ES2536710T3 - Nuevo uso terapéutico de LPC, ligandos agonistas específicos para el receptor G2A - Google Patents

Abstract

Un compuesto para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la supresión de la apoptosis de neutrófilos o a la liberación excesiva de IL-8 seleccionada entre sepsis y choque séptico, en un sujeto, donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en 18:0 LPC (también denominada: 1-estearoil lisofosfatidilcolina; L- α-Lisofosfatidilcolina estearoilo; Lisolecitina estearoilo), 18:1 LPC (también denominada: 1-oleoil lisofosfatidilcolina; L- α-Lisofosfatidilcolina oleoilo; Lisolecitina oleoilo); 14:0 LPC (también denominada: 1-miristoil lisofosfatidilcolina; L-α- Lisofosfatidilcolina miristoilo), y 16:0 LPC (también denominada: 1-palmitoil lisofosfatidilcolina; L-α-Lisofosfatidilcolina palmitoilo; Lisolecitina palmitoilo; DL-α-Lisofosfatidilcolina palmitoilo).

Description

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articular neuropática (articulación de Charcot), hemartrósico, púrpura de Henoch-Schonlein, osteoartropatía hipertrófica, reticulohistiocitoma multicéntrico, escoliosis, hemocromoatosis, meniscocitosis, otras hemoglobinopatía, hiperlipoproteinemia, hipogammaglobulinemia, fiebre mediterránea familiar, enfermedad de Gerhardt, lupus sistémico eritematoso, fiebre recurrente, soriasis, esclerosis múltiple, sepsis (septicemia), choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda, síndrome de disfunción multiorgánica, enfermedad obstructiva pulmonar crónica, artritis reumática, lesión pulmonar aguda, displasia broncopulmonar, y otras similares. Solo el tratamiento de la sepsis y del choque séptico forma parte de la invención.

Adicionalmente, se ha publicado que en pacientes con lesión de isquemia-reperfusión, se produce una acumulación excesiva de neutrófilos. Es decir, casi todos los órganos y tejidos que incluyen el corazón, el cerebro, los riñones, el hígado, etc., sufren daños tisulares debidos a la reperfusión cuando se produce el trastorno de la corriente sanguínea. Se ha sabido que los neutrófilos desempeñan un papel importante en este proceso (Jordan et al., Cardiovasc. Res., 43, 860-78, 1999). Por consiguiente, los ligandos agonistas según la presente invención se pueden aplicar para tratar la lesión de isquemia-reperfusión que incluye la enfermedad cerebral isquémica, la enfermedad cardiaca isquémica, la enfermedad renal isquémica, la enfermedad hepática isquémica, la enfermedad intestinal isquémica, la lesión en órganos debida al trastorno de la corriente sanguínea en trasplantes, etc., así como enfermedades inflamatorias.

Además, la presente invención proporciona un uso terapéutico de los ligandos agonistas específicos para el receptor G2A. Específicamente, la presente invención proporciona un uso de los ligandos agonistas específicos para el receptor G2A según las reivindicaciones para la fabricación de una composición farmacéutica para recuperar la apoptosis de neutrófilos suprimida, inhibir la liberación de IL-8, o aumentar la actividad bactericida de los neutrófilos, en células, tejidos o un organismo según las reivindicaciones. La composición farmacéutica puede comprender además vehículos farmacéuticamente aceptables además de LPC (fórmula I), tal como se reivindica. Los ejemplos de los vehículos farmacéuticamente aceptables son los enumerados anteriormente. La composición farmacéutica según la presente invención se puede administrar oral o parenteralmente, y los ejemplos de administración oral o parenteral son los mencionados anteriormente. Asimismo, la presente invención proporciona un uso de los ligandos agonistas específicos para el receptor G2A según las reivindicaciones para la fabricación de un agente para tratar una enfermedad o trastorno asociado a la supresión de la apoptosis de neutrófilos y a la hiperactividad de neutrófilos y/o a la excesiva liberación de IL-8 según las reivindicaciones. Los ejemplos de enfermedades o trastornos a los cuales se pueden aplicar los ligandos agonistas según la presente invención son los enumerados anteriormente.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra los efectos inhibidores de 1-estearoil LPC contra la supresión de la apoptosis de neutrófilos que es inducida por un mediador de inflamación exógena (LPS; A) o por mediadores de inflamación endógenos (GM-CSF, G-CSF e IFN-γ; B).

Figura 2: muestra los efectos inhibidores de 1-estearoil LPC frente a la liberación excesiva de IL-8 que es inducida por LPS en neutrófilos (A) y monocitos (B).

Figura 3: muestra los resultados RT-PCR obtenidos usando ARN aislado de neutrófilos como plantilla y cebadores específicos para el receptores G2A ó GPR4.

RT (+): RT-PCR se lleva a cabo con transcriptasa inversa.

RT (-): RT-PCR se lleva a cabo sin transcriptasa inversa (Grupo de control).

Figura 4: muestra los efectos inhibidores de SPC contra la supresión de apoptosis de neutrófilos que es inducida por LPS. (No forma parte de la invención).

Figura 5: muestra los efectos de 1-estearoil LPC en un modelo de septicemia inducido por E. coli.

A: Tasa de supervivencia de ratones con el transcurso del tiempo tras la administración de LPC.

B: Número de células de E. coli intraperitoneales en los ratones 24 horas después de que se administre la LPC.

Figura 6: muestra los efectos de 1-estearoil LPC en un modelo de septicemia inducida por CLP.

A: Número de células de E. coli intraperitoneales en los ratones cuando la LPC se administra 2 horas y 14 horas después de la cirugía CLP, respectivamente.

B: Tasas de supervivencia de ratones con el transcurso del tiempo cuando se administra LPC cuatro veces en intervalos de 12 horas, 2 horas después de la cirugía CLP.

C: Tasas de supervivencia de ratones con el transcurso del tiempo cuando se administra la LPC cuatro veces a intervalos de 12 horas, 10 horas tras la cirugía CLP.

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Figura 7: muestra los efectos de 1-miristoil LPC (14:0 LPC) y 1-oleoil LPC (18:1 LPC) en un modelo de septicemia inducido por CLP.

Figura 8: muestra los efectos de SPC en un modelo de septicemia inducido por CLP. (No forma parte de la invención).

Figura 9: muestra los efectos de 1-estearoil LPC frente al síndrome de dificultad respiratoria aguda en un modelo local de lesión pulmonar aguda inducida por LPS (A), un modelo sistémico de lesión pulmonar aguda inducida por LPS (B), y un modelo de lesión pulmonar aguda por sepsis inducida por CLP (C).

Figura 10: muestra los efectos de 1-estearoil LPC frente al síndrome de disfunción multiorgánica en un modelo de sepsis inducida por CLP.

Figura 11: muestra los efectos de 1-estearoil LPC en relación a la actividad bactericida de neutrófilos en un modelo de sepsis inducido por bacterias.

Modo óptimo de realización de la invención

La presente invención se describirá más detalladamente en virtud a los siguientes ejemplos.

Sin embargo, los ejemplos mostrados a continuación se proporcionan únicamente para ilustrar la invención. En los siguientes ejemplos, los porcentajes relativo a mezclas sólido/sólido, líquido/líquido y líquido/sólido están expresados como peso/peso, volumen/volumen y peso/volumen, respectivamente, y a menos que se indique lo contrario todas las reacciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente.

EJEMPLO 1

Efectos inhibidores de LPC frente a la anti-apoptosis de neutrófilos por mediadores de inflamación

<1-1> Aislamiento de neutrófilos

Los neutrófilos fueron aislados de adultos sanos usando un gradiente Percoll discontinuo según el método de Szucs,

S. et al. (J. Immunol. Methods, 167: 245-251, 1994). En primer lugar, se separaron los plasmas de sangre entera heparinizada, y se agotaron las células rojas por sedimentación con dextrano. Después de eso, los leucocitos fueron distribuidos sobre un gradiente Percoll con densidades de 1,077 y 1,094 (Pharmacia, Suecia). Se recuperaron capas de neutrófilos separadas de la interfaz del gradiente Percoll, y a continuación se lavaron con HBSS (disolución salina equilibrada de Hank, Sigma Chemical Co., EE.UU.). La partícula restante fue resuspendida en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS (suero bovino fetal) y gentamicina 2 mM. Como resultado del examen del citospin teñido con Wright-Giemsa (Sigma Chemical Co., EE.UU.), se observó que la disolución de resuspensión contenía un 95% o más de neutrófilos. Asimismo, como resultado del examen usando el método de exclusión de colorante de azul de tripano, se observaron el 98% o más de neutrófilos.

<1-2> Efectos inhibidores de la LPC frente a la anti-apoptosis de neutrófilos por mediador de la inflamación exógeno

Se cultivaron 1 x 105 células de neutrófilos aisladas en el anterior Ejemplo <1-1> en una placa de 96 pocillos a la cual se añadió medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FBS. Después de eso, se trataron con 1-estearoil lisofosfatidilcolina (Sigma Chemical Co., EE.UU.) en concentraciones de 15 μM y 30 μM, respectivamente. Tras 1 hora, fueron tratadas con 1 μg/mL de LPS (Sigma Chemical Co.). Tras 24 horas, se eliminó el medio de las placas y las células restantes fueron lavadas dos veces con tampón PBS (salino tamponado con fosfato) a 4ºC. Las células adheridas al fondo de la placa fueron rascadas y llevadas a un tubo eppendorf de 1,5 mL. A continuación fueron centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos, y se retiró el sobrenadante. Nuevamente, se añadió 0,1 mL de tampón PBS a 4ºC a la partícula, que entonces se mezcló bien pipeteando. A 25 μL de la suspensión celular se añadieron 2μL de disolución colorante AcOr/EtBr en la cual se mezclaron 100 μg/mL de naranja de acridina (AcOr) y 100 μg/mL de bromuro de etidio (EtBr). A continuación, se calculó el porcentaje de células apoptóticas/células totales observando las células de neutrófilos bajo un microscopio de fluorescencia. Como resultado, tal como se muestra en la Figura 1A, el porcentaje de apoptosis de neutrófilos que había bajado por LPS se vio aumentado por 1-estearoil LPC de un modo dependiente de la concentración. Por consiguiente, se puede observar que la LPC bloquea de manera efectiva el efecto del mediador de la inflamación exógeno que inhibe la apoptosis de neutrófilos.

<1-3> Efectos inhibidores de LPC frentes a la anti-apoptosis de neutrófilos por mediadores de la inflamación endógenos

Los experimentos fueron llevados a cabo según los mismos métodos usados en el Ejemplo <1-2>, excepto en que los neutrófilos aislados en el Ejemplo <1-1> fueron tratados con 100 ng/mL de GM-CSF (Sigma Chemical Co.), 100 ng/mL de G-CSF (Sigma Chemical Co.) y 100 ng/mL de IFN-γ (Sigma Chemical Co.), respectivamente, en lugar de LPS. Como resultado, como se muestra en la Figura 1B, el porcentaje de apoptosis de neutrófilos que había disminuido por acción de mediadores de la inflamación endógenos se vio incrementado por 1-estearoil LPC de un modo dependiente de la concentración. Por consiguiente, se puede observar que la LPC bloquea de manera efectiva

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los efectos inhibidores de la apoptosis de neutrófilos por acción de mediadores de la inflamación endógenos, así como por acción de mediadores de la inflamación exógenos.

EJEMPLO 2

Efectos inhibidores de LPC frente a la liberación de IL-8, que es una citosina inductora de inflamación

Se investigaron los efectos de la LPC con respecto a la liberación de IL-8, una citosina inductora de inflamación importante en los neutrófilos y los monocitos sanguíneos, que se considera seriamente como el mecanismo de inicio de las enfermedades inflamatorias.

<2-1> Aislamiento de neutrófilos

Los neutrófilos fueron aislados según el método de Szucs, S. et al. (J. Immunol. Methods, 167: 245-251, 1994) tal como se ha descrito antes en el Ejemplo <1-1>.

<2-2> Aislamiento de monocitos

Se tomaron muestras de sangre periférica de una persona sana, se colocaron en un tubo heparinizado y después se mezcló bien con 1x de tampón PBS. A continuación se distribuyó por capas en una disolución Ficoll-Hypaque (densidad 1,077, Sigma Chemical Co., EE.UU.) y después se centrifugó a 2500 rpm a 4ºC durante 25 minutos. Una vez que la capa de monocitos entre la capa de Ficoll y la capa de plasma había sido recuperada con cuidado, se añadió a la misma 1x de tampón PBS y se mezcló bien. Entonces se centrifugó nuevamente a 2500 rpm a 4ºC durante 25 minutos. Dicho procedimiento de centrifugación se repitió dos veces hasta que se hubieron agotado las células sanguíneas rojas. Después de eso, la partícula se cultivó en FBS a 37ºC durante 15 minutos y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos. A continuación se añadió 1x de tampón PBS nuevamente a la partícula. Las células aisladas fueron distribuidas en capas en una disolución Percoll (densidad 1,066) y después se centrifugaron a 2500 rpm a 4ºC durante 30 minutos. Tras haber recuperado solo la capa de monocitos de las capas aisladas, se añadió a la misma 1x de tampón PBS. Se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos. Tras repetir la centrifugación dos o tres veces, los monocitos aislados fueron inoculados en medio RPMI1640 que contenía un 10% de FBS y se cultivó en un incubador con un 5% de CO2 a 37ºC.

<2-3> Medida de IL-8

Los neutrófilos y los monocitos aislados en los Ejemplos <2-1> y <2-2> anteriores fueron cultivados en una placa de 96 pocillos a la cual se añadió medio RPMI1640 que contenía un 10% de FBS, a una concentración de 1x105 células/pocillo/0,2 mL, respectivamente. Fueron tratados con 1-estearoil LPC en concentraciones de 15 μM y 30 μM, respectivamente. Tras 1 hora, fueron tratados con 1 μg/mL de LPS. Tras 3 horas, los sobrenadantes fueron recolectados y llevados a un tubo eppendorf. A continuación, se midió el nivel de IL-8 usando un kit ELISA (Biosource, EE.UU.). Como resultado, tal como se muestra en la Figura 2, el nivel de liberación de IL-8 que había aumentado por LPS en los neutrófilos (A; PMNs humanas) y en los monocitos (B; PBMC humana) se vio inhibido por la LPC de un modo dependiente de la concentración.

EJEMPLO 3

Búsqueda de receptores específicos de LPC que existan en los neutrófilos

A día de hoy, se sabe que el G2A y el GPR4 son receptores a los cuales se une específicamente la LPC (Zhu, K. et al., J. Biol. Chem., 276(44): 41325-41335, 2001; Kabarowski, J. H. et al., Science, 293(5530): 702-705, 2001). Especialmente, el hecho de que el G2A existe en los monocitos como receptor de LPC fue publicado por Rikitake et al. (Rikitake et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22: 2049-53, 2002). Sin embargo, para los neutrófilos no se conoce nada. Por consiguiente, los presentes inventores han investigado si existen receptores específicos de LPC en los neutrófilos.

En primer lugar, se aislaron los neutrófilos de muestras de sangre según los mismos métodos descritos anteriormente en el Ejemplo <1-1>. A continuación se aisló el ARN de los neutrófilos aislados usando el reactivo TRIZOL (GibcoBRL, EE.UU.). Se llevó a cabo una RT-PCR usando cebadores específicos de G2A (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y cebadores específicos de GPR4 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), respectivamente. Los tamaños de G2A y GRP4 a amplificar por cada cebador fueron de 409 pb y 247 pb, respectivamente. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 40 ciclos de 94ºC/2 min, 60ºC/1,5 min y 72ºC/2 min. Como control, se llevó a cabo una RT-PCR sin transcriptasa inversa (RT). Como resultado, tal como se muestra en la Figura 3, el nivel de expresión de G2A se vio marcadamente incrementado en comparación con el grupo de control. Por otro lado, el nivel de expresión de cada receptor observado en el grupo de control se considera debido al hecho de que el ADN no fue eliminado por completo durante el proceso de aislamiento de ARN. A partir de los resultados de estos experimentos, se considera que la LPC tiene una función inhibidora de anti-apoptosis e inhibe la liberación de IL-8 actuando sobre el receptor G2A.

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<EJEMPLO 4> (referencia)

Efectos inhibidores de SPC frente a anti-apoptosis de neutrófilos por mediadores de la inflamación

Con el objetivo de examinar si la SPC, conocida por ser otro ligando agonista de receptor G2A, tiene las mismas funciones que la LPC, se llevaron a cabo experimentos según los mismos métodos usados anteriormente en el Ejemplo <1-2>, excepto que en lugar de LPC se usó SPC (Sigma-Aldrich Co.). Los resultados se muestran en la Figura 4. Tal como se muestra en la Figura 4, el porcentaje de apoptosis de neutrófilos que había disminuido por LPS se vio incrementado por la SPC de un modo dependiente de la concentración. Por consiguiente, se puede observar que la SPC, otro ligando específico para el receptor G2A, tiene las mismas funciones que la LPC.

<Ejemplo de referencia 1>

Preparación del modelo de septicemia

<1-1> Modelo de sepsis inducido directamente: modelo de sepsis inducido por bacterias y modelo de sepsis inducido por LPS

a) Modelo de sepsis inducido por bacterias

Se inyectó a ratones ICR (25-30 g de peso corporal; MJ Ltd.) intraperitonealmente con 108 células vivas/mL de E. coli (DH5a) que fueron suspendidas en 0,5 mL de PBS (salino tamponado con fosfato) para provocar peritonitis, induciendo con ello la sepsis.

b) Modelo de sepsis inducida por LPS

Se inyectó a ratones ICR (25-30 g de peso corporal; MJ Ltd.) intraperitonealmente con LPS (inducida a partir de E. coli 055:B5) en una cantidad de 1 mg/kg, induciendo con ello la sepsis.

<1-2> Modelo de sepsis inducida indirectamente: modelo de sepsis inducida por CLP

Tras anestesiar a ratones ICR (25-30 g de peso corporal; MJ Ltd.) con pentobarbital, se diseccionaron las zonas abdominales del costado derecho con una longitud de 1 cm para exponer su ciego, y se ligaron los sitios por debajo de la válvula ileocecal. Después, tras haber creado 4~6 perforaciones sobre el ciego con una aguja del 21, se suturó el abdomen nuevamente para provocar peritonitis, induciendo de este modo la sepsis.

<Ejemplo de referencia 2>

Determinación de la actividad de mieloperoxidasa en tejidos pulmonares

Se determinó la actividad de mieloperoxidasa (MPO), un indicador de neutrófilos, en tejidos pulmonares según los métodos de Goldblum et al (J. Appl. Physiol. 59: 1978, 1985) y Parey et al (J. Immunol. 160: 1007, 1998). Primeramente, se sacrificaron ratones y se obtuvieron los mismos tejidos pulmonares. Los tejidos habían sido homogeneizados en tampón de fosfato potásico, y se centrifugaron para obtener partículas. Dichas partículas fueron sometidas a ultrasonidos en tampón de fosfato potásico que contenía un 0,5% de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), y se incubaron a 60ºC durante 120 minutos. Tras centrifugación se obtuvieron los sobrenadantes. Se mezclaron 0,02 mL de sobrenadantes con una disolución de tampón de fosfato potásico (0,18 mL) que contenía dihidrocloruro de o-dianisidina de 0,167 mg/mL y un 0,0005% de peróxido de hidrógeno. A continuación se determinó la absorbancia de la mezcla a una longitud de onda de 460 nm.

<Ejemplo de referencia 3>

Determinación del número de E. coli intraperitoneales

Después de que la cavidad peritoneal hubiera sido expuesta, se lavó con salino esterilizado (2 mL). La disolución resultante se diluyó con HBSS (Sigma Chemical Co., EE.UU.) en una proporción de 1/1000, y a continuación se dispersaron 10 μL de cada disolución diluida sobre placas de agar Trypticase Soy (BBL, Becton Dickinson Co., EE.UU.). Tras incubación durante una noche a 37ºC, se midieron las unidades de formación de colonias (CFU).

<EJEMPLO 5>

Efectos terapéuticos de 1-estearoil LPC en el modelo de sepsis inducida por bacterias

14 ratones ICR del modelo de septicemia inducida por bacterias según el Ejemplo de referencia <1-1> a) fueron divididos en dos grupos de 7 ratones. Se administró a 7 ratones 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución al 1% de BSA (albúmina de suero bovino) que no contenía ácidos grasos en una cantidad de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea, 2 y 14 horas después de que se inyectara intraperitonealmente E. coli, respectivamente (grupo experimental). A los restantes 7 ratones se les administró una disolución al 1% de BSA que no contenía ácidos grasos en la misma cantidad indicada anteriormente, en lugar de LPC, del mismo modo (grupo

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de control). En consecuencia, se examinaron las tasas de supervivencia de los ratones de los grupos experimental y de control a lo largo del tiempo. Asimismo, se midió el número de células de E. coli intraperitoneales 24 horas después de la inyección intraperitoneal según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 3. Se calcularon los valores medios y se representan en la Figura 5. Tal como se muestra en las Figuras 5A y 5B, en los ratones del grupo experimental en el que se había administrado LPC, la tasa de mortalidad debida a septicemia fue suprimida de manera significativa (p < 0,05) y el número de células de E. coli intraperitoneales también disminuyó pronunciadamente (p < 0,01).

<EJEMPLO 6>

Efectos terapéuticos de 1-estearoil LPC en el modelo de sepsis inducida por CLP

<6-1> En el caso en que se administra LPC 2 y 10 horas después de cirugía CLP, respectivamente

14 ratones ICR del modelo de septicemia inducida por CLP según el Ejemplo de referencia <1-2> fueron divididos en dos grupos de 7 ratones. Se administró a 7 ratones 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución al 1% de BSA (albúmina de suero bovino) que no contenía ácidos grasos en una cantidad de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea, 2 y 14 horas después de la cirugía CLP, respectivamente (grupo experimental). A los restantes 7 ratones se les administró una disolución al 1% de BSA que no contenía ácidos grasos en la misma cantidad indicada anteriormente del mismo modo (grupo de control). Se midió el número de células de E. coli intraperitoneales en los ratones ICR de los grupos experimental y de control según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 3, 24 horas después de la cirugía CLP. Se calcularon los valores medios y se representan en la Figura 6A. Tal como se muestra en la Figura 6A, se puede observar que en los ratones del grupo experimental, a los que se había administrado LPC, el número de células de E. coli intraperitoneales disminuyó pronunciadamente (p < 0,01).

<6-2> En el caso en que se administra LPC cuatro veces a intervalos de 12 horas, 2 horas después de cirugía CLP

40 ratones ICR del modelo de septicemia inducida por CLP según el Ejemplo de referencia <1-2> fueron divididos en cuatro grupos de 10 ratones. A cada grupo de 10 ratones ICR se les administró intraperitonealmente 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución de BSA al 1% que no contenía ácidos grasos en cantidades de 5, 10 y 20 mg/kg, respectivamente, cuatro veces a intervalos de 12 horas, 2 horas después de la cirugía CLP (grupo experimental 1, 2 y 3). A los restantes 10 ratones ICR se les administró solo disolución de BSA al 1% que no contenía ácidos grasos (grupo de control). A continuación, se investigaron las tasas de supervivencia con el tiempo de los ratones de los grupos experimentales y de control. Los resultados se muestran en la Figura 6B, la tasa de supervivencia de los ratones de los grupos experimentales en los que se administró LPC fue muy superior a la de los ratones del grupo de control.

<6-3> En el caso en que se administra LPC cuatro veces a intervalos de 12 horas, 10 horas después de cirugía CLP

A fin de investigar si la LPC tiene o no un efecto terapéutico incluso en los casos en los que la septicemia ya se había desarrollado, se dividieron en dos grupos 20 ratones ICR del modelo de sepsis inducida por CLP según el Ejemplo de referencia <1-2>. A 10 ratones del grupo experimental se les administró intraperitonealmente 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co. EE.UU.) disuelta en una disolución de BSA al 1% que no contenía ácidos grasos en una cantidad de 10 mg/kg, cuatro veces a intervalos de 12 horas, 10 horas después de la cirugía CLP. A los restantes 10 ratones del grupo de control se les administró solo la disolución de BSA al 1% que no contenía ácidos grasos. Después de eso, se investigaron las tasas de supervivencia con el tiempo de los ratones ICR de los grupos experimental y de control. Los resultados se muestran en la Figura 6C. Tal como se muestra en la Figura 6C, incluso cuando se la septicemia se había desarrollado más, la LPC demostró un excelente efecto terapéutico.

<EJEMPLO 7>

Efectos terapéuticos de 1-oleoil LPC y 1-miristoil LPC en el modelo de sepsis inducida por CLP

Con el objetivo de investigar si las LPCs con otros sustituyentes (R1) diferentes al 1-estearoilo tienen un efecto sobre la septicemia, se administró intraperitonealmente LPCs con 1-oleoilo y 1-miristoilo en una cantidad de 10 mg/kg según los mismos métodos usados en el Ejemplo <6-2>. Como resultado, tal como se muestra en la Figura 7, tanto la 1-oleoil LPC como la 1-miristoil LPC demostraron un excelente efector terapéutico contra la sepsis.

<Ejemplo comparativo>

Actividad antibacteriana in vitro de LPC

Se añadió 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) a medio LB en concentraciones de 12, 60 y 300 mM, respectivamente, que fueron vertidas en placas Petri y endurecidas (grupo experimental 1, 2 y 3). Se usaron cuatro placas Petri por grupo. Para el grupo de control, solo se vertió medio LB en cuatro placas Petri de 60 mm y se endureció. Se lavó la cavidad peritoneal de los ratones según el Ejemplo <6-1> con salino esterilizado. La disolución resultante se diluyó con HBSS en una proporción de 1/100, y a continuación se extendieron 10 μL de la disolución

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diluida sobre el medio para cada grupo. Posteriormente, después de haber sido incubados, en incubadora de bacterias mantenida a 37ºC durante 12 horas, se midieron visualmente las unidades formadoras de colonias (CFU).

[Tabla 1] Actividad antibacteriana in vitro de LPC

Grupo de control

Grupo experim. 1 Grupo experim. 2 Grupo experim. 3

Conc. de LPC

0 μM 12 μM 60 μM 300 μM

CFU

498 ± 189 661 ± 285 639 ± 304 611 ± 281

Tal como se muestra en la Tabla 1 anterior, no se observaron efectos antibacterianos in vitro directos de la LPC contra E. coli.

<EJEMPLO 8> (Referencia)

Efectos de SPC en el modelo de sepsis inducida por CLP

Los ratones del modelo de sepsis inducida por CLP fueron inyectados subcutáneamente con SPC, en lugar de 1estearoil LPC, en dosis de 3 mg/kg y 30 mg/kg cuatro veces a intervalos de 12 horas, 2 horas después de la cirugía CLP, respectivamente. Se investigaron las tasas de supervivencia de los ratones. Como resultado, tal como se muestra en la Figura 8, se pudo observar que como la LPC, la SPC inhibe de forma efectiva la tasa de mortalidad debida a sepsis de CLP con una dosis de 30 mg/kg.

<EJEMPLO 9>

Efectos terapéuticos de LPC contra el Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda

<9-1> Modelo de Lesión Pulmonar Aguda (LPA) inducida por LPS

Se administró intratraquealmente a los ratones LPS para provocar una lesión pulmonar aguda directa, induciendo de este modo el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Se dividieron 35 ratones ICR (25-30 g de peso corporal, MJ Ltd.) en cinco grupos de 7 ratones (grupo Sham, grupos experimentales 1, 2 y 3, y un grupo de control). Todos los ratones fueron anestesiados con pentobarbital, se diseccionó su piel con una longitud de 1 cm para exponer sus bronquios. A los ratones del grupo Sham se les administró intratraquealmente una disolución de PBS (50 μL) y después fueron suturados, mientras que a los ratones ICR de los grupos experimentales y de control se les administró directamente intratraquealmente LPS (6 μg/50 μL de tampón PBS) y después fueron suturados. Posteriormente, a los ratones ICR de los grupos experimentales 1, 2 y 3 se les administró subcutáneamente 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en cantidades de 5, 10 y 20 mg/kg, respectivamente, 2 y 14 horas después de la administración de LPS. Por otro lado, a los ratones ICR del grupo de control se les administró disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en la misma cantidad, en lugar de LPC, y del mismo modo. 24 horas después de la administración de LPS, se determinó la actividad de MPO, un indicador de neutrófilos, en los tejidos pulmonares de los ratones ICR de cada grupo, tal como se describe en el Ejemplo de referencia 2, y los valores medios se presentan en la Figura 9A. Tal como se muestra en la Figura 9A, cuando el LPS se administra intratraquealmente, la actividad de MPO se ve incrementada significativamente (p < 0,001). En los ratones ICR de los grupos experimentales, la actividad de MPO fue suprimida de un modo dependiente de la concentración, en comparación con los ratones del grupo de control. Cuando se administra la LPC a ratones ICR en una cantidad de 20 mg/kg (grupo experimental 3), se obtuvieron los efectos más excelentes (p < 0,01).

<9-2> Modelo de lesión pulmonar aguda inducida por LPC sistémica

La lesión pulmonar agua indirecta fue provocada mediante administración sistémica de LPS, mediante lo cual se indujo el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Se dividieron 35 ratones ICR del modelo de septicemia inducida por LPS según el Ejemplo de referencia <1-1> b) en cinco grupos de 7 ratones (grupo Sham, un grupo experimental 1, un grupo experimental 2, un grupo experimental 3 y un grupo de control). A los ratones del grupo Sham se les administró intraperitonealmente tampón PBS (0,5 mL/100 g de peso), en lugar de LPS. A los ratones de los grupos experimentales 1, 2 y 3 se les administró subcutáneamente 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en cantidades de 5, 10 y 20 mg/kg, respectivamente, 2 y 14 horas después de la administración de LPS. Por otro lado, a los ratones del grupo de control se les administró una disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en la misma cantidad, en lugar de LPC, y del mismo modo. A las 24 horas de la administración del LPS, se determinó la actividad de MPO, un indicador de neutrófilos, en los tejidos pulmonares de

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los ratones de cada grupo, tal como se describe en el Ejemplo de referencia 2. En la Figura 9B se muestran los valores medios. Tal como se muestra en la Figura 9B, cuando se administra el LPS intraperitonealmente, la actividad de MPO se ve incrementada significativamente (p < 0,01). En los ratones de los grupos experimentales, la actividad de MPO fue suprimida de un modo dependiente de la concentración, en comparación con los ratones del grupo de control. Cuando la LPC se administra a los ratones ICR en una cantidad de 20 mg/kg (grupo experimental 3), se obtienen los resultados más excelentes (p < 0,01).

<9-3> Modelo de Lesión Pulmonar Aguda por sepsis inducida por CLP

Se usó el modelo de sepsis inducida por CLP para provocar la lesión pulmonar aguda indirecta, induciendo de este modo el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Se dividieron 20 ratones ICR del modelo de sepsis inducida por CLP según el Ejemplo de referencia <1-2> en dos grupos. A 10 ratones del grupo experimental se les administró 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en una cantidad de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea 2 y 14 horas después de la cirugía CLP, respectivamente. A los restantes 10 ratones del grupo de control se les administró únicamente la disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos. Simultáneamente, se anestesiaron 10 ratones ICR (de 25-30 g de peso corporal, ML Ltd.) con pentobarbital, a los cuales se les diseccionó la zona abdominal con una longitud de 1 cm para exponer su ciego, y a continuación volvieron a ser suturados (grupo Sham). Justo después de la cirugía CLP y 4, 8 y 16 horas después, se determinó la actividad de MPO, un indicador de neutrófilos, en los tejidos pulmonares de los ratones de cada grupo, tal como se describe en el Ejemplo de referencia 2 y se muestra en la Figura 9C. Tal como se muestra en la Figura 9C, la actividad de MPO aumentó marcadamente desde 4 horas después de la cirugía CLP y se mantuvo hasta las 16 horas. En los ratones ICR del grupo experimental, la actividad de MPO, que había aumentado por la cirugía CLP, disminuyó marcadamente en comparación con el grupo de control.

<EJEMPLO 10>

Efectos terapéuticos de LPC frente al Síndrome de Disfunción Multiorgánica

La septicemia provoca el síndrome de disfunción multiorgánica como complicación derivada y habitualmente se ven afectados el pulmón, el hígado, los riñones, etc. Se investigó el efecto de la LPC frente a la lesión hepática como uno de los síndromes de disfunción multiorgánica. Se dividieron 20 ratones ICR del modelo de septicemia inducido por CLP según el Ejemplo de referencia <1-2> en dos grupos. A 10 ratones del grupo experimental se les administró 1-estearoil LPC (Sigma Chemical Co., EE.UU.) disuelto en una disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos, en una cantidad de 10 mg/kg vía inyección subcutánea 2 y 14 horas después de la cirugía CLP, respectivamente. A los restantes 10 ratones del grupo de control se les administró solo la disolución de BSA al 1%, que no contenía ácidos grasos. Simultáneamente, se anestesiaron 10 ratones ICR (de 25-30 g de peso corporal; MJ Ltd.) con pentobarbital, a los que se diseccionó la zona abdominal con una longitud de 1 cm para exponer su ciego, y después fueron suturados de nuevo (grupo Sham). 16 horas después de la cirugía CLP, se tomaron muestras de sangre de ratones de cada grupo. Se determinó el nivel de alanina aminotransferasa (ALT), un indicador de hepatotoxicidad, según el método de Reitman-Frankel (Witter & Grubbs, Clin. Chim. Acta, 13: 524-7, 1966). Como resultado, tal como se muestra en la Figura 10, en los ratones ICR del grupo experimental, el nivel de ALT, que se había incrementado con la cirugía CLP, se vio claramente suprimido en comparación con el grupo de control.

<EJEMPLO 11>

Efectos de LPC sobre la actividad bactericida de neutrófilos en el modelo de sepsis inducida por bacterias

A fin de investigar el mecanismo de cómo disminuye pronunciadamente el número de células de E. coli intraperitoneales en los ratones debido a la administración de LPC del anterior Ejemplo 5, los inventores han llevado a cabo los siguientes experimentos: se tomaron muestras de sangre de ratones del modelo de septicemia inducido por bacterias preparado en el Ejemplo de referencia <1-1> a), y se aislaron neutrófilos a partir de las mismas. Los neutrófilos aislados fueron adheridos a un cubreobjetos recubierto con poli-L-Lisina (0,01%) en una incubadora de células mantenida a 37ºC, con una concentración celular de 106 células/mL durante 1 hora. Después se añadió E. coli en una concentración de 106 células/mL y se cultivó durante 1 hora. Las células de E. coli no ingeridas por los neutrófilos fueron retirados mediante lavado del portaobjetos con tampón PBS. A continuación se trató el cubreobjetos con 1-estearoil LPC 30 μM, y se continuó cultivando otra hora. En este punto, el cubreobjetos del grupo de control fue tratado con tampón PBS, en lugar de LPC. Posteriormente, tras cambiar por un nuevo medio RPMI1640, se continuó con el cultivo durante otra hora para proporcionar tiempo de muerte. A continuación los neutrófilos fueron destruidos usando Triton X-100 (0,05%) y se recuperaron las células de E. coli. Las células de E. coli recuperadas fueron distribuidas sobre una placa y se cultivaron en incubadora mantenida a 37ºC. Se contabilizaron las células de E. coli que habían crecido sobre el medio y se realizó un análisis estadístico. Como resultado, tal como se muestra en la Figura 11, en el grupo experimental que fue tratado con LPC, disminuyó significativamente el número de E. coli vivas. Esto indica que la LPC aumenta la capacidad bactericida de los neutrófilos mediante la estimulación directa de los neutrófilos. En consecuencia, se puede observar que la LPC bloquea la apoptosis de

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