KR20240003739A - 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물 - Google Patents

수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물 Download PDF

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KR20240003739A
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Abstract

본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 전달하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 하이드로겔을 이용한 경구용 조성물, 에멀젼을 이용한 연고용 조성물, 필름을 이용한 패치용 조성물, 및 마이크로니들을 통한 피부 문신용 조성물을 제공하며, 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 효과적으로 전달함으로써, 최적화된 면역항암치료제의 전달 시스템을 구축할 수 있다.

Description

수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물{COMPOSITION FOR TARGETED SITE DELIVERY OF DENDRITIC CELL-MIMICKING NANOSTRUCTURES}
본 발명은 면역항암제로서 수지상세포를 이용한 나노구조체의 인체 전달 기술에 관한 것이다.
우리나라 암 환자의 유병률은 계속 증가 추세에 있다. 암 치료방법으로는 외과 수술, 방사선 요법, 생물 요법, 화학 요법 등이 있다. 대부분의 화학 요법제는 빠르게 분열, 증식하는 암세포를 사멸시키지만, 암세포 외에도 정상세포인 골수, 면역 세포 및 장 상피에도 독성을 나타내어 부작용을 유발한다.
최근에는 항암제의 항암 활성을 경감시키지 않으면서 항암제에 의하여 유발되는 부작용을 예방 또는 치료하는 면역항암 요법이 암 치료방법으로서 활발히 연구되고 있다. 면역항암제는 사람의 몸 속 면역체계를 강화하여 암세포를 사멸시키는 개념으로서 작용 기전에 따라 다양한 종류로 분류되는데, 체크포인트 억제제, 사이토카인, CAR-T 세포 및 기타 세포 치료제, 공동자극수용체에 대한 항체, 백신, 종양 용해 바이러스 및 이중 특이성 항체가 그러하다.
그러나 다양한 면역항암제의 개발에도 불구하고, 임상적으로 사용하는 데 있어 효능 및 안전성과 관련하여 해결해야 할 문제가 여전히 남아 있다. 이에 보다 안전한 방법으로 면역항암제를 표적 부위에 전달할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 항원제시 기능을 가지는 세포를 사용하여 면역반응 증대에 따른 암 치료 효과를 구현할 수 있는 면역항암제 및 이를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 다양한 전달 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 기술적 과제 해결을 위하여, 본 발명은 나노입자 코어 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘을 포함하는 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 전달하기 위한 조성물로서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체; 및 담체, 필름 및 마이크로니들에서 선택되는 어느 하나;를 포함하는, 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 담체는 젤라틴을 포함하는 경구용 하이드로겔일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔 100 중량부에 대하여 젤라틴 10 내지 20 중량부, 글리세롤 5 내지 15 중량부, 및 펙틴 0.1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴 및 펙틴은 30:1 내지 6:1의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체 및 담체는 W/O/W 또는 W/O 에멀젼을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 에멀젼은 면역관문억제제를 더 담지할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 에멀젼의 제1수상은 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하고, 유상은 생분해성 고분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유상 및 제1수상은 1.5:1 내지 3.5:1의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드-글리콜산 공중합체 (poly(latic-co-glycolc acid, PLGA), 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 및 폴리락트산(poly(lactic acid, PLA)에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 에멀젼의 제2수상은 소디움 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulphate, SDS), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 (cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB), 메틸 셀룰로오스 (methyl cellulose, MC), 젤라틴 (gelatin), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 수용액에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체는 생체적합성 고분자를 포함하는 필름 내 분산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 피브린, 및 엘라스틴에서 선택되는 하나 이상의 수용성 천연 고분자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체는 1×105 내지 1×108 cells/㎖ 의 농도로 필름 내 로딩될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 필름은 두께가 50 내지 1000 ㎛일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 필름 내 분산된 수지상세포 모방 나노구조체는 피부에 적용되어 피부 속 70 내지 330 ㎛의 깊이로 침투될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로니들은 피부 문신용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로니들은 염료, 안료, 및 형광 물질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로니들을 형성하는 용해성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스 (sodium carboxymethyl cellulose), 비닐피롤리돈-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 당(saccharide) 또는 이들의 혼합물일 수 있따.
또한 본 발명은 상술한 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물을 포함하는 면역치료제를 제공할 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물은 수지상세포의 항원제시능을 그대로 나노입자 표면에 도입함으로써 수지상세포의 항원제시기능은 보존함과 동시에 사멸하지 않고 나노입자의 표적화 기능을 구현하는 수지상세포 모방 나노구조체를 인체에 효과적으로 전달하기 위한 다양한 방법을 제공할 수 있다. 이에 따라 체내에서 수지상세포의 항원제시 기능에 따라 세포독성 T 세포를 직접 활성화하여 암세포의 선택적 사멸을 유도하고, 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 젤라틴 기반 경구용 하이드로겔을 담체로 한 수지상세포 모방 나노구체의 표적 부위 전달용 조성물은 복약이 용이하며, 수지상세포 모방 나노구조체의 용출 속도를 제어하여, 표적 부위에 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 W/O/W 에멀젼 형태는 생체적합성이 뛰어나며, 수지상세포 모방 나노구조체를 연고로 제형화함으로써 국소 부위에의 확산 및 침투 효과를 향상시켜, 특히 피부암 치료에 효과적일 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 히알루론산 기반 패치형의 경우 비침습적이며, 간 및 장에서의 대사 회피를 통해 부작용을 감소시킬 수 있다는 장점을 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 마이크로니들형의 경우 수지상세포 모방 나노구조체를 특정의 표적 부위에 정량으로 전달할 수 있으며, 전달 속도와 방출 속도의 제어가 용이할 수 있다.
도 1은 본 발명 실시예 1의 시료 1 및 시료3에 대해 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 로딩하기 전과 후를 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 내지 시료 4에 따른 하이드로겔의 전단 강도를 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 및 시료 3에 따른 하이드로겔의 anDC 로딩 후의 전단 강도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 내지 시료 4에 따른 하이드로겔의 인장 강도를 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 내지 시료 4에 따른 하이드로겔의 체내 안정성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 및 시료 3에 따른 하이드로겔이 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 담지하지 않은 상태에서는 anDC를 방출하지 않는 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명 실험예 1에 있어서, 시료 1 및 시료 3에 따른 하이드로겔이 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 담지한 상태에서 약물 방출능을 평가한 결과 그래프이다. 시간 경과에 따라 anDC가 지속적으로 방출됨을 보여준다.
도 8은 본 발명 실시예 2에 따른 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)의 전달 유형으로서, anDC를 w/o/w 에멀젼으로 제형화하여 표적 부위에 전달하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 9는 본 발명 실험예 2에 있어서, 실시예 2에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 담지하지 않은 w/o 에멀젼 및 anDC를 담지한 w/o/w 에멀젼의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명 실험예 2에 있어서, 수지상세포 모방 나노구조체를 담지한 에멀젼의 SEM 이미지를 나타낸 것이다. anDC 에멀젼의 내부(W/O) SEM 이미지로, 빨간색 화살표는 세포막, 파란색 화살표는 금 나노입자를 의미한다.
도 11은 본 발명 실험예 2에 있어서, 수지상세포 모방 나노구조체를 담지한 에멀젼의 피부 섬유아세포(HDF)에 대한 독성 시험결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명 실험예 2에 있어서, 실시예 2에 따라 제조된 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율(1:1, 2:1, 4:1)에 따른 저장 모듈러스 및 손실 모듈러스값을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명 실험예 2에 있어서, 실시예 2에 따라 제조된 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율(1:1, 2:1, 4:1)에 따른 tan δ을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명 실험예 2에 있어서, 실시예 2에 따라 제조된 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율(1:1, 2:1, 4:1)에 따른 탄성(Elasticity)값을 나타낸 그래프이다.
도 15 내지 도 18은 본 발명 실험예 2에 따라 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율에 따른 시간 경과시 전단 변형에 대한 저장모듈러스 및 손실모듈러스값을 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명 실험예 2에 따라 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율에 따른 시간별 LVE 영역의 저장 모듈러스 변화를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명 실험예 2에 따라 anDC 에멀젼의 PLGA : anDC 비율에 따른 시간별 안정도 변화를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명 실험예 2에 따라 PLGA: anDC=1:1인 anDC 에멀젼의 투과성을 평가한 것이다.
도 22는 본 발명 실험예 2에 따라 PLGA: anDC=2:1인 anDC 에멀젼의 투과성을 평가한 것이다.
도 23은 본 발명 실시예 3에 따른 anDC를 담지한 필름에 관한 모식도 및 일 실시 형태인 anDC가 접착성 필름에 분산된 패치형을 도시한 것이다.
도 24는 본 발명 실시예 3에 따른 히알루론산 필름 내 anDC의 존재를 확인한 공초점 이미지를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명 실험예 3에 따른 anDC 담지 히알루론산 필름을 돼지 피부에 부착하고, 시간 경과에 따라 피부에 투과된 깊이를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명 실험예 3에 따른 anDC 담지 히알루론산 필름을 마우스 피부에 부착하고, 30분 경과한 후 피부에 투과된 깊이를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명 실험예 3에 따른 anDC 담지 히알루론산 필름에서의 anDC 방출능 평가 그래프로서, 5분 이내 anDC가 100% 방출된 결과를 나타낸다.
도 28은 본 발명 일 실시예에 따른 수지상세포 모방 나노구조체 및 마이크로니들을 포함하는 진피전달용 조성물의 일 예에 대한 모식도이다.
도 29는 본 발명 실험예 4에 따라 anDC의 대식세포의 식세포 작용 결과를 나타낸 것으로 Group 6을 제외한 Group 1-5는 모두 linear한 경향으로 시간에 따라 감소함을 보인다.
도 30은 본 발명 실험예 4에 따른 Group 6 및 Group 3의 대식세포에 의한 식세포 작용 결과를 비교한 그래프이다.
이하에서 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물에 대하여, 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 본 발명의 설명에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서의 실시예 및 첨부된 도면은 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로서, 실시예 및 도면에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 실시예 및 도면으로 한정되는 것은 아니다. 본 발멸의 기술적 사상을 변화시키지 않는 범위 내에서 다른 형태로 구체화될 수 있다.
또한 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 효과 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도될 수 있다.
이하 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명은 나노입자-세포화 기술을 이용한 수지상세포 모방 나노구조체를 면역항암제로 활용하는 기술에 관한 것이며, 상세하게는 수지상세포 모방 나노구조체를 효과적으로 인체 내 표적 부위에 전달하는 다양한 방법에 관한 것이다.
구체적으로 본원 발명은 나노입자 코어 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘을 포함하는 수지상세포 모방 나노구조체; 및 담체, 필름 및 마이크로니들에서 선택되는 어느 하나;를 포함하는, 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
(수지상세포 모방 나노 구조체)
나노입자-세포화 기술은 3가지 대표적인 단계로 진행된다. (1) 살아있는 세포의 세포막을 손상 없이 추출하고 (2) 필터 압출기를 이용하여 소정 사이즈의 나노 리포좀을 생성한 뒤, (3) 코팅하고자 하는 나노입자와의 필터압출을 반복함으로써 물리적인 힘을 가해 세포막 전체를 나노입자 표면에 옮길 수 있다. 또한, 세포막 및 나노입자의 종류에 상관없이 원하는 대로 특정 세포를 모방하는 나노입자를 제조할 수 있다는 점에서 파생되는 기술이 다양하다.
수지상세포를 이용한 암 치료 백신의 경우 환자의 혈액 내 단핵세포 (monocyte)로부터 분화시킨 수지상세포에 암 항원을 발현시키게 한 후 해당 암 환자에게 다시 주입함으로써 암 환자 체내 암 항원 특이적 T 세포를 활성화시키는 전략을 사용하였다. 하지만 이러한 형태의 수지상세포 암 치료 백신은 주입한 수지상세포의 짧은 생존기간 및 약한 T 세포 자극 능력 등의 한계로 인해 뚜렷한 항암 효과를 나타내지 못했다.
또한 면역항암치료 이외에도 류마티스 관절염을 포함한 자가면역질환의 치료를 위해서 면역관용(immune tolerance)이 유도된 수지상세포를 치료제로 사용하고자 하는 노력들이 있었으나, 마찬가지로 면역관용 수지상세포의 짧은 생존기간 및 약한 면역억제 능력 등으로 인해 충분한 치료 효과를 나타내지 못했다.
본 발명은 이러한 한계를 극복하기 위한 새로운 형태의 면역치료제를 제공하며, 나아가 인체 내 표적 부위에 효과적으로 전달할 수 있는 다양한 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 구체적으로, 나노입자 코어; 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하고, 상기 쉘은 지질 분자의 이중층을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 나노입자는 생체적합성을 가지며, 바람직하게는 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 발열하는 성질을 가진 것일 수 있다. 구체적으로 광열 효과를 나타낼 수 있는 금속 나노입자, 유기 고분자 나노입자, 멜라닌 나노입자, 그래핀 나노입자, 무기 나노입자 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 나노입자는 환원전위가 높아 체내에서 안전한 상태를 유지할 수 있고, 표면 개질이 용이한 금 나노입자일 수 있다.
일 예로서, 수지상세포 모방 나노구조체는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 수지상세포를 급속 냉동-해동 및 원심분리하여 세포막을 정제할 수 있다. 상기 정제된 세포막에 초음파를 처리하여 수백 나노 또는 수 마이크로 단위의 세포막 현탁액을 형성할 수 있다. 이후 상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필터를 통해 여과하면 원하는 크기의 세포막 리포좀을 수득할 수 있다. 상기 세포막 리포좀과 나노입자를 혼합하고, 필터로 공압출하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득할 수 있다. 이는 수지상세포의 세포막이 상기 나노입자 표면에 코팅된 형태이다.
상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱할 수 있다. 수지상세포화된 나노입자를 항원에 노출시킴으로써 항원이 세포막에 탑재되는 것인데, 이를 통해 수지상세포 모방 나노구조체는 보다 강력한 항원 특이적 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.
상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있고, 상기 종양 항원은 종양 연관 항원 또는 종양 특이 항원일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 생쥐 암 모델에 있어서, 오브알부민(ovalbumin, OVA), LCMV(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus) glycoprotein, retrovirus protein 유래의 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 보다 구체적으로 OVA257-264, GP33-41, p15E 모델의 암 항원 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
또한 인간 암 항원에 있어서, (1) HER2/Neu, tyrosinase, gp100, MART, HPV E6/E7, EBV EBNA-1, carcinoembryonic antigen, a-fetoprotein, GM2, GD2, testis antigen, prostate antigen, 및 CD20를 포함하는 종양 연관 항원 및 (2) 다양한 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 신생항원(neoantigen)을 포함하는 종양 특이 항원으로부터 유래된 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 항원은 상술한 암 항원 펩타이드 1종 또는 2종 이상의 상이한 펩타이드일 수 있다.
상기 펄싱은 당업계에 알려진 다양한 펄싱 프로토콜이 가능하고, 구체적으로 5% CO2 및 37℃ 가습 조건에서 0.5 내지 6 시간 동안 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질과 혼합 배양하여 수행될 수 있다.
항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체는 나노사이즈의 크기로 인하여 암 표적기능이 매우 뛰어나며(negative targeting), 안정적이고, 부피 대비 넓은 표면적을 가지고 있기 때문에 T 세포와 쉽게 접촉할 수 있다. 따라서 수지상세포 모방 나노구조체의 활성화 및 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 또한, 체내에서 사멸의 위험이 없기 때문에 체내 순환 시간이 굉장히 길다는 장점이 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체는 면역관문 억제를 통한 면역 치료를 위해 αCTLA-4 단일클론 항체, αPD-1, αPD-L1이 표면에 수식된 것일 수 있다. T 세포 활성화능에서도 현저히 향상된 효과를 나타낼 수 있다.
(담체)
본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 효과적으로 전달하기 위한 담체를 구성요소로 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 담체는 젤라틴을 포함하는 경구용 하이드로겔일 수 있다. 구체적으로 상기 하이드로겔은 연질의 젤라틴 캡슐 형태일 수 있고, 이 경우 수지상세포 모방 나노구조체를 함입하여 밀봉할 수 있다. 또한 특정 시간 및 위치에 도달할 때까지 수지상세포 모방 나노구조체를 보호하여 이의 활성을 유지하도록 하며, 필요시 분해되어 수지상세포 모방 나노구조체 방출에 용이할 수 있다.
일 예에 있어서, 하이드로겔은 젤라틴, 글리세롤을 포함하며, 선택적으로 가교제를 더 포함할 수 있다. 이때 가교제로는 염화칼슘을 포함할 수 있다.
일 예에 있어서, 하이드로겔은 젤라틴, 글리세롤 및 펙틴을 포함하며, 선택적으로 가교제로서 염화칼슘을 더 포함할 수 있으나, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다. 상기 펙틴을 포함하는 경우 인장 강도 및 전단 강도에서 하이드로겔 물성이 보다 향상되며, 구체적으로 증류수, 버퍼액, 및 위장액에서의 무게 변화가 적어, 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체가 체내 환경에서 높은 안정도로 존재할 수 있다.
일 예로서, 상기 펙틴을 포함하는 하이드로겔의 최대 힘에서의 인장 변형율은 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상일 수 있고, 구체적으로 50% 내지 90%, 또는 55% 내지 80%일 수 있다.
일 예로서, 상기 펙틴을 포함하는 하이드로겔의 파단 시 인장 변형율은 40% 이상, 50% 이상, 또는 60% 이상일 수 있고, 구체적으로 60% 내지 95%, 또는 65 내지 85%일 수 있다.
본 발명에 있어서, 경구용 하이드로겔은 최대 힘에서의 인장 강도가 0.01 내지 0.05 MPa, 최대 힘에서의 인장 변형율이 50 내지 90%, 및 파단 시 인장 변형율이 60% 내지 95%를 모두 만족하는 경우 수지상세포 모방 나노구조체 기반 나노 항암제 전달 효과가 매우 우수하게 나타날 수 있다.
일 실시예에 있어서, 담체는 하이드로겔 100 중량부에 대하여 젤라틴 10 내지 20 중량부, 글리세롤 5 내지 15 중량부, 펙틴 0.1 내지 5 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 젤라틴 및 펙틴은 30:1 내지 6:1의 중량비로 혼합될 수 있고, 보다 구체적으로 20:1 내지 10:1의 중량비로 혼합될 수 있다. 이때 필요에 따라 염화칼슘과 같은 가교제를 0.1 내지 5 중량부 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 담체는 에멀젼일 수 있다. 즉, 수지상세포 모방 나노구조체 및 상기 담체는 W/O/W 또는 W/O 에멀젼을 형성할 수 있다. 구체적으로는 W/O형 에멀젼이 수상 (water phase)에 재분산되어 형성된 수중유중수(W/O/W)형 다중 에멀젼일 수 있다. W/O/W형 다중 에멀젼은 유상 (oil phase)이 내부 수상을 외부 수상과 분리시키는 반투과성을 나타내며, 본원 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 방출을 제어함에 있어 용이하다.
일 실시예에 있어서, 상기 W/O/W형 에멀젼은 면역관문억제제를 더 담지한 것일 수 있다. 친수성 면역관문억제제는 소수성의 생분해성 고분자와 혼합되어 W/O형 에멀젼을 형성할 수 있고, 이는 친수성의 생체적합성 입자와 혼합되어 W/O/W형 다중 에멀젼을 수득할 수 있다.
이때 면역관문억제제는 αCTLA-4 단일클론 항체, αPD-1, αPD-L1에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 유상을 형성하는 소수성의 생분해성 고분자는 폴리락타이드-글리콜산 공중합체 (poly(latic-co-glycolc acid, PLGA), 폴리글리콜산((Poly(glycolic acid), PGA), 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 및 폴리락트산(poly(lactic acid, PLA)에서 선택될 수 있으나, 이에 반드시 제한되지 않는다.
상기 소수성의 생분해성 고분자와 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 포함하는 제1 수상 용액은 W/O형 1차 에멀젼을 형성할 수 있다. 상기 1차 에멀젼은 제2수상과 혼합되어 W/O/W형 2차 에멀젼을 형성할 수 있다. 이때 유상은 호모게나이저법, 고압 호모게나이저법, 고속 교반법, 초음파 유화법, 막 유화법 등의 표준 방법에 의하여 내부 수상에 분산될 수 있고, 필요에 따라 열이 가해질 수 있다.
구체적으로 제2수상은 소디움 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulphate, SDS), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 (cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB), 메틸 셀룰로오스 (methyl cellulose, MC), 젤라틴 (gelatin), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 수용액에서 선택될 수 있으나, 이에 반드시 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 표적 부위 전달용 조성물은 수지상세포 모방 나노구조체가 담지된 W/O/W형 2차 에멀젼일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 유상 및 제1수상은 1:1 내지 4:1 또는 1.1:1 내지 3.9:1, 또는 1.5:1 내지 3.5:1의 중량비로 포함되어, 전술한 범위에서 W/O/W형 에멀젼은 제형 안정도가 우수하게 나타날 수 있다.
상술한 기술적 특징을 가지는 수지상세포 모방 나노구조체가 담지된 W/O/W형 에멀젼은 피부에 도포되어 종양 부위에 70 ㎛ 이상의 깊이로 침투될 수 있어, 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 효과적으로 전달할 수 있다. 구체적으로 상기 W/O/W형 에멀젼은 단시간에 60 내지 420 ㎛ 깊이로의 침투가 용이하다. 이에 수지상세포 모방 나노구조체는 상기 에멀젼 형태로 표적 부위에 용이하게 확산 및 침투되어, 정상 조직에 영향을 미치지 않고, 표적화 치료가 가능하다. 구체적으로 상기 조성물에 따른 제형은 흑색종 발생 피부에 보다 효과적으로 적용될 수 있다.
(필름)
본 발명의 일 실시예에 있어서, 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물은 필름 내 수지상세포 모방 나노구조체가 분산된 것일 수 있다. 구체적으로 접착성 필름 내 상기 나노구조체가 균일하게 분산된 패치일 수 있다.
구체적으로 상기 패치는 수지상세포 모방 구조체가 분산된 접착성 필름 외 패치의 접착성을 보존하기 위한 보호층을 더 포함할 수 있다. 또한 상기 패치는 수분을 비롯한 외부 환경으로부터 보호하기 위한 배리어츨을 더 포함할 수 있다.
일 예로서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물은 경피 전달용 조성물일 수 있다.
여기서 "패치"는 종래의 약물 레저버 또는 약물 매트릭스 패치, 또는 비제한적인 예에서 경피 약물 전달 기술에 적합하게 사용될 수 있는 임의의 다른 유형의 패치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액 또는 겔의 형태일 수 있거나, 또는 고체 중합체 매트릭스 내에 분산된 형태를 모두 포함할 수 있다.
패치는 약물과 점착제 성분이 포함된 층을 피부에 직접 부착하는 형태로 인체에 적용된다. 피부는 이물의 침입을 막는 배리어 층이 있어, 약물의 침투를 막는 역할을 하여 원하는 약물을 피부 내부에 침투시키기 용이하지 않다.
이러한 측면에서, 상기 패치는 보조적 외부 자극에 따라 수지상세포 모방 나노구조체가 방출될 수 있다. 예를 들어 외부 자극은 미세 전기 자극, 적외선, 또는 pH, 혈당, 산소포화도, 효소 활성과 같은 생체 환경이 이에 해당할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 필름의 두께는 20 내지 1000 ㎛, 50 내지 500 ㎛, 또는 60 내지 300 ㎛일 수 있다.
상기 필름 내 수지상세포 모방 나노구조체가 분산된 패치를 적용하는 경우 경구 투입에 의해 발생하는 부작용이 없고, 피부를 통해 약물을 체내에 전달하기 때문에 위장장애를 가진 환자들의 치료에 유익하다. 상기 패치는 표적 부위에 국소적으로 작용하여, 치료 효과가 우수할 수 있다.
상기 필름 내 분산된 수지상세포 모방 나노구조체는 피부에 적용되어 피부 속 70 내지 330 ㎛의 깊이로 침투될 수 있다.
상기 필름의 재료는 생체적합성 고분자로 구성된 것으로서 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 피브린, 및 엘라스틴에서 선택되는 하나 이상의 수용성 천연 고분자에서 선택될 수 있다. 본 발명의 비제한적인 일 실시예에 있어서, 상기 필름은 히알루론산 필름일 수 있다.
필요에 따라 적절히 조절될 수 있으나, 일 예에 있어서, 수지상세포 모방 나노구조체는 1×105 내지 1×108 cells/㎖ 의 농도로 필름 내 로딩될 수 있다.
(마이크로니들)
본 명세서에서 "마이크로니들 (microneedle)"은 직경 및 길이가 1 mm 미만의 극소 사이즈 미세바늘로 피부 각질층을 통과하여 피부 안에 백신 또는 약물을 투여하는 약물전달시스템을 의미하고, 패치형 외에도 약물을 전달할 수 있는 것이라면 문신(tattoo)용 마이크로니들을 포함할 수 있다.
마이크로니들은 실리콘, 비생분해성 고분자, 금속, 유리 등의 소재일 수 있으나, 마이크로니들이 패치형인 경우 생분해성 고분자로 구성된 것이 바람직하다.
구체적으로 생분해성 고분자는 Hyaluronic Acid (HA), Poly(lactic acid) (PLA), (PCL), Polyhydroxyalkanoate (PHA), Polyesteramide (PEA), polyethylene glycol (PEG), poly(p-dioxanone) (PPDO), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), Polyglycolic acid (PGA), Polyvinyl alcohol (PVA) 및 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다.
마이크로니들은 구조 형성 물질 이외에 가소제, 계면활성제, 보존제, 항염제 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 가소제(plasticizer)로는 예를 들어, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 디프로필렌글리콜(dipropylene glycol), 부틸렌글리콜(butylene glycol), 글리세린(glycerin) 등의 폴리올이 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 마이크로니들은 피부 문신용일 수 있다. 이때 마이크로니들은 염료, 안료, 및 형광 물질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로 마이크로니들은 문신용 잉크를 포함할 수 있고, 일 예로서, 수지상세포 모방 나노구조체는 용매, 상기 염료, 안료 및 형광 물질 중 하나 이상, 및 첨가제와 문신용 잉크에 혼합될 수 있다.
마이크로니들의 길이는 특정 크기에 한정되는 것은 아니나, 각질층을 통과하여 피부 세포를 타깃으로 하는 목적을 고려하여 마이크로니들의 상하 길이는 0.05 mm 내지 2.5 mm, 또는 0.1 mm 내지 2 mm 일 수 있다.
일 예로서, 반영구 혹은 영구적인 문신을 위해서는 염료, 안료, 형광 물질을 진피층에 전달해야 하므로 마이크로니들의 길이는 200 ㎛ 이상일 수 있다.
일 예로서, 일시적인 문신을 위해서는 표피층에 색소를 전달하여 피부의 재생주기 동안 문신이 유지되도록 하기 위해 마이크로니들의 길이는 20 내지 200 ㎛일 수 있다.
마이크로니들의 모양은 원통형(Cylinder), 피라미드형(Pyramid), 원뿔형(Cone), 경사형(Beveled)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
마이크로니들을 형성하는 물질은 피부 내에서 생분해되거나 용해되는 것일 수 있다. 마이크로니들의 피부 적용 후 마이크로니들이 용해 또는 붕괴되어야 하므로, 본 발명에 있어서, 마이크로니들은 약물의 안정성을 위해서 생분해성 고분자보다는 피부 내에서 용해되는 물질로 제조되는 것이 바람직하다.
상기 마이크로니들을 형성하는 용해성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스 (sodium carboxymethyl cellulose), 비닐피롤리돈-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 당(saccharide) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 수지상세포 모방 나노구조체는 문신용 잉크와 함께 마이크로니들에 함입되고, 마이크로니들이 피부 속에 침투하여 표적 부위에 도달하여, 체내에 존재하는 T 세포의 활성을 효과적으로 증대시킬 뿐 아니라, 우수한 투과성 및 장기간 안정적인 체류로 인해 림프절 뿐만 아니라 종양을 포함한 염증 부위에 머물 수 있으며, 이때 표적 부위에 추가로 근적외선을 조사하면 나노입자의 광열효과로 인해 암 세포를 더 효과적으로 제거할 수 있는 이점이 있다.
또한 본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
일 예시에 따르면, 암은 B-세포 림프종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종, 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종, 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종일 수 있으나 이에 제한받지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 수지상세포 모방 나노구조체와 조합하여 면역 증강제가 더 포함될 수 있다. 면역 증강제는 지방조직에서 분리된 기질혈관 분획물일 수 있다. 기질혈관분획물(stromal vascular fraction, SVF)은 표현형이나 기능에 있어서 림프절 기질세포와 유사한 세포들로 구성되어 있고, 상기 SVF를 3차원 배양하여 얻은 SVF 스페로이드(spheroid)가 면역세포의 이동 통로가 되는 혈관을 형성할 수 있다. 또한 SVF 스페로이드가 면역세포를 불러들이고 활성화시키는 케모카인 등 다양한 인자들(Spp1, Ccl8, Cxcl5, Postn, Cxcl16, Ccl17 등)를 높게 발현하고, SVF 스페로이드가 수지상 세포를 비롯한 면역세포를 유인하며 수지상 세포와 함께 생체 내로 주입될 때 수지상 세포와 T 세포의 상호작용을 증진시킬 수 있는 점에서 바람직할 수 있다. 구체적으로, 상기 기질혈관 분획물은 2차원 배양물 또는 3차원 배양물 스페로이드 일 수 있다.
상기 면역 증강제는 CD40 아고니스트(agonist)일 수 있다. CD40 아고니스트는 잠재적인 면역자극 및 항종양 활성을 갖는 세포 표면 수용체 CD40의 아고니스트를 의미한다. 내인성(endogenous) CD40 리간드(CD40L 또는 CD154)와 유사하게, CD40 아고니스트는 바람직하게는 다양한 면역 세포 유형의 CD40에 결합할 수 있다. CD40 분자에 대한 아고니스트의 결합은 세포 증식 및 항원 제시 세포(APC)의 활성화, B 세포 및 T 세포의 활성화를 유발하여 면역 반응을 향상시킬 수 있다. CD40 아고니스트로는 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 같은, 아고니스틱 CD40 단일클론 항체, 이의 단편 또는 유도체일 수 있다.
수지상 세포 모방 나노구조체와 조합하여 투여될 수 있는 CD40 아고니스트는 CD40L과 같은 천연 CD40 리간드, 또는 아고니스틱 특성을 갖는 이의 기능적 단편일 수 있다. CD40 아고니스트는, 예를 들어, CP-870, CP-893(61), CDX-1140, APX005M, RG7876/셀리크렐루맙, ADC-1013/JNJ-64457107, ABBV-428, SEA-CD40 또는 MEDI5083(62) 또는 아고니스틱 특성을 갖는 이의 기능적 단편과 같은 아고니스틱 특성을 갖는 단일클론 항체일 수 있다. CD40 아고니스트는 또한 예를 들어 MiniCD40Ls-1 또는 MiniCD40Ls-2와 같은 천연 리간드 또는 아고니스틱 항체를 모방하도록 설계된 소분자일 수 있다.
상기 면역 증강제는 CD40L 단백질 및 이종 CXCL13 단백질일 수 있다. CD40L 단백질 및 이종 CXCL13 단백질은 종양 항원에 대한 새로운 항종양 세포 및 체액성 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 특정 메커니즘에 결합하지 않고, 수지상 세포 모방 나노구조체와 조합하여 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
상기 약학적 조성물은 CD93 단백질을 더 포함할 수 있다. CD93을 더 포함함에 따라 본 발명에 따른 약학적 조성물은 수지상 세포 모방 나노구조체와 숙주 수지상 세포 사이의 크로스-토크(cross-talk)를 촉진하여, 안정적이고 지속적인 숙주 항-종양 면역원성을 생성할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥 내 주사, 비강 내 흡입, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 경피 흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
아울러 본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료방법을 제공할 수 있다. 상기 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 개체에서 종양 특이적 면역 반응을 유도하거나 개체에서 암의 증상을 치료 및/또는 완화시킬 수 있다. 이때 상기 개체는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다.
통상의 기술자는 본 발명의 양태에 따라 치료의 투약량 및 지속기간을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 특정 환자에 대한 유효량은 치료 중인 병태, 환자의 전반적 건강 및 투여 방법, 경로 및 용량과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 당업계에 공지된 파라미터를 이용하여 임상의는 적절한 용량을 결정할 수 있다. 치료적으로 사용될 약학적 조성물의 유효량은, 치료 내용 및 목적에 따라 결정될 것이다. 따라서 통상의 기술자는 치료를 위한 적절한 투약량 수준이, 나노구조체 및 면역증강제의 종류에 따라 달라지는 것을 자명하게 알 수 있고, 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체중 및 기관의 크기, 연령 및 일반적 건강상태에 따라 다를 것임을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 투약량을 적정할 수 있고, 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여 경로를 변경시킬 수 있다.
이하, 구체적인 실험예들을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대해 추가적으로 설명한다. 실험예에 포함된 실시예 및 비교예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
제조예 1. 수지상세포 모방 나노구조체의 제조
6주~8주령 Na
Figure pat00001
ve B6 마우스(Orient Bio)의 대퇴골에서 분리된 골수세포로부터 분화된 수지상세포를 추출하여, 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 순수한 수지상세포를 수득하였다. 이후, Protease Inhibitor Tablet-PBS buffer를 처리하여 1~2×106 cells/㎖ 농도로 분산시켰다. 그리고 -70 ℃에서 급속 냉동, 상온에서의 해동 과정 및 원심분리를 거쳐 세포막만을 정제하였다. 이후 20%의 진폭으로, 3초 켜기/끄기 및 사이클간 2초의 냉각기를 갖는 3초 1회전을 총 60회 수행하는 초음파(VC505, Sonics & materials)를 처리하여, 마이크로 단위의 세포막 현탁액을 확보하였으며, 이를 나노 사이즈의 필터를 갖는 폴리카보네이트 막(기공크기 1㎛, 400 ㎚, 100 ㎚)으로 걸러내 각 기공 크기의 직경을 갖는 나노 리포좀을 생성하였다. 나노입자 표면 상에 코팅되는 세포막의 표면적을 고려하여, 나노입자 및 리포좀이 최적화된 혼합비율을 가지는 경우를 XDM=1로 전제하였다.
[식 1]
이에 따라, 상기 XDM = 1이 되도록 폴리스타이렌(PS) 나노입자 5 ㎕ 및 리포좀 1 ㎖을 혼합한 후, 함께 필터압축 (filter extrusion)하여, 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다. 상기 제조된 수지상세포 모방 나노구조체에 0.2 ㎍/㎖의 GP-33 항원을 약 30분간 37 ℃에서 처리함으로써 MHC class I, II 표면에 항원을 제시할 수 있도록 유도하여, 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
제조예 2. 수지상세포 모방 나노구조체의 제조
나노입자를 60 ㎚의 금 나노입자를 사용한 것을 제외하면, 상기 제조예 1과 동일한 방법을 수행하여 수지상세포 모방 나노구조체 및 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다. 상기 수지상세포 모방 나노구조체는 크기가 대략 80 ㎚로 관찰되었다.
[실험예 1] 수지상세포 모방 나노구조체(anDC) 전달용 경구용 시스템
하기 실시예 1에 따라 제조된 젤라틴 기반 anDC 전달 시스템의 경구용 항암제의 전달 효능 및 생체적합성 여부를 평가하였다.
실시예 1. 젤라틴 하이드로겔을 이용한 anDC 전달 시스템 제조
하기 표 1에 기재된 조성에 따른 하이드로겔을 준비하고, 모든 시료에 대해 상기 제조예 2에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체 107 개/㎖ 를 1 ㎖ 씩 로딩하였다.
[표 1]
(젤라틴 하이드로겔의 전단 강도 평가)
상기 시료 1 내지 4의 조성에 따른 하이드로겔의 전단 강도를 레오미터를 이용하여 측정하였고, 그 결과는 도 2에 도시되었다. 도 2의 결과를 살펴보면, 모든 시료에서 G'> G"를 나타내어 하이드로겔이 성공적으로 형성되었음을 알 수 있다. 특히 3번 시료 및 4번 시료의 전단 강도가 1번 시료 및 2번 시료와 대비하여 매우 높게 유지되며 탄성이 훨씬 높게 나타남을 확인할 수 있는데, 이는 펙틴이 포함된 하이드로겔의 물성이 우수하다는 점을 시사한다. 3번 시료 및 4번 시료는 전단 강도의 미차가 있으나, CaCl2에 의한 가교로 하이드로겔의 큰 물성 변화는 없는 것으로 해석할 수 있다.
(anDC 로딩 후의 젤라틴 하이드로겔의 전단 강도 평가)
상기 제조된 젤라틴 하이드로겔에 실시예 1에 따라 수지상세포 모방 나노구조체를 로딩한 후, 레오미터를 이용하여 1번 시료 및 3번 시료에 대한 전단 강도를 재측정하였고, 그 결과는 도 3에 도시되었다. 도 3의 결과를 살펴보면, 수지상세포 나노구조체의 로딩 후 전단 강도의 변화는 나타나지 않아 하이드로겔의 물성은 변화되지 않음을 확인할 수 있다.
(젤라틴 하이드로겔의 인장 강도 평가)
상기 시료 1 내지 4의 조성에 따른 하이드로겔의 인장 강도를 ASTM D 638의 표준 방법에 따라 만능 인장시험기(UTM)을 이용하여 측정하였고, 그 결과는 하기 표 2 및 도 4에 도시되었다. 하기 표 2에 따르면 3번 및 4번 시료의 펙틴이 포함된 하이드로겔의 경우 최대 힘에서의 인장 강도, 인장 변형율 및 파단 시 인장 변형율이 모두 우수하게 나타남을 확인할 수 있다.
[표 2]
(젤라틴 하이드로겔의 체내 환경 안정성 평가)
상기 시료 1 내지 4의 조성에 따른 하이드로겔의 안정성 평가를 위해 3차 증류수(3DW), 인산버퍼용액(Phosphate buffered saline, PBS), 위장액(Gastric fluid), 소장액(Intestinal fluid)에 하이드로겔을 넣고 1시간 후의 무게 변화를 측정하였고, 그 결과는 도 5에 도시되었다. 시료 3의 경우 3차 증류수 및 인산버퍼용액에서 안정하며, 위장액에서도 무게 변화가 가장 적게 나타나 anDC를 안정적으로 전달할 수 있는 담체로 작용할 것으로 예측할 수 있다.
(젤라틴 하이드로겔의 방출능 평가)
상기 시료 1 및 3의 조성에 따른 하이드로겔의 약물 방출능 평가를 위해, 나노드롭을 이용하여 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 6 및 도 7에 도시되었다. 도 6은 수지상세포 모방 나노구조체를 담지하지 않은 상태의 젤라틴 하이드로겔(GG w/o anDC, GGP w/o anDC) 의 최대 흡광도 변화를 나타낸 것으로서, 금 나노입자에 해당하는 562nm에서의 피크가 관찰되지 않아 anDC가 방출되지 않음을 의미한다.
도 7은 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 담지한 젤라틴 하이드로겔(GG w/ anDC, GGP w/ anDC)의 최대 흡광도 변화를 나타낸 것으로서, 금 나노입자의 해당하는 562nm에서의 피크가 시간에 따라 점점 증가하는 양상을 보였는데, 이는 시간에 따라 anDC가 지속적으로 방출됨을 의미한다. 또한 펙틴을 첨가한 GGP의 경우 2시간 30분 후 방출된 anDC의 양이 펙틴을 첨가하지 않은 GG에서 40분 동안 방출된 anDC의 양과 같음을 확인할 수 있는데, 이는 펙틴에 의하여 anDC의 방출이 지연되었음을 의미한다. 이러한 양상은 펙틴을 첨가한 하이드로겔은 anDC의 인체 내 전달 기술로서 우수한 효과를 제공할 수 있음을 시사한다.
[실험예 2] 수지상세포 모방 나노구조체(anDC) 전달용 에멀젼의 성능 평가
하기 실시예 2에 따라 제조된 anDC 전달용 에멀젼 제형의 성능 및 세포 독성 여부를 평가하였다.
실시예 2. 수지상세포 모방 나노구조체 (anDC)를 담지한 W/O/W 에멀젼 제조
폴리락트산-글리콜산 공중합체 (Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 150 mg에 디클로로메테인 (dichloromethane, DCM)을 4 ㎖ 첨가하고 vortexing을 통해 녹여 유상 (oil phase)를 준비하였다. 폴리비닐알코올 (Poly (vinyl alcohol), PVA)를 2% w/v로 물에 녹여 수상 (water phase)를 준비하였다. 상기 유상의 PLGA 용액과 1xPBS에 분산되어 있는 수상의 수지상세포 모방 나노구조체 용액 (anDC 용액)을 homogenization을 통해 혼합하여 W/O 용액을 제조하였다. 제조된 W/O 용액을 준비된 2% w/v PVA 용액에 천천히 부어 homogenization을 진행하여 최종적인 anDC W/O/W 에멀젼을 제조하였다.
(SEM 이미지)
anDC를 담지하지 않은 PLGA 및 PVA의 W/O 에멀젼 및 anDC를 담지한 W/O/W 에멀젼의 SEM 이미지를 도 9에 도시하였다. 또한 도 10은 anDC 에멀젼의 내부 (W/O) SEM 이미지로 세포막 (빨간색 화살표 도시)과 금 나노입자 (파란색 화살표 도시)가 안정적으로 존재함을 확인할 수 있다.
(세포 독성 평가)
인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)를 96 웰플레이트에 1.0×104 cells/well의 농도로 분주하여, 24시간 배양 후, anDC 에멀젼을 처리하고, 24시간 동안 세포를 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척한 뒤 lysis buffer를 (25 mM Tris-HCl, pH 7.8, 2 mM EDTA,180 mM NaCl and 1% Triton X-100) 이용하여 세포를 분해하였다. 세포 용리액을 원심분리한 후 침전물에 2%의 2,4-dinitrophenylhydrazine 을 첨가한 뒤 상온에서 20분간 방치하였고, 20% trichloroacetic acid를 첨가하여 펠렛을 가라앉힌 후 가라앉은 펠렛을 ethanol: ethylacetate (1:1 v/v)용액을 이용하여 3회 반복 세척하였다. 이후 침전물에 6 M guanidin hydrochloride (500 ㎕)를 첨가한뒤 37 ℃에서 15분간 방치하고 1,500rpm에서 5분간 원심분리한뒤 상등액을 이용하여 370 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 11에 도시되었다. anDC를 담지하지 않은 W/O 에멀젼 및 anDC를 담지한 W/O/W를 처리한 군 모두 피부 독성이 없음을 확인하였다.
(제형의 안정성 평가)
제형의 안정성을 평가하기 위하여 수지상세포 모방 나노구조체를 담지한 anDC w/o/w 에멀젼의 물리적 물성을 측정하였다. PGLA 및 anDC의 중량비가 1:1, 2:1 및 4:1이 되는 3개의 에멀젼 샘플에 대하여 레오미터를 이용하여 저장 모듈러스 및 손실 모듈러스, tanδ, 탄성도를 측정하고, 1주일 간의 경과를 관찰하였다. 그 결과는 도 12 내지 도 20에 도시되었다. 도 12 내지 14을 참조하면, 모든 에멀젼에서 tanδ<1인 결과를 나타내어 점성보다는 탄성이 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 15 내지 도 20을 참조하면, 모든 샘플의 에멀젼은 선형 점탄성 (linear viscoelastic, LVE) 영역에서 G'>G"이고, 겔과 같은 거동을 보인다. PGLA: anDC의 비가 1:1인 샘플의 경우 가장 단단하며, 7일차에 고형화되었고, 4:1인 샘플의 경우 가장 부드러웠으나, 5일차에 고형화되었다. 반면 2:1인 샘플의 경우 7일까지도 제형이 안정하게 유지되어, 가장 안정도가 높게 나타남을 확인하였다.
(제형의 투과도 평가)
PGLA: anDC의 비가 1:1인 샘플 및 2:1인 샘플에 대해 피부 투과도 평가를 진행하였다. 그 결과는 도 21 및 22에 도시되었다. 샘플 모두 10분 경과 시, 60 ㎛까지 투과된 모습을 관찰할 수 있고, PGLA: anDC의 비가 2:1인 샘플의 경우 30분 경과 시, 1:1인 샘플이 100 ㎛까지 투과한 것과 대비하여 훨씬 더 깊은 420 ㎛까지 투과된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 수지상세포 모방 나노구조체(anDC) 전달용 패치의 성능 평가
실시예 3. 약물전달 패치 제조
히알루론산 (Hyaluronic acid, HA) 3%, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) 2%를 3차 증류수에 녹이고, 0.1M NaOH를 0.1% 넣고 40 ℃에서 하루 동안 혼합하였다. 제조예 2에 따라 준비된 수지상세포 모방 나노구조체(anDC)를 HA용액에 1:4의 부피비로 혼합하였다. 이후 용액을 동결건조하여 anDC가 담지된 히알루론산 필름을 제조하였다. 도 24는 히알루론산 필름 내 anDC가 성공적으로 담지되었음을 확인할 수 있는 2D 및 3D 공초점 이미지를 나타낸 것이다.
(투과 실험)
돼지 피부와 마우스 피부에 하기 실시예 3에서 제조한 anDC가 담지된 히알루론산 필름을 부착하였다. 이후 시간 경과에 따라 anDC의 투과도를 관찰한 결과를 도 25 및 도 26에 도시하였다. 도 25를 참조하면, 돼지 피부에서 anDC가 100~330 ㎛까지 깊숙이 침투한 것을 확인할 수 있다. 도 26을 참조하면, 마우스 피부에서 anDC가 30분간 60 ㎛ 깊이까지 도달한 것을 확인할 수 있다. 표적 부위가 깊이 70 ㎛ 이상인 점을 고려하면, 본원 발명에 따른 패치는 종양 부위까지 면역항암제를 전달하기에 충분하다고 기대된다.
(방출 실험)
0.3333Х106 cell/㎖ 농도의 anDC가 담지된 히알루론산 필름에서 anDC의 방출능을 평가하였고, 결과는 도 27에 도시되었다. 5분 이내 anDC가 100% 방출되었음을 확인할 수 있다.
실험예 4. 수지상세포 모방 나노구조체(anDC) 전달을 위한 마이크로니들의 성능 평가
마이크로니들 또는 타투 매개에 의한 anDC 전달방법이 효과적인지 여부를 평가하기 위하여, anDC가 대식세포에 의한 식작용이 일어난 이후, 세포외배출되는지를 형광 안료 DiD(red-fluorescent)를 이용하여 확인하였다.
Raw 264.7 세포를 96 웰플레이트에 시딩하고, 24시간이 경과한 후, DiD (DiIC18(5); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt) 및 anDC-DiD를 처리하였다. 실험군에 따른 처리 조건은 하기 표 3에 기재된 바와 같다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여, 흡광도 측정을 통한 대식세포에 의한 식작용 테스트를 진행하였다. 그 결과는 도 29 및 도 30에 도시되었다.
[표 3]
도 29를 살펴보면, Group 6을 제외한 모든 Group에서 결과값은 linear하게 감소하는 추세로 나타났다. 도 30을 살펴보면, Group 6은 초기 흡광도(0 h)와 24 h의 흡광도 값이 동일하게 나타남을 알 수 있다. 또한 Group 3과 Group 6의 초기 흡광도(0 h) 결과값 이후 동일한 흡광도를 나타내는 14.6h까지는 Group 3이 Group 6에 비해 흡광도가 높은데, 이는 대식세포에 의한 식작용으로 cellular uptake가 일어났으며, 이후(14.6 h~) 다시 Group 6의 흡광도가 높아진 결과에 따라 anDC-Did가 세포외배출되었음을 확인할 수 있었다.
즉, anDC가 대식세포에 의한 식작용이 일어난 이후, 세포외배출됨을 본 실험을 통해 검증할 수 있었다.
본 발명은 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다.

Claims (20)

  1. 나노입자 코어 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘을 포함하는 수지상세포 모방 나노구조체를 표적 부위에 전달하기 위한 조성물로서, 상기 수지상세포 모방 나노구조체; 및 담체, 필름 및 마이크로니들에서 선택되는 어느 하나;를 포함하는, 수지상세포 모방 나노구조체의 표적 부위 전달용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 담체는 젤라틴을 포함하는 경구용 하이드로겔인, 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 하이드로겔 100 중량부에 대하여 젤라틴 10 내지 20 중량부, 글리세롤 5 내지 15 중량부, 및 펙틴 0.1 내지 5 중량부를 포함하는, 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 젤라틴 및 펙틴은 30:1 내지 6:1의 중량비로 포함되는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 수지상세포 모방 나노구조체 및 담체는 W/O/W 또는 W/O 에멀젼을 형성하는, 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 에멀젼은 면역관문억제제를 더 담지한, 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 에멀젼의 제1수상은 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하고, 유상은 생분해성 고분자를 포함하는, 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 유상 및 제1수상은 1.5:1 내지 3.5:1의 중량비로 포함되는, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드-글리콜산 공중합체 (poly(latic-co-glycolc acid, PLGA), 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 및 폴리락트산(poly(lactic acid, PLA)에서 선택되는, 조성물.
  10. 제 5항에 있어서,
    상기 에멀젼의 제2수상은 소디움 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulphate, SDS), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 (cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB), 메틸 셀룰로오스 (methyl cellulose, MC), 젤라틴 (gelatin), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 수용액에서 선택되는, 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 수지상세포 모방 나노구조체는 생체적합성 고분자를 포함하는 필름 내 분산된, 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 피브린, 및 엘라스틴에서 선택되는 하나 이상의 수용성 천연 고분자인, 조성물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 수지상세포 모방 나노구조체는 1×105 내지 1×108 cells/㎖ 의 농도로 필름 내 로딩된, 조성물.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 필름은 두께가 50 내지 1000 ㎛인, 조성물.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 필름 내 분산된 수지상세포 모방 나노구조체는 피부에 적용되어 피부 속 70 내지 330 ㎛의 깊이로 침투되는, 조성물.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로니들은 피부 문신용인, 조성물.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로니들은 염료, 안료, 및 형광 물질 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로니들을 형성하는 용해성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스 (sodium carboxymethyl cellulose), 비닐피롤리돈-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 당(saccharide) 또는 이들의 혼합물인, 조성물.
  19. 제 1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 면역치료제.
  20. 제 1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
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