억제제, 항체, 또는 방사선치료제를 포함한다. 구체적 예에서, 치료제는 STAT3, CD39, CD73, TGF-β, PD-L1, PD1, CTLA4, MIF, PLK1, HIF, NOX1-4, HER2, EGFR, BCL2, AKT1, HIF1-알파, NOX1-4, AR, MYC, 또는 MTDH의 발현 또는 활성을 억제한다.
면역치료 구축물의 또 다른 실시양태에서, 치료제는 항생제 (예를 들어, 도세탁셀, 독소루비신, 또는 미톡산트론), 식물 알칼로이드 (예를 들어, 카바지탁셀), PLK1 억제제, 유사분열 키나제 억제제, 면역 체크포인트 억제제 (예컨대 PD-L1, PD1 또는 CTLA4에 대항한 항체), 백금 기반 화학요법제, 소분자 HER2 억제제 또는 HER2-특이적 항체 중 하나 이상을 포함한 항암제이다. 유사분열 키나제 억제제의 예는 폴로-유사 키나제 (PLK), 오로라 키나제, 시클린-의존성 키나제 (CDK)1, CDK2, HASPIN, 단극 스핀들 1 키나제 (Mps1), 또는 NimA-관련 키나제 (NEK) 중 적어도 하나의 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유사분열 키나제 억제제는 GSK461364, BI2536, Tak960, NMS-P937, BI6727 (볼라세르팁), Chk 1 키나제 억제제 LY2603618, AU14022, YK-4-279, 또는 PMN 중 하나 이상을 포함한다
면역치료 구축물의 임의의 실시양태의 예에서, 아주반트 화합물은 면역자극 활성을 갖는다. 예를 들어, 아주반트 화합물은 CpG 올리고뉴클레오티드, CpG 서열을 함유하는 DNA TLR 효능제, 비-CpG DNA TLR 효능제, RNA TLR 효능제, 알루미늄 염, 항-CD40 항체, 융합 단백질, 시토카인, 소분자 TLR 효능제, 오일- 또는 계면활성제-기반 아주반트, 리포폴리사카라이드, 식물 추출물, 또는 그의 유도체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적 예에서, 아주반트 화합물은 CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가르디퀴모드, 폴리 IC, 폴리 ICLC, dSLIM, 또는 EnanDIM을 포함한다.
제공된 면역치료 구축물 실시양태 중 임의의 것이 종양-특이적 항원 또는 오브알부민을 포함하지 않을 수 있다는 것이 본원에서 구체적으로 고려된다.
또 다른 제공된 실시양태는 본원에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 면역치료 구축물; 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 또는 그의 혼합물을 포함하는 조성물이다.
또한, 본원에 기재된 면역치료 구축물의 사용 방법, 예를 들어 암 또는 또 다른 과다증식성 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
암을 치료하는 하나의 제공된 방법은 암에 걸린 대상체에게 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여, 암의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 제공된 방법 실시양태는 암의 증상을 나타내는 세포를 처리하는 방법으로서, 이러한 방법은 상기 세포를 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 제공된 방법 실시양태는 암의 증상을 나타내는 대상체로부터 수득된 세포를 처리하는 방법으로서, 이러한 방법은 상기 세포를 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 실시양태의 예에서, 대상체로부터 수득된 세포는 암 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 암 세포가 아니며; 예를 들어, 일부 경우에 비-암 (예를 들어, 정상) 세포는 면역학 세포이다. 세포를 처리하는 방법의 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 처리된 세포를 대상체에게 다시 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 제공된 실시양태는 과다증식성 질환 또는 병태가 있거나 또는 이러한 질환 또는 병태가 발병할 위험이 높은 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법으로서, 이러한 방법은 상기 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 과다증식성 질환 또는 병태는 암, 전암, 또는 암 전이 중 하나 이상을 포함하는 것으로 다양한 실시양태에서 고려된다. 예를 들어, 일부 경우에 과다증식성 질환은 흑색종, 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 신장암, 결장직장암, 림프종, 결장암 또는 간암 중 하나 이상을 포함한다.
또한 적어도 하나의 다른 치료, 예를 들어 암 또는 또 다른 과다증식성 질환 또는 병태에 대한 치료와 함께 면역치료 구축물의 투여를 조합하는 방법 실시양태가 제공된다. 이러한 조합 방법의 제1 예에서, 상기 방법은 항암 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에서 항암 요법의 효과를 증강시키며, 이러한 방법은 항암 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 항암제 (예를 들어, 화학요법제, 표적화 치료제, 또는 면역 체크포인트 억제제)를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 예시적인 조합 방법에서, 상기 방법은 체크포인트 차단 면역요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함하여, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 체크포인트 차단 면역요법 효과를 증강시킨다. 또 다른 조합 방법은 방사선 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 기재된 실시양태 중 어느 하나의 면역치료 구축물, 또는 면역치료 구축물을 포함하는 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 방사선 요법을 투여하는 것을 포함하는, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 방사선 요법 효과를 증강시키는 방법이다. 조합 방법 실시양태 중 임의의 것에서, 면역치료 구축물 또는 조성물 및 제2 작용제 (일반적으로, 항암 요법 작용제 또는 치료제)가 순차적으로 또는 공동으로 투여되는 예가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항암 요법의 치료 효과와 관련하여 용어 "증강시키는 것"은 항암 요법 (예를 들어, 항암제를 사용한 치료, 방사선 요법 또는 체크포인트 면역요법 등)이 본 발명의 면역치료 구축물 없이 투여될 때 정상적으로 수득되는 것을 초과하여 항암 요법의 치료 효과가 증가하는 것을 지칭한다. "치료 효과에서의 증가"는 항암 요법으로 수득된 치료 효과의 강도 및/또는 정도의 가속화 및/또는 증가가 있을 때 나타난다. 이는 또한 치료 혜택의 수명 연장을 포함한다. 이는 또한, 본 발명에 의해 제공되는 면역치료 구축물와 공동-투여되는 경우에는, 단독으로 투여되는 경우의 항암 요법의 더 높은 투여량, 빈도 또는 지속 기간과 동일한 혜택 및/또는 효과를 수득하기 위해 항암 요법의 더 낮은 투여량, 투여 빈도 또는 치료 지속 기간이 요구되는 것으로 나타날 수 있다. 증강 효과는 반드시 그런 것은 아니지만 바람직하게, 항암 요법 단독으로는 효과적이지 않거나 치료상 덜 효과적인 급성 증상의 치료를 초래한다. 증강은 항암 요법 단독 투여와 비교하여 본 발명의 면역치료 구축물이 항암 요법과 공동-투여될 때 치료 효과에서 적어도 10% 증가 (예를 들어, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 100%)가 있을 때 달성된다.
기재된 방법 실시양태 중 임의의 것에서 면역치료 구축물을 투여하는 것은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 대상체 내의 종양, 병변, 또는 절제된 종양 영역 내로 또는 그 주위에 직접 주사; 또는 대상체 내의 전신 주사; 또는 대상체에 대한 국소 적용; 또는 흡입; 또는 이식 장치; 또는 대상체에 대한 마이크로니들 적용.
제공된 방법 실시양태 중 임의의 것의 예에서, 대상체 (치료 중이거나, 구축물 또는 조성물이 투여되거나, 또는 그로부터 세포가 수득됨)는 포유동물이고; 예를 들어, 특정 실시양태에서 포유동물은 인간이다.
또한, 본원에 기재된 면역치료 구축물 및 적어도 하나의 항암제를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항암제는 화학요법제, 표적화 치료제, 또는 면역 체크포인트 억제제이다.
본 개시내용의 측면은 하기와 같이, 본 개시내용의 교시를 뒷받침하기 위한 부가의 세부사항 및 옵션과 함께 기재된다: (I) 면역치료 구축물; (II) 치료제 (종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정함); (III) 아주반트 화합물; (IV) 임의적 부가의 구성요소(들); (V) 전달 시스템; (VI) 제약 조성물 및 투여 제형; (VII) 예시적인 사용 방법; (VIII) 키트; (IX) 예시적인 실시양태; 및 (X) 실시예.
(I) 면역치료 구축물
암 세포에 아주반트(들) 및 치료상 활성제(들)를 공동-전달하는 조작된 입자를 포함하는 새로운 부류의 면역치료제 (일반적으로, "면역치료 구축물")가 본원에 기재되어 있다. 실시양태는 항원 방출 (구체적으로, 종양 항원 방출)을 유도하고/거나 면역억제 환경 (예컨대 종양 미세환경)을 조정하는 치료상 활성제(들)를 제공한다. 이러한 면역치료 구축물은 CD8+ T 세포 레퍼토리를 부스트하고 어떤 항원(들)이 치료 중인 암과 연관되어 있는지 알거나 확인할 필요 없이 전신 항종양 면역요법 효과를 유도한다.
이러한 전략은 많은 주요 특징을 가질 것이며; 그 특징은 효과적이고 개인 맞춤형이며, 국소 전달로 인해 안전하고, 기억 효과로 암을 공격하도록 신체 면역 세포를 훈련 및 활용하기 때문에 내구성이 있으며, 저렴하고 (예를 들어, 낮은 투여량 및 적은 횟수의 투여가 요구됨), 많은 유형의 암에 적용가능하다는 것이다.
면역치료 구축물 내의 각각의 구성요소 (예를 들어, 치료제, 아주반트, 전달 비히클, 또는 전달 비히클의 임의의 구성요소)의 양은 실시양태에 따라 변할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 임의의 개별 구성요소는 면역치료 구축물의 0.001 중량% 내지 80 중량%, 0.01 중량% 내지 75 중량%, 0.5 내지 50 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 1 내지 10 중량%, 또는 2 내지 4 중량%를 구성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA 또는 본원에 기재된 임의의 다른 올리고뉴클레오티드)를 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 면역치료 구축물의 0.5 내지 30 중량%, 예를 들어 0.5 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 5 내지 15 중량% 또는 10 내지 30 중량%를 구성한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항암제 (예를 들어, 소분자 억제제 또는 본원에 기재된 임의의 다른 항암제)를 포함하고, 항암제는 면역치료 구축물의 0.1 내지 30 중량%, 예를 들어, 0.5 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 5 내지 15 중량%, 또는 10 내지 30 중량%를 구성한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체를 포함하고, 항체는 면역치료 구축물의 0.1 내지 30 중량%, 예를 들어 0.5 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 5 내지 15 중량%, 또는 10 내지 30 중량%를 구성한다.
(II) 치료제
제공된 조작된 면역치료 구축물에 의해 암 및/또는 면역 세포에 전달되는 치료상 활성제의 예 (예를 들어, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, sgRNA-cas9, DNA 및 mRNA를 포함한 치료 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 소분자 억제제, 화학요법제, 항체, 화학 작용제 등)는 종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정한다. 구체적 실시양태에서, 활성제는 암 세포를 사멸시킴으로써 종양 항원을 방출하는 반면, 공동-전달된 아주반트 (예를 들어, CpG, R848, 폴리 I:C 등)는 방출된 종양 항원에 대항하여 적응 면역 세포를 프라이밍하고 활성화시킨다. 활성화된 이펙터 세포는 신체 내의 임의의 부위 (면역치료 구축물의 국소화된 전달로부터 멀리 떨어진 부위 포함)에서 종양을 인식하고 공격할 수 있을 뿐만 아니라 처리된 종양과 동일한 종양 항원 중 하나 이상이 정착된 새로운 종양의 확산, 재발 또는 발달을 감소시키거나 심지어 방지할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역치료 구축물 상의 치료제의 용량은 유익한 면역 세포에 대한 독성을 감소시키도록 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 세포에 해를 끼치지 않으면서 암의 생육력에 영향을 미치는 치료제가 면역치료 구축물에 활용된다. 다른 예에서, 치료상 활성제 (예를 들어, STAT3, CD39, CD73, IDO-6, PD-L1, TGF-β, 항산화제 등에 대항한 siRNA, 억제제 또는 기타 약물)가 전달 비히클 (예를 들어, 입자) 상에/내에 로딩되어 면역억제 종양 미세환경을 조정하여, 면역 세포의 프라이밍 및 활성화가 암 세포를 효과적으로 공격할 수 있게 하고, 이미 종양에 있거나 면역치료 구축물에 의해 그의 방출이 촉발되는 항원을 활용한다. 치료제는, 예를 들어 STAT3, IDO-1, TGF-β, CD47, NOX1-5, HSP47, XBP1, BCL2, BCL-XL, AKT1, AKT2, AKT3, MYC, HER2, HER3, AR, 서바이빈(Survivin), GRB7, EPS8L1, RRM2, PKN3, EGFR, IRE1-알파, VEGF-R1, RTP801, 프로NGF, 케라틴 K6A, LMP2, LMP7, MECL1, HIF1α, 푸린, KSP, eiF-4E, p53, β-카테닌, ApoB, PCSK9, SNALP, CD39, CD73, PD-L1, PD-1, CTLA-4, MIF, VEGF, PIGF, CXCR4, CCR2, PLK1, MTDH, Twist, Lcn2, IL-6, IL-10, SOCS1, TRAIL, p65, 및 유사분열 키나제 (예를 들어, PLK1, PLK2, PLK3, PLK4, CDK1, CDK2, CHK1, CHK2, BUB1, BUBR1, MPS1, NEK2, HASPIN, 오로라 A)를 표적으로 할 수 있다. 치료제는 관련 기술분야에 공지된 다른 면역억제 유전자를 표적으로 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Database, bax094, 2017; Rabinovich et al., Annu Rev Immunol, 25:267, 2010]). 치료제는 또한 관련 기술분야에 공지된 면역 체크포인트의 활성을 억제할 수 있다. 암 치료에 유익한 면역 체크포인트는 억제되었을 때, PD-L1, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, B7-H3, VISTA, A2AR, IDO 등을 비-포괄적으로 포함한다 (Khair et al., Frontiers Immunology, 10:453, 2019). 종합하면, 면역치료 구축물은 장기간 지속되는 면역 매개 항암 효과를 일으킬 것이다. 기억 적응 면역이 또한 확립될 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역치료 구축물은 면역 반응을 활성화시키기 위해 사용된다. 이러한 실시양태는 면역 반응을 활성화시키는 특정한 방식으로 제한되지 않는다.
치료 올리고뉴클레오티드. 상이한 유형의 치료 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있으며, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, DNA, mRNA, sgRNA (CRISPR의 경우), 및 CRISPR-cas9 요소를 비-포괄적으로 포함한다. 다시 말해서, 특정 유전자 및 단백질의 작용 또는 합성을 특이적으로 조정 (간섭 또는 부스트)할 수 있는 한, 뉴클레오티드의 임의의 쇄가 본 기술분야에 활용될 수 있다. 각각의 특정한 올리고뉴클레오티드는 단일 또는 다중 표적을 가질 수 있다. 본 발명에 대한 관심 유전자/단백질 표적의 예는 면역 체크포인트, 전사 인자, 포스파타제, 키나제 등을 포함한다. 특이적 표적은 STAT3, IDO-1, TGF-β, CD47, NOX1-5, HSP47, XBP1, BCL2, BCL-XL, AKT1, AKT2, AKT3, MYC, HER2, HER3, AR, 서바이빈, GRB7, EPS8L1, RRM2, PKN3, EGFR, IRE1-알파, VEGF-R1, RTP801, 프로NGF, 케라틴 K6A, LMP2, LMP7, MECL1, HIF1α, 푸린, KSP, eiF-4E, p53, β-카테닌, ApoB, PCSK9, SNALP, CD39, CD73, PD-L1, PD-1, CTLA-4, MIF, VEGF, PIGF, CXCR4, CCR2, PLK1, MTDH, Twist, Lcn2, IL-6, IL-10, SOCS1, TRAIL, p65, 및 유사분열 키나제 (예를 들어, PLK1, PLK2, PLK3, PLK4, CDK1, CDK2, CHK1, CHK2, BUB1, BUBR1, MPS1, NEK2, HASPIN, 오로라 A)를 포함한다. 치료 올리고뉴클레오티드는 또한 관련 기술분야에 공지된 다른 면역억제 유전자를 표적으로 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Database, bax094, 2017; Rabinovich et al., Annu Rev Immunol, 25:267, 2010). 치료 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 면역 체크포인트의 발현 및 활성을 억제할 수 있다. 암 치료에 유익한 면역 체크포인트는 억제되었을 때, PD-L1, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, B7-H3, VISTA, A2AR, IDO 등을 비-포괄적으로 포함한다 (Khair et al., Frontiers Immunology, 10:453, 2019). 치료 올리고뉴클레오티드는 또한 2개의 유전자를 표적으로 하는 2개의 가닥을 함유할 수 있다 (예컨대 BLC2 및 AKT1에 대항한 siRNA, AR 및 MYC에 대항한 siRNA). 그들은 또한 면역 반응을 동시에 부스트시키고 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 면역자극성 서열/요소를 함유할 수 있다. 그들은 또한 돌연변이가 있는 전술한 유전자를 표적으로 하도록 설계될 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역치료 구축물은 활성제로서 RNA 간섭을 매개하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. RNA 간섭은 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 의해 촉발되는 고도로 보존된 메커니즘이며 dsRNA에 상동인 유전자의 전사체를 하향조절할 수 있다. dsRNA는 먼저 다이서(Dicer)에 의해 짧은 간섭 RNA (siRNA)라고 하는 21-23개 뉴클레오티드의 짧은 이중체로 프로세싱된다. RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)에 혼입되어, 그들은 표적 mRNA의 절단을 통해 유전자 침묵을 매개할 수 있다. "siRNA" 또는 "소형 간섭 리보핵산"은 생리학적 조건 하에 상보적 영역을 따라 혼성화하는 리보뉴클레오티드의 두 가닥을 지칭한다. siRNA 분자는 표적 유전자의 mRNA 영역과 실질적으로 동일한 이중 가닥 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응하는 서열과 100% 동일성을 갖는 영역이 적합하다. 이러한 상태는 "완전히 상보적"인 것으로서 지칭된다. 그러나, 그 영역은 또한, 표적화되는 mRNA의 영역의 길이에 따라 표적 유전자의 상응하는 영역과 비교 시 1, 2 또는 3개의 미스매치를 함유할 수 있고, 그 자체로 완전히 상보적이지 않을 수 있다. 특이적 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위해 충분한 서열 동일성을 갖는 siRNA를 분석하고 확인하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 mRNA 표적 영역은 코딩 영역일 것이다. 또한 비-번역된 영역, 예컨대 5'-UTR, 3'-UTR 및 스플라이스 연접부가 mRNA 표적에 독특한 경우에 이들은 적합한다.
일부 실시양태에서, 면역치료 구축물 내에 캡슐화되거나 그와 연합된 siRNA는 RNA 간섭을 수반하는 방법 및 시스템에서 활용된다. 이러한 실시양태는 siRNA 분자의 특정한 크기 또는 유형으로 제한되지 않는다. 표적에 상보적인 siRNA 영역의 길이는, 예를 들어 15 내지 100개의 뉴클레오티드, 18 내지 25개의 뉴클레오티드, 20 내지 23개의 뉴클레오티드, 또는 15, 16, 17 또는 18개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 상응하는 표적 영역에 대한 미스매치가 있는 경우, 상보적 영역의 길이는 일반적으로 다소 길어야 한다.
특정 실시양태에서, (예를 들어, 면역치료 구축물 상에 siRNA의 로딩을 통해) 본원에 개시된 면역치료 구축물을 사용하는 siRNA 전달 접근법을 사용하여 임의의 관심 유전자의 생산을 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 특이적 표적은 암 및 다른 질환에서 동인으로서 공지된 유전자 중에서, STAT3, IDO-1, TGF-β, CD47, NOX1-5, HSP47, XBP1, BCL2, BCL-XL, AKT1, AKT2, AKT3, MYC, HER2, HER3, AR, 서바이빈, GRB7, EPS8L1, RRM2, PKN3, EGFR, IRE1-알파, VEGF-R1, RTP801, 프로NGF, 케라틴 K6A, LMP2, LMP7, MECL1, HIF1α, 푸린, KSP, eiF-4E, p53, β-카테닌, ApoB, PCSK9, SNALP, CD39, CD73, PD-L1, PD-1, CTLA-4, MIF, VEGF, PIGF, CXCR4, CCR2, PLK1, MTDH, Twist, Lcn2, IL-6, IL-10, SOCS1, TRAIL, p65, 및 유사분열 키나제 (예를 들어, PLK1, PLK2, PLK3, PLK4, CDK1, CDK2, CHK1, CHK2, BUB1, BUBR1, MPS1, NEK2, HASPIN, 오로라 A)를 포함한다. 공지된 다른 잠재적인 면역억제 유전자는 문헌 [Liu et al., Database, bax094, 2017 and Rabinovich et al., Annu Rev Immunol, 25:267, 2010]에 기재되어 있다. 추가로, siRNA는 야생형 유전자보다는 변이체 또는 돌연변이된 유전자에 대해 지시될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 공개 서열 데이터베이스에서 쉽게 입수할 수 있는 이들 표적에 대한 대표적인 서열에 접근하는 방법을 이해할 것이다. 하기 표는 샘플 서열 정보를 제공한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
이러한 실시양태는 시험관내 및/또는 생체내에서 siRNA의 전달 프로파일을 평가하는 특정한 방식으로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자를 영상화제 (예를 들어, 형광 염료 FITC, RITC, Cy™ 염료, Dylight® 염료, 또는 알렉사 플루오르® 염료) 또는 방사성추적자로 표지하는 것은 기관 수준 및 또한 세포내 전달 프로파일에서 siRNA 분자의 생체분포의 가시화를 허용한다. 일부 실시양태에서, RT-PCR, FISH, IHC, 유동 세포계수법 및 웨스턴 블롯은 mRNA 수준 및 단백질 수준 각각에서 표적 단백질을 분석하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 RNA 간섭에 의해 표적 유전자를 억제할 수 있는 siRNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 유전자를 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 siRNA는 서로 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함하고, 여기서 siRNA는 면역치료 구축물 상으로 로딩된다. 일부 실시양태에서, siRNA는 3' 센스 가닥에서 콜레스테롤로 변형된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 또는 동물 대상체 (예를 들어, 말, 개, 고양이, 또는 기타 가축, 농장, 또는 암에 걸린 기타 동물) 내에 있다.
마이크로RNA (miRNA) 또는 miRNA 모방체는 3'-UTR 요소를 통해 단백질 코딩 유전자를 표적으로 하고 실질적으로 침묵시킬 수 있는 짧은 비-코딩 RNA이다. 수많은 생물학적 프로세스에서 miRNA의 중요한 역할은 확립되었지만, 복합 질환에서 miRNA 기능에 대한 포괄적인 분석은 부족하다. miRNA는 초기에 1차 miRNA (pri-miRNA)로서 전사된 다음 핵 RNAse인 드로샤(Drosha) 및 파샤(Pasha)에 의해 절단되어 전구체 miRNA (pre-miRNA)를 산출한다. 이들 전구체는 세포질 RNAse III 다이서에 의해 추가로 프로세싱되어 짧은 이중 가닥 miR-miR* 이중체를 형성하고, 그 중 한 가닥 (miR)은 효소 다이서 및 아르고노트 (Ago)를 포함하는 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 통합된다. 성숙한 miRNA (~17-24 nt)는 표적 유전자의 3'UTR 내에 위치한 특이적 표적 부위로 RISC를 지시한다. 일단 표적 부위와 결합하면, miRNA는 mRNA 붕괴, 번역 억제 및/또는 프로세싱 바디 (P-바디)로의 격리를 통해 번역을 억제한다 (Eulalio et al., Cell, 132:9-14, 2008; Behm-Ansmant et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 71:523-530, 2006; Chu and Rana, Plos. Biology., 4:e210, 2006). 최근 추정에 따르면 단백질 코딩 유전자의 60% 이상이 3'-UTR miRNA 표적 부위를 운반하는 것으로 나타났다 (Friedman et al., Genome Res., 19:92-105, 2009). 이와 관련하여, miRNA는 초기 발달 (문헌 [Reinhart et al., Nature, 403:901-906, 2000]), 세포 증식 및 세포 사멸 (문헌 [Brennecke et al., Cell, 113(1):25-36, 2003]), 아폽토시스 및 지방 대사 (문헌 [Xu et al., Curr. Biol., 13(9):790-795, 2003]), 및 세포 분화 (문헌 [Chen et al., Mol. Microbiol., 53843-856, 2004; Dostie et al., RNA-A Publication of the RNA Society, 9:180-186, 2003])와 같이 다양한 프로세스의 주요 조절인자로서 작용한다. 또한, 만성 림프구성 백혈병 (문헌 [Calin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:5166-5171, 2008]), 결장 선암종 (문헌 [Michael et al., Mol. Cancer Res., 1:882-891, 2003]), 버킷 림프종 (문헌 [Metzler et al., Genes Chromosomes Cancer, 39:167-169, 2004]), 심장병 (문헌 [Zhao et al., Cell, 129:303-317, 2007]) 및 바이러스성 감염 (문헌 [Pfeffer et al., Science, 304:734-736, 2004])에서의 miRNA 발현 연구는 miRNA와 수많은 질환 간의 중요한 연결을 시사한다.
따라서 지금까지 관찰된 miRNA는 통상적으로 길이가 21-22개의 뉴클레오티드이며 비-단백질 코딩 유전자로부터 전사되는 더 긴 전구체로부터 발생한다. 문헌 [Carrington and Ambros, Science, 301(5631):336-338, 2003]에서 검토되었다. 전구체는 자기 상보적 영역에서 서로 다시 접히는 구조를 형성하며; 그런 다음 동물의 경우에는 뉴클레아제 다이서 (또는 식물의 경우에는 DCL1)에 의해 프로세싱된다. miRNA 분자는 표적과의 정확하거나 부정확한 염기-쌍형성을 통해 번역을 중단한다. 일부 실시양태에서, miRNA는 질환, 예컨대 예를 들어 암을 치료하기 위해 대상체, 예컨대 인간 환자에게 치료적으로 투여된 제공된 면역치료 구축물의 한 구성요소로서 사용될 수 있고; 대안적으로, 일부 실시양태에서, miRNA에 상보적인 핵산은 생체내에서 대상체에게 치료적으로 투여되거나 또는 시험관내에서 사용되어 원하는 치료 결과를 생성할 수 있다 (예를 들어, miRNA-142-3p, miRNA-142-3p, miRNA-124, 또는 miRNA-138). 이러한 방식으로, 상보적 핵산을 주형으로서 사용하여 원하는 치료 miRNA (예를 들어, miRNA-142-3p, miRNA-142-3p, miRNA-124 또는 miRNA-138)를 생성할 수 있다.
치료 올리고뉴클레오티드가 STAT3에 대해 지시되거나 특이적인 실시양태가 특히 고려된다. STAT3은 "신호 전달자 및 전사 활성화제 3" 단백질 및 그의 상동체를 지칭하며; 이러한 용어는 단백질의 야생형이든 돌연변이체 형태이든지 간에 인간 단백질을 포함한다. 실시양태에서, "STAT3"은 엔트레즈 유전자 6774, OMIM 102582, 유니프로트 P40763 및/또는 RefSeq (단백질) NP 003141과 연관된 단백질을 지칭한다 (이는 본 출원의 출원일 현재 공지된 단백질 및 연관 핵산을 지칭함). "인산화된 STAT3"은 인산화되고 인산화에 의해 활성화되는 STAT3 단백질을 지칭한다. 실시양태에서, 인산화된 STAT3은 티로신 705 또는 상동체 내의 티로신 705에 상응하는 잔기 상에서 인산화된다. 실시양태에서, STAT3의 활성화는 STAT3이 다른 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 의미한다. 실시양태에서, 활성화된 STAT3은 티로신 705, 또는 티로신 705에 상응하는 잔기 상에서 인산화되어 이량체 (예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체)를 형성하고, 핵으로 전위되고/거나 전사를 활성화시킨다. 실시양태에서, 활성화된 STAT3은 동종이량체를 형성한다. STAT3를 인산화하여 STAT3를 활성화시키는 단백질의 예는 JAK2, EGFR, c-MET 및 PDGF-R을 포함한다.
항암제. 항암제라는 어구는 그것의 평범한 통상적인 의미에 따라 사용되며, 항신생물 특성 또는 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 능력을 갖는 조성물 (예를 들어, 화합물, 약물, 길항제, 억제제, 조정제)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 표적화 치료제이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 암을 치료하는 방법에서 유용성을 갖는 본원에서 확인된 작용제이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 암 치료를 위해 FDA 또는 미국 이외의 국가의 유사한 규제 기관에 의해 승인된 작용제이다.
항암제의 예는 MEK (예를 들어, MEK1, MEK2 또는 MEK1 및 MEK2) 억제제 (예를 들어, XL518, CI-1040, PD035901, 셀루메티닙/AZD6244, GSK1120212/트라메티닙, GDC-0973, ARRY-162, ARRY-300, AZD8330, PD0325901, U0126, PD98059, TAK-733, PD318088, AS703026, BAY 869766, PD184352, SB239063, BAY 43-9006); 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 (예를 들어, 메클로로에타민, 시클로포스파미드, 우라무스틴, 클로람부실, 멜팔란, 이포스파미드), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (예를 들어, 헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 술포네이트 (예를 들어, 부술판 및 헵술팜), 니트로소우레아 (예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 및 스트렙토조신), 및 트리아젠 (예를 들어, 데카르바진); 항대사물질, 예컨대 엽산 유사체 (예를 들어, 메토트렉세이트, 류코보린, 랄티트렉세드 및 페메트렉세드), 피리미딘 유사체 (예를 들어, 플루오로우라실, 플록소우리딘, 시타라빈, 카페시타빈 및 젬시타빈) 및 퓨린 유사체 (예를 들어, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 및 5-아자티오프린); 식물 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀, 및 호모해링턴닌); 토포이소머라제 억제제, 예컨대 캄프토테신 유도체 (예를 들어, 이리노테칸 및 토포테칸), 암사크린 및 에피포도필로톡신 (예를 들어, 에토포시드 (VP16), 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드); 항생제, 예컨대 안트라센디온 (예를 들어, 미톡산트론), 안트라시클린 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 플루오로다우노루니신 염산염), 스트렙토미세스-유래 항생제 또는 그의 유도체 (예를 들어, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 젤다나마이신, 플리카마이신, 및 17-N-알릴아미노-17-데메톡시젤다나마이신 (17-AAG; 타네스피마이신), 클로파지민 및 베타 락탐 유도체; 백금-기반 화학요법제 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴); 치환된 우레아 (예를 들어, 히드록시우레아); 메틸 히드라진 유도체 (예를 들어, 프로카르바진), 부신피질 억제제 (예를 들어, 미토탄 및 아미노글루테티미드); 혈관신생 억제 효소 (예를 들어, L-아스파라기나제 및 아르기닌 데이미나제); PI3K 억제제 (예를 들어, 워트만닌 및 LY294002); mTOR 억제제 (예를 들어, 세르트랄린); DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제 (예를 들어, 5-아자-2'-데옥시시티딘); 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아폽토시스 유전자 조정제; 아폽토시스 조절제 (예를 들어, 데옥시아데노신 및 트립톨리드); BCR/ABL 길항제; bFGF 억제제; 카제인 키나제 억제제 (ICOS); 질산갈륨; 젤라티나제 억제제; 글루타티온 억제제 (예를 들어, 에타니다졸); 면역자극 펩티드; 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 백혈병 억제 인자; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; MIF 억제제; 불일치 이중 가닥 RNA; 미코박테리아 세포벽 추출물; 산화질소 조정제; 포스파타제 억제제; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉); 단백질 A-기반 면역 조정제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 리보자임; 신호 변환 억제제/조정제 (예를 들어, 이트라코나졸); 단일 쇄 항원 결합 단백질; 줄기세포 억제제; 스트로멜리신 억제제; 합성 글리코사미노글리칸; 텔로머라제 억제제; 갑상선 자극 호르몬; 번역 억제제; 유로키나제 수용체 길항제; 성선자극호르몬 방출 호르몬 효능제 (GnRH), 예컨대 고세렐린 및 류프롤리드 (류프로렐린); 스테로이드, 예컨대 부신피질스테로이드 (예를 들어, 프레드니손 및 덱사메타손); 프로게스틴 (예를 들어, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트); 항프로게스트로겐 (예를 들어, 미페프리스톤); 에스트로겐 (예를 들어, 디-에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올); 항에스트로겐, 예컨대 아로마타제 억제제 (예를 들어, 엑세메스탄, 파드로졸, 레트로졸, 펜트로졸 및 아나스트로졸), 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (예를 들어, 타목시펜, 타목시펜 메티오다이드, 파노미펜 및 클로미펜 유사체); 안드로겐 (예를 들어, 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론); 항안드로겐 (예를 들어, 플루타미드, 피나스테리드 및 비칼루타미드); 면역자극제, 레바미솔, 인터류킨 (예를 들어, 인터루킨-2) 및 인터페론/인터페론 효능제 (예를 들어, 알파-인터페론); 모노클로날 항체, 예컨대 항-CD20 (예를 들어, 리툭시맙), 항-HER2 (예를 들어, 트라스투주맙), 항-CD52, 항-CD25 (예를 들어, 다클리주맙), 항-HLA-DR 및 항-VEGF 모노클로날 항체; 면역독소 (예를 들어, 항-CD33 모노클로날 항체-칼리케아미신 접합체, 항-CD22 모노클로날 항체-슈도모나스 외독소 접합체 등); 방사선면역치료제 (예를 들어, 111In, 90Y 또는 131I 등과 접합된 항-CD20 모노클로날 항체); 스타틴 (예를 들어, 세리바스타틴 및 피타바스타틴); 5-T1B 수용체 효능제 (예를 들어, 5-노닐옥시트립타민); BRAF 키나제 억제제 (예를 들어, 베무라페닙 및 다브라페닙); 티로신 키나제 억제제, 예컨대 EGFR, HER2, KDR, FLT4, EphB4 및 Src 중 하나 이상의 억제제 (예를 들어, 게피티닙 (이레사(Iressa)™), 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™), 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)™), 라파티닙 (티커브(Tykerb)™), 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)™), 반데타닙 (카프렐사(Caprelsa)™), 아파티닙/BIBW2992, CI-1033/카네르티닙, 네라티닙/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, AG-1478, 다코미티닙/PF299804, OSI-420/데스메틸 에를로티닙, AZD8931, ARRY-380, AEE788, 펠리티닙/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, 소라페닙, 이마티닙 (글리벡(Gleevec)®), 수니티닙, 및 다사티닙; 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-CTLA4, 항-PD1/L1 항체); PLK1 억제제 (GSK461364, BI2536, Tak960, NMS-P937, 볼라세르팁) 등, 또는 그의 혼합물 (예를 들어, 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
부가적으로, 본원에 기재된 면역치료 구축물은 면역자극제 (예를 들어, 바실레 칼메트-게랑 (BCG), 레바미솔, 인터류킨-2, 알파-인터페론 등), 치료 모노클로날 항체 (예를 들어, 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-HLA-DR 및 항-VEGF 모노클로날 항체), 면역독소 (예를 들어, 항-CD33 모노클로날 항체-칼리케아미신 접합체, 항-CD22 모노클로날 항체-슈도모나스 외독소 접합체 등), 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-CTLA4, 항-PD1, 항PD-L1 항체) 및 방사선면역요법 (예를 들어, 111In, 90Y 또는 131I 등과 접합된 항-CD20 모노클로날 항체 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적인 면역치료제와 공동-투여될 수 있다. 이러한 면역치료제는 또한 치료 효과를 증강시키고, 독성을 감소시키며 투여 시간을 단축시키기 위해 면역치료 구축물 상으로 직접 로딩될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원에 기재된 면역치료 구축물은 방사성핵종, 예컨대 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At 및 212Bi를 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적인 방사선치료제와 공동-투여될 수 있다. 이러한 방사선치료제는 또한 치료 효과를 증강시키고, 독성을 감소시키며 투여 시간을 단축시키기 위해 면역치료 구축물 상으로 직접 로딩될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 대신에, 표적 유전자 및 단백질의 활성을 방해하거나 또는 이를 부스트시키는 항체 및 소분자 억제제가 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, PD-1에 대항한 siRNA 대신에, PD-1 항체는 또한 본원에 제공된 면역치료 구축물에서 치료제 구성요소로서 나노입자 상에 로딩될 수 있다.
(III) 아주반트
본원에 제공된 면역치료 구축물은, 예를 들어 전달 비히클 내에 함유되거나 달리 전달 비히클과 연합된 적어도 하나의 아주반트 구성요소를 포함한다. 면역치료 구축물 실시양태는 특정한 유형의 아주반트에 제한되지 않지만, 구체적 예가 본원에 제공된다. 아주반트는 또한 치료제의 일부이거나 또는 치료제와 접합될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자를 녹다운시키는 siRNA는 면역자극 서열을 함유하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 아주반트는 면역치료 구축물의 0.5 내지 20 중량%를 구성한다.
일반적으로, 아주반트는 백신 조성물로의 혼합물이 (암) 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 달리 변형시키는 임의의 물질이다. 면역자극 활성을 갖는 아주반트가 구체적으로 고려된다. 아주반트는 항원과 연합되지 않는 한 면역 체계의 비특이적 활성화를 유도한다 (예를 들어, 백신 내의 아주반트). 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 아주반트의 능력은 전형적으로 면역 매개 반응에서의 상당한 증가 또는 질환 증상에서의 감소에 의해 나타난다. 예를 들어, 체액성 면역의 증가는 전형적으로 항원에 대해 유발된 항체의 역가에서의 상당한 증가에 의해 나타나고, T-세포 활성의 증가는 전형적으로 증가된 항원-특이적 T 세포 증식, 표적 세포의 사멸, 또는 시토카인 분비에서 나타난다. 아주반트는 또한, 예를 들어 주로 체액성 또는 Th2 반응을 주로 세포성 또는 Th1 반응으로 변화시킴으로써 면역 반응을 변경할 수 있다.
적합한 아주반트는 TLR-결합 DNA 치환기, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, ISS 1018; 앰플리백스; CpG ODN 7909, CpG ODN 1826, CpG ODN D19, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, ODN 1668, ODN 1826, ODN 2006, ODN 2007, ODN 2395, ODN M362, 및 SD-101), CpG 서열을 함유하는 DNA TLR 효능제 (예를 들어, dSLIM), 비-CpG DNA TLR 효능제 (예를 들어, EnanDIM), 및 양이온성 펩티드-접합된 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, IC30, IC31); RNA TLR 효능제 (예를 들어, 폴리 I:C 및 폴리-ICLC); 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 염화알루미늄, 및 황산칼륨 알루미늄등); 항-CD40 항체 (예를 들어, CP-870,893); 시토카인, 예컨대 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF); 소분자 TLR 효능제 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가르디퀴모드 및 3M-052); 융합 단백질 (예를 들어, ImuFact IMP321, CyaA 및 ONTAK); 오일- 또는 계면활성제-기반 아주반트, 예컨대 MF59, 몬타니드 IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V 및 몬타니드 ISA-51; 식물 추출물, 예컨대 사포닌으로부터 유래된 QS21 자극제 (아퀼라 바이오텍; 미국 매사추세츠주 우스터); 미코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체, 예컨대 리포폴리사카라이드 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, OM-174, OM-197-MP-EC 및 Pam3Cys); 크산테논 유도체 (예를 들어, 바디메잔); 그의 혼합물 (예를 들어, AS-15); 및 기타 독점 아주반트, 예컨대 리비의 데톡스, 퀼, 또는 슈퍼포스를 포함한다. 여러 면역학적 아주반트 (예를 들어, 수지상 세포에 특이적인 MF59 및 그의 제조가 이전에 기재된 바 있다 (Dupuis et al., Cell Immunol. 186(1): 18-27, 1998; Allison, Dev Biol Stand.; 92:3-11, 1998).
또한 시토카인을 사용할 수 있다. 여러 시토카인은 림프계 조직으로의 수지상 세포 이동에 영향을 미쳐 (예를 들어, TNF-알파), 수지상 세포가 T-림프구에 대한 효율적인 항원 제시 세포로의 성숙을 가속화하며 (예를 들어, GM-CSF, IL-1 및 IL-4) (미국 특허 번호 5,849,589), 면역아주반트로서 작용하는 것 (예를 들어, IL-12)과 직접적으로 연계되어 있다 (Gabrilovich et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. (6):414-418, 1996). 톨 유사 수용체 (TLR) 또는 TLR을 활성화시키는 작용제가 또한 아주반트로서 사용될 수 있으며, 이는 "병원체-연관 분자 패턴" (PAMPS)이라고 하는 많은 미생물이 공유하는 보존된 모티프를 인식하는 패턴 인식 수용체 (PRR) 패밀리의 중요한 구성원이다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 또한 백신 환경에서 아주반트의 효과를 증강시키는 것으로 보고되었다. 임의의 특정한 기계론적 이론에 얽매이는 것은 아니지만, CpG 올리고뉴클레오티드는 주로 TLR9인 톨-유사 수용체 (TLR)를 통해 선천적 (비-적응) 면역 체계를 활성화시킴으로써 적어도 부분적으로 작용한다. CpG 촉발된 TLR9 활성화는 예방 및 치료 백신 둘 다에서 펩티드 또는 단백질 항원, 생 또는 사멸 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포성 백신 및 폴리사카라이드 접합체를 비롯한 광범위한 항원에 대한 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 증강시킨다. 더 중요한 것은 수지상 세포의 성숙과 분화를 증강시켜, CD4 T-세포의 도움이 없는 경우에도 TH1 세포의 활성화 증강과 강력한 세포독성 T-림프구 (CTL) 생성을 초래한다는 것이다. TLR9 자극에 의해 유도된 TH1 바이어스는 정상적으로 TH2 바이어스를 촉진하는 명반 또는 불완전 프로인트 아주반트 (IFA)와 같은 백신 아주반트의 존재 하에서도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 유도하는데 특히 필요한 제형, 예컨대 마이크로입자, 나노 입자, 지질 에멀젼 또는 유사한 제형 내에서 또는 다른 아주반트와 함께 제형화되거나 공동-투여될 때 훨씬 더 큰 아주반트 활성을 나타낸다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화하고, 일부 실험에서 CpG가 없는 전체 용량 백신에 필적할만한 항체 반응으로 항원 용량을 두 자릿수 정도 감소시킬 수 있었다 (Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5:471-484, 2006). 미국 특허 번호 6,406,705에는 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위해 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 아주반트 및 항원을 조합하여 사용하는 것이 기재되어 있다. 상업적으로 입수가능한 CpG TLR9 효능제는 몰로겐 (Mologen; 독일 베를린)의 dSLIM (이중 줄기 루프 면역조정제)이다. 다른 TLR 결합 분자, 예컨대 RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9가 또한 사용될 수 있다.
크산테논 유도체, 예컨대 예를 들어, 바디메잔 또는 AsA404 (5,6-디메틸아크산테논-4-아세트산 (DMXAA)로서 공지되기도 함)가 또한 본 발명의 실시양태에 따른 아주반트로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 유도체는 또한, 예를 들어 전신 또는 종양내 전달을 통해 본 발명의 백신과 병행하여 투여되어 종양 부위에서 면역을 자극할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 그러한 크산테논 유도체는 인터페론 (IFN) 유전자 ISTING 수용체의 자극제를 통해 IFN 생산을 자극함으로써 작용하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Conlon et al., J Immunology, 190:5216-5225, 2013; 및 Kim et al., ACS Chem Biol, 8:1396-1401, 2013] 참조). 유용한 아주반트의 다른 예는 치료적으로 작용하고/거나 아주반트로서 작용할 수 있는, 화학적으로 변형된 CpG (예를 들어, CpR, Idera), 폴리 (I:C) (예를 들어, 폴리i:CI2U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 뿐만 아니라 면역활성 소분자 및 항체, 예컨대 시클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스(Celebrex)™, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라피닙, XL-999, CP-547632, 파조파닙, ZD2171, AZD2171, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 및 SC58175를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 유용한 아주반트 및 부가제의 양 및 농도는 과도한 실험 없이 숙련된 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 부가의 아주반트는 집락 자극 인자, 예컨대 과립구 대식세포 집락 자극 인자 [GM-CSF, 사르그라모스팀(sargramostim)]를 포함한다.
폴리-ICLC는 폴리리신과 카르복시메틸셀룰로스를 부가하여 혈청 뉴클레아제에 의해 열변성 및 가수분해에 대해 안정화된, 평균 길이 5000개 뉴클레오티드의 폴리I 및 폴리C 가닥을 포함하여 합성적으로 제조된 이중 가닥 RNA이다. 이러한 화합물은 PAMP 패밀리의 두 구성원인 TLR3 및 MDA5의 RNA 헬리카제 도메인을 활성화시켜, DC 및 자연 살해 (NK) 세포 활성화 및 유형 I 인터페론, 시토카인 및 케모카인의 "자연 혼합물"의 생성을 초래한다. 더욱이, 폴리-ICLC는 2개의 IFN 유도성 핵 효소 시스템인 2' 5'-OAS 및 PKR (4-6)로서 공지되기도 한 PI/eIF2a 키나제 뿐만 아니라 RIG-I 헬리카제 및 MDA5에 의해 매개되는 보다 직접적이고 광범위한 숙주 표적화된 항감염 효과 및 가능하게는 항종양 효과를 발휘한다.
면역치료 구축물과 연합될 수 있는 면역학적 아주반트의 예는 TLR 리간드, C-유형 렉틴 수용체 리간드, NOD-유사 수용체 리간드, RLR 리간드, 및 RAGE 리간드를 포함한다. TLR 리간드는 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 그의 유도체 뿐만 아니라 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A (MPL), 글리코피라노실 지질 A, PET-지질 A, 및 3-O-데사실-4'-모노포스포릴 지질 A를 포함한 그의 유도체를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 면역학적 아주반트는 MPL이다. 또 다른 실시양태에서, 면역학적 아주반트는 LPS이다. TLR 리간드는 또한 TLR3 리간드 (예를 들어, 폴리이노신-폴리시티딜산 (폴리(I:C)), TLR7 리간드 (예를 들어, 이미퀴모드 및 레시퀴모드), 및 TLR9 리간드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "TLR-결합 DNA 치환기"는 적어도 하나의 데옥시리보핵산을 포함한, 톨-유사 수용체 ("TLR")와 결합할 수 있는 치환기 또는 모이어티를 지칭한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 핵산이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 적어도 하나의 핵산 유사체를 포함한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 대체 백본 (예를 들어, 포스포디에스테르 유도체 (예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포노카르복실산, 포스포노카르복실레이트, 포스포노아세트산, 포스포노포름산, 메틸 포스포네이트, 붕소 포스포네이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트), 펩티드 핵산 백본(들), LNA 또는 연결)을 갖는 적어도 하나의 핵산 유사체를 포함한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 DNA를 포함한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기 내의 모든 뉴클레오티드 당은 데옥시리보스이다 (예를 들어, 모든 뉴클레오티드는 DNA임). 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포디에스테르 및 포스포디에스테르 유도체 (예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포노카르복실산, 포스포노카르복실레이트, 포스포노아세트산, 포스포노포름산, 메틸 포스포네이트, 붕소 포스포네이트, O-메틸포스포로아미다이트, 또는 그의 조합)로부터 선택된 뉴클레오티드간 연결을 갖는 DNA를 포함하거나 그러한 DNA이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택된 뉴클레오티드간 연결을 갖는 DNA를 포함한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포디에스테르 및 포스포로디티오에이트로부터 선택된 백본 연결을 갖는 DNA를 포함하거나 그러한 DNA이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포디에스테르 백본 연결을 포함한 DNA를 포함하거나 그러한 DNA이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포로티오에이트 백본 연결을 포함한 DNA를 포함하거나 그러한 DNA이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 포스포로디티오에이트 백본 연결을 포함한 DNA를 포함하거나 그러한 DNA이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 다른 TLR에 비해 TLR9와 우선적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 TLR9와 특이적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 TLR3과 특이적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 TLR7과 특이적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 TLR8과 특이적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 세포성 하위 구획 (예를 들어, 엔도솜) 연관 TLR (예를 들어, TLR3, TLR7, TLR8, 또는 TLR9)과 특이적으로 결합한다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 G-풍부 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그러한 올리고뉴클레오티드이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 CpG 모티프를 포함하며, 여기서 C 및 G는 뉴클레오티드이고 p는 C와 G를 연결하는 포스페이트이다. 실시양태에서, CpG 모티프는 비-메틸화된다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 클래스 A CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 클래스 B CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기는 클래스 C CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다. 실시양태에서, TLR-결합 DNA 치환기 (예를 들어, TLR9-결합 DNA 치환기)는 A, G, C, 또는 T 염기 및 포스포디에스테르 연결 및/또는 포스포디에스테르 유도체 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 연결(들))을 갖는 데옥시리보핵산을 포함한다.
"CpG 모티프"라는 문구는 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결 또는 포스포디에스테르 유도체 뉴클레오티드간 연결을 통해 3' G 뉴클레오티드에 연결된 5' C 뉴클레오티드를 지칭한다. 실시양태에서, CpG 모티프는 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 실시양태에서, CpG 모티프는 포스포디에스테르 유도체 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "클래스 A CpG ODN" 또는 "A-클래스 CpG ODN" 또는 "D-유형 CpG ODN" 또는 "클래스 A CpG DNA 서열"은 생물학 및 화학 과학에서의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 5', 3' 또는 양쪽 말단에 폴리-G 서열 중 하나 이상; CpG 모티프를 포함하는 내부 팔린드롬 서열; 또는 데옥시뉴클레오티드를 연결하는 하나 이상의 포스포디에스테르 유도체를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 CpG 모티프를 지칭한다. 실시양태에서, 클래스 A CpG ODN은 5', 3', 또는 양쪽 말단에 폴리-G 서열; CpG 모티브를 포함하는 내부 팔린드롬 서열; 및 데옥시뉴클레오티드를 연결하는 하나 이상의 포스포디에스테르 유도체를 포함한다. 실시양태에서, 포스포디에스테르 유도체는 포스포로티오에이트이다. 클래스 A CpG ODN의 예는 ODN D19, ODN 1585, ODN 2216 및 ODN 2336을 포함한다.
용어 "클래스 B CpG ODN" 또는 "B-클래스 CpG ODN" 또는 "K-유형 CpG ODN" 또는 "클래스 B CpG DNA 서열"은 생물학 및 화학 과학에서의 통상적인 의미에 따라 사용되며, CpG 모티프를 포함하는 6량체 모티프 중 하나 이상; 모든 데옥시뉴클레오티드를 연결하는 포스포디에스테르 유도체를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 CpG 모티프를 지칭한다. 실시양태에서, 클래스 B CpG ODN은 CpG 모티프를 포함하는 6량체 모티프의 하나 이상의 카피 및 모든 데옥시뉴클레오티드를 연결하는 포스포디에스테르 유도체를 포함한다. 실시양태에서, 포스포디에스테르 유도체는 포스포로티오에이트이다. 실시양태에서, 클래스 B CpG ODN은 CpG 모티프를 포함하는 하나의 6량체 모티프를 포함한다. 실시양태에서, 클래스 B CpG ODN은 CpG 모티프를 포함하는 6량체 모티프의 2개의 카피를 포함한다. 실시양태에서, 클래스 B CpG ODN은 CpG 모티프를 포함하는 6량체 모티프의 3개의 카피를 포함한다. 실시양태에서, 클래스 B CpG ODN은 CpG 모티프를 포함하는 6량체 모티프의 4개의 카피를 포함한다. 클래스 B CpG ODN의 예는 ODN 1668, ODN 1826, ODN 2006 및 ODN 2007을 포함한다.
용어 "클래스 C CpG ODN" 또는 "C-클래스 CpG ODN" 또는 "C-유형 CpG DNA 서열"은 생물학 및 화학 과학에서의 통상적인 의미에 따라 사용되며, CpG 모티프를 포함하는 팔린드롬 서열 및 모든 데옥시뉴클레오티드를 연결하는 포스포디에스테르 유도체 (포스포로티오에이트)를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드를 지칭한다. 클래스 C CpG ODN의 예는 ODN 2395 및 ODN M362를 포함한다.
(IV) 임의적 부가의 구성요소
표적화 모이어티
하나 이상의 표적화 모이어티 (일명, 표적화 분자)가 전달 비히클 내에 포함될 수 있으며, 예를 들어, 전달 비히클 내로 로딩되거나, 전달 비히클의 표면에 부착되고/거나 전달 비히클 내에 봉입될 수 있다. 실시양태에서, 표적화 모이어티는 전달 비히클의 외부 표면 상에 표시된다. 특정 실시양태에서, 이러한 표적화 모이어티는 특이적 세포 표적화 (예를 들어, 독성 치료제의 면역 세포로의 전달 방지, 세포-특이적 기능을 갖는 치료제의 강화/표적화 전달)를 허용한다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 또한 치료 활성을 가질 수 있고 따라서 또한 본원에 제공된 면역치료 구축물의 치료제 (예를 들어, PD-L1 항체)로서 작용할 수 있다. 이러한 표적화 모이어티는 전신 전달에 특히 유익할 수 있다.
예시적인 표적화 분자는 기관, 조직, 세포 또는 세포외 매트릭스, 또는 특이적 유형의 종양 또는 감염된 세포와 연관된 하나 이상의 표적과 결합하는 단백질, 펩티드, 리간드, 핵산, 지질, 사카라이드, 항체, 압타머, 어피바디 분자, 리간드, 소분자, 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 전달 비히클이 표적화되는 특이성의 정도는 적절한 친화도 및 특이성을 갖는 표적화 분자의 선택을 통해 조정될 수 있다. 예를 들어, 항체는 매우 특이적이다. 이들은 폴리클로날, 모노클로날, 단편, 재조합 또는 단일 쇄일 수 있으며, 이들 중 다수는 상업적으로 입수가능하거나 또는 표준 기술을 사용하여 쉽게 수득될 수 있다. T-세포 특이적 분자, 항원, 및 종양 표적화 분자는 면역치료 구축물의 표면과 결합할 수 있다. 표적화 분자는 입자의 표면 상에 존재하는 하나 이상의 PEG 쇄의 말단과 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적 세포, 예컨대 악성 세포 (예를 들어, 종양 항원) 상에 독점적으로 또는 상승된 양으로 존재하는 세포 또는 종양 마커를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 쇄 가변 단편)이다. 표적 분자를 나노입자과 접합시키는 방법 뿐만 아니라 관심 세포 및 조직으로 면역치료 구축물을 지시하는데 사용될 수 있는 적합한 표적 분자는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ruoslahti et al. (Nat. Rev. Cancer, 2:83-90, 2002)]을 참조한다. 항원 결합 분자 예컨대 항체로 표적화될 수 있는 예시적인 종양 항원은 백신 항원과 관련하여 상기 논의된다. 특정 경우에, 치료제는 암과 면역 세포 둘 다에 독성이 있어, 최적 이하의 효능을 초래할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 면역치료 구축물은 표적화 모이어티와 접합되어, 치료제 및 아주반트가 암 세포로만 전달되는 것을 강화시킬 수 있다. 그 예는 암 세포 상에 발현되거나 임의로 과다발현되는 HER2, EGFR, PSMA, PD-L1 등에 대항한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역치료 구축물은 표적화 모이어티와 접합되어, 치료제 및 아주반트가 면역 세포로만 전달되는 것을 강화시킬 수 있다.
표적화 분자는 또한 뉴로필린 및 내피 표적화 분자, 인테그린, 셀렉틴, 부착 분자, 골 표적화 분자 예컨대 졸레드론산 및 알렌드론산 (예를 들어, 뼈로 전이된 암을 표적화하기 위함), 기질, 및 섬유모세포 표적화 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 면역치료 구축물이 항원 제시 세포 (APC), 특히 수지상 세포로서 공지된 APC의 하위부류를 표적으로 하게 한다. 수지상 세포는 세포내이입을 매개할 수 있는 다수의 세포 표면 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역치료 구축물은 종양 항원을 프로세싱하는 DC의 활성을 증강시키고 이에 따라 계내 종양 백신 접종을 더 잘 촉발한다. DC로의 표적화된 전달이 수행될 수 있다. 외인성 항원이 전신에 분포된 항원 제시 세포 상의 내재화 표면 분자를 표적으로 하는 것은 입자의 흡수를 용이하게 하고 요법에 있어서의 주요 속도 제한 단계를 극복할 수 있다.
수지상 세포 표적화 분자는 수지상 세포의 표면 상에 표시된 에피토프를 인식하고 그와 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 수지상 세포 표적화 분자는 또한 수지상 세포 상의 세포 표면 수용체와 결합하는 리간드를 포함한다. 그러한 수용체 중 하나인 렉틴 DEC-205는 체액성 반응 (항체-기반)과 세포성 반응 (CD8 T 세포) 둘 다를 2-4 자릿수 정도 부스트시키기 위해 시험관내 및 마우스에서 사용되었다 (Hawiger et al., J. Exp. Med., 194(6):769-79, 2001; Bonifaz et al., J. Exp. Med., 196(12):1627-38 2002; Bonifaz et al., J. Exp. Med., 199(6):815-24, 2004). 이들 보고서에서, 항원은 항-DEC205 중쇄에 융합되었고 면역화를 위해 재조합 항체 분자가 사용되었다.
만노스-특이적 렉틴 (만노스 수용체) 및 IgG Fc 수용체를 비롯한 다양한 다른 세포내이입 수용체가 또한, 항원 제시 효율의 유사한 증강과 함께 이러한 방식으로 표적화되었다. 표적화될 수 있는 다른 적합한 수용체는 DC-SIGN, 33D1, SIGLEC-H, DCIR, CD11c, 열 충격 단백질 수용체 및 스캐빈저 수용체를 포함한다. 이들 수용체에 대한 표적화 모이어티는 이들 수용체를 발현하는 면역 세포로의 우선적인 흡수를 위해 면역치료 구축물에 부착될 수 있다. 그 예는 높은 수준의 만노스 수용체를 갖는 대식세포 및 DC에 대한 표적화된 전달을 위해 면역치료 구축물 상에 부착된 만노스이다.
표적화될 수 있는 다른 수용체는 톨-유사 수용체 (TLR)를 포함한다. TLR은 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)을 인식하고 그와 결합한다. PAMP는 수지상 세포의 표면 상의 TLR을 표적으로 하고 내부적으로 신호를 보냄으로써, 잠재적으로 DC 항원 흡수, 성숙 및 T 세포 자극 능력을 증가시킨다. 입자 표면과 접합되거나 또는 공동-캡슐화된 PAMP는 비메틸화된 CpG DNA (박테리아), 이중 가닥 RNA (바이러스), 리포폴리사카라이드 (박테리아), 펩티도글리칸 (박테리아), 리포아라비노만닌 (박테리아), 자이모산 (효모), 미코플라즈마 지단백질 예컨대 MALP-2 (박테리아), 플라젤린 (박테리아) 폴리(이노신산-시티딜산) (박테리아), 리포테이코산 (박테리아) 또는 이미다조퀴놀린 (합성)을 포함한다.
표적화 분자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 전달 비히클과 공유 결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 표적화 모이어티는 PEG화 또는 비오틴-아비딘 브릿지에 의해 전달 비히클에 부착된다.
CD40 효능제. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 CD40을 표적으로 한다. 모이어티는 CD40 효능제일 수 있다. 세포 표면 분자 CD40은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며 면역, 조혈, 혈관, 상피 및 광범위한 종양 세포를 비롯한 기타 세포에 의해 광범위하게 발현된다. 암 요법에 대한 잠재적인 표적으로서, CD40은 면역 활성화의 간접적인 효과와 종양에 대한 직접적인 세포독성 효과 둘 다를 통해 종양 퇴행을 매개하여, CD40 효능제의 "2 대 1" 작용 메커니즘을 초래할 수 있다. CD40 효능제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 문헌 [Vonderheide, Clin Cancer Res, 13(4):1083-1088, 2007]에서 검토되었다. 예시적인 효능제는 재조합 CD40L (재조합 인간 삼량체), CD-870, 893 (완전 인간 IgG2 mAb), SGN-40 (인간화 IgG1), 및 HCD 122 (완전 인간 IgG1 mAb)를 포함한다. 가용성 효능작용 CD40 항체는 T 세포 매개 면역의 뮤린 모델에서 CD4+ 림프구에 의해 제공된 T 세포 도움을 대체하는 것으로 나타났다 (Khalil et al., Update Cancer Ther., 2:61-65, 2007).
인테그린 리간드. 또 다른 실시양태에서, 표적화 모이어티는 인테그린에 대한 리간드이다. 연구에 따르면 인테그린은 종양 세포의 표면 상에 과다발현되어 종양 세포와 정상 세포를 구별하는 마커로서 작용할 수 있다. 특정 인테그린은 또한 세포외 경로를 통해 TGF-β를 활성화시킨다. 잠재 TGF-β가 종양 세포로부터 방출된 후, 이는 종양 세포의 표면 상의 인테그린과 결합하여 잠재 TGF-β의 활성화를 초래한다. 종양 미세환경에서 증가된 TGF-β 농도는 면역 억제를 지원하고 조절 T 세포를 종양 환경으로 동원한다.
RGD 펩티드는 이중 기능을 제공할 수 있으며; 이는 전형적인 인테그린 표적화 리간드일 뿐만 아니라 (문헌 [Ruoslahti et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12:697-715, 1996]) APC를 활성화시키는 면역 위험 신호로도 작용한다 (Altincicek et al., Biol Chem., 390, 1303-11, 2009). 따라서, 바람직한 실시양태에서, RGD 펩티드는 전달 비히클 내로 로딩되고, 그의 표면에 부착되고/거나 전달 비히클 내에 봉입된다.
p53 항원을 인식하는 T 세포 수용체. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 인간 MHC의 맥락 내에서 p53 항원을 인식하는 T 세포 수용체 (TCR)이다. T 세포 수용체 재조합 단백질은 알파, 베타 쇄 또는 감마/델타 쇄로 구성된 T 세포 수용체 (α/β TCR 또는 γ/Δ TCR)를 포함하는 박테리아, 진핵 또는 효모 세포로부터 유래된다.
IL-15/IL-15Rα. 또 다른 실시양태에서, 표적화 모이어티는 IL-15/IL-15Rα 복합체이다. 인터루킨-15 (IL-15)는 IL-2와 특정 수용체 서브유닛을 공유하는 시토카인이므로 일부 중복되는 작용 메커니즘을 갖는다. IL-15는 수지상 세포에 의해 발현되며 자연 살해 (NK) 세포의 증식 및 프라이밍에 중요한 신호를 제공한다. 따라서, IL-15/IL-15Rα 복합체는 나노입자 조성물을, 예를 들어 자연 살해 (NK) 세포로 표적화하는데 사용될 수 있다.
(V) 전달 시스템
본원에 제공된 면역치료 구축물의 실시양태는 치료제 및 아주반트의 전달에 이용되는 전달 시스템에 대해 불가지론적이다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 전달 시스템은 임의의 유형의 공지되거나 개발될 미립자 전달 비히클을 사용하거나 이에 기초할 수 있다. 이들은 나노입자, 풀러렌, 내면체 메탈로풀러렌, 3금속성 질화물 주형화 내면체 메탈로풀러렌, 단일벽 및 다중벽 탄소 나노튜브, 분지형 및 수지상 탄소 나노튜브, 금 나노막대, 은 나노막대, 단일벽 및 다중벽 붕소/질산염 나노튜브, 탄소 나노튜브 피포드, 탄소 나노혼, 탄소 나노혼 피포드, 리포솜, 지질-기반 나노입자, 리포플렉스, 중합체성 나노입자, 인산칼슘 입자, 알루미늄 염 입자, 폴리플렉스, 나노쉘, 덴드리머, 마이크로입자, 양자점, 초상자성 나노입자, 나노막대, 셀룰로스 나노입자, 유리 및 중합체 마이크로- 및 나노-구체, 생분해성 PLGA 마이크로- 및 나노-구체, 금 나노입자, 아주반트 입자 (예를 들어, 바이로솜 또는 기타 바이러스 유사 입자), 은 나노입자, 탄소 나노입자, 철 나노입자, 다공성 및 비-다공성 실리카 나노입자, 및/또는 변형된 미셀을 포함한다. 여러 부류의 물질을 포함하는 혼성체 입자가 또한 사용될 수 있다. 나노미터 및 마이크로미터 크기의 입자를 사용할 수 있다. 입자는 임의의 모양, 구조 및 다공성일 수 있다. 치료제, 아주반트, 및 임의의 부가의 화합물은 임의의 적합한 수단에 의해 전달제와 함께 포함될 수 있으며, 예를 들어 전달 시스템 내로 로딩되거나, 그의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 전달 시스템 내에 봉입되거나, 또는 전달 시스템 내에 함유될 수 있다. 이러한 작용제는 캡슐화되거나, 공유 결합되거나 또는 비-공유 결합될 수 있다 (예를 들어, 정전기, 소수성, 반 데르 발스 또는 화합물-특이적 상호작용 (예컨대 핵산 염기 쌍형성, 리간드-수용체, 항체-항원, 비오틴-아비딘 등)에 의함).
일부 실시양태에서, 전달 시스템은 메소다공성 실리카 나노입자 (MSNP), 예컨대 미국 특허 공개 번호 US2017/0173169 또는 US2017/0172923에 기재된 것을 포함하며, 상기 문헌에 기재된 MSNP는 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 메소다공성 나노입자 (또는 상이한 나노입자)의 평균 입자 크기는 약 5 nm 내지 약 200 nm, 약 5 nm 내지 약 90 nm, 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 80 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 또는 약 100 nm이다. 일부 실시양태에서, 메소다공성 실리카 나노입자는 양이온성 중합체 또는 다른 화합물로 코팅된다. 양이온성 중합체는 임의의 적절한 수단을 사용하여 나노입자의 표면과 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 정전기적 상호작용을 통해 나노입자와 결합한다. 양이온성 중합체는 양전하를 갖는 임의의 중합체, 예컨대 PEI, 폴리아미도아민, 폴리(알릴아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 키토산, 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-아크릴아미드), 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-아크릴산), 폴리(L-리신), 디에틸아미노에틸-덱스트란, 폴리-(N-에틸-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트), 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-코-폴리(트리메틸아미노에틸메타크릴레이트 클로라이드)이나 이에 제한되지 않을 수 있다. 다른 양이온성 중합체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어 문헌 [Polymer Handbook, 4th Edition, Edited by: Brandrup, E.H. Immergut, and E.A. Grukle; John Wiley & Sons, 2003]에서 찾을 수 있다.
양이온성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 약 500 Da 내지 25 kDa의 크기 범위일 수 있고 분지형 또는 선형일 수 있다. 예를 들어, 평균 크기가 1.8 kDa 내지 10 kDa인 분지형 PEI가 나노입자 코어 상으로 로딩될 수 있다. 양이온성 중합체 대 나노입자의 비는 원하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 양이온성 중합체는 나노구축물의 1 내지 50 wt%, 예를 들어 5 내지 40 wt%, 10 내지 30 wt%, 20 내지 30 wt%, 5 내지 15 wt%, 5 내지 20 wt%, 5 내지 25 wt%, 5 내지 30 wt%, 10 내지 20 wt%, 10 내지 25 wt%, 또는 25 내지 40 wt%, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35 wt%로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 10 내지 20 wt%로 존재한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는, 예를 들어 절단가능한 디술피드 결합과 가교되어, 나노입자 상에 사전 또는 사후 코팅된다. 일부 실시양태에서, 부착된 양이온성 중합체는, 예를 들어 DSP (디티오비스[숙신이미딜 프로피오네이트]), DTSSP (3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트), 및 DTBP (디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트)를 사용하여 나노입자, 예를 들어 MSNP와 결합한 후에 가교된다. 가교는 용액 중 유리 양이온성 중합체의 부재 또는 존재하에 발생할 수 있다. 다른 실시양태에서, 양이온성 중합체는 가교되지 않는다.
안정제는 예를 들어 임의의 적절한 수단에 의해 MSNP (또는 상이한 나노입자) 및/또는 양이온성 중합체와 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정제는 나노입자 (예를 들어, MSNP) 상에 코팅된 가교된 양이온성 중합체의 아민 또는 기타 반응성 기와 접합된다. 예시적인 안정제는 PEG, 덱스트란, 폴리시알산, 히알루론산, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 및 폴리아크릴아미드, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
안정제는 예를 들어 나노입자, 양이온성 중합체, 및/또는 기타 구성요소에 부착하기 위한 다수의 화학적 반응성 기를 가질 수 있다. 예를 들어, 반응성 안정제, 예를 들어 PEG 유도체는 2개의 친전자성 모이어티, 예컨대 마이클 수용체와 활성화된 에스테르 둘 다를 함유하는 말레이미드-PEG-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (Mal-PEG-NHS)를 가질 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법과 연계해서 사용되는 안정제, 예를 들어 PEG는 일반적으로 500 Da 내지 40 kDa, 예를 들어 2 내지 10 kDa 범위의 분자량을 갖는다. 안정제는 나노구축물의 1 내지 50 wt%, 예를 들어 5 내지 30 wt%, 10 내지 20 wt%, 10 내지 25 wt%, 5 내지 15 wt%, 5 내지 20 wt%, 5 내지 25 wt%, 또는 1 내지 10 wt%, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 35, 40 또는 45 wt%로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "평균 입자 크기"는 일반적으로 입자 집단에서 입자의 통계적 평균 입자 크기 (직경)를 지칭한다. 본질적으로 구형 입자의 직경은 물리적 또는 유체역학적 직경을 지칭할 수 있다. 비-구형 입자의 직경은 우선적으로 유체역학적 직경을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비-구형 입자의 직경은 입자 표면 상의 두 지점 사이의 가장 큰 선형 거리를 지칭할 수 있다. 평균 유체역학적 입자 크기는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 동적 광산란을 사용하여 측정될 수 있다.
"단분산" 및 "균질한 크기 분포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 모든 입자가 동일하거나 거의 동일한 크기인 나노입자 또는 마이크로입자의 집단을 설명한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단분산 분포는 분포의 90%가 중앙값 입자 크기의 15% 이내, 보다 바람직하게 중앙값 입자 크기의 10% 이내, 가장 바람직하게 중앙값 입자 크기의 5% 이내인 입자 분포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "나노입자"는 일반적으로 5 nm 내지 1 마이크로미터 미만, 바람직하게 20 nm 내지 1 마이크로미터의 직경을 갖는 입자를 지칭한다. 입자는 어떤 모양도 가질 수 있다. 구형 모양을 갖는 나노입자는 일반적으로 "나노구체"로서 지칭된다. 본 개시내용은 암 및 관련 과다증식성 장애를 치료 또는 예방하도록 구성된 아주반트 및 치료제와 복합체를 형성하기 위한 특이적 유형 또는 종류의 나노입자에 제한되지 않는다.
나노입자의 예는 풀러렌 (일명 C60, C70, C76, C80, C84), 풀러렌 케이지 내부에 부가의 원자, 이온 또는 클러스터를 함유하는 내면체 메탈로풀러렌 (EMI), 3금속성 질화물 주형화 내면체 메탈로풀러렌 (TNT EME; 탄소 케이지 내의 3금속성 질화물 주형에서 형성되는 고-대칭 4원자 분자 클러스터 내면체), 단일벽 및 다중벽 탄소 나노튜브, 분지형 및 수지상 탄소 나노튜브, 금 나노막대, 은 나노막대, 단일벽 및 다중벽 붕소/질산염 나노튜브, 탄소 나노튜브 피포드 (내부 메탈로-풀러렌 및/또는 기타 내부 화학 구조가 있는 나노튜브), 탄소 나노혼, 탄소 나노혼 피포드, 지질 입자 리포솜, 리포플렉스, 중합체성 나노입자, 폴리플렉스, 나노쉘, 덴드리머, 양자점, 초상자성 나노입자, 나노막대, 아주반트 입자 (예를 들어, 바이로솜 또는 기타 바이러스 유사 입자), 및 셀룰로스 나노입자를 포함한다. 다른 예시적인 나노입자는 유리 및 중합체 마이크로- 및 나노-구체, 생분해성 PLGA 마이크로- 및 나노-구체, 금, 은, 백금, 탄소, 및 철 나노입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 변형된 미셀이다. 이러한 실시양태에서, 변형된 미셀은 소수성 중합체 블록을 함유하도록 변형된 폴리올 중합체를 포함한다. 본 개시내용에 사용된 바와 같은 용어 "소수성 중합체 블록"은 그 자체로 소수성이 되는 중합체의 세그먼트를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "미셀"은 액체에 분산된 분자의 집합체를 지칭한다. 수용액 중 전형적인 미셀은 주변 용매와 접촉하는 친수성 "헤드" 영역과 집합체를 형성하여, 미셀 중심의 소수성 단일 테일 영역을 격리한다. 일부 실시양태에서, 헤드 영역은 예를 들어 폴리올 중합체의 표면 영역일 수 있는 반면, 테일 영역은 예를 들어 폴리올 중합체의 소수성 중합체 블록 영역일 수 있다.
본 발명은 나노미터 규모에 더하여 마이크로미터 규모의 입자의 사용을 추가로 포괄한다. 마이크로입자가 사용되는 경우, 1-50 마이크로미터 정도로 비교적 작은 것이 바람직하다. 논의의 편의를 위해, 본원에서 "나노입자"의 사용은 진정한 나노입자 (1 nm 내지 1000 nm의 크기), 마이크로입자 (예를 들어, 1 마이크로미터 내지 50 마이크로미터), 또는 둘 다를 포괄한다.
나노입자의 예는, 예를 들어 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀러렌-유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머, 공유 부착된 금속 킬레이트를 갖는 덴드리머, 나노섬유, 나노혼, 나노-어니언, 나노막대, 나노로프, 아주반트 입자 (예를 들어, 바이로솜 또는 기타 바이러스 유사 입자), 및 양자점을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 금속 나노입자 (예를 들어, 금, 팔라듐, 백금, 은, 구리, 니켈, 코발트, 이리듐, 또는 그의 둘 이상의 합금의 나노입자)이다. 나노입자는 코어-쉘 나노입자에서와 같이 코어 또는 코어 및 쉘을 포함할 수 있다. 여러 부류의 물질을 포함하는 혼성체 입자가 또한 사용될 수 있다.
각각 전달 비히클 내로 로딩되고, 그의 표면에 부착되고/거나 전달 비히클 내에 봉입된 하나 이상의 활성제 및 하나 이상의 아주반트 화합물을 포함하는 면역치료 구축물-함유 조성물이 개시된다. 나노미립자 조성물은 용액 중 표적 세포에 활성제 또는 활성제들을 전달하는 것보다 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 나노미립자 조성물은 나노입자 상에 또는 나노입자 내에 하나 이상의 활성제의 국소화된 농도를 제시하여, 나노입자가 표적 세포를 만날 때 결합력을 증가시킨다. 나노미립자 조성물은 또한 활성제 또는 활성제들의 유효 전신 반감기 및 효능을 연장하기 위해 수일에 걸쳐 연장될 수 있는 조정가능한 방출 동역학을 갖는 활성제의 저장소로 작용할 수 있다.
전형적으로, 2가지 이상의 활성제 (하나의 치료제 및 하나의 아주반트를 포함함)는 전달 비히클 내로 로딩되고, 그의 표면에 부착되고/거나 전달 비히클 내에 봉입된다. 2가지 이상의 활성제 각각의 상대 농도 및 전달 비히클 상의 또는 내에서의 위치는 표적 세포에 의해 수용될 바람직한 투여량 및 제시에 적응하기 위해 조성물의 제조 동안 조작될 수 있다. 2가지 이상의 활성제를 동일한 전달 비히클 내로 또는 상으로 로딩하면 2가지 이상의 활성제가 표적 세포 또는 동일한 종양 미세환경에 동시에 또는 달리 미리 결정된 순서로 제시될 수 있다.
전달 비히클은, 예를 들어 나노리포겔, 중합체 입자, 실리카 입자, 리포솜, 또는 다중층 소포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미립자 전달 비히클은 나노규모 조성물, 예를 들어 10 nm 내지 1 마이크로미터 미만이다. 그러나, 일부 실시양태에서 및 일부 용도를 위해, 입자는 더 작거나 더 클 수 있는 것으로 인지될 것이다 (예를 들어, 마이크로입자 등). 본원에 개시된 예시적인 면역치료 구축물은 나노미립자 조성물로서 지칭될 수 있지만, 일부 실시양태에서 및 일부 용도를 위해, 미립자 조성물은 나노입자보다 다소 클 수 있는 것으로 인지할 것이다. 예를 들어, 미립자 조성물은 또한 1 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터일 수 있다. 이러한 조성물은 마이크로미립자 조성물로서 지칭될 수 있다.
암을 치료하기 위한 실시양태에서 입자는 종양 미세환경에 접근하기에 적합한 크기인 것이 바람직하다. 특정한 실시양태에서, 입자는 증강된 투과성 및 체류 (EPR) 효과에 의해 종양 미세환경 및/또는 종양 세포에 접근하기에 적합한 크기를 갖는다. EPR은 특정 크기의 분자 (예를 들어, 본원에서 논의된 미립자 조성물)가 정상 조직에서보다 종양 조직에 훨씬 더 축적되는 경향이 있는 특성을 지칭한다. 따라서, 암 치료를 위한 조성물에서, 전달 비히클은 바람직하게 25 nm 내지 500 nm 범위, 보다 바람직하게 30 nm 내지 300 nm 범위이다.
나노리포겔. 나노리포겔은 활성제의 지속적인 전달을 위해 리포솜과 중합체-기반 입자 둘 다의 장점을 조합한 코어-쉘 나노-미립자이다. 이러한 실시양태 및 적용 중 일부에서, 나노리포겔은 통상적인 나노입자 조성물과 비교하여 거대분자 및 분자의 조합에 대해 증가된 로딩 효율, 증가된 지속 방출 및 개선된 치료 효능을 나타낼 수 있다.
전형적으로, 나노리포겔의 외부 쉘은 카고를 보호하고 표적화 분자(들)로 기능화하기 위한 표면 뿐만 아니라 생체적합성을 제공한다. 외부 쉘은 구성요소들을 캡슐화하여, 예를 들어 환경 조건 또는 자극에 대한 반응으로 원할 때까지 노출되지 않도록 하여 단분산의 재현가능한 입자 집단을 생성하고 원하는 세포 유형으로의 내재화를 매개한다. 덴드리머 또는 기타 중합체일 수 있는 내부 코어는 외부 쉘에 대해 별도의 부가 기능성을 가지고 있다. 예를 들어, 내부 쉘은 약물, 백신 또는 조영제의 2차 침착을 허용하고; 상이한 물리화학적 특성을 가진 구성요소를 입자 내로 로딩하는 것을 증가시키며; 입자로부터 내용물의 조정가능한 방출을 허용하고; 엔도솜을 파괴하여 DNA/RNA, 약물 및/또는 단백질의 세포질 가용성을 증가시켜, 모두 약물 효과, 항원 제시 및 형질감염/침묵을 증강시킨다.
나노리포겔은 하나 이상의 숙주 분자를 함유하는 중합체 매트릭스 코어를 가지고 있다. 중합체 매트릭스는 바람직하게 히드로겔, 예컨대 하나 이상의 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 하나 이상의 지방족 폴리에스테르 세그먼트, 예컨대 폴리락트산을 함유하는 가교된 블록 공중합체이다. 하나 이상의 카고 분자가 중합체 매트릭스 내에 분산되거나 그와 공유 결합된다. 히드로겔 코어는 리포솜 쉘로 둘러싸여 있다.
나노리포겔은 이후에 제어된 방식으로 방출될 수 있는 다양한 활성제를 혼입하도록 구축될 수 있다. 활성제는 히드로겔 매트릭스 내에 분산될 수 있고, 리포솜 쉘 내에 분산될 수 있으며, 리포솜 쉘에 공유적으로 부착될 수 있고, 그의 조합일 수 있다. 활성제는 나노리포겔 내의 이들 부위 각각에 선택적으로 혼입될 수 있다. 더욱이, 이들 부위 각각으로부터의 활성제의 방출 속도는 독립적으로 조정될 수 있다. 이들 부위 각각은 크기 및 소수성/친수성을 포함하여 별개의 특성을 보유하고 있기 때문에, 이들 부위 각각에 독립적으로 혼입된 화학 물질은 크기 및 조성과 관련하여 현저하게 상이할 수 있다. 예를 들어, 나노리포겔은 중합체 매트릭스 내에 분산된 하나 이상의 화합물 뿐만 아니라 연합된 소분자 소수성 약물 및 아주반트(들)와 함께 로딩될 수 있다. 로딩될 수 있는 나노리포겔은 화학적 조성과 분자량이 크게 상이한 작용제의 동시 지속 방출을 제공한다.
나노리포겔은 전형적으로 구형이고, 평균 입자 크기가 50 nm 내지 1000 nm, 보다 바람직하게 75 nm 내지 300 nm, 가장 바람직하게 90 nm 내지 200 nm 범위이다. 특정 실시양태에서, 나노리포겔은 100 nm 내지 140 nm의 평균 입자 크기를 갖는다. 입자는 구형이 아닐 수 있다.
나노리포겔의 리포솜 쉘에 존재하는 지질의 성질에 따라, 양전하, 음전하 또는 거의 중성에 가까운 표면 전하를 갖는 나노리포겔이 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노리포겔은 거의 중성에 가까운 표면 전하를 갖는다. 특정 실시양태에서, 나노리포겔은 10 mV 내지 -10 mV, 보다 바람직하게 5 mV 내지 -5 mV, 보다 바람직하게 3 mV 내지 -3 mV, 가장 바람직하게 2 mV 내지 -2 mV의 ζ-전위를 갖는다.
소수성 활성제, 예컨대 단백질은 나노리포겔의 표면에 공유적으로 연결될 수 있는 반면, 친수성 활성제는 나노리포겔의 표면에 공유적으로 연결되거나 리포솜 쉘 내에 분산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리포솜 쉘은 하나 이상의 PEG화 지질을 포함한다. 이러한 경우에, 하나 이상의 활성제는 리포솜 쉘의 표면에 존재하는 하나 이상의 PEG 쇄의 말단과 접합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 지질은 원하는 경우, 비오틴화된 표적화 모이어티, 검출가능한 표지, 또는 다른 활성제가 그와 커플링될 수 있도록 하는 아비딘 모이어티를 포함하도록 변형된다.
특정한 실시양태에서, 하나 이상의 활성제는 외부 화학적 또는 물리적 자극, 예컨대 주위 pH 상의 변화에 반응하여 절단되는 연결기를 통해 나노리포겔의 표면에 공유적으로 연결되어, 원하는 생리학적 위치에서 활성제의 방출을 촉발한다.
코어. 나노리포겔 코어는 중합체 매트릭스로부터 형성된다. 매트릭스는 하기에 보다 자세히 논의되는 바와 같이 하나 이상의 숙주 분자를 포함할 수 있다. 나노리포겔 코어는 하나 이상의 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성제는 숙주 분자에 착화되거나, 중합체 매트릭스로 분산되거나, 또는 그의 조합일 수 있다.
나노리포겔의 중합체 매트릭스는 하나 이상의 중합체 또는 공중합체로부터 형성될 수 있다. 중합체 매트릭스의 조성 및 형태를 변화시킴으로써, 다양한 제어 방출 특징을 달성할 수 있어 장기간에 걸쳐 하나 이상의 활성제의 적당한 일정한 용량을 전달할 수 있다.
중합체 매트릭스는 비-생분해성 또는 생분해성 중합체로부터 형성될 수 있으나; 바람직하게, 중합체 매트릭스는 생분해성이다. 중합체 매트릭스는 1일 내지 1년, 보다 바람직하게 7일 내지 26주, 보다 바람직하게 7일 내지 20주, 가장 바람직하게 7일 내지 16주 범위의 기간에 걸쳐 분해되도록 선택될 수 있다. 생분해성 가교제는 가교제의 분해 후 작은 단편으로서 체내로부터 제거될 수 있는 중합체의 분자량을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일반적으로 합성 중합체가 선호되지만, 천연 중합체를 사용할 수도 있다. 대표적인 중합체는 폴리(히드록시산), 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리히드록시알카노에이트, 예컨대 폴리3-히드록시부티레이트 또는 폴리4-히드록시부티레이트; 폴리카프로락톤; 폴리(오르토에스테르); 폴리무수물; 폴리(포스파젠); 폴리(락티드-코-카프로락톤); 폴리(글리콜리드-코-카프로락톤); 폴리카르보네이트 예컨대 티로신 폴리카르보네이트; 폴리아미드 (합성 및 천연 폴리아미드 포함), 폴리펩티드 및 폴리(아미노산); 폴리에스테르아미드; 기타 생체적합성 폴리에스테르; 폴리(디옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 친수성 폴리에테르; 폴리우레탄; 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리실록산; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 폴리케탈; 폴리포스페이트; 폴리히드록시발레레이트; 폴리알킬렌 옥살레이트; 폴리알킬렌 숙시네이트; 폴리(말레산), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈; 폴리(알킬렌 옥시드), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 알킬 셀룰로스 (예를 들어, 메틸 셀룰로스), 히드록시알킬 셀룰로스 (예를 들어, 히드록시프로필 셀룰로스), 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로셀룰로스; 아크릴산, 메타크릴산의 중합체 또는 그의 공중합체 또는 유도체, 예를 들어 에스테르, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트) (본원에서 공동으로 "폴리아크릴산"으로서 지칭됨), 뿐만 아니라 그의 유도체, 공중합체 및 블렌드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "유도체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 만들어진 상기 기재된 중합체 백본에 대한 치환, 화학 기의 부가 및 기타 변형을 갖는 중합체를 포함한다. 단백질, 예컨대 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 프롤라민, 예컨대 제인, 및 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트 및 펙틴을 포함한 천연 중합체가 또한 중합체 매트릭스 내로 혼입될 수 있다. 다양한 중합체를 사용하여 중합체 매트릭스를 형성할 수 있지만, 일반적으로 그 결과로 생성된 중합체 매트릭스는 히드로겔이 될 것이다. 특정 경우에, 중합체 매트릭스가 천연 중합체를 함유하는 경우, 천연 중합체는 가수분해에 의해 분해되는 생체고분자, 예컨대 폴리히드록시알카노에이트이다.
중합체 매트릭스는 임의로 하나 이상의 가교가능한 중합체를 함유할 수 있다. 바람직하게, 가교가능한 중합체는 하나 이상의 광중합성 기를 함유하여, 나노리포겔 형성 후 중합체 매트릭스의 가교를 허용한다. 적합한 광중합성 기의 예는 비닐 기, 아크릴레이트 기, 메타크릴레이트 기 및 아크릴아미드 기를 포함한다. 존재하는 경우 광중합성 기는 가교가능한 중합체의 백본 내, 가교가능한 중합체의 측쇄 중 하나 이상 내, 가교가능한 중합체의 말단 중 하나 이상, 또는 그의 조합에 혼입될 수 있다.
중합체 매트릭스는 다양한 분자량을 갖는 중합체로부터 형성되어, 특이적 용도에 최적인 약물 방출 속도를 비롯한 특성을 갖는 나노리포겔을 형성할 수 있다. 일반적으로 중합체 매트릭스를 구성하는 중합체는 500 Da 내지 50 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다. 중합체 매트릭스가 비-가교가능한 중합체로부터 형성되는 경우, 중합체는 전형적으로 1 kDa 내지 50 kDa, 보다 바람직하게 1 kDa 내지 70 kDa, 가장 바람직하게 5 kDa 내지 50 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다. 중합체 매트릭스가 가교가능한 중합체로부터 형성되는 경우, 중합체는 전형적으로 500 Da 내지 25 kDa, 보다 바람직하게 1 kDa 내지 10 kDa, 가장 바람직하게 3 kDa 내지 6 kDa 범위의 더 낮은 평균 분자량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 5 kDa의 평균 분자량을 갖는 가교가능한 중합체로부터 형성된다.
일부 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체 또는 하나 이상의 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성된다. 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체 또는 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체 세그먼트는 8 내지 500개의 반복 단위, 보다 바람직하게 40 내지 300개의 반복 단위, 가장 바람직하게 50 내지 150개의 반복 단위를 함유할 수 있다. 적합한 폴리(알킬렌 옥시드)는 폴리에틸렌 글리콜 (폴리에틸렌 옥시드 또는 PEG로서 지칭되기도 함), 폴리프로필렌 1,2-글리콜, 폴리(프로필렌 옥시드), 폴리프로필렌 1,3-글리콜, 및 그의 공중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 지방족 폴리에스테르 또는 하나 이상의 지방족 폴리에스테르 세그먼트를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성된다. 바람직하게 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 세그먼트는 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) PGA, 또는 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA)이다.
일부 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 하나 이상의 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트, 하나 이상의 지방족 폴리에스테르 세그먼트, 및 임의로 하나 이상의 광중합성 기를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성된다. 이러한 경우에, 하나 이상의 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트는 그 결과로 생성된 중합체 매트릭스가 적합한 히드로겔을 형성하도록 중합체에 필요한 친수성을 주입하는 반면, 폴리에스테르 세그먼트는 조정가능한 소수성/친수성 및/또는 원하는 생체내 분해 특징을 갖는 중합체 매트릭스를 제공한다.
폴리에스테르 세그먼트의 분해 속도, 및 종종 상응하는 약물 방출 속도는 수일 (순수한 PGA의 경우) 내지 수개월 (순수한 PLA의 경우)로 다양할 수 있으며, 폴리에스테르 세그먼트에서 PLA 대 PGA의 비를 변경함으로서 쉽게 조작될 수 있다. 또한, 폴리(알킬렌 옥시드), 예컨대 PEG, 및 지방족 폴리에스테르, 예컨대 PGA, PLA 및 PLGA는 인간에서 사용하기에 안전한 것으로 확립되었으며; 이러한 물질은 30년 초과 동안 약물 전달 시스템을 포함한 인체 임상 적용에 사용되었다.
특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트의 어느 한 말단에 부착된 인접한 지방족 폴리에스테르 세그먼트, 및 하나 이상의 광중합성 기를 함유하는 트리-블록 공중합체로부터 형성된다. 바람직하게, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트는 PEG이고, 지방족 폴리에스테르 세그먼트는 PGA, PLA 또는 PLGA이다.
일반적으로, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트의 평균 분자량은 인접한 폴리에스테르 세그먼트의 평균 분자량보다 더 크다. 특정 실시양태에서, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트의 평균 분자량은 인접한 폴리에스테르 세그먼트 중 하나의 평균 분자량보다 적어도 3배 더 크고, 보다 바람직하게 인접한 폴리에스테르 세그먼트 중 하나의 평균 분자량보다 적어도 5배 더 크며, 가장 바람직하게 인접한 폴리에스테르 세그먼트 중 하나의 평균 분자량보다 적어도 10배 더 크다.
일부 경우에, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트는 500 Da 내지 10,000 Da, 보다 바람직하게 1,000 Da 내지 7,000 Da, 가장 바람직하게 2,500 Da 내지 5,000 Da 범위의 평균 분자량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 중심 폴리(알킬렌 옥시드) 세그먼트의 평균 분자량은 4,000 Da이다. 전형적으로, 각각의 인접한 폴리에스테르 세그먼트는 100 Da 내지 3,500 Da, 보다 바람직하게 100 Da 내지 1,000 Da, 가장 바람직하게 100 Da 내지 500 Da 범위의 평균 분자량을 갖는다.
천연 중합체의 예는 단백질, 예컨대 알부민, 콜라겐, 젤라틴 및 프롤라민, 예를 들어 제인, 및 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트, 셀룰로스 유도체 및 폴리히드록시알카노에이트, 예를 들어, 폴리히드록시부티레이트를 포함한다. 마이크로입자의 생체내 안정성은 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 공중합된 폴리(락티드-코-글리콜리드)를 사용하여 생산 동안 조정될 수 있다. PEG가 외부 표면에 노출되면, PEG의 친수성으로 인해 이러한 물질이 순환하는 시간이 증가할 수 있다.
비-생분해성 중합체의 예는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리(메트)아크릴산, 폴리아미드, 그의 공중합체 및 혼합물을 포함한다.
매트릭스는 또한 겔 유형 중합체, 예컨대 전통적인 이온 겔화 기술을 통해 생산된 알기네이트로 만들 수 있다. 중합체를 먼저 수용액에 용해시키고, 황산바륨 또는 일부 생물활성제와 혼합한 다음, 미세액적 형성 장치를 통해 압출시키며, 일부 경우에는 질소 가스의 흐름을 이용하여 액적을 분리한다. 천천히 교반되는 (예를 들어, 100-170 RPM) 이온 경화 배스는 형성되는 미세액적을 잡기 위해 압출 장치 아래에 위치한다. 마이크로입자는 겔화가 발생하기에 충분한 시간을 허용하기 위해 20분 내지 30분 동안 그 배스에서 인큐베이션되도록 방치시킨다. 다양한 크기의 압출기를 사용하거나 질소 가스 또는 중합체 용액 유속을 변경함으로써 마이크로입자 크기를 제어한다. 키토산 마이크로입자는 중합체를 산성 용액에 용해시키고 이를 트리폴리포스페이트와 가교시킴으로써 제조될 수 있다. 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 마이크로입자는 중합체를 산 용액에 용해시키고 납 이온으로 마이크로입자를 침전시킴으로써 제조될 수 있다. 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 알기네이트, CMC)의 경우, 상이한 분자량의 양으로 하전된 리간드 (예를 들어, 폴리리신, 폴리에틸렌이민)가 이온적으로 부착될 수 있다.
아마도 가장 널리 사용되는 것은 지방족 폴리에스테르, 구체적으로 소수성 폴리(락트산) (PLA), 보다 친수성인 폴리(글리콜산) PGA 및 그의 공중합체인 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA)이다. 이러한 중합체의 분해 속도 및 종종 상응하는 약물 방출 속도는 수일 (PGA) 내지 수개월 (PLA)로 다양할 수 있으며 PLA 대 PGA의 비를 변경함으로써 쉽게 조작될 수 있다. 둘째, PLGA와 이의 단독중합체인 PGA 및 PLA의 생리학적 적합성이 인간에게 안전한 사용을 위해 확립되었으며; 이러한 물질은 약물 전달 시스템을 포함한 다양한 인간 임상 적용에서 30년 초과의 역사를 가지고 있다. PLGA 나노입자는 수동적 또는 능동적 표적화에 의해 표적 조직에 대한 약물 약동학 및 생체분포를 개선시키는 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 마이크로입자는 수일에서 수주의 기간에 걸쳐 캡슐화되거나 부착될 분자를 방출하도록 설계된다. 방출 지속 시간에 영향을 미치는 요인은 주변 매질의 pH (PLGA의 산 촉매된 가수분해로 인해 pH 5 이하에서 방출 속도가 더 높음) 및 중합체 조성을 포함한다. 지방족 폴리에스테르는 소수성에 있어서 상이하며, 이는 결국 분해 속도에 영향을 미친다. 구체적으로, 소수성 폴리(락트산) (PLA), 더 친수성인 폴리(글리콜산) PGA 및 그의 공중합체인 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA)는 다양한 방출 속도를 갖는다. 이러한 중합체의 분해 속도 및 종종 상응하는 약물 방출 속도는 수일 (PGA) 내지 수개월 (PLA)로 다양할 수 있으며 PLA 대 PGA의 비를 변경함으로써 쉽게 조작된다.
쉘 구성요소. 나노리포겔은 하나 이상의 동심 지질 단층 또는 지질 이중층으로 구성된 리포솜 쉘을 포함한다. 쉘은 하나 이상의 활성제, 표적화 분자, 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
나노리포겔은 하나 이상의 동심 지질 단층 또는 지질 이중층으로 구성된 리포솜 쉘을 포함한다. 리포솜 쉘의 조성은 생체내에서 하나 이상의 활성제의 방출 속도에 영향을 미치도록 변화될 수 있다. 지질은 또한 원하는 경우 공유 가교되어 생체내 약물 방출을 변경할 수 있다.
지질 쉘은 단일 지질 이중층 (단일층) 또는 여러 개의 동심 지질 이중층 (다중층)으로부터 형성될 수 있다. 지질 쉘은 단일 지질로부터 형성될 수 있으나; 바람직한 실시양태에서, 지질 쉘은 하나 초과의 지질의 조합으로부터 형성된다. 지질은 생리학적 pH에서 중성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다.
적합한 중성 및 음이온성 지질은 스테롤 및 지질, 예컨대 콜레스테롤, 인지질, 리소지질, 리소인지질, 및 스핑고지질을 포함한다. 중성 및 음이온성 지질은 포스파티딜콜린 (PC) (예컨대 계란 PC, 대두 PC), 예를 들어 1,2-디아실-글리세로-3-포스포콜린; 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 (PI); 당지질; 스핑고인지질, 예컨대 스핑고미엘린; 스핑고당지질 (1-세라미딜 글루코시드로서 공지되기도 함), 예컨대 세라미드 갈락토피라노시드, 강글리오시드 및 세레브로시드; 지방산, 카르복실산 기를 함유하는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 및 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 예를 들어 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 1,2-디올레오일글리세릴 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 1,2-디헥사데실포스포에탄올아민 (DHPE), 1,2-디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC) 및 1,2-디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC)을 포함한다. 또한 이들 지질의 천연 (예를 들어, 조직 유래 L-.알파.-포스파티딜: 난황, 심장, 뇌, 간, 대두) 및/또는 합성 (예를 들어, 포화 및 불포화 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헵타노일-SN-글리세로-3-포스포콜린) 유도체가 적합하다.
적합한 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 염을 포함하며, 이는 TAP 지질, 예를 들어 메틸술페이트 염으로서 지칭되기도 한다. 적합한 TAP 지질은 DOTAP (디올레오일-), DMTAP (디미리스토일-), DPTAP (디팔미토일-), 및 DSTAP (디스테아로일-)를 포함한다. 다른 적합한 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDAB), 1,2-디아실옥시-3-트리메틸암모늄 프로판, N-[1-(2,3-디올로일옥시)프로필]-N,N-디메틸 아민 (DODAP), 1, 2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 디옥타데실아미도글리실스페르민 (DOGS), 3-[N--(N',N'-디메틸아미노-에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol); 2,3-디올레오일옥시-N-(2-(스페르민카르복사미도)-에틸)-N,N-디메틸-1-프로파나미늄-트리플루오로-아세테이트 (DOSPA), .베타.-알라닐 콜레스테롤, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 디C14-아미딘, N-tert-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노-프로피온아미딘, N-(알파-트리메틸암모니오아세틸)디도데실-D-글루타메이트 클로라이드 (TMAG), 디테트라데카노일-N-(트리메틸암모니오-아세틸)디에탄올아민 클로라이드, 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드 (DOSPER), 및 N,N,N',N'-테트라메틸-, N'-비스(2-히드록실에틸)-2,3-디올레오일옥시-1,4-부탄디암모늄 아이오다이드, 1-[2-(아실옥시)에틸]2-알킬(알케닐)-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 유도체, 예컨대 1-[2-(9(Z)-옥타데세노일옥시)에틸]-2-(8(Z)-헵타데세닐-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 1-[2-(헥사데카노일옥시)에틸]-2-펜타데실-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DPTIM), 및 4차 아민 상에 히드록시알킬 모이어티를 함유하는 2,3-디알킬옥시프로필 4차 암모늄 유도체, 예를 들어 1,2-디올레오일-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시프로필 암모늄 브로마이드 (DORIE-HP), 1,2-디올레일-옥시-프로필-3-디메틸-히드록시부틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-HB), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시펜틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-Hpe), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록실에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 1,2-디팔미틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DPRIE), 및 1,2-디스테릴옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DSRIE)를 포함한다.
다른 적합한 지질은 상기 기재된 중성, 음이온성 및 양이온성 지질의 PEG화 유도체를 포함한다. 하나 이상의 PEG화 지질 유도체를 지질 쉘 내로 혼입하면, 그의 표면 상에 폴리에틸렌 글리콜 쇄을 표시하는 나노리포겔이 생성될 수 있다. 그 결과로 생성된 나노리포겔은 표면 상에 PEG 쇄가 결여된 나노리포겔과 비교 시 생체내에서 증가된 안정성 및 순환 시간을 가질 수 있다. 적합한 PEG화 지질의 예는 DSPE PEG (2000 MW) 및 DSPE PEG (5000 MW)를 포함한 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 (DSPE-PEG); 디팔미토일-글리세로-숙시네이트 폴리에틸렌 글리콜 (DPGS-PEG), 스테아릴-폴리에틸렌 글리콜 및 콜레스테릴-폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
특정 실시양태에서, 지질 쉘은 하나 초과의 지질의 조합으로부터 형성된다. 특정 실시양태에서 지질 쉘은 적어도 3개의 지질의 혼합물로부터 형성된다. 특정한 실시양태에서, 지질 쉘은 포스파티딜 콜린 (PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG), 및 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
일부 실시양태에서, 지질 쉘은 하나 이상의 PEG화 인지질과 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 혼합물로부터 형성된다. 특정 경우에, 하나 이상의 PEG화 지질 대 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 몰비는 1:1 내지 1:6, 보다 바람직하게 1:2 내지 1:6, 가장 바람직하게 1:3 내지 1:5의 범위이다. 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 PEG화 지질 대 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 몰비는 1:4이다.
일부 실시양태에서, 지질 쉘은 하나 이상의 인지질과 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 혼합물로부터 형성된다. 특정 경우에, 하나 이상의 인지질 대 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 몰비는 1:1 내지 6:1, 보다 바람직하게 2:1 내지 6:1, 가장 바람직하게 3:1 내지 5:1의 범위이다. 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 인지질 대 하나 이상의 부가의 지질 또는 스테롤의 몰비는 4:1이다.
바람직한 실시양태에서, 지질 쉘은 인지질, 예컨대 포스파티딜 콜린 (PC), PEG화 인지질, 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG), 및 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다. 특정한 실시양태에서, 지질 쉘은 포스파티딜 콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG), 및 콜레스테롤의 3:1:1 몰비의 혼합물로부터 형성된다.
중합체 입자. 전달 비히클은 또한 중합체 입자, 예를 들어 마이크로입자 또는 나노입자일 수 있다. 입자는 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있다. 중합체 입자를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 중합체는 나노리포겔의 중합체 매트릭스 구성요소와 관련하여 상기에서 논의되었다.
바람직한 생분해성 중합체의 예는 히드록시산 예컨대 락트산 및 글리콜산의 중합체, 및 PEG와의 공중합체, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 그의 블렌드 및 공중합체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 입자는 하나 이상의 폴리에스테르로 구성된다.
예를 들어, 입자는 하기 폴리에스테르 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 본원에서 "PGA"로서 지칭되는, 글리콜산 단위를 포함하는 단독중합체, 및 락트산 단위를 포함하는 단독중합체, 예컨대 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드 및 폴리-D,L-락티드 (본원에서 집합적으로 "PLA"로서 지칭됨), 및 카프로락톤 단위를 포함하는 단독중합체, 예컨대 폴리(.엡실론.-카프로락톤) (본원에서 집합적으로 "PCL"로서 지칭됨); 및 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체, 예컨대 락트산:글리콜산의 비를 특징으로 하는 다양한 형태의 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드) (본원에서 집합적으로 "PLGA"로서 지칭됨); 및 폴리아크릴레이트, 및 그의 유도체. 예시적인 중합체는 또한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 전술한 폴리에스테르의 공중합체, 예컨대 다양한 형태의 PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 공중합체 (본원에서 집합적으로 "PEG화 중합체"로서 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시양태에서, PEG 영역은 중합체와 공유적으로 연합되어 절단가능한 링커에 의해 "PEG화 중합체"를 산출할 수 있다. 알기네이트 중합체가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 입자는 PLGA로 구성된다. PLGA는 FDA 승인을 받은 안전한 중합체이다. PLGA 입자는 활성제를 보호하고 (즉, 캡슐화제), 장기간 방출을 촉진하고, 표적화 모이어티를 부가할 수 있기 때문에 유리한다.
입자는 중합체와 표적화 모이어티, 검출가능한 표지, 또는 다른 활성제 간의 말단 대 말단 연결을 함유하는 하나 이상의 중합체 접합체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 변형된 중합체는 PLGA-PEG-포스포네이트일 수 있다. 또 다른 예에서, 입자는 아비딘 모이어티를 포함하도록 변형되고 비오티닐화된 표적화 모이어티, 검출가능한 표지, 또는 다른 활성제가 그와 커플링될 수 있다.
바람직한 천연 중합체의 예는 단백질, 예컨대 알부민, 콜라겐, 젤라틴 및 프롤라민, 예를 들어 제인, 및 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트, 셀룰로스 유도체 및 폴리히드록시알카노에이트, 예를 들어, 폴리히드록시부티레이트를 포함한다. 입자의 생체내 안정성은 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 공중합된 폴리(락티드-코-글리콜리드)를 사용함으로써 생산 동안 조정될 수 있다. PEG가 외부 표면에 노출되면, PEG의 친수성으로 인해 이러한 물질이 순환하는 시간이 증가할 수 있다.
비-생분해성 중합체의 예는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리(메트)아크릴산, 폴리아미드, 그의 공중합체 및 혼합물을 포함한다.
나노리포겔. 나노리포겔은 핵산, 단백질 및/또는 소분자의 지속적인 전달을 위해 리포솜과 중합체-기반 입자 둘 다의 장점을 조합한 나노입자이다. 나노리포겔은 구체, 디스크, 막대 또는 상이한 종횡비를 가진 기타 기하학적 형태일 수 있다. 나노구체가 더 클 수 있으며, 즉 마이크로입자이다. 나노리포겔은 전형적으로 원격 로딩에 의해 작용제를 캡슐화할 수 있는 합성 또는 천연 중합체로 형성되고, 상이한 방출 속도를 용이하게 하도록 특성을 조정할 수 있다. 방출 속도는 지질에 대한 중합체 비를 0.05 내지 5.0, 보다 바람직하게 0.5 내지 1.5로 변화시킴으로써 조정된다.
형성 전, 형성 동안 또는 형성 후에 작용제를 나노리포겔에 로딩하고 후속적으로 그 작용제에 대한 제어 방출 비히클로서 기능하도록 설계된다. 다수 개의 작용제의 제어 방출이 후속적으로 달성되도록 하나 초과의 작용제가 나노리포겔에 로딩될 수 있다.
작용제의 존재 하에 나노리포겔의 재수화 프로세스에 의한 형성 동안 및/또는 형성 후에 하나 이상의 치료제 및/또는 아주반트가 나노리포겔에 로딩된다. 예를 들어, 항암제(들)와 함께 아주반트의 전달 및 방출을 위하여, 아주반트로서 작용하는 분자가 나노리포겔에 로딩되고, 그 후 나노리포겔에 형성 후 하나 이상의 항암제가 혼입된다.
중합체 나노입자
에멀젼 방법. 일부 실시양태에서, 중합체 나노입자는 에멀젼 용매 증발 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 중합체 물질은 수불혼화성 유기 용매에 용해되고 약물 용액 또는 약물 용액의 조합과 혼합된다. 수불혼화성 유기 용매는 클로로포름, 디클로로메탄 및 아실 아세테이트 중 하나 이상일 수 있다. 약물은 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로필 알콜, 아세토니트릴 및 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 하나 이상에 용해될 수 있다. 이어서, 그 결과로 생성된 혼합물 용액에 수용액을 부가하여 유화에 의해 에멀젼 용액을 산출한다. 유화 기술은 프로브 초음파 처리 또는 균질화기를 통한 균질화일 수 있다. 펩티드 또는 형광단 또는 약물은 입자의 중합체 매트릭스의 표면과 연합되거나, 그 내에서 캡슐화되거나, 그에 의해 둘러싸이고/거나 그 전체에 분포될 수 있다.
나노침전 방법. 또 다른 실시양태에서, 중합체 나노입자는 나노침전 방법 또는 미세유체 장치를 사용하여 제조된다. 중합체 물질은 수혼화성 유기 용매 중의 약물 또는 약물 조합과 혼합된다. 이어서, 그 결과로 생성된 혼합물 용액을 수용액에 부가하여 나노입자 용액을 산출한다.
예시적인 제조 방법. 입자는 입자의 중합체 조성을 포함하는 기준에 기초하여 선택될 수 있는 다양한 방법을 사용하여 상이한 중합체로부터 제조될 수 있으며, 작용제(들)는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 입자 내로 로딩되거나 입자와 연합된다. 예시적인 방법이 하기에 제공된다.
용매 증발. 이러한 방법에서, 중합체는 휘발성 유기 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드에 용해된다. 약물 (가용성이거나 또는 미세 입자로서 분산됨)을 용액에 부가하고, 혼합물을 표면 활성제 예컨대 폴리(비닐 알콜)를 함유하는 수용액에 현탁시킨다. 그 결과로 생성된 에멀젼은 대부분의 유기 용매가 증발되어 고체 입자가 남을 때까지 교반시킨다. 그 결과로 생성된 입자를 물로 세척하고 동결건조기에서 밤새 건조시킨다. 이러한 방법으로 상이한 크기 (0.5-1000 마이크로미터)와 형태를 가진 입자를 수득할 수 있다. 이러한 방법은 폴리에스테르 및 폴리스티렌과 같은 비교적 안정적인 중합체에 유용한다.
그러나, 불안정한 중합체, 예컨대 폴리무수물은 물의 존재로 인해 제조 프로세스 동안 분해될 수 있다. 이러한 중합체의 경우에는, 완전하게 무수성인 유기 용매에서 수행되는 하기 두 가지 방법이 보다 유용한다.
핫 멜트 마이크로캡슐화. 이러한 방법에서는 중합체를 먼저 용융시킨 다음, 이를 고체 입자와 혼합한다. 혼합물을 비혼화성 용매 (예컨대 실리콘 오일)에 현탁시키고 계속 교반하면서 중합체의 융점 5℃ 위로 가열한다. 일단 에멀젼이 안정화되면, 중합체 입자가 고형화될 때까지 냉각시킨다. 그 결과로 생성된 입자를 석유 에테르로 경사분리함으로써 세척하여 자유 유동성 분말을 제공한다. 이러한 방법으로 0.5 내지 1000 마이크로미터 크기의 입자를 수득한다. 이러한 기술로 제조된 구체의 외부 표면은 통상적으로 부드럽고 조밀하다. 이러한 절차는 폴리에스테르 및 폴리무수물로 만들어진 입자를 제조하는데 사용된다. 그러나, 이러한 방법은 분자량이 1,000 내지 50,000인 중합체로 제한된다.
용매 제거. 이러한 기술은 주로 폴리무수물을 위해 설계되었다. 이러한 방법에서는, 약물을 메틸렌 클로라이드와 같은 휘발성 유기 용매 중의 선택된 중합체의 용액에 분산 또는 용해시킨다. 이러한 혼합물은 에멀젼을 형성하기 위해 유기 오일 (예컨대, 실리콘 오일)에서 교반함으로써 현탁시킨다. 용매 증발과 달리, 이러한 방법은 융점이 높고 분자량이 상이한 중합체로부터 입자를 만드는데 사용될 수 있다. 이러한 절차에 의해 1 내지 300 마이크로미터 범위의 입자를 수득할 수 있다. 이러한 기술로 생산된 구체의 외부 형태는 사용된 중합체 유형에 크게 의존한다.
분무-건조. 이러한 방법에서는, 중합체를 유기 용매에 용해시킨다. 공지된 양의 활성 약물을 중합체 용액에 현탁시키거나 (불용성 약물) 공동-용해시킨다 (가용성 약물). 그런 다음 용액 또는 분산액을 분무-건조시킨다. 미니-분무 건조기 [부치(Buchi)]에 대한 전형적인 프로세스 파라미터는 하기와 같다: 중합체 농도 = 0.04 g/mL, 입구 온도 = -24℃, 출구 온도 = 13-15℃, 흡인기 설정 = 15, 펌프 설정 = 10 mL/분, 스프레이 유동 = 600 Nl/hr, 및 노즐 직경 = 0.5 mm. 사용되는 중합체의 유형에 따라 형태가 달라지는 1-10 마이크로미터 범위의 마이크로입자가 수득된다.
히드로겔 입자. 겔 유형 중합체, 예컨대 알기네이트로 만들어진 입자는 전통적인 이온 겔화 기술을 통해 생산된다. 중합체를 먼저 수용액에 용해시키고, 황산바륨 또는 일부 생물활성제와 혼합한 다음, 미세액적 형성 장치를 통해 압출시키며, 일부 경우에는 질소 가스의 흐름을 이용하여 액적을 분리한다. 천천히 교반되는 (예를 들어, 100-170 RPM) 이온 경화 배스는 형성되는 미세액적을 잡기 위해 압출 장치 아래에 위치한다. 입자는 겔화가 발생하기에 충분한 시간을 허용하기 위해 20분 내지 30분 동안 그 배스에서 인큐베이션되도록 방치시킨다. 다양한 크기의 압출기를 사용하거나 질소 가스 또는 중합체 용액 유속을 변경함으로써 입자 크기를 제어한다. 키토산 입자는 중합체를 산성 용액에 용해시키고 이를 트리폴리포스페이트와 가교시킴으로써 제조될 수 있다. 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 입자는 중합체를 산 용액에 용해시키고 납 이온으로 입자를 침전시킴으로써 제조될 수 있다. 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 알기네이트, CMC)의 경우, 상이한 분자량의 양으로 하전된 리간드 (예를 들어, 폴리리신, 폴리에틸렌이민)가 이온적으로 부착될 수 있다.
다른 전달 비히클
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 리포솜 또는 지질 나노입자이다. 리포솜은 전형적으로 층상 지질 이중층으로 구성된 구형 소포이다. 리포솜은, 예를 들어, 다중층 소포 (MLV), 소형 단일층 리포좀 소포 (SUV), 대형 단일층 소포 (LUV), 또는 달팽이관 소포일 수 있다. 개시된 나노미립자 조성물의 제조에 유용한 리포솜, 미셀, 및 기타 지질-기반 전달 비히클은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Torchilin et al. (Adv Drug Delivery Rev, 58(14):1532-55, 2006)]을 참조한다. 광범위한 리포솜 및 엑소솜이 본 발명과 함께 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸-술페이트 (DOTAP) 또는 리포펙타민(Lipofectamine)™을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키토산을 포함하는 전달 시스템은, 예를 들어 문헌 [Lu et al. (Cancer Cell, 18:185-197, 2010)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노벡터를 사용하여 대상체에 miRNA를 전달할 수 있고; 나노벡터는, 예를 들어 문헌 [Pramanik et al. (Mol Cancer Ther, 10:1470-1480, 2011)]에 기재되어 있다.
전달 비히클은 또한 실리카 입자일 수 있다. 개시된 나노미립자 조성물의 제조에 유용한 적합한 실리카 입자는 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Barbe et al. (Adv Materials, 16(21):1959-1966, 2004), Ngamcherdtrakul et al. (Adv Func Materials, 25: 2646-2659, 2015) 및 Argyo et al. (Chem. Mater., 26(1):435-451, 2014)]을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실리콘 나노입자 (예를 들어, 문헌 [Bharali et al. PNAS, 102(32): 11539-11544, 2005]에 기재된 바와 같음)를 사용하여 아주반트 및 또 다른 치료상 활성제를 세포에 전달할 수 있다. 체내에서 실리카 또는 실리콘의 용해도는 입자가 운반하는 작용제의 시간 방출 능력을 제공한다. 또한, 생분해성 중합체 또는 생환원성 가교제는 실리카 또는 실리콘 입자를 변형시켜 시간 방출 능력을 제공하는데 사용될 수 있다.
(VI) 제약 조성물 및 투여 제형
암, 전암 및 기타 증식성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 적어도 2가지 활성 구성요소/작용제를 포함하며, 그 중 하나는 (1) 종양 항원 방출을 유발하고/거나 (2) 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 치료상 활성제이고; 그 중 또 다른 것은 아주반트이다. 본원에 기재된 바와 같이, 활성제는 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 유기 또는 무기 (나노- 또는 마이크로-) 입자 등 내에서/그와 연합되어 전달된다.
조성물은 세포와 접촉하는 것과 같이 직접적으로 또는 임의의 생물학적 프로세스의 작용을 통해서와 같이 간접적으로 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 생리학상 허용되는 담체 또는 비히클에서 제형화될 수 있고 세포를 둘러싸는 조직 또는 유체 내로 주사될 수 있다. 조성물은 단순 확산, 세포내이입, 또는 임의의 능동 또는 수동 수송 메커니즘에 의해 세포막을 통과할 수 있다.
제약 조성물로 제형화되는 경우, 치료 화합물 (예컨대, 적어도 하나의 치료제 및 적어도 하나의 아주반트와 커플링된 전달 시스템)은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는"이라는 문구는 일반적으로 생리학적으로 허용되는 것으로 여겨지고 전형적으로 인간 또는 수의학 대상체에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 이상 반응, 예컨대 위장 장애, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 유도체"는 수용자에게 투여 시 원하는 활성제, 또는 그의 활성 대사산물 또는 잔류물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는, 원하는 활성제의 임의의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 전구약물, 예를 들어 에스테르를 의미한다. 그러한 유도체는 과도한 실험 없이도 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인식될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 문헌 [Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1 : Principles and Practice]의 교시를 참조한다. 제약상 허용되는 유도체는 염, 용매화물, 에스테르, 카르바메이트 및 포스페이트 에스테르를 포함한다.
요법을 위해 조성물을 그 자체로 사용하는 것이 가능하지만, 이를 제약 제형으로, 예를 들어 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실무와 관련하여 선택된 적합한 제약 부형제, 희석제 또는 담체와의 혼합물로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 제약 조성물 또는 제형은 제약상 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 담체와 연합하여, 적어도 하나의 활성 조성물, 또는 그의 제약상 허용되는 유도체를 포함한다. 부형제, 희석제 및/또는 담체는 제형의 다른 성분(들)과 양립가능하고 그의 수용자에게 현저하게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"하다.
본원에 개시된 임의의 조성물 제형은 연구, 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 것이든 간에, 투여의 혜택을 능가하는 유의하게 유해하거나, 알레르기성 또는 기타 불리한 반응을 일으키지 않는 것을 포함하는 임의의 다른 제약상 허용되는 담체를 유리하게 포함할 수 있다. 치료 용도를 위한 예시적인 제약상 허용되는 부형제, 희석제 및 담체는 제약 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A.R., Gennaro edit. 2005), 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 기재되어 있다. 더욱이, 제형은 미국 FDA 생물학적 표준 사무국 및/또는 기타 관련 외국 규제 기관에서 요구하는 바와 같은 무균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족하도록 제조될 수 있다. 제약 부형제(들), 희석제(들) 및 담체(들)는 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실무와 관련하여 선택될 수 있다.
이러한 제약 제형은 하나 이상의 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 도움으로 통상적인 방식으로 사용하기 위해 제시될 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 생체활성 물질에 대한 투여 형태의 형성을 도와주거나 가능하게 하며, 이는 희석제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 착색제 및 기타 성분을 포함한다. 보존제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제가 제약 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 벤조산나트륨, 아스코르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제가 또한 사용될 수 있다. 부형제는 원하는 기능을 수행하는 것 외에도, 무독성이고 섭취 시 내약성이 우수하며, 생체활성 물질의 흡수를 방해하지 않는 경우에 제약상 허용된다.
일반적으로 사용되는 예시적인 제약상 허용되는 담체는 모든 및 임의의 증량제 또는 충전제, 용매 또는 공용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 보존제, 등장제, 흡수 지연제, 염, 안정제, 완충제, 킬레이트제 (예를 들어, EDTA), 겔, 결합제, 붕해제 및/또는 윤활제를 포함한다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 푸마레이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및/또는 트리메틸아민 염을 포함한다.
예시적인 보존제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.
예시적인 등장제는 3가 이상의 당 알콜을 포함한 다가 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 또는 만니톨을 포함한다.
예시적인 안정제는 유기 당, 다가 당 알콜, 폴리에틸렌 글리콜; 황-함유 환원제, 아미노산, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 이뮤노글로불린, 친수성 중합체 또는 폴리사카라이드를 포함한다.
"치료상 유효량" 또는 "치료상 유효 용량"은 상태, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때, 이러한 상태, 장애 또는 병태에 영향을 미치기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료상 유효량"은 화합물, 질환 및 그의 중증도 및 치료될 포유동물의 연령, 체중, 신체 상태 및 반응성에 따라 달라질 것이다. 정확한 용량 및 제형은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), and Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조). 특정 경우에, "치료상 유효량"은 원하는 활성을, 예를 들어 10%, 50%, 또는 90%만큼 조정, 예를 들어 증가 또는 감소시키기에 충분한 양 또는 용량을 의미하는데 사용된다. 일반적으로, 치료상 유효량은 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료 요법 후 숙주에서 임상적으로 유의한 병태의 개선을 야기하기에 충분하다. 활성 성분의 농도 또는 양은 본원에 논의된 바와 같이 원하는 투여량 및 투여 요법에 의존한다.
특정한 대상체에게 투여되는 실제 투여량은 표적, 체중, 암의 병기, 암의 유형, 이전 또는 공동 치료적 개입, 대상의 특발성 및 투여 경로를 포함한 파라미터, 예컨대 신체적, 생리적 및 심리적 요인을 고려하여 의사, 수의사 또는 연구원에 의해 결정될 수 있다.
이러한 용도에 유효한 양은 질환의 중증도 및 특히 전이 부위가 관련된 경우, 그의 위치 및 치료 중인 환자의 체중 및 일반적인 상태에 따라 다를 것이다. 일반적으로 투여량은 1일 면역치료 구축물 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 숙주 체중의 범위이며, 1일 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 투여량이 보다 통상적으로 사용되며, 예를 들어 3-7 mg/kg의 투여량이 사용된다. 장기간에 걸친 유지 투여량은 필요에 따라 조정될 수 있다. 그러나 투여량은 환자의 요구 사항, 치료되는 병태의 중증도 및 이용되는 화합물에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 투여량은 특정한 환자에서 진단된 암의 유형 및 병기를 고려하여 경험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 환자에게 유익한 치료 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 용량의 크기는 또한 특정한 환자에서 특정한 벡터 또는 형질도입된 세포 유형의 투여에 수반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 특정한 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 의사의 기술 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량보다 적은 투여량으로 시작된다. 그 후, 상황 하에 최적의 효과에 도달할 때까지 그 투여량을 조금씩 증량한다. 편의상, 필요에 따라 총 1일 투여량을 하루 동안 여러번 나누어 투여할 수 있다.
선택된 투여량은 원하는 치료 효과, 투여 경로, 원하는 치료 지속 기간 및 이용되는 특이적 면역치료 복합체에 의해 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 면역치료 구축물은 투여당 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위로 투여될 수 있다 (예를 들어, 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 매일; 또는 매주 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과; 또는 매월 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과 등). 투여 경로가 또한 투여량을 결정할 때 고려될 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 면역치료 구축물은 정맥내 또는 복강내 경로에 의해 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위로 (예를 들어, 매일; 또는 매주 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과; 또는 매월 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과 등) 투여되거나, 또는 피하 경로 (예를 들어, 종양 내로 또는 종양에 인접하여 또는 TME 내로의 국소 주사)의 경우에는 0.0001 mg/kg 내지 1 mg/kg의 범위로 (예를 들어, 매일; 또는 매주 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과; 또는 매월 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과 등) 투여된다. 더 예시적인 투여량이 하기에 논의된다.
적합한 투여량은 1일, 1주 또는 1개월당 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 예시적인 용량은 본원에 개시된 활성 화합물 (면역치료 구축물) 0.05 mg/kg 내지 10.0 mg/kg을 포함할 수 있다. 총 1일 용량은 60분 동안 경구, 정맥내 또는 기타 투여를 사용하여 1일 약물의 투여 형태 0.05-3.0, 0.1-3.0, 0.5-3.0, 1.0-3.0, 1.5-3.0, 2.0-3.0, 2.5-3.0, 및 0.5-3.0 mg/kg의 총 1일 용량의 투여를 포함하여, 1일 1회 내지 3회 대상체에게 투여되는 작용제 0.05 mg/kg 내지 30.0 mg/kg일 수 있다. 하나의 특정한 예에서, 용량은 예를 들어, 최대 92-98% wt/v의 본원에 개시된 화합물을 갖는 조성물 1.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 또는 7.5 mg/kg의 총 1일 용량으로 대상체에게 QD 또는 BID로 투여될 수 있다.
부가의 유용한 용량은 종종 0.1 내지 5 μg/kg 또는 0.5 내지 1 μg /kg의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 μg/kg, 10 μg/kg, 20 μg /kg, 40 μg/kg, 80 μg/kg, 200 μg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg 또는 0.5 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 또는 그 초과를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 치료 물질은 심각한 질환 상태, 즉 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 이용될 수 있다. 그러한 경우에, 이러한 조성물의 실질적인 과량을 투여하는 것이 치료 의사에 의해 가능하고 바람직하다고 느낄 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 구체적 투여량은 활성 화합물의 약동학에 의해 영향을 받을 것이다. 투여를 위해, 치료상 유효량 (본원에서 용량으로서 지칭되기도 함)은 시험관내 검정 및/또는 동물 모델 연구로부터의 결과에 기초하여 초기에 추정될 수 있다. 그러한 정보는 관심 대상체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 유용한 전임상 시험은 약력학적 분석, 독성 분석 등을 포함한다.
치료상 유효량은 치료 요법의 과정 동안 (예를 들어, 매시간, 2시간마다, 3시간마다, 4시간마다, 6시간마다, 9시간마다, 12시간마다, 18시간마다, 매일, 격일, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 2주마다, 3주마다 또는 매월) 단일 또는 다수의 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다.
활성제를 함유하는 화합물의 유효량은 원하는 치료적, 예방적 및/또는 생물학적 효과를 부분적으로 또는 완전히 달성하는 용량을 포함한다. 특정한 적용에 대한 실제 유효량은 치료 중인 병태 및 투여 경로에 따라 다르다. 인간에 사용하기 위한 유효량은 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간에 대한 용량은 동물에서 유효한 것으로 밝혀진 국소 (예를 들어, 종양내) 또는 순환 수준을 달성하도록 제형화될 수 있다.
조성물은 에탄올, 부피바카인, 클로로프로카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프로카인, 로피바카인, 테트라카인, 데스플루란, 이소플루란, 케타민, 프로포폴, 세보플루란, 코데인, 펜타닐, 히드로모르폰, 마르카인, 메페리딘, 메타돈, 모르핀, 옥시코돈, 레미펜타닐, 수펜타닐, 부토르파놀, 날부핀, 트라마돌, 벤조카인, 디부카인, 에틸 클로라이드, 크실로카인 및/또는 페나조피리딘을 포함한 하나 이상의 마취제와 함께 투여될 수 있다.
암 (예를 들어, 암 전이 포함)의 치료 또는 예방을 포함하는 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 다른 암 치료, 예컨대 화학요법제, 방사선 요법 및/또는 면역요법과 연계해서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 선택된 시간 창 내에, 예컨대 10분, 1시간, 3시간, 10시간, 15시간, 24시간, 또는 48시간의 시간 창 내에, 또는 상보적 치료가 임상적으로 관련된 치료 창 내에 있을 때, 또 다른 치료와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 비경구 (근육내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사) 투여, 점적 투여, 또는 데포 투여용일 수 있으며, 이는 각각의 투여 경로에 적절한 투여 형태로 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 표적화된 세포로의 조성물의 전달에 유효한 양으로, 예를 들어 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 전신으로 투여된다. 다른 경로는 점적 또는 점막을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 예를 들어 치료할 부위에 직접 주사함으로써 국소적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 종양 또는 병든 조직에 직접 주사되거나 달리 투여된다. 전형적으로, 국소 주사는 전신 투여에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 큰 증가된 국소화된 농도의 조성물을 야기한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 카테터 또는 주사기를 사용하여 적절한 세포에 국소적으로 전달된다. 이러한 조성물을 세포에 국소적으로 전달하는 다른 수단은 주입 펌프를 사용하거나 또는 조성물을 이식물의 인접 영역으로 지속 방출할 수 있는 중합체 이식물 내로 조성물을 혼입하는 것을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시양태에서 면역치료 구축물은 예를 들어 쉽게 접근가능한 종양, 예컨대 흑색종, 두경부암, 유방암 및 림프종에 국소적으로 제공되거나; 또는 다른 암, 예컨대 폐암, 간암, 췌장암, 전립선암 및 전이성에 대해 전신적으로 제공된다.
따라서, 본원에 기재된 치료 조성물은 인간 또는 수의학에서 사용하기 위한 임의의 편리한 방식을 포함한 다양한 경로에 의해 (그 자체로 또는 조합 요법의 일부로서) 투여될 수 있다. 원하는 활성제(들)의 치료상 유효량은 비경구로, 경점막으로 (예를 들어, 경구, 비강 또는 직장으로), 또는 경피로 도입되는 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 예를 들어 정맥내 주사, 또는 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 뇌실내 및 두개내 투여를 통한 비경구 투여이다. 투여는 볼루스로서, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수강내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-피부 종양으로의 국소 전달을 허용하는 이식된 시스템, 예를 들어, 간 동맥 주입 펌프, 대류 강화 전달이 또한 본원에 제공된 면역치료 구축물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 관절에 영향을 미치는 염증 상태의 치료에 관여하는 경우, 제약 조성물은 바람직하게 주사기를 사용한 주사에 의해 활막, 활액 또는 관절낭에 직접 투여될 수 있다. 투여는 국소적이거나 전신적일 수 있으며; 그 선택은 치료 중인 병태 뿐만 아니라 투여되는 활성제(들) 및 조성물에 의해 영향을 받을 수 있다.
주사를 위한 조성물은 수용액으로서, 예컨대 완충액, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리 염수 중에서 만들 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열원 없는 물과 함께 구성하기 위한 동결건조 및/또는 분말 형태일 수 있다.
면역치료 구축물을 포함하는 조성물은 비경구 주사에 의해 수용액 중에서 투여될 수 있다. 주사가능한 제형은 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있고, 임의로 제약상 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아주반트 및/또는 담체를 포함한다. 이러한 주사가능한 조성물은 희석제, 예컨대 멸균수, 다양한 완충제 함량 (예를 들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 완충 염수; 및 임의로, 첨가제, 예컨대 세정제 및 가용화제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80으로서 지칭되기도 한 트윈(TWEEN)™ 20, 트윈™ 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨) 및 보존제 (예를 들어, 티메로살, 벤질 알콜)를 포함할 수 있다. 비-수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 옥수수 오일, 젤라틴, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트이다. 주사용 제형은 동결건조되고, 예를 들어 사용 직전에 재현탁될 수 있다. 주사가능한 제형은, 예를 들어 박테리아 보유 필터를 통한 여과를 통해, 조성물 내로의 멸균제의 혼입에 의해, 조성물에 방사선을 조사함으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.
다른 실시양태에서, 면역치료 구축물 포함 조성물은 국소적으로 또는 점적에 의해 적용된다. 국소 투여는 폐, 비강, 구강 (설하, 협측), 질 또는 직장 점막에 대한 적용을 포함할 수 있다. 이러한 투여 방법은 점막 수송 요소(들)로 전달 비히클의 쉘 또는 코팅을 제형화함으로써 효과적일 수 있다. 조성물은 흡입하는 동안 폐로 전달될 수 있고 5 마이크로미터 미만의 공기역학적 직경을 갖는 분무 건조된 입자 또는 에어로졸로서 전달될 때 혈류로 폐 상피 내층을 가로질러 횡단할 수 있다.
치료 산물의 폐 전달을 위해 설계된 광범위한 기계 장치가 사용될 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 분무기, 정량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
점막에 투여하기 위한 제형은 전형적으로 정제, 겔, 캡슐, 현탁액 또는 에멀젼 내로 혼입될 수 있는 분무 건조된 약물 입자일 것이다. 표준 제약 부형제는 임의의 제형기로부터 입수가능하다.
경피 제형이 또한 제조될 수 있다. 이들은 전형적으로 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있는 연고, 로션, 스프레이 또는 패치일 것이다. 경피 제형은 침투 증강제를 포함할 수 있다. 전기천공법 및 마이크로니들을 포함한 화학적 증강제 및 물리적 방법이 이러한 방법과 연계해서 작동할 수 있다.
마이크로니들 (MN)은 높이 10-2000 μm, 너비 10-50 μm의 마이크로미터 크기의 니들로, 통증이 거의 없거나 전혀 없이 표피층을 통해 직접 진피 조직까지 침투할 수 있다 (Hao et al., J Biomed Nanotechnol, 13(12):1581-1597, 2017). 여러 유형의 마이크로니들이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 금속-기반 또는 플라스틱 마이크로니들 롤러를 사용하여 피부 표면을 물리적으로 파괴하여 적용된 국소 작용제 (이러한 경우 면역치료 구축물)의 침투를 증강시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 분해성 및 용해성 마이크로니들은 면역치료 구축물을 함유할 수 있다. 피부에 투여하면, 마이크로니들이 용해되어 피부 층 깊숙이 구축물을 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-분해성 마이크로니들은 면역치료 구축물로 코팅되어, 피부층 깊숙이 코팅된 구축물을 전달할 수 있다. 마이크로니들은 중합체, 사카라이드, 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질, 금속, 무기 화합물 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 부류의 물질로부터 제조될 수 있다 (Ye et al., Adv Drug Deliv Rev, 127: 106-118, 2018). 마이크로니들 기술에 대해 관련 기술분야에 공지된 모든 물질 및 제조 방법은 이러한 면역치료 구축물의 전달을 증강시키기 위해 적용할 수 있다.
치료제의 전신 또는 국소화된 전달을 용이하게 하는 임의의 장치가 또한 본 발명자들의 면역치료 구축물에 적용가능하다. 예를 들어, 최소한의 전신 독성으로 고농도의 세포독성제를 간 전이에 직접 전달하는 이식된 화학요법 장치인 간 동맥 주입 (HAI) 펌프 (문헌 [Cohen et al., The Oncologist, 8(6): 553-566, 2003])가 또한 본원에 기재된 면역치료 구축물을 전달하는데 활용될 수 있다.
(VII) 예시적인 사용 방법:
적어도 하나의 아주반트; 및 항원 방출을 유도할 수 있고/거나 면역억제 환경 (예컨대, 종양 미세환경)을 조정할 수 있는 적어도 하나의 치료상 활성제(들)를 포함하는 면역치료 구축물이 본원에 제공됨에 따라, 암, 암의 증상, 암 진행 (전암에서 암으로의 진행 포함), 및 암 전이를 포함한 과다증식성 질환, 장애 또는 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법이 본 발명에 의해 가능하게 되었다. 과다증식성 질환, 장애 또는 병태의 구체적 예는 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 암에 걸린 대상체 또는 개체의 면역 체계를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 면역치료 구축물은 암-매개 면역 억제를 억제하거나 역전시킬 수 있고 면역 인식 및 악성 종양의 제거를 허용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료" 또는 "치료하는 것"은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 치료된 대상체에서 발생하는 암의 임의의 개선을 지칭한다. 이러한 개선은 암의 악화 또는 진행의 예방 (예를 들어, 질환 진행이 없는 생존 개선)일 수 있다. 더욱이, 그러한 개선은 또한 암 또는 그에 수반되는 증상의 감소 또는 치유 (예를 들어, 종양 용적의 감소, 부분 관해, 완전 관해 (예를 들어, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 또는 그 초과 동안), 암 재발 방지, 전이 감소, 또는 종양 또는 병변의 수 감소)일 수 있다. 치료는 치료될 대상체의 100%에 대해 성공적이지 않을 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자 (예를 들어, 의사)에 의해 결정된 바와 같이 개체가 받은 다른 치료와 비교하여 특정 개체에서 성공적일 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "예방하는 것"은 본원에 사용된 바와 같은 암 또는 그에 수반되는 증후군의 발병을 피하는 것을 지칭한다. 예방은 미래의 특정 시간 창 내에 암의 발병을 피하는 것을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 상기 시간 창은 바람직하게, 본 발명의 의미에서 화합물의 투여 시에 시작되어야 하고 적어도 1개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년 동안 또는 심지어 대상체의 남은 생리적 수명 동안 지속되어야 한다. 예방은 치료될 대상체의 100%에 대해 성공적이지 않을 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자 (예를 들어, 의사)에 의해 결정된 바와 같이 개체가 받은 다른 치료와 비교하여 특정 개체에서 성공적일 수 있음을 이해할 것이다. 예방은 또한, 예를 들어 집단에서 재발가능성의 감소로써 측정되는 바와 같이, 관해 후 암의 재발의 맥락에서 이루어질 수 있다. 예방은 또한, 그렇지 않으면 다시 자랄 수 있고 나중에 양성 예후와 질환 증상을 나타낼 수 있는 신체의 임의의 부위의 암 세포를 제거하는 것을 지칭한다.
개시된 조성물은 양성 또는 악성 암, 및 그의 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료는 암 세포를 직접 표적으로 하여 이를 사멸시킬 수 있거나, 암 세포에 대항한 면역 반응을 증가시킴으로써 암 세포를 간접적으로 표적으로 하거나; 또는 그의 조합일 수 있다.
성숙한 동물에서는, 대부분의 기관과 조직에서 세포 재생과 세포 사멸 간의 균형이 통상적으로 유지된다. 체내의 다양한 유형의 성숙한 세포는 주어진 수명이 있으며; 이들 세포가 사멸함에 따라, 다양한 유형의 줄기 세포의 증식과 분화에 의해 새로운 세포가 생성된다. 정상적인 상황 하에서는, 임의의 특정한 유형의 세포 수가 일정하게 유지되도록 새로운 세포의 생산이 조절된다. 그러나 때때로, 정상적인 성장 제어 메커니즘에 더 이상 반응하지 않는 세포가 발생한다. 이러한 세포는 상당한 크기로 확장되어 종양이나 신생물을 생산할 수 있는 세포 클론을 생성한다. 무한 성장할 수 없고 건강한 주변 조직을 광범위하게 침범하지 않는 종양은 양성이다. 계속 성장하고 점진적으로 침습적인 종양은 악성이다. 용어 암은 구체적으로 악성 종양을 지칭한다. 비제어된 성장 외에도, 악성 종양은 전이를 나타낸다. 이러한 프로세스에서는, 암성 세포의 작은 덩어리가 종양으로부터 빠져 나와, 혈액이나 림프관을 침범하고, 다른 조직으로 옮겨져 계속 증식한다. 이러한 방식으로, 한 부위의 원발성 종양이 또 다른 부위의 이차 종양을 유발할 수 있다.
개시된 조성물은 대상체 내의 종양의 성장을 지연 또는 억제하고/거나, 종양의 성장 또는 크기를 감소시키거나 이를 완전히 제거하고/거나, 종양의 전이를 억제 또는 감소시키고/거나, 종양 발생 또는 성장과 연관된 증상을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체 내의 종양 부담을 감소시키거나 또는 시간 경과에 따라 종양 성장을 늦추거나 예방한다.
악성 종양은 종양이 유래된 조직의 배아 기원에 따라 분류될 수 있다. 암종은 내배엽 또는 외배엽 조직, 예컨대 피부 또는 내부 기관 및 내부 선의 상피 내층으로부터 발생하는 종양이다. 덜 자주 발생하는 육종은 중배엽 결합 조직, 예컨대 뼈, 지방, 및 연골로부터 유래된다. 백혈병과 림프종은 골수 조혈 세포의 악성 종양이다. 백혈병은 단일 세포로서 증식하는 반면, 림프종은 종양 덩어리로서 증식하는 경향이 있다. 악성 종양은 암을 확립하기 위해 신체의 수많은 기관 또는 조직에 나타날 수 있다.
제공된 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 암의 유형은 혈관암, 예컨대 다발성 골수종 뿐만 아니라 뼈, 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위 및 자궁의 선암종 및 육종을 포함한 고형암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 다수의 암 유형을 공동으로 치료하는데 사용된다. 조성물은 또한 다수의 위치에서의 전이 또는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
투여는 기존 종양의 치료에 제한되지 않고 개체에서 이러한 질환의 발병 위험을 예방하거나 낮추기 위해, 즉 예방적 용도로 사용될 수 있고, 예를 들어 전이를 통한 암의 확산을 감소시키기 위해 사용될 수도 있다. 예방 백신 접종의 잠재적 후보는 암 발병 위험이 높은 개체, 즉 특정 유형의 암에 대한 개인적 또는 가족 병력이 있는 개체를 포함된다.
한 실시양태에서, 아주반트 작용제 CpG, 항원 방출을 유도하는 흑색종 및 전구체 세포 (검은 점 내의 멜라닌 세포)를 사멸시키는 BRAFV600E에 대항한 siRNA, 및 면역억제 환경을 완화하는 STAT3에 대항한 siRNA를 포함하는 면역치료 구축물은 흑색종 발병 위험이 높은 대상체 및 흑색종 환자에서 적응 면역을 생성하는데 사용될 수 있다. 면역치료 구축물은 흑색종을 예방 및 치료할 뿐만 아니라 더 진행된 병기의 흑색종 환자에 대한 수술 후 미래의 재발로부터 보호해 줄 것이다. 표적화제와 함께 다른 유전자에 대항한 siRNA가 나노입자/구축물 상에 또는 내에 혼입될 수 있다.
전신 면역요법, 화학요법 및 생화학요법을 비롯한 다양한 치료 양식이 아주반트 설정에서 시험되었지만, 이들은 또한 전신 독성 및 부작용을 야기하며, 이는 본원에 기재된 면역치료 구축물을 사용한 국소화된 치료로 극복될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역치료 구축물 (예를 들어, CpG 또는 또 다른 아주반트를 화학약물, 표적화 요법 및/또는 STAT3에 대항한 siRNA와 함께 함유함)은 원발성 유방 종양의 외과적 제거 전에 종양내 주사에 의해 아주반트 설정에서 유방암을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 전신 약물의 독성 없이 암의 재발 및 전이를 예방할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "암"은 백혈병, 림프종, 암종 및 육종을 포함한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 제약 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 암은 림프종, 육종, 방광암, 골암, 뇌 종양, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 골수종, 갑상선암, 백혈병, 전립선암, 유방암 (예를 들어, 삼중 음성, ER 양성, ER 음성, 화학요법 내성, 헤르셉틴(Herceptin)® 내성, HER2 양성, 독소루비신 내성, 타목시펜 내성, 유관 암종, 소엽 암종, 원발성, 전이성), 난소암, 췌장암, 간암 (예를 들어, 간세포 암종), 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종, 편평세포 폐 암종, 선암종, 대세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 카르시노이드, 육종), 다형성 교모세포종, 신경교종, 흑색종, 전립선암, 거세 저항성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 교모세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종 (예를 들어, 두부, 경부 또는 식도), 결장직장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종 또는 다발성 골수종을 포함한다. 부가의 예는 갑상선암, 내분비계암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 식도암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 또는 수모세포종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 신경교종, 다형성 교모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 비뇨기 방광암, 전악성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식기암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 또는 외분비 췌장의 신생물, 갑상선 수질암, 갑상선 수질 암종, 흑색종, 결장직장암, 유두상 갑상선암, 간세포 암종, 유두의 파제트병, 엽상 종양, 소엽 암종, 유관 암종, 췌장 성상세포암, 간 성상세포암 또는 전립선암을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전암"은 암에 선행하거나 암으로 발전하는 상태 또는 성장을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "암 전이"는 암 세포 또는 종양이 신체의 한 기관 또는 일부에서 신체의 또 다른 기관 또는 일부로 확산되는 것을 지칭한다.
용어 "백혈병"은 광범위하게 혈액 형성 기관의 진행성 악성 질환을 지칭하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 그의 전구체의 왜곡된 증식 및 발달을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질환 급성 또는 만성의 지속 시간 및 특질; (2) 관련된 세포의 유형; 골수 (골수성), 림프 (림프성) 또는 단핵구; 및 (3) 혈액-백혈병 또는 비백혈병 (아백혈병)에서 비정상적인 세포 수의 증가 또는 비-증가에 기초하여 임상적으로 분류된다. 본원에 제공된 화합물, 제약 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 백혈병은, 예를 들어 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병, 비백혈성 백혈병, 백혈구증가성 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 배아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 모발 세포 백혈병, 혈모세포 백혈병, 혈구모세포 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 소골수모구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 네겔리 백혈병, 형질 세포 백혈병, 다발성 골수종, 형질구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리더 세포 백혈병, 실링 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 또는 미분화 세포 백혈병을 포함한다.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 구성된 종양을 지칭하며, 일반적으로 원섬유 또는 균질한 물질에 포매된 밀접하게 패킹된 세포로 구성된다. 본원에 제공된 화합물, 제약 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메시 육종, 지방 육종, 지방육종, 폐포 연부 육종, 법랑아 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 융모막 암종, 배아 육종, 윌름 종양 육종, 자궁내막 육종, 기질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유모세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소 출혈 육종, B 세포의 면역모세포 육종, 림프종, T 세포의 면역모세포 육종, 젠슨 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관육종, 백혈육종, 악성 간엽종 육종, 방골 육종, 망상내피 육종, 라우스 육종, 장낭포성 육종, 활액 육종 또는 모세혈관 육종을 포함한다.
용어 "흑색종"은 피부 및 기타 기관의 멜라닌 세포 시스템으로부터 발생하는 종양을 의미하는 것으로 간주된다. 본원에 제공되는 화합물, 제약 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 흑색종은, 예를 들어, 아크랄-렌티질 흑색종, 아멜란성 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만 흑색종, S91 흑색종, 하딩-패시 흑색종, 소아 흑색종, 악성 흑점자 흑색종, 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 설하 흑색종 또는 표재성 확산 흑색종을 포함한다.
용어 "암종"은 주변 조직에 침투하여 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성의 새로운 성장을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 제약 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 암종은, 예를 들어 갑상선 수질 암종, 가족성 갑상선 수질 암종, 선방 암종, 선방상 암종, 선낭 암종, 선양낭성 암종, 선종 암종, 부신 피질 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저양 암종, 기저 편평 세포 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 대뇌모양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드성 암종, 면포 암종, 코퍼스 암종, 소공질 암종, 퀴라세 암종, 피부 암종, 원통형 암종, 원통형 세포 암종, 관 암종, 유관 암종, 경막 암종, 배아 암종, 뇌양 암종, 표피양 암종, 상피 아데노이드 암종, 외생 암종, 궤양 전 암종, 섬유질 암종, 젤라티니포르니 암종, 젤라틴 암종, 거대 세포 암종, 기간토셀룰라레 암종, 선상 암종, 과립 세포 암종, 모발-매트릭스 암종, 조혈 암종, 간세포 암종, 허슬 세포 암종, 유리질 암종, 고신세포 암종, 유아 배아 암종, 계내 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페셔 암종, 쿨치츠키 세포 암종, 대세포 암종, 수정체 암종, 수정체 암종, 지방종 암종, 소엽 암종, 림프상피 암종, 수질 암종, 수질상 암종, 흑색종 암종, 몰리 암종, 점액 암종, 점막 암종, 점막 세포 암종, 점막 표피양 암종, 점막 암종, 점액 암종, 점액종, 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 화골 암종, 유골 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종, 전침윤성 암종, 가시상피 세포 암종, 윤상 암종, 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종, 육종 암종, 슈나이더 암종, 경피 암종, 음낭 암종, 인장 고리 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구상 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면 암종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 스트링 암종, 모세관확장 암종, 모세관 암종, 이행 세포 암종, 결절 암종, 관상 암종, 결절 암종, 사마귀 암종 또는 융모 암종을 포함한다.
(VIII) 키트
특히 적어도 하나의 기재된 치료 구축물 (적어도 하나의 치료제 및 적어도 하나의 아주반트를 함유하거나 그와 연합된 전달 비히클 포함)을 포함한 활성 구성요소(들)는 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 임의로 요법에 사용하기 위한 하나 이상의 부가의 작용제와 함께, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 화합물 또는 복합체 (예를 들어, 항암제)를 포함 (함유)하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 키트는 일정량의 적어도 하나의 부가의 항암 조성물, 또는 일정량의 적어도 하나의 부가의 항염증제, 또는 둘 다를 포함할 것이다.
키트 내의 임의의 활성 구성요소는 사전 측정된 투여량으로 제공될 수 있지만 필수는 아니며; 특정 키트는 1회 초과의 용량을 포함할 것으로 예상된다.
키트는 또한 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지서를 포함할 수 있으며, 이러한 통지서는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다. 통지서는 제공된 활성 성분이 대상체에게 투여될 수 있다고 명시할 수 있다. 키트는 키트 사용에 대한 추가 지침, 예를 들어 투여에 관한 지침; 관련 폐기물의 적절한 처리 등을 포함할 수 있다. 지침은 키트 내에 제공된 인쇄된 지침의 형태일 수 있거나, 또는 지침은 키트 자체의 일부분에 인쇄될 수 있다. 지침은 시트, 팜플렛, 브로셔, CD-ROM 또는 컴퓨터 판독가능 장치의 형태이거나 또는 웹사이트와 같은 원격 위치에 있는 지침에 대한 지시 사항을 제공할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 키트는 또한 키트를 효과적으로 사용하는데 필요한 필수 의료 용품, 예컨대 어플리케이터, 앰풀, 스폰지, 멸균 접착 스트립, 클로라프렙, 장갑 등의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트 중 임의의 것의 내용물의 변동이 이루어질 수 있다. 키트의 지침은 그러한 키트 내에 포함된 활성 성분(들)의 사용을 지시하여 본원에 기재된 임상 및/또는 치료 용도를 수행할 것이다.
개시된 발명의 실시양태의 실시 및/또는 시험에 사용된 적합한 방법, 재료 및 예가 본원에 기재되어 있다. 이러한 방법 및 재료는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 다른 방법, 재료 및 예가 사용될 수 있다.
하기 예시적인 실시양태 및 실시예(들)는 본 개시내용의 특정한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시에 비추어 본원에 개시된 구체적 실시양태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 개시의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 여전히 같거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
(IX) 예시적인 실시양태.
1. 전달 시스템; 예를 들어, 전달 시스템 내로 로딩되거나, 그의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 그 내에 봉입되거나, 또는 그 내에 함유된 적어도 하나의 치료제로서, 종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 치료제; 및, 예를 들어, 전달 시스템의 표면에 부착되거나, 그와 커플링되거나, 그 내에 봉입되거나, 또는 그 내에 함유된 적어도 하나의 아주반트 화합물을 포함하는 면역치료 구축물로서, 여기서 면역치료 구축물은 종양-특이적 항원 또는 오브알부민을 포함하지 않는 것인 면역치료 구축물.
2. 실시양태 1에 있어서, 전달 시스템이 리포솜, 지질-기반 입자, 중합체 입자, 무기 입자, 중합체 또는 지질로 코팅된 무기 입자, 또는 그의 혼성체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
3. 실시양태 2에 있어서, 전달 비히클이 리포솜, 지질-기반 입자, 중합체 입자, 무기 입자, 또는 중합체 또는 지질로 코팅된 무기 입자인 면역치료 구축물.
4. 실시양태 3에 있어서, 전달 비히클이 무기 입자이고 메소다공성 실리카, 금, 알루미늄, 산화철, 인산칼슘, 또는 항산화제 입자 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
5. 실시양태 4에 있어서, 무기 입자가 산화세륨을 포함하는 항산화제 입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
6. 실시양태 4에 있어서, 전달 비히클이 메소다공성 실리카 입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
7. 실시양태 1에 있어서, 전달 비히클이 풀러렌, 내면체 메탈로풀러렌, 3금속성 질화물 주형화 내면체 메탈로풀러렌, 단일벽 및 다중벽 탄소 나노튜브, 분지형 및 수지상 탄소 나노튜브, 금 나노막대, 은 나노막대, 단일벽 및 다중벽 붕소/질산염 나노튜브, 탄소 나노튜브 피포드, 탄소 나노혼, 탄소 나노혼 피포드, 리포솜, 나노쉘, 덴드리머, 마이크로입자, 양자점, 초상자성 나노입자, 나노막대, 셀룰로스 나노입자, 실리콘, 실리카 및 중합체 마이크로- 및 나노-구체, 실리카-쉘, 생분해성 PLGA 마이크로- 및 나노-구체, 금 입자, 산화세륨 입자, 산화아연 입자, 은 입자, 알루미늄 입자, 탄소 입자, 철 입자, 산화철 입자, 인산칼슘, 아주반트 입자, 및/또는 변형된 미셀 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전달 비히클이 PLGA, PLL, 폴리아르기닌, PEG, PEI, 또는 키토산 중 하나 이상을 포함하는 중합체 입자인 면역치료 구축물.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 5 nm 내지 999 nm의 유체역학적 크기를 갖는 나노입자인 면역치료 구축물.
10. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터의 유체역학적 크기를 갖는 마이크로입자인 면역치료 구축물.
11. 실시양태 6에 있어서, 전달 비히클이 약 5-200 nm의 크기를 갖는 메소다공성 실리카 나노입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
12. 실시양태 11에 있어서, 메소다공성 실리카 나노입자가, 가교된 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸렌 글리콜로 코팅되는 것인 면역치료 구축물.
13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, DNA, sgRNA (CRISPR-cas9 요소), 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 화학요법 약물, 독소, 항산화제, 소분자 억제제, 항체, 또는 방사선치료제를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
14. 실시양태 13에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, 또는 DNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
15. 실시양태 14에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
16. 실시양태 15에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3, CD39, CD73, TGF-β, PD-L1, PD1, CTLA4, MIF, PLK1, HIF, NOX1-4, HER2, EGFR, BCL2, AKT1, HIF1-알파, NOX1-4, AR, MYC, BRAF, BRAF V600E, 또는 MTDH의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
18. 실시양태 15 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 HER2의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
19. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3, CD39, CD73, TGF-β, PD-L1, PD1, CTLA4, MIF, PLK1, HIF, NOX1-4, HER2, EGFR, BCL2, AKT1, HIF1-알파, NOX1-4, AR, MYC, 또는 MTDH의 발현 또는 활성을 억제하는 것인 면역치료 구축물.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료제가 항생제, 식물 알칼로이드, PLK1 억제제, 유사분열 키나제 억제제, 면역 체크포인트 억제제, 백금-기반 화학요법제, HER2 소분자 억제제 또는 HER2-특이적 항체 중 하나 이상을 포함한 항암제인 면역치료 구축물.
21. 실시양태 20에 있어서, 치료제가 체크포인트 억제제이고, 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD1, 또는 CTLA4에 대항한 항체인 면역치료 구축물.
22. 실시양태 21에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-L1에 대항한 항체인 면역치료 구축물.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 PLK1 억제제를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
24. 실시양태 23에 있어서, PLK1 억제제가 볼라세르팁인 면역치료 구축물.
25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 도세탁셀, 미톡산트론, 또는 카바지탁셀 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
26. 실시양태 1 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 항-EGFR 항체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
27. 실시양태 26에 있어서, 항-EGFR 항체가 세툭시맙인 면역치료 구축물.
28. 실시양태 1 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 항-HER2 항체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
29. 실시양태 28에 있어서, 항-HER2 항체가 트라스투주맙인 면역치료 구축물.
30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 한 실시양태에 있어서, 아주반트가 면역자극 활성을 갖고 CpG 올리고뉴클레오티드, CpG 서열을 함유하는 DNA TLR 효능제, 비-CpG DNA TLR 효능제, RNA TLR 효능제, 알루미늄 염, 항-CD40 항체, 융합 단백질, 시토카인, 소분자 TLR 효능제, 오일- 또는 계면활성제-기반 아주반트, 리포폴리사카라이드, 식물 추출물, 또는 그의 유도체 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 아주반트 화합물이 CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가르디퀴모드, 폴리 I:C, 폴리 ICLC, dSLIM, 또는 EnanDIM을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 아주반트 화합물이 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 또는 그의 혼합물을 포함하는 조성물.
34. 암에 걸린 대상체에게 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 유효량을 투여하여, 암의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
36. 실시양태 35에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
37. 암의 증상을 나타내는 세포를 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 처리하는 방법.
38. 암의 증상을 나타내는 대상체로부터 수득된 세포를 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 처리하는 방법.
39. 세포를 생체외에서 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
40. 실시양태 38 또는 39에 있어서, 세포가 암 세포인 방법.
41. 실시양태 38 또는 39에 있어서, 세포가 암 세포가 아닌 것인 방법.
42. 실시양태 41에 있어서, 세포가 면역 세포인 방법.
43. 실시양태 38 또는 39에 있어서, 세포가 불멸화되는 것인 방법.
44. 실시양태 37 내지 43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 처리된 세포를 대상체에게 다시 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
45. 과다증식성 질환 또는 병태를 갖거나 또는 이러한 질환 또는 병태가 발병할 위험이 높은 것으로 진단된 대상체에게 실시양태 33의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
46. 실시양태 45에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
47. 실시양태 46에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
48. 실시양태 45 내지 47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 과다증식성 질환 또는 병태가 암, 전암, 또는 암 전이 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
49. 실시양태 45 내지 48 중 어느 한 실시양태에 있어서, 과다증식성 질환이 흑색종, 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 신장암, 결장직장암, 림프종, 결장암, 또는 간암 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
50. 실시양태 45 내지 49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 투여하는 것이 하기 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법: 대상체 내의 종양으로의 직접 주사; 대상체 내의 전신 주사; 또는 대상체에 대한 국소 적용.
51. 실시양태 45 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, 투여하는 것이 대상체에 대한 마이크로니들 적용을 포함하는 것인 방법.
52. 항암 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 항암제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항암 요법의 효과를 증강시키는 방법.
53. 실시양태 52에 있어서, 항암제가 화학요법제 또는 표적화 치료제인 방법.
54. 체크포인트 차단 면역요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 체크포인트 차단 면역요법 효과를 증강시키는 방법.
55. 방사선 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물 또는 실시양태 33의 조성물의 유효량; 및 적어도 하나의 방사선 요법을 투여하는 것을 포함하는, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 방사선 요법 효과를 증강시키는 방법.
56. 실시양태 52 내지 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역치료 구축물 또는 조성물 및 항암 요법이 순차적으로 또는 공동으로 투여되는 방법.
57. 실시양태 52 내지 56 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
58. 실시양태 57에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
59. 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 면역치료 구축물, 및 항암제를 포함하는 키트.
60. 실시양태 59에 있어서, 항암제가 화학요법제, 표적화 치료제, 또는 면역 체크포인트 억제제인 키트.
(X) 실시예.
실시예 1: 전신 항종양 면역을 프라이밍하는 암 백신 접종을 위한 저장소로 종양을 조작하기 위해 나노기술을 활용하는 것
면역 체크포인트 억제제 (ICI), 예컨대 PD-L1/PD-1, CTLA-4 등에 대한 억제제는 임상에서 인상적인 결과를 보여주었다 (Sharon et al., Chin J Cancer, 33(9):434-44, 2014; Buchbinder & Desai, Am J Clin Oncol, 39(1):98-106, 2016). 면역 체크포인트 억제제는 암과 싸우기 위해 환자 자신의 면역 체계의 브레이크를 해제하여, 면역학적 기억을 제공하고 치료를 중단한 후에도 면역 반응이 오래 지속되도록 한다. 따라서 ICI는 도 1에 도시된 바와 같이 화학요법 및 표적화 요법이 할 수 있는 것보다 말기 암에서 더 내구성 있는 반응을 제공할 수 있다. 그러나, 그 치료는 환자의 서브세트 (~10-40%)에서만 작동한다 (Ribas, Update Cancer Therapeutics, 2(3):133-139, 2007; Topalian et al., N Engl J Med, 366(26): p. 2443-54, 2012). 반응 결여는 전형적으로 기존의 항종양 면역 (예를 들어, 종양에 대항한 이펙터 (CD8+) T 세포)의 부재로 인한 것이다 (Santarpia & Karachaliou, Cancer Biology & Medicine, 12(2):74-78, 2015; Tumeh et al., Nature, 515(7528):568-571, 2014). 따라서 항종양 CD8+ T 세포 레퍼토리를 프라이밍할 수 있는 능력은 면역요법에 필수적이다.
계내 종양 백신 접종은 종양이 국소적으로 사멸되어, 면역자극의 존재 하에 종양 항원을 방출하는 전략이며, 이는 함께 종양에 대항한 전신 적응 면역을 프라이밍한다 (Pierce et al., Hum Vaccin Immunother, 11(8):1901-9, 2015). 이러한 전략은 기존의 암 백신 개발에서 종양 항원을 미리 식별할 필요가 없기 때문에 큰 가능성이 있다. 이것은 또한 독특한 종양 항원 세트가 방출되고 각각의 환자에 대한 특이적 면역을 프라이밍하기 때문에 개인 맞춤형 요법이다.
본원에 제공된 암에 대한 면역치료적 접근법은 환자 자신의 종양을 개인 맞춤형 종양 항원 세트를 위한 저장소로서 활용한다 (계내 종양 백신 접종). 본원에 기재된 시스템의 예는 AIRISE (면역 반응을 증강하고 종양의 억제 환경을 억제하는 것)로서 지칭되며; AIRISE는 단독으로 또는 체크포인트 억제제와 함께 사용될 때 환자의 생존 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다 (도 1). 제공된 입자 (면역치료 구축물)는 아주반트 (예를 들어, CpG) 및 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 하나 이상의 화합물 (siRNA, 약물, 소분자 등) (예를 들어, 도세탁셀, STAT3에 대항한 siRNA)을 운반한다. 종양 부위에서 제공된 면역치료 구축물로 치료하면 (예를 들어, 국소 종양내 주사 또는 전신 전달을 통한 종양 귀소를 통함), 종양 항원은 면역자극 (아주반트에 의해 제공됨)의 존재 하에 방출되어 적응 면역을 개시한다. 동시에, 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 화합물을 동일한 나노입자에 공동-전달하여, 계내 종양 백신 접종 효과를 최대화할 수 있다. 종양 항원은 나이브 T 세포에 항원을 제시하는 AIRISE 활성화된 항원 제시 세포 (APC)에 의해 흡수될 수 있다. T 세포 (종양 항원에 대항함)는 이펙터 T 세포 (림프절 내 또는 종양 부위 내)로 프라이밍되고 활성화되어 전신으로 증식한다. 이펙터 T 세포는 신체의 어느 위치에 있든 동일한 종양 항원을 공유하는 종양 (예를 들어, 국소 처리된 종양 및 신체의 다른 곳에 있는 미처리된 전이성 종양 둘 다)에 특이적으로 귀소될 것이다. 세포독성 T 세포에 의한 암 세포의 사멸은 더 많은 종양 항원을 방출하여, 양성 피드백 루프에서 항종양 T 세포 생성 프로세스를 증폭시킨다. 특히, 치료가 국소적인 경우에도 (예를 들어, 종양내 주사), 종양 부위에서 국소적으로 유도된 백신 접종 효과는 전신적이고 오래 지속되는 항종양 면역 반응을 생성한다 (도 2). 예를 들어, AIRISE는 흑색종 병변에 직접 주사할 수 있으며, 치료는 폐 또는 간에서 주사된 종양 및 미처리된 전이된 흑색종 종양 둘 다에 영향을 미칠 수 있다.
특이적 종양 항원을 인식하도록 훈련된 이러한 항종양 T 세포는 주사된/처리된 부위(들)와 신체의 다른 곳에 있는 부위 둘 다에서 종양을 제어할 것이다 (도 2). 카고 조합은 AIRISE를 만들기 위해 임의의 유형의 마이크로/나노입자 상에 적용될 수 있다. 하기 실시예는 개념 증명으로서 확립된 메소다공성 실리카 나노입자 (미국 특허 출원 공개 2017/0172923)를 활용한다. 도 11에 도시된 또 다른 예는 CpG 및 siSTAT3에 의한 계내 백신 접종을 위해 1.1 마이크로미터의 유체역학적 크기를 갖는 양이온성 지질 입자를 활용하였고, 도 7과 유사한 결과를 산출하며, 이는 다양한 유형과 크기의 입자가 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
방법 & 재료
나노입자 합성 및 특징규명: 메소다공성 실리카-기반 나노입자는 이전에 기재된 바와 같이 합성되었다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015; Ngamcherdtrakul et al., International J Nanomed, 13:4015-4027, 2018). 간단히 말해서, 메소다공성 실리카 나노입자 (MSNP)는 졸-겔 합성에 의해 합성되었다. MSNP 코어는 폴리에틸렌이민 (PEI)과 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 층별로 코팅되었다. MSNP 상의 PEI는 또한 이전에 설명된 바와 같이 증강된 올리고뉴클레오티드 전달 효능 및 안전성을 위해 가교되었다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015). 가교된 PEI 및 PEG로 코팅된 MSNP는 이후 본 실시예에서 "NP"로서 지칭된다.
NP에 대한 카고 로딩: siRNA 및 CpG (ODN 1826; 서열식별번호: 7)는 10분 혼합에 의해 나노입자 (NP)에 정전기적으로 로딩되었지만, 더 짧은 시간 (2-5분)도 효과적이었다. 미톡산트론은 또한 수용액 (예를 들어, PBS)에서 실온 하에 4시간 혼합하여 NP에 로딩되었다. 로딩은 원심분리에 의해 카고-로딩된 NP를 분리할 때 상청액에 자유 카고 분자의 부재에 의해 확인된 바와 같이 완전한 결합 방식으로 수행되었다. 카고 함량은 분광광도법으로 측정되었다. siRNA를 Dy677 염료 [다마콘(Dharmacon)]와 접합시켜 형광 신호에 의해 정량화하였다. CpG는 나노드롭 분광광도법으로 측정되었다. 결합되지 않은 siRNA 및 CpG는 또한 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 미톡산트론 (MTX)은 658 nm에서의 흡광도 측정에 의해 정량화되었다. CpG 및 siRNA가 있는 최종 NP는 제타사이저에 의해 PBS에서 유체역학적 크기에 대해 특징규명되었다 (도 26 및 29).
도세탁셀은 PEI 결합 전에 나노입자에 과량으로 로딩되었다. 간단히 말해서, MSNP는 PEI 결합 전에 밤새 에탄올에서 도세탁셀과 혼합되었다. 결합되지 않은 도세탁셀 및 PEI를 PBS에서 세척하였다. 그런 다음 PEI-NP (DTX)를 이전 방법에 따라 PEG와 접합시켰다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015; Ngamcherdtrakul et al., International J Nanomed, 13:4015-4027, 2018). 최종 산물은 0.2-0.8의 출발 DTX 대 MSNP 질량 비에서 0.5-1.7 wt% DTX를 함유한다. 그들은 100 nm의 DLS 크기를 갖는다.
B16F10 양측 동소 뮤린 흑색종 종양 모델: 6주령 암컷 C57BL/6 마우스를 찰스 리버(Charles River) NCI 콜로니 (미국 매사추세츠주 윌밍턴)으로부터 수득하였다. 각각의 마우스의 좌측 어깨 (국소, 250,000개 세포) 및 우측 어깨 (원격, 100,000개 세포)에 B16F10 세포를 피내 이식하였다. 이식 후 8일에, 시험 화합물/구축물을 좌측 (국소) 종양에만 종양내 주사한 반면, 우측 (원격) 종양은 미처리된 상태로 두었다. 달리 명시되지 않는 한, 시험 화합물/구축물은 3회 용량에 대해 3일마다 제공되었다. 마우스에서 국소 및 원격 종양 둘 다의 부담은 1-2일마다 버니어 캘리퍼로 측정하고 종양 용적은 V = 0.5 x 길이 x 너비2로 계산하였다. 생존을 또한 모니터링하였다. 총 종양 부담이 2000 mm3를 초과할 때 마우스를 희생시켰다.
NP 처리와 면역 체크포인트 억제제를 조합한 연구의 경우, PD-1 Ab (200 μg/마우스)와 CTLA-4 Ab (100 μg/마우스)의 칵테일을 NP 화합물의 종양내 처리와 같은 날 복강내로 제공하였다 (3일마다 3회 용량).
치료 효능이 면역 매개된다는 것을 확인하기 위해, 시험 화합물/구축물로 처리된 마우스에 CD8 항체를 복강내 주사하였으며 (200 μg/마우스), 이는 제1 종양내 처리 하루 전에 시작하여 전체 연구 내내 계속되었다.
면역 프로파일링을 위해, 관련 기술분야에 확립된 프로토콜에 따라 국소 및 원격 종양 및 이들 각각의 배출 림프절을 수집하고 단일 세포로 프로세싱하였다. 그런 다음 수거된 세포를 상이한 면역 세포 집단 및 그의 상태를 함께 확인해주는 상이한 표면 단백질 (예를 들어, CD45, CD8, CD4, CD44, TIM3, PD-1, CD39, LAG3, CD3, CD19, CD11b, CD11c, MHCII, CD80, Ly6C, Ly6G, F4/80, CD206)에 대한 형광 표지된 항체 세트로 염색하였다. 특정 세포내 단백질 (예를 들어, Ki67, FoxP3, STAT3)은 또한 제조업체의 프로토콜 [BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)]에 따라 염색할 수 있다. 유동 세포계수법은 전형적으로 BD 포르테사(Fortessa) (4개의 레이저, 최대 18개의 파라미터)에 의해 2개의 별도의 항체 패널 (림프계 및 골수)에서 수행되었다. 형광 보상은 관련 기술분야에 공지된 확립된 프로토콜에 따라 다색 유동 세포계수법의 견고성을 보장하기 위해 수행되었다. 종양 미세환경에서의 AIRISE 흡수 연구 (도 18)를 위해, 앞서 기재된 바와 같이 AIRISE-02 (siSTAT3 대신 알렉사488 염료 접합된 siSCR이 로딩됨)를 양측 B16F10 종양을 보유하는 마우스 내로 종양내 주사하였다. 처리 후 2시간에, 종양 (처리 및 미처리된)을 수거하고, 단일 세포로 프로세싱하고, 본원에 기재된 바와 같은 항체 패널로 표면 염색을 수행하였다. 종양에 상이한 세포 집단에서의 AIRISE-02의 존재는 유동 세포계수법에 의해 분석되었다.
LLC-JSP 전이성 뮤린 폐 종양 모델: LLC-JSP (200,000개 세포)를 6주령 C57BL/6 마우스에게 정맥내 (꼬리-정맥) 주사하였다. 암 세포 주사 후 3일에, 마우스를 무작위로 분류하고 총 4회 용량에 대해 3일마다 시험 화합물/구축물로 처리하였다. 이러한 모델에서는, AIRISE-02를 종양내 대신 꼬리-정맥을 통해 정맥내 주사하였다.
CT26 양측 이소성 종양 모델. 250K 및 100K CT26 (뮤린 결장직장암) 세포를 각각의 마우스 (Balb/c)의 양측 복부에 이식하였다. 종양 이식 후 15일에, 마우스를 시험 화합물/구축물로 처리하였다.
4T1 양측 동소 종양 모델. 100K 및 40K 4T1 세포를 각각의 마우스 (Balb/c)의 양측 유방 지방 패드 내로 이식하였다. 종양 이식 후 8일 또는 11일에 (명시된 바와 같음), 마우스를 시험 화합물/구축물로 처리하였다.
결과 & 논의
CpG 로딩된 나노입자는 유리 CpG보다 더 나은 아주반트 특성을 나타낸다.
C57BL/6 마우스 (n=3/군)에게 NP 상의 4 μg의 유리 CpG 또는 4 μg의 CpG를 마우스의 한쪽 발바닥에 주사하였다. 주사 후 24시간에, 국소 배출 림프절 (DLN) 및 비-배출 림프절 (NDLN)을 수거하고 CD11c, MHCII 및 CD80 발현에 대해 유동 세포계수법으로 분석하였다. CpG 로딩된 나노입자는 유리 CpG보다 훨씬 더 우수하게 국소 DLN에서의 수지상 세포를 활성화시켰다 (도 3). CpG-나노입자는 또한 동일한 부위에 여러 치료 카고를 공동-전달할 수 있는 가능성을 부가하였다. 추가로, 예시적인 나노입자는 mRNA 수준에서 종양의 면역억제 특징을 조정할 수 있는 siRNA의 전달을 위해 고도로 최적화되었다. 종양 면역억제의 여러 특징을 다루는 siRNA 또는 기타 표적화된 분자와 함께 CpG (또는 또 다른 아주반트)를 공동-전달하는 것은 면역치료 효과를 유리하게 프라이밍하기 위해 제안된다.
아주반트 로딩된 나노입자는 계내 종양 백신 접종을 촉발한다
계내 종양 백신 접종을 촉발할 수 있는 CpG-NP의 능력을 평가하기 위해, 2개의 (양측) 흑색종 종양을 보유하는 마우스를 사용하였다. 처리물은 2개의 종양 중 하나에만 종양내로 주사된 반면, 다른 종양은 미처리된 상태로 두었다. 종양 둘 다의 성장을 모니터링하였으며; CpG-NP의 종양내 처리는 전신 면역 반응을 성공적으로 프라이밍하였고 강력한 압스코팔 효과 (국소 처리된 종양과 원격 미처리된 종양 둘 다의 억제)를 유도하였다 (도 4). 그 결과로서, 생존이 또한 연장된다. 본원에 기재된 면역치료 구축물 기술은 계내 백신 접종을 촉발하므로, 종양 항원이 복합체 중 임의의 것 상으로 또는 그 내로 로딩될 필요가 없다.
동일한 NP에 대한 약물과 CpG의 공동-전달은 효과적인 계내 종양 백신 접종을 유도할 수 있다
계내 종양 백신 접종을 촉발하는 화학요법 약물의 종양내 주사는 널리 연구되지 않았다. 실제로, 화학요법 약물과 아주반트를 함유하는 나노입자의 종양내 주사는 이전에 수행된 적이 없다. 이것은 어떠한 활성화된 면역치료 반응도 무효화할 수 있는 면역 세포에 대한 화학요법 약물의 잠재적인 독성 때문이다.
놀랍게도, 동일한 나노입자에 대한 화학요법 약물 도세탁셀 (DTX)과 CpG의 동시 전달 (CpG-DTX-NP)은 면역 세포에 대한 잠재적인 화학요법의 독성에도 불구하고 CpG-NP의 계내 백신 접종 효과를 악화시키지 않았다 (도 5). 실제로, CpG-DTX-NP는 CpG-NP보다 국소 처리된 종양을 더 잘 제어할 수 있다. 동시에, CpG-DTX-NP는 원격 종양의 제어 및 마우스의 연장된 생존에 의해 나타난 바와 같이, 여전히 CpG-NP보다 약간 더 나은 계내 백신 접종 효과를 유도한다. 또한, DTX-NP는 어떠한 유의한 활성도 나타내지 않는다.
동일한 나노입자에 대한 또 다른 화학요법 약물 미톡산트론 (MTX)과 CpG의 공동-전달은 또한 CpG-NP의 계내 백신 접종 효과를 촉발하였다 (도 16).
면역 세포 분석은 종양과 림프절에서 활성화된 CD8+ T 세포의 상당한 증가를 보여준다.
처리 후 (도 5a), T 세포 상태는 1차 투약 후 제7일에 국소 및 원격 종양에서 특징규명되었다. 염수와 비교하여, CpG-DTX-NP (도 6에서 "NP"로서 약칭됨)로의 처리는 하기와 같은 세포독성 CD8+ T 세포의 바람직한 특징을 초래하였다: 처리된 종양과 원격 종양 둘 다에서 PD1의 더 낮은 발현 (도 6a), 처리된 종양에서 CD8+ T 세포의 더 높은 증식 (도 6b), 처리된 종양에서 덜 소모된 CD8+ T 세포 (도 6c), 및 조절 T 세포에 비해 더 높은 비의 CD8+ T 세포 (도 6d). 마찬가지로, 처리된 종양의 배출 림프절 (DLN)에서 더 높은 CD8+ T 세포가 관찰되었으며 (도 6e), 이는 또한 보다 활성화되었다 (도 6f). 활성화된 CD8+ T 세포는 종양 둘 다의 DLN에서 더 증식적이었다 (Ki67 마커에 의함) (도 6g). 비-DLN에서 더 많이 증식하고 활성화된 CD8+ T 세포가 관찰되었으며 (도 6h), 이는 T 세포가 국소 림프절 외부 (예를 들어, 혈액 내)로 수송되어, 치료의 압스코팔 효과에 기여한다는 것을 시사한다. 이러한 T 세포 특징은 본원에 기재된 나노입자가 유익한 항종양 T 세포 레퍼토리를 증가시켜 (비-소진 상태), 전신 면역을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 NP 상의 DTX는 종양 세포를 사멸시켜 종양 항원을 방출시켰지만, CD8+ T 세포에는 해를 끼치지 않았고, 오히려 그 증식을 증가시켰다.
동일한 NP에 대한 siRNA와 CpG의 공동-전달은 효과적인 계내 종양 백신 접종을 유도할 수 있다
단일 NP가 종양내 주사를 통해 아주반트와 siRNA를 공동-전달하는데 사용된 것은 이번이 처음이다. 나노입자에 의한 면역원성 화학요법 약물, 종양 항원 또는 아주반트의 전달은 이전에 수행되었지만, siRNA는 나노입자 상에 아주반트와 함께 공동-전달된 적이 없었다.
NP에 대한 CpG 올리고와 siSTAT3의 종양내 공동-전달은 흑색종 마우스 모델에서 전신 항종양 면역 반응을 유도하였다.
siSTAT3 (2 wt%)는 NP의 메소다공성 실리카 코어에 로딩되었고, CpG 올리고 (10 wt%)는 외부 표면 (양이온성 중합체 층과 결합되었지만 효소적 분해로부터 PEG 하에 보호됨)에 로딩되었다. 종양 항원 (이미 종양에 있거나 치료 후 암 사망에 의해 방출됨)은 CpG에 의한 면역자극의 존재 하에 항종양 면역을 프라이밍할 것이라고 제안된다. siSTAT3은 면역억제 종양 환경을 조정하여 면역치료 반응을 증폭시킨다. 이를 입증하기 위해, siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02)를 마우스의 양측 B16F10 흑색종 종양 모델에서 평가하였다 (도 7a). 종양 이식 후 8일에, AIRISE-02를 3일 간격으로 총 3회 용량에 대해 종양 중 하나 (국소)에 주사하였다. AIRISE-02는 마우스의 생존을 유의하게 개선시켰고 (도 7d), 국소 종양 (처리됨, 도 7b) 및 원격 종양 (미처리됨, 도 7c)을 둘 다 감소시켰으며, 이는 성공적인 계내 종양 백신 접종 및 치료의 압스코팔 효과 (처리된/주사된 부위를 벗어난 부위에서의 효과)를 시사한다. 도 7b-7c는 또한 siSTAT3-CpG-NP가 CpG-NP 및 siSTAT3-NP보다 우수하다는 것을 보여준다.
별도의 실험에서는, 도 7과 동일한 방식으로 마우스를 AIRISE-02 (siSTAT3-CpG-NP)로 처리하였다. 3차 투약 후 1일 (또는 1차 투약 후 7일)에 마우스를 희생시켰다. 종양 및 연관 배출 림프절 (DLN)을 수집하고 다색 유동 세포계수법으로 면역 프로파일링을 수행하였다. 도 17은 AIRISE-02가 국소 종양 (처리됨) 및 원격 종양 (미처리됨) 및 연관 DLN 둘 다에서 상당히 더 높은 CD8/Treg 비를 초래했다는 것을 보여주며 (AIRISE-02 vs. 염수에 대해 p<0.05), 이는 성공적인 계내 종양 백신 접종을 확인시켜 주었다. 조절 T 세포 (Treg)는 전형적으로 환자의 종양에서 상승하고 CD8+ T 세포 활성을 포함한 항종양 면역 반응을 억제한다. 따라서, 더 높은 종양내 CD8/Treg 비가 바람직하며 암 환자에서 연장된 생존의 지표 중 하나이다. CpG-NP는 이러한 시점에서 종양 또는 림프절 중 어느 하나에서 CD8/Treg를 유의하게 증가시키지 않았으며, 이는 도 7에서 AIRISE-02보다 더 열악한 효능에 상응한다. 더욱이, 림프절 내의 이펙터 CD8+ T 세포는 다른 대조군보다 AIRISE-02 처리된 마우스에서 더 증식성이었다 (Ki-67) (도 17c).
별도의 실험에서는, siRNA-CpG-NP (AIRISE-02)를 종양내 주사함으로써 마우스를 처리하였다 (도 7과 유사한 모델). siRNA는 알렉사-488로 태그부착되었다. 도 18은 종양내 주사 후 2시간에 siRNA-CpG-NP가 TME에서 세포의 15%에 의해 흡수된 반면, 이전 작업에서 CpG-siSTAT3 접합체는 종양내 주사 후 1시간 및 3시간에 TME에서 세포의 단지 2%에 의해 흡수되는 것으로 보고되었다는 것을 보여준다 (Kortylewski et al., Nature biotechnology, 27(10):925-932, 2009). siRNA-CpG-NP를 흡수한 세포 중 80%는 암 세포 (CD45-)이고, 20%는 면역 세포 (CD45+)로, 이는 TME가 80 내지 90% 암 세포로 이루어진다는 본 발명자들의 발견에 따른 것이다. 대조적으로, 전술한 CpG-siSTAT3 접합체는 프로세싱을 위해 CpG에 의존하며 주로 TLR9- 암 세포가 아닌 TLR9+ 세포에 의해서만 흡수된다. 암과 면역 세포 둘 다에 siSTAT3 및 CpG를 전달하는 것이 더 바람직하다. 면역 세포 중에서, 골수 세포 (CD45+CD3-CD19-)가 가장 많은 siSTAT3-CpG-NP를 차지하였다. 이들은 대식세포 (F4/80+) 및 DC (CD11c+MHCII+)를 포함하였다. 원격 미처리된 종양에서는 NP가 검출되지 않았으며 (표시되지 않음), 이는 미처리된 종양에 대한 NP의 침출액이 없다는 것을 나타낸다.
또한 AIRISE-02의 치료 작용은 치료제의 직접적인 세포독성 효과보다는 면역 반응에 의존하는 것으로 확인되었다. 항-CD8 항체를 사용하여 마우스로부터 CD8이 고갈되었을 때 (도 8a), siSTAT3-CpG-NP의 치료 반응은 유의하게 감소되었다 (도 8b-8d). 이것은 치료 효과가 면역 매개되었다는 것을 예시한다.
더욱이, NP 처리는 더 많은 CD8+ T 세포 레퍼토리를 생성하기 때문에, 이러한 처리가 항암 효과를 증강시키기 위해 체크포인트 억제제 처리와 유리하게 조합될 수 있다고 제안된다. 이것은 현재 임상에서 사용 중인 2개의 체크포인트 억제제 (항-PD-1 및 항-CTLA4 항체)와 함께 siSTAT3-CpG-NP (AIRISE-02, 도 9a)를 사용함으로써 시험되었다. NP 처리 (2개의 종양 중 단 하나 내로의 종양내)는 생존의 관점에서 체크포인트 억제제 칵테일 (복강내로 제공됨)과 유사한 효능을 갖는다 (도 9d). AIRISE-02와 체크포인트 억제제 칵테일의 조합은 국소 종양 (도 9b) 및 원격 종양 (도 9c) 뿐만 아니라 마우스 생존 (도 9d)의 제어 관점에서 효능을 실질적으로 개선시켰다. 놀랍게도, 8마리 중 5마리의 마우스 (지금까지 10개월 동안 종양이 없는 상태로 남아 있음)에서 완전한 치유가 달성된 반면, AIRISE-02 또는 ICI 단독의 경우에는 치유된 마우스가 없었다 (도 10c). B16F10 모델에서의 치유 효과는 이러한 모델이 문헌에서 공격적인 것으로 공지되어 있고, 종양 이식 후 1주에 치료를 시작할 때 치유 효과가 이전 CpG-기반 백신 + ICI에서 발견되지 않았기 때문에 인상적인 것으로 간주된다 (치유 효과는 때때로 예방적 설정에서 보고됨). 치유된 또 다른 마우스 세트에서는, 마지막 처리 후 3개월에 B16F10 세포를 이식함으로써 종양 재시험감염을 수행하였다. 치유된 마우스는 암이 성장하는 것을 거부하였으며, 이는 AIRISE+ICI의 성공적인 장기간 지속되는 항종양 효과 (기억 효과)를 시사한다.
NP에 대한 CpG 올리고 및 siSTAT3의 전신 공동-전달은 마우스의 생존을 연장하였으며, 이는 잠재적인 면역 프라이밍 및 활성화를 시사한다.
종양내 투여 외에도, AIRISE-02는 폐암과 같이 종양내 주사로 쉽게 접근할 수 없는 암을 치료하기 위해 전신 투여될 수 있다. 도 10a는 루이스 폐 암종 (LLC-JSP) 종양이 있는 마우스에서 꼬리 정맥을 통한 AIRISE-02의 치료 일정을 보여준다. 연장된 생존이 관찰되었고 (도 10b), 이는 성공적인 항암 면역요법 효과를 시사한다.
양이온성 지질에 의한 CpG 올리고 및 siSTAT3의 종양내 공동-전달은 또한 계내 종양 백신 접종을 유도한다.
siSTAT3 및 CpG를 양이온성 지질 (다마콘으로부터의 다르마펙트)과 혼합하여 지질 나노입자를 형성하고, 이를 도 7과 동일한 방식으로 마우스에게 투여하였다. 도 11a-11c는 메소다공성 실리카 나노입자에서 관찰된 바와 같이 양이온성 지질에서 매우 유사한 반응이 달성되었다는 것을 보여준다 (도 7). 이는 종양내 주사의 경우, 다양한 유형의 나노입자를 사용하여 본원에 기재된 카고 조합으로 치료제를 생성할 수 있다는 것을 예시한다.
NP는 CpG와 함께 siRNA를 암과 면역 세포 둘 다에 전달할 수 있어 표적 유전자의 녹다운을 초래할 수 있다. NP는 B16F10 암 세포의 경우 도 12a에 도시되고, J774 대식세포의 경우 도 12b에 도시되며, 마우스 1차 DC의 경우 도 12c에 도시된 바와 같이 암 및 면역 세포 둘 다에 siRNA를 전달하고 STAT3 유전자 (예로서)를 녹다운시킬 수 있다. 흥미롭게도, siSCR-NP는 또한 DC에서 STAT3 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (미처리 대비 도 12c 참조). 이것은 세포 생육력이 미처리된 대조군과 대비하여 변하지 않았고 (도 34), STAT3 mRNA가 하우스키핑 mRNA로 정규화되었기 때문에 나노입자 독성에 의해 야기되지 않았다. 어떠한 설명에도 얽매이는 것은 아니지만, 항산화제가 STAT3 활성화를 포함한 면역억제 경로에 대응하는 것으로 이전에 보고되었기 때문에 이것은 메소다공성 실리카 나노입자의 항산화 특성에 기인할 수 있다고 제안된다 (Yoon et al., Autophagy, 6(8):1125-1138, 2010). 한편으론, 다르마펙트 [호리즌 디스커버리(Horizon Discovery)에 의한 양이온성 지질 (비-항산화제)를 기반으로 하는 상업적 형질감염제]는 DC에서 STAT3 발현을 증가시켜, 바람직하지 않은 면역억제성 TME를 유발할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 35). 이는 문헌 [Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015]에 기재된 항산화제 메소다공성 실리카 나노입자 플랫폼의 사용이 STAT3 매개 경로를 제어하기 위해 지질 나노입자보다 유리할 수 있다는 것을 시사한다. 도 19는 또한 STAT3이 매우 보존되어 동일한 siSTAT3 서열이 개, 뮤린 및 인간 세포에서 STAT3를 녹다운시켜, 뮤린 연구에서 개 및 인간 연구로의 직접적인 번역을 촉진할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 종 전체에 걸친 적용 내내 동일한 siSTAT3 서열이 사용되었다.
암 세포, DC 및 대식세포를 형질감염시키고 특정 유전자 예컨대 STAT3을 감소시킬 수 있는 능력은 본원에 기재된 면역치료 구축물이 면역 세포의 생체외 조작에 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 그러한 생체외 조작된 면역 세포는 치료 효과 및 면역 반응 (예를 들어, 암 세포를 사멸시킴)을 위해 환자에게 다시 투여될 수 있다. 세포는 치료받은 환자 또는 상이한 건강한 공여자로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 줄기 세포 및 그의 유도체 -- 문헌 [Senju et al., Int J Hematol, 91(3):392-400, 2010]). 암 세포는 본 발명자들의 면역치료 구축물로 생체외 처리되어 (부가의 작용제의 유무에 관계없음) 전체 세포 암 백신을 생성할 수 있다 (Keenan et al., Int J Hematol, 91(3):392-400, 2010; Goldstein et al., Int J Hematol, 117:118-127, 2011).
또한 AIRISE-02 (siSTAT3-CpG-NP)가 결장암 (도 20) 및 유방암 (도 21&22)을 포함한 다른 종양 모델에서 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 본 발명자들은 이들 두 모델에서, 각각의 마우스의 두 종양 중 하나에 국소적으로 제공된 ICI (전신적으로 i.p. 제공)와 AIRISE를 조합하는 것이 AIRISE 단독 또는 ICI 단독보다 더 나은 효능을 제공한다는 것을 보여준다.
AIRISE-02의 안전성 프로파일. AIRISE 안전성은 마우스와 원숭이 둘 다에서 평가되었다. 마우스에 대한 AIRISE-02의 근육내 주사는 마우스 피부에 독성을 일으키지 않는 것으로 밝혀졌다 (부종 또는 홍반 없음, 도 23). 또한 마우스를 염수로 처리한 경우 대비 AIRISE-02로 처리한 경우에는, 체중 및 신장 및 간 기능에 대한 혈청 바이오마커 상의 변화가 없었다 (도 24). AIRISE-02는 또한 원숭이에서 시험되었으며 안전한 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, AIRISE-02는 1주 간격으로 용량 단계적 상승 방식 (1, 2.8, 및 9.5 mg/kg, 군당 n=3 동물, 도 25)으로 시노몰구스 원숭이에게 피하 투여되었다. 3마리 동물 모두가 예정된 연구 종료까지 생존하였다. 임상 관찰에 대한 시험 물품-관련 효과는 없었다. 피부 관찰의 관점에서, 낮은 용량의 경우에는 시험 물품-관련 피부 관찰이 없었고; 중간 용량의 경우에는 시험 물품-관련 부종 (등급 2-3)이 투여 후 48시간 및/또는 72시간에 관찰되었지만 7일 후에 해소되었고; 높은 용량의 경우에는, 모든 동물에서 시험 물품-관련 부종 (등급 1-3) 및 홍반 (등급 1)이 투여 후 24시간 이내에 시작되어 7일 (마지막 관찰)까지 지속되었지만 우려 사항은 아니였다. 체중에 대한 시험 물품-관련 효과는 없었다. 혈액학 파라미터에 대한 시험 물품-관련 효과는 없었다. 응고 파라미터에 대한 시험 물품-관련 효과는 없었다. 임상 화학 파라미터에 대한 시험 물품-관련 효과는 없었다.
실시예 2: 면역치료 구축물 (예컨대 NP)에는 또한 효능 손실 없이 2가지 유형의 siRNA가 동시에 로딩될 수 있다.
siRNA 및 CpG의 공동-전달에 더하여, 본원에 기재된 면역치료 구축물은 또한 다수의 siRNA를 공동-전달할 수 있다. 예를 들어, 도 13은 NP (본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조됨)에 HER2 또는 STAT3에 대항한 2개의 개별 siRNA가 로딩되었을 때, 각각의 단백질의 특이적 녹다운이 달성되었다는 것을 보여준다. 도 13은 또한 상기 siRNA 둘 다가 동일한 NP 바이알에 로딩되었을 때 (T-siHER2/siSTAT3-NP 참조), 두 단백질이 2개의 별도의 NP 바이알에 로딩되었을 때와 유사한 녹다운이 달성되었다는 것을 보여준다 (T-siHER2-NP + T-siSTAT3-NP 참조). 또 다른 예로서, 도 36은 흑색종 모델에서 면역 체크포인트 억제제의 효능을 증강시키는데 있어서 siCXCR4, siSTAT3 및 CpG가 로딩된 NP (siSTAT3/siCXCR4-CpG-NP)의 효능을 보여준다.
이것은 효능을 상실하지 않으면서 하나 초과 유형의 올리고뉴클레오티드를 로딩할 때 본원에 기재된 면역치료 구축물 입자의 다양성을 예시한다. 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 전달은 또한 각각이 암 세포를 사멸시킬 수 있고/거나 면역억제의 여러 측면을 조정할 수 있는 하나 초과의 siRNA의 로딩을 허용하기 때문에 유익하다.
도 13에 도시된 데이터는 NP가 siRNA 또는 2개 이상의 상이한 siRNA의 칵테일을 전달할 수 있다는 것을 명확하게 보여주며, 여기서 siRNA는 암 세포에 세포독성 효과를 제공하거나, 면역억제 종양 미세환경을 무효화하거나, 면역자극성 서열을 함유하거나, 또는 이러한 특징의 임의의 조합을 가질 수 있다.
실시예 3: 세포 유형 특이적/표적화된 면역치료 구축물
siRNA는 임의의 유전자를 정확하고 효과적으로 조정할 수 있기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있다. 면역치료 구축물 (AIRISE)은 특이적 전달을 위해 본 발명자들의 나노입자에 대해 항체 (또는 기타 표적화제)를 활용함으로써 상이한 면역억제 경로 또는 상이한 면역 세포 집단을 다룰 수 있다. 본원에 제공된 NP를 포함한 면역치료 구축물은 특이적 세포 집단(들), 예컨대 종양 내의 특이적 세포로의 표적화된 전달을 위한 표적화제(들)와 접합될 수 있다. 일부 항체, 예컨대 항-PD-L1 항체는 표적화제로서의 역할과 면역억제 경로의 조정제로서의 역할 둘 다를 할 수 있다.
도 14a-14c는 NP의 이러한 표적화의 예를 제공한다. 세툭시맙 (항-EGFR 항체)과 접합된 NP는 낮은 EGFR 세포보다 EGFR+ 세포에 대한 우선적인 흡수를 나타낸다 (도 14a-14b). 마찬가지로, 트라스투주맙 (항-HER2 항체)과 접합된 NP는 낮은 HER2 세포보다 HER2+ 세포에 대한 우선적인 흡수를 나타낸다 (도 14c) (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015).
이러한 유형의 표적화는 본원에 기재된 바와 같이 아주반트 및 활성제가 로딩된 NP와 동등하게 잘 작동할 것으로 여겨진다.
실시예 4: 다중 작용제 나노입자 처리
본 실시예에서, PD-L1 항체 (바이오엑스셀로부터의 마우스 PD-L1)는 PLK1 억제제 (볼라세르팁) 및 CpG가 로딩된, 실시예 1에서와 같이 본질적으로 제조된 메소다공성 실리카 나노입자와 접합된다. PD-L1 항체는 ICI로서의 역할과 종양 귀소 작용제 (표적화제)로서의 역할 둘 다를 한다.
방법
볼라세르팁 (PLK1 억제제; iPLK1)은 PEI 결합 전에 나노입자에 과량으로 로딩되었다. 간단히 말해서, MSNP는 PEI 결합 전에 밤새 에탄올/DMSO 용액에서 볼라세르팁과 혼합되었다. 결합되지 않은 도세탁셀 또는 볼라세르팁 및 PEI를 PBS에서 세척하였다. 그런 다음 PEI-NP (iPLK1)는 이전에 공개된 방법에 따라 PEG와 접합되었다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015; Ngamcherdtrakul et al., International J Nanomed, 13:4015-4027, 2018). 최종 산물은 0.5-2 wt% iPLK1을 함유한다. 그들은 100 nm의 DLS 크기를 갖는다. PD-L1 항체를 함유하는 구축물 (p-NP)의 경우, PD-L1 항체를 티올화하고 본 발명자들의 이전에 공개된 방법에 따라 나노입자 상의 PEG 층 끝과 접합하였다 (Ngamcherdtrakul et al., Advanced Functional Materials, 25(18):2646-2659, 2015; Ngamcherdtrakul et al., International J Nanomed, 13:4015-4027, 2018).
LLC-JSP 양측 뮤린 폐 종양 모델: 6주령 암컷 C57BL/6 마우스는 찰스 리버 NCI 콜로니 (미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 수득되었다. 각각의 마우스의 좌측 (국소, 100,000개 세포) 및 우측 (원격, 40,000개 세포) 측복부에 LLC-JSP 세포를 피하 주사하였다. 이식 후 12일에, 시험 화합물/구축물을 좌측 (국소) 종양에만 종양내 주사한 반면, 우측 (원격) 종양은 미처리된 상태로 두었다. 달리 명시되지 않는 한, 시험 화합물/구축물은 3회 용량에 대해 3일마다 제공되었다. 마우스에서 국소 및 원격 종양 둘 다의 부담은 1-2일마다 버니어 캘리퍼로 측정하고 종양 용적은 V = 0.5 x 길이 x 너비2로 계산하였다. 생존을 또한 모니터링하였다. 총 종양 부담이 2000 mm3를 초과할 때 마우스를 희생시켰다.
결과
종양 접종 후 제12일에, 마우스는 염수, PD-L1 항체 코팅된 나노입자 (p-NP), PLK1 억제제가 로딩된 나노입자 (iPLK1-NP), PLK1 억제제가 로딩된 p-NP (p-iPLK1-NP), 또는 PLK1 억제제 및 CpG가 로딩된 p-NP (p-iPLK1-NP-CpG)를 좌측 (국소) 종양에 투여하여 종양내 처리하였다 (반면, 원격 종양은 미처리된 상태로 두었다). 50 μl 중 0.5 mg NP (2.5 μg iPLK1, 20 μg PD-L1 항체, 20 μg CpG)를 3일마다 총 3회 용량으로 투여하였다. 면역치료 구축물은 CpG가 없는 것을 제외하고는 동일한 면역치료 구축물에 비해 마우스의 생존을 연장시켰다 (도 15). 면역치료 구축물은 또한 각각 나노입자에 대한 것보다 5배 더 높은 농도로 제공된 유리 PD-L1 항체 및 볼라세르팁보다 훨씬 더 효과적이었다. 동일한 NP에 아주반트 (CpG)를 혼입하면 생존이 더욱 개선되었다. 예를 들어, 본 발명자들은 p-iPLK1-NP 상에 CpG를 혼입하면 (p-iPLK1-NP-CpG로서 지칭되기도 함) 7마리 중 2마리의 마우스의 생존이 유의하게 개선되었으며, 1마리의 마우스에는 종양이 전혀 없다는 것을 밝혀내었다.
실시예 5: AIRISE의 국소 제형 및 적용
본원에 개시된 면역치료 구축물은 국소 제형으로 제형화될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 여러 비히클, 예를 들어 아쿠아포르 (연고-기반) 및 카르보폴 (겔-기반)이 구축물과 혼합될 수 있다. 열 또는 계면활성제 (예를 들어, 유화제로서 폴리소르베이트 80 (트윈 80))를 사용하여 비히클과 AIRISE의 수성 현탁액을 더 잘 혼합할 수 있다. 예를 들어, 10 wt% 트윈-80은 나노입자로부터 siRNA의 임의의 조기 누출을 일으키지 않았다는 것을 확인하였다. 또한 2.5 wt% 트윈-80은 혼합물을 55℃로 가온할 때 siRNA-NP와 아쿠아포르의 혼합을 증강시키기에 충분하였다는 것을 보여주었다.
침투를 동시에 증강시키는 방법, 예컨대 초음파 및 마이크로니들 롤러 [예를 들어, 니들 높이가 0.5 mm 내지 1.5 mm 범위인 더마롤러(Dermaroller)®]를 사용할 수 있다. 0.5 mm 만큼 짧은 니들 높이를 갖는 마이크로니들을 적용하면 돼지 피부 (도 30) 및 마우스 (도 31)에서 시험할 때 국소 siRNA-나노입자 제형의 침투를 증강시킬 수 있다.
도 30은 인간 피부와 두께가 유사한 돼지 피부에서 시험할 때 마이크로니들 롤러가 siRNA 나노입자 구축물의 침투를 증강시킨다는 것을 보여준다. 돼지 피부를 1.5시간 (37℃; 5% CO2) 동안 제형 (아쿠아포르의 Dy677-siSCR-NP)과 함께 인큐베이션하였다. 1.5시간 후, 처리된 부위로부터 피부 펀치를 채취하고 표준 접근법을 사용하여 형광 영상화를 위해 프로세싱하였다. 마이크로니들 롤러를 사용한 피부 침투에 있어서의 현저한 증강이 관찰되었다. 롤러 사용 없이 아쿠아포르의 siRNA-NP를 제공했을 때 siRNA 신호 (화살표)가 돼지 피부의 외부 표면에 국한되었지만, 본 발명자들은 마이크로니들 사전 적용으로 siRNA 신호 (화살표)가 표피를 지나 진피층까지 내려가는 것을 관찰하였다 (도 30).
도 31은 마이크로니들 롤러가 siRNA-NP의 국소 전달을 증강시킨다는 것을 보여준다. 먼저, 처리 하루 전에 마우스를 면도하였다. Dy677-siSCR-NP (0.72 nmol siRNA)를 100 μL의 2.5% 트윈-아쿠아포르 (1회 적용당)와 혼합하였다. 처리 직전에, 등의 한쪽 면에만 4개 방향으로 지속적으로 피부 마이크로롤러를 적용한 반면, 다른 쪽은 전처리하지 않았다. 비교를 위해 마이크로니들 전처리를 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우의 면도된 부위 (대략 2 cm2 적용 부위)에 혼합물을 적용하였다. 1.5시간의 처리 시간 후, 처리된 피부 샘플을 수거하고 영상화를 위해 프로세싱하였다.
도 32는 마이크로롤러 + 국소 siRNA 나노구축물 적용 후 3일에 그 결과로 생성된 유전자 녹다운을 보여준다. 염수 처리군과 대비하여 siEGFR-NP에서의 55% EGFR 녹다운 (*p < 0.05)이 관찰되었다 (도 32a). 이에 비해, siEGFR-NP의 1회 피내 주사 (0.72 nmol의 동일한 siEGFR 용량)는 염수 처리군과 대비하여 40% EGFR 녹다운을 초래하였다 (도 32b).
마이크로니들 형태의 AIRISE-02. 덱스트란, 아밀로펙틴, PVP, PEG, 메틸셀룰로스, 키토산, 또는 관련 기술분야에 공지된 기타 중합체 또는 화합물을 기반으로 하는 용해성 마이크로니들의 사용은 도 33에 도시된 바와 같이 마이크로니들 제작을 위해 조사되었고, 이는 가정에서 무통 치료가 가능하고 니들 밀도가 높아 (1 cm2당 100개의 니들) AIRISE-02를 전달하는데 있어서 매우 효과적이다. 한 예로서 (도 33), Dy677-접합된 siRNA가 로딩된 NP를 함유하는 덱스트란 용액 (수 중 300 mg/ml)을 마이크로니들 몰드 상으로 캐스팅하였다. 용액을 원심분리하거나 진공시켜 몰드를 조밀하게 충전시켰다. 마이크로니들을 공기, 데시케이터, 진공 오븐, 냉장고 또는 그의 조합으로 건조시키고 몰드로부터 제거하였다. 니들의 높이는 템플릿과 최적화에 따라 300 내지 800 마이크로미터으로 다양하였다. siRNA-NP는 이들 니들 어레이 내로 성공적으로 로딩되었으며 (어레이당 약 0.5 nmol siRNA), 니들은 돼지 피부에 적용한 후 5분 이내에 완전히 용해되었다. 마이크로니들의 성분을 다양하게 하여 상이한 용해 시간을 조작할 수 있다. 상이한 모양과 형태의 마이크로니들 패치가 또한 상이한 템플릿으로 제작할 수 있다.
실시예 6: 상이한 나노입자 물질을 사용하여 개시된 카고 조합을 전달하고 유사한 면역치료 효과를 초래할 수 있다.
한 예로서, siSTAT3 및 CpG를 양이온성 지질 입자 (다르마펙트; 상업적으로 입수가능함)에 로딩하고 실시예 1과 동일한 방식으로 마우스에 투여하였다 (메소다공성 실리카에 기반한 AIRISE-02). 양이온성 지질 입자와 함께 전달된 CpG 및 siSTAT3은 또한 계내 종양 백신 접종/면역자극 효과를 산출하는 것으로 밝혀졌다 (도 11). 전달 시스템으로서 jetPEI (임상 단계에 도달한 상업적으로 입수가능한 PEI-기반 형질감염제)를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. 이는 개시된 카고 조합의 다양성과 전달 플랫폼의 관점에서 불가지론적 성질을 보여준다. 그러나, 지질 플랫폼이 일반적으로 암 세포에 siRNA를 전달하는데 효과적이지만, 층별로 기능화된 메소다공성 실리카 나노입자 (본원에 기재된 바와 같음)가 지질 대응물보다 면역 세포 (예를 들어, 1차 수지상 세포)에서 더 나은 siRNA 녹다운 활성을 나타낸다는 것은 아무 가치가 없다 (도 12).
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 실시양태는 그의 특정한 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 따라서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는 것"은 "포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는" 것을 인용하는 것으로 해석되어야 한다. 이행 용어 "포함하다"는 지정되지 않은 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 심지어 다량으로 포함하고 그러한 포함을 허용하는 것을 의미한다. 이행 문구 "로 이루어지는 것"은 지정되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 제외한다. 이행 문구 "로 본질적으로 이루어지는 것"은 실시양태의 범위를 명시된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소 및 실시양태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 이러한 맥락에서 물질적 효과는 면역치료 구축물의 생물학적 영향 (예컨대 항암 효과)의 측정가능한 감소이다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 특성 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 관점에서 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다. 추가의 명확성이 요구되는 경우, 용어 "약"은 명시된 수치 또는 범위와 연계해서 사용될 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 합리적으로 부여된 의미를 가지며, 즉 명시된 값의 ±20%; 명시된 값의 ±19%; 명시된 값의 ±18%; 명시된 값의 ±17%; 명시된 값의 ±16%; 명시된 값의 ±15%; 명시된 값의 ±14%; 명시된 값의 ±13%; 명시된 값의 ±12%; 명시된 값의 ±11%; 명시된 값의 ±10%; 명시된 값의 ±9%; 명시된 값의 ±8%; 명시된 값의 ±7%; 명시된 값의 ±6%; 명시된 값의 ±5%; 명시된 값의 ±4%; 명시된 값의 ±3%; 명시된 값의 ±2%; 또는 명시된 값의 ±1%의 범위 이내로, 명시된 값 또는 범위보다 다소 많거나 다소 적은 것을 의미한다.
본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오류를 함유한다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 맥락에서) 사용된 단수의 지시 대상물은 본원에서 달리 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수와 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 역할을 할 뿐이다. 본원에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 그것이 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 밝히기 위한 것이며 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되서는 안 된다.
본원에 개시된 발명의 대안적인 요소 또는 실시양태의 군화는 제한으로 해석되서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로 또는 군의 다른 구성원 또는 본원에 있는 다른 요소와 임의로 조합하여 참조 및 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원이 편의 및/또는 특허성을 이유로 군에 포함되거나 또는 군으로부터 결실될 수 있는 것으로 예상된다. 그러한 임의의 포함 또는 결실이 발생하면, 본 명세서는 변형된 바와 같은 군을 함유하는 것으로 간주되므로, 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 군의 서면 설명을 충족한다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최상의 모드를 포함한 본 발명의 특정 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 물론, 이들 기재된 실시양태에 대한 변동은 전술한 설명을 판독할 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 숙련된 기술자가 그러한 변동을 적절하게 이용하기를 기대하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 본 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변동에서 전술한 요소의 임의의 조합이 본 발명에 의해 포괄된다.
더욱이, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허, 인쇄된 출판물, 저널 기사 및 기타 서면 텍스트에 대한 수많은 참조가 만들어졌다 (본원에 참조된 자료). 참조된 자료 각각은 참조된 교시를 위해 그 전체 내용이 개별적으로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 발명의 실시양태는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해해야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라서 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 정확히 제시되고 기재된 것으로 제한되지 않는다.
본원에 제시된 세부 사항은, 예로서 그리고 본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 예시적인 논의를 위한 목적으로만 제공되며, 본 발명의 다양한 실시양태의 원리 및 개념적 측면에 대한 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있는 설명인 것으로 여겨지는 것을 제공하는 원인에 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다는 본 발명의 구조적 세부사항을 더 상세하게 나타내려는 시도는 이루어지지 않으며, 도면 및/또는 실시예와 함께 취해진 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구현될 수 있는지를 명백하게 한다.
본 개시내용에 사용된 정의 및 설명은 본 실시예(들)에서 명확하고 모호하지 않게 변형되거나 또는 의미의 적용이 임의의 구축을 의미가 없거나 본질적으로 의미가 없게 만드는 경우를 제외하고 임의의 미래 구축을 제어하도록 의미 및 의도된다. 용어의 구축으로 인해 의미가 없어지거나 본질적으로 의미가 없어지는 경우, 웹스터 사전 (제3판) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 사전, 예컨대 옥스포드 생화학 및 분자 생물학 사전 (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)으로부터의 정의를 취해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Oregon Health & Science University PDX Pharmaceuticals, LLC <120> IMMUNOTHERAPEUTIC CONSTRUCTS AND METHODS OF THEIR USE <130> 51127-004WO2 <150> US 62/873,762 <151> 2019-07-12 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy bases <400> 1 ggaucuagaa cagaaaaugt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feat <222> (20)..(21) <223> deoxy bases <400> 2 cauuuucugu ucuagaucct g 21 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 cacguuugag uccaugccca auu 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 uugggcaugg acucaaacgu guu 23 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 uuagucgaca uguaaacca 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

Claims (60)

  1. 하기를 포함하는 면역치료 구축물로서:
    종양 항원 방출을 유발하고/거나 면역억제 종양 미세환경을 조정하는 적어도 하나의 치료제 및 적어도 하나의 아주반트 화합물을 포함하는 전달 시스템,
    여기서 면역치료 구축물은 종양-특이적 항원 또는 오브알부민을 포함하지 않는 것인
    면역치료 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 전달 시스템이 리포솜, 지질-기반 입자, 중합체 입자, 무기 입자, 또는 그의 혼성체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  3. 제2항에 있어서, 전달 비히클이 리포솜, 지질-기반 입자, 중합체 입자, 무기 입자, 또는 중합체 또는 지질로 코팅된 무기 입자인 면역치료 구축물.
  4. 제3항에 있어서, 전달 비히클이 무기 입자이고 메소다공성 실리카, 금, 알루미늄, 은, 산화철, 인산칼슘, 또는 항산화제 입자 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  5. 제4항에 있어서, 무기 입자가 산화세륨을 포함하는 항산화제 입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  6. 제4항에 있어서, 전달 비히클이 메소다공성 실리카 입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  7. 제1항에 있어서, 전달 비히클이 풀러렌, 내면체 메탈로풀러렌, 3금속성 질화물 주형화 내면체 메탈로풀러렌, 단일벽 및 다중벽 탄소 나노튜브, 분지형 및 수지상 탄소 나노튜브, 금 나노막대, 은 나노막대, 단일벽 및 다중벽 붕소/질산염 나노튜브, 탄소 나노튜브 피포드, 탄소 나노혼, 탄소 나노혼 피포드, 리포솜, 나노쉘, 덴드리머, 마이크로입자, 양자점, 초상자성 나노입자, 나노막대, 셀룰로스 나노입자, 실리콘, 실리카 및 중합체 마이크로- 및 나노-구체, 실리카-쉘, 생분해성 PLGA 마이크로- 및 나노-구체, 금 입자, 산화세륨 입자, 산화아연 입자, 은 입자, 알루미늄 입자, 탄소 입자, 철 입자, 산화철 입자, 아주반트 입자, 및/또는 변형된 미셀 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 PLGA, PLL, 덱스트란, 덴드리머, 폴리아르기닌, PEG, PEI, 또는 키토산 중 하나 이상을 포함하는 중합체 입자인 면역치료 구축물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5 nm 내지 999 nm의 유체역학적 크기를 갖는 면역치료 구축물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1 마이크로미터 내지 1000 마이크로미터의 유체역학적 크기를 갖는 면역치료 구축물.
  11. 제6항에 있어서, 전달 비히클이 약 5-200 nm의 크기를 갖는 메소다공성 실리카 나노입자를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  12. 제11항에 있어서, 메소다공성 실리카 나노입자가, 가교된 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸렌 글리콜로 코팅되는 것인 면역치료 구축물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, DNA, sgRNA (CRISPR-cas9 요소), 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 화학요법 약물, 독소, 항산화제, 소분자 억제제, 항체, 또는 방사선치료제를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, 또는 DNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3, CD39, CD73, TGF-β, PD-L1, PD1, CTLA4, MIF, PLK1, HIF, NOX1-4, HER2, EGFR, BCL2, AKT1, HIF1-알파, NOX1-4, AR, MYC, BRAF, BRAF V600E, 또는 MTDH의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 HER2의 발현 또는 활성을 억제하는 siRNA를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 STAT3, CD39, CD73, TGF-β, PD-L1, PD1, CTLA4, MIF, PLK1, HIF, NOX1-4, HER2, EGFR, BCL2, AKT1, HIF1-알파, NOX1-4, AR, MYC, BRAF, BRAF V600E, 또는 MTDH의 발현 또는 활성을 억제하는 것인 면역치료 구축물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 항생제, 식물 알칼로이드, PLK1 억제제, 유사분열 키나제 억제제, 면역 체크포인트 억제제, 백금-기반 화학요법제, HER2 소분자 억제제, 항-EGFR 항체, 및 항-HER2 항체로부터 선택된 하나 이상의 항암제를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 면역 체크포인트 억제제를 포함하고, 면역 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD1, 또는 CTLA4에 대항한 항체인 면역치료 구축물.
  22. 제21항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-L1에 대항한 항체인 면역치료 구축물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 PLK1 억제제를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  24. 제23항에 있어서, PLK1 억제제가 볼라세르팁인 면역치료 구축물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 도세탁셀, 미톡산트론, 또는 카바지탁셀 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 항-EGFR 항체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  27. 제26항에 있어서, 항-EGFR 항체가 세툭시맙인 면역치료 구축물.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 항-HER2 항체를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  29. 제28항에 있어서, 항-HER2 항체가 트라스투주맙인 면역치료 구축물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 면역자극 활성을 갖고 CpG 올리고뉴클레오티드, CpG 서열을 함유하는 DNA TLR 효능제, 비-CpG DNA TLR 효능제, RNA TLR 효능제, 알루미늄 염, 항-CD40 항체, 융합 단백질, 시토카인, 소분자 TLR 효능제, 오일- 또는 계면활성제-기반 아주반트, 리포폴리사카라이드, 식물 추출물, 또는 그의 유도체 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가르디퀴모드, 폴리 I:C, 폴리 ICLC, dSLIM, 또는 EnanDIM을 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 면역치료 구축물.
  33. 하기를 포함하는 조성물:
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물; 및
    적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 또는 그의 혼합물.
  34. 암에 걸린 대상체에게 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  37. 암의 증상을 나타내는 세포를 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 처리하는 방법.
  38. 암 또는 또 다른 과다증식성 장애의 증상을 나타내는 대상체로부터 수득된 세포를 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 처리하는 방법.
  39. 암 또는 또 다른 과다증식성 장애의 증상을 나타내는 대상체로부터 수득된 세포를 생체외에서 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 치료상 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 처리하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 세포가 암 세포인 방법.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 세포가 암 세포가 아닌 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포가 면역 세포인 방법.
  43. 제38항 또는 제39항에 있어서, 세포가 불멸화되는 것인 방법.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 처리된 세포를 대상체에게 다시 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 과다증식성 질환 또는 병태를 갖거나 또는 이러한 질환 또는 병태가 발병할 위험이 높은 것으로 진단된 대상체에게 제33항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 질환 또는 병태가 암, 전암, 또는 암 전이 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 질환이 흑색종, 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 신장암, 결장직장암, 림프종, 위암, 결장암, 간암, 또는 희귀암 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여하는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
    대상체 내의 종양으로의 또는 종양에서의 주사;
    대상체 내의 종양으로의 또는 종양에서의 국소적 주입;
    대상체 내의 전신 주사;
    대상체 내의 전신 주입; 또는
    대상체에 대한 국소 적용.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 투여하는 것이 대상체에 대한 마이크로니들 적용을 포함하는 것인 방법.
  52. 항암 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항암 요법의 효과를 증강시키는 방법:
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 유효량; 및
    적어도 하나의 항암제.
  53. 제52항에 있어서, 항암제가 화학요법제 또는 표적화 치료제인 방법.
  54. 체크포인트 차단 면역요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 체크포인트 차단 면역요법 효과를 증강시키는 방법:
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 유효량; 및
    적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제.
  55. 방사선 요법 효과의 증강을 필요로 하는 대상체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는, 신생물이 있는 것으로 진단된 대상체에서 방사선 요법 효과를 증강시키는 방법:
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물 또는 제33항의 조성물의 유효량; 및
    적어도 하나의 방사선 요법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역치료 구축물 또는 조성물 및 항암 요법이 순차적으로 또는 공동으로 투여되는 것인 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  59. 하기를 포함하는 키트:
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역치료 구축물; 및
    적어도 하나의 항암제.
  60. 제59항에 있어서, 항암제가 화학요법제, 표적화 치료제, 또는 면역 체크포인트 억제제인 키트.
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