JP4320262B2 - G2a受容体に特異的な作用剤リガンドの新規な治療用途 - Google Patents
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Description
本発明によるG2A受容体に特異的な作用剤リガンドはLPC(リゾホスファチジルコリン)、SPC(スフィンゴシルホスホリルコリン)及びこれらの誘導体を含む。
ただし、下記の実施例は本発明を例示するもので、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。また、下記の実施例において、固体と固体混合物、液体と液体、及び液体と固体に対する百分率はそれぞれ重量/重量、体積/体積、及び重量/体積に基づいたもので、特別な指示がない限り、全ての反応は室温で行った。
Szucs, Sらの方法(J. Immunol. Methods, 167: 245-251, 1994)により、パーコルを用いる不連続密度勾配法(discontinuous percoll gradient)を用いて、健康な成人から好中球を分離した。まず、ヘパリン処理された全血から血漿を分離した後、赤血球をデキストラン沈殿(dextran sedimentation)で除去した。その後、白血球を比重1.077及び1.094のパーコル勾配(percoll gradient, Phharmacia, Sweden)で重畳させた。好中球層をパーコル勾配境界面から回収した後、HBSS(Hank’s balanced salt solution, Sigma Chemical Co., USA)で洗浄した。残っているペレットを10%FBS(牛胎児血清)と2mMゲンタマイシンを含有するRPMI 1640培地に再懸濁させた。ライト−ギームザ(Wright-Giemsa, Sigma Chemical Co., USA)により染色されたシトスピン(cytospin)を試験した結果、再懸濁溶液に95%以上の好中球が含まれていることを確認した。また、トリパンブルーを用いる染色法(trypan blue dye exclusion method)で試験した結果、98%以上の好中球が観察された。
前記実施例<1−1>で分離された好中球細胞1×105個を10%FBSを含有するRPMI1640倍地を添加した96−ウェルプレートで培養した。その後、1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を15μM及び30μMの濃度でそれぞれ処理した。1時間後、前記好中球細胞を1μg/mlLPS(Sigma Chemical Co., USA)で処理した。24時間後、培地をプレートから除去し、残余の細胞を4℃のPBS(phosphate-buffered saline)緩衝液で2回洗浄した。プレートの底に付いている細胞を全て掻き出し、1.5mlエペンドルフチューブ(eppendorf tube)に入れた。その後、2500rpmで5分間遠心分離した後、上層液を除去した。さらに、4℃のPBS緩衝液0.1mlを添加し、ピペットでよく混合した。前記細胞懸濁液25μlに100μg/mlのアクリジンオレンジ(acridine orange、AcOr)と100μg/mlエチジウムブロマイド(ethidium bromide、EtBr)が混合されたAcOr/EtBr染色液2μlを添加した。その後、好中球細胞を蛍光顕微鏡で観察して、アポトーシス細胞/総細胞の百分率を計算した。その結果、図1のAに示すように、LPSにより減少した好中球のアポトーシスのパーセンテージが1−ステアロイルLPCにより濃度依存的に増加することが確認できた。これによって、LPCが好中球のアポトーシスを阻害する外因性炎症媒介因子の作用を効果的に遮断することが分かった。
前記実施例<1−1>で分離された好中球を、LPSの代わりに、100ng/mlのGM−CSF(Sigma Chemical Co.)、100ng/mlのG−CSF(Sigma Chemical Co.)及び100ng/mlのIFN−γ(Sigma Chemical Co.)で処理したことを除き、前記実施例<1−2>と同様な方法で実験を行った。その結果、図1のBに示すように、内因性炎症媒介因子により減少した好中球アポトーシスのパーセンテージが1−ステアロイルLPCにより濃度依存的に増加することが確認できた。これによって、LPCが外因性炎症媒介因子だけでなく、内因性炎症媒介因子による好中球アポトーシスの阻害作用を効果的に遮断することが分かる。
炎症性疾患の発生機序として重要視されている好中球及び血液単球での重要な炎症誘発サイトカインであるIL−8の放出に対するLPSの作用を試験した。
前記実施例<1−1>に記載したように、Szucs, S. らの方法により好中球を分離した。
健康な人から末梢血を採取してヘパリンの入っている容器に入れ、1×PBS緩衝液を添加してよく混合した。その後、フィコール−ヒパーク溶液(Ficoll-Hypaque solution、比重1.077, Sigma Chemical Co., USA)に重畳させた後、4℃で25分間2500rpmで遠心分離した。フィコール層とプラズマ層間にある単球を、気をつけて回収した後、1×PBS緩衝液を添加してよく混合し、さらに4℃で25分間2500rpmで遠心分離した。このような遠心分離過程を、赤血球が除去されるまで、2回繰り返した。その後、ペレットを37℃のFBSで15分間培養し、2500rpmで10分間遠心分離した。さらに、ペレットに1×PBS緩衝液を添加した。分離した細胞をパーコル溶液(比重1.066)に重畳させた後、4℃で30分間2500rpmで遠心分離した。分離された層から単球層のみを回収した後、1×PBS緩衝液を添加し、2500rpmで15分間遠心分離を行った。遠心分離を2〜3回繰り返した後、分離された単球を10%FBSを含有するRPMI1640倍地に接種し、37℃、5%CO2インキュベータで培養した。
前記実施例<2−1>及び<2−2>で分離された好中球と単球をそれぞれ1×105/well/0.2mlの濃度で10%FBSを含有するRPMI1640倍地を添加した96−ウェルプレートで培養した。その後、1−ステアロイルLPCを15μM及び30μMでそれぞれ処理した後、1時間後に1μg/mlLPSで処理した。3時間後、上層液を収集してエペンドルフチューブに入れた。その後、ELISAキット(Biosource, USA)を用いてIL−8の濃度を測定した。その結果、図2に示すように、好中球(A;人PMNS)と単球(B;人PBMC)において、LPSにより増加したIL−8の放出濃度がLPCにより濃度依存的に抑制されることが確認できた。
現在まで、LPCが特異的に結合する受容体としては、G2AとGPR4が知られている(Zhu, K. et al., J. Biol. Chem., 276(44): 41325-41335, 2001; Kabarowski, J. H. et al., Science, 293(5530): 702-705, 2001)。特に、単球にLPCの受容体としてG2Aが存在するという事実が最近リキタケら(Rikitake et al., Arterioscler Thromb Vasc Bio.l, 22: 2049-53, 2002)により報告された。しかし、好中球においては何も知られていない。したがって、本発明者らは好中球にLPC−特異的受容体が存在するか否かについて検討した。
G2A受容体の他のリガンドとして知られている、SPCもLPCと同一の作用をするかを調べるため、LPCの代わりにSPC(Sigma-Aldrich Co.)を使用したことを除き、前記実施例<1−2>と同様な方法で実験を行った。その結果を図4に示す。図4に示すように、LPSにより減少した好中球のアポトーシスのパーセンテージがSPCの濃度に依存して増加した。これによって、G2A受容体に特異的な他の作用剤リガンドであるSPCもLPCと同一の機能を有することが分る。
敗血症モデルの製造
<1−1>直接的に誘発された敗血症モデル:細菌−誘発敗血症モデル及びLPS−誘発敗血症モデル
a)細菌−誘発敗血症モデル
ICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)に0.5mlのPBS(リン酸−緩衝食塩液)に懸濁している108個/mlの生きている大腸菌(DH5a)を腹腔内注射して腹膜炎を引き起こして敗血症を誘発させた。
b)LPS−誘発敗血症モデル
ICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)にLPS(E. coli 055:B5より誘発)を1mg/kgの量で腹腔内注射して敗血症を誘発させた。
<1−2>間接的に誘発された敗血症モデル:CLP−誘発敗血症モデル
ICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)をペントバルビタールで麻酔した後、腹部右側部を1cmの長さに切開して盲腸を露出させ、回盲弁の下部を結紮した。その後、盲腸に21ゲージ針で4〜6個の孔を形成した後、腹部を縫合して腹膜炎を引き起こして敗血症を誘発させた。
肺組織のミエロペルキシダーゼ活性の測定
肺組織での好中球の指標であるミエロペルキシダーゼ(MPO)活性はゴールドブラムらの方法(Goldblum et al., J. Appl. physiol. 59: 1978, 1985)及びパレーらの方法(Parey et al., J. Immunol. 160:1007, 1998)に従って測定した。まず、マウスを殺して肺組織を取った。その組織をリン酸カリウム緩衝液中でホモジナイズし、ついで遠心分離を行ってペレットを得た。前記ペレットを0.5%のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(HTAB)を含有するリン酸カリウム緩衝液中で超音波処理し、60℃で120分間培養した。遠心分離して上層液を収得し、0.02ml上層液を、0.167mg/mlのo−ジアニシジン二塩酸と0.0005%の過酸化水素を含有するリン酸カリウム緩衝液(0.18ml)と混合した。その後、460nmの波長で混合物の吸光度を測定した。
腹腔内大腸菌数の測定
マウスの腹腔を露出させた後、滅菌生理食塩水(2ml)で洗浄した。腹腔を洗浄した液をHBSS(Sigma Chemical Co., USA)で1/1000に希釈した後、それぞれの希釈液を10μlずつトリプチカーゼソイ寒天(Trypticase Soy agar, BBL, Becton Dickinson Co., USA)プレートに塗末した。37℃で1夜培養し、コロニー形成単位(colony forming unit;CFU)を測定した。
参考例<1−1>のa)による細菌−誘発敗血症モデルのICRマウス14匹を7匹ずつ2群に分けた。7匹のマウスには、大腸菌を腹腔内注射した後、2時間及び14時間後にそれぞれ1回ずつ脂肪酸を含有していない1%BSA(牛血清アルブミン)溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)をそれぞれ10mg/kgの量で皮下注射で投与した(実験群)。残りの7匹のマウスには、LPCの代わりに、同量の脂肪酸を含有していない1%BSA溶液を同様な方式で投与した(対照群)。その後、時間経過による実験群及び対照群のマウスの生存率を調査した。また、大腸菌の腹腔内注射24時間後の腹腔内大腸菌数を参考例3に記載した方法で測定した。その平均値を算出して図5に示す。図5Aの及び5Bに示すように、LPCが投与された実験群のマウスは敗血症による死亡率が有意に抑制され(P<0.05)、腹腔内大腸菌数も著しく減少した(P<0.01)。
参考例<1−2>によるCLP−誘発敗血症モデルのICRマウス14匹を7匹ずつ2群に分けた。7匹のマウスにはCLP手術2時間及び14時間後にそれぞれ1回ずつ、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を10mg/kgの量で皮下注射で投与し(た実験群。残り7匹のマウスには、同量の脂肪酸を含有していない1%BSA溶液を同様な方式で投与した(対照群)。CLP手術24時間後、参考例3に従って、実験群及び対照群のICRマウスの腹腔内大腸菌数を測定した。その平均値を算出して図6Aに示す。図6Aに示すように、LPCが投与された実験群のマウスの腹腔内大腸菌数が著しく減少した(P<0.01)ことが確認できた。
参考例<1−2>によるCLP−誘発敗血症モデルのICRマウス40匹を10匹ずつ4群に分けた。各10匹のICRマウスに、CLP手術2時間後から12時間の間隔で4回、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)をそれぞれ5、10、20mg/kgの量で腹腔内投与した(実験群−1、−2及び−3)。残り10匹のICRマウスには脂肪酸を含有していない1%BSA溶液のみを投与した(対照群)。その後、時間経過による実験群及び対照群のマウスの生存率を調査した。その結果を図6Bに示す。図6Bに示すように、LPCを投与した実験群のマウスの生存率が対照群のマウスに比べて遥かに高かった。
LPCが敗血症の進行後にも治療効果を表すかを観察するため、参考例<1−2>によるCLP−誘発敗血症モデルのICRマウス20匹を2群に分けた。10匹の実験群マウスには、CLP手術後10時間後、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)の10mg/kgの量を12時間の間隔で4回腹腔投与した。残り10匹の対照群マウスには脂肪酸を含有していない1%BSA溶液のみを投与した。その後、時間経過による実験群及び対照群マウスの生存率を調査した。その結果を図6Cに示す。図6Cに示すように、敗血症がさらに進行された場合にもLPCは優れた治療効果を表した。
1−ステアロイルでない他の置換基(R1)を有するLPCも敗血症に効果があるかを調べるため、1−オレオイル又は1−ミリストイルを有するLPCを10mg/kgの量で実施例<6−2>と同様な方法で腹腔内に投与した。その結果、図7に示すように、1−オレオイルLPC及び1−ミリストイルLPCも敗血症に対する優れた治療効果を示した。
LPCの in vitro 抗菌作用
LB培地に1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を12、60及び300mMの濃度でそれぞれ添加し、60mmペトリ皿に注いで固めた(実験群−1、−2及び−3)。各群当り4つのペトリ皿を使用した。対照群としては、4つの60mmペトリ皿にLB培地のみを注いで固めた。、実施例<6−1>によるマウスの腹膜液を滅菌生理食塩水で洗浄した。この洗浄液をHBSSで1/100に希釈し、次いで10μlの希釈液を各群の培地上に塗末した。その後、37℃細菌培養器で12時間培養した後、コロニー形成単位(CFU)を肉眼で測定した。その結果を下記の表1に示す。
CLP−誘発敗血症モデルマウスに、CLP手術2時間後、12時間の間隔で4回、1−ステアロイルLPCの代わりに、SPCを3mg/kg及び30mg/kgの用量でそれぞれ皮下注射した。マウスの生存率を調査した。その結果、図8に示すように、SPCも、LPCと同様に、CLP敗血症による死亡率を30mg/kgの用量で効果的に抑制することが確認できた。
LPSをマウスの気管支内に投与し直接的な急性肺損傷を引き起こして急性呼吸窮迫症候群を誘発した。
35匹のICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)を7匹ずつ5群(シャム群、実験群−1、−2、−3及び対照群)に分けた。ペントバルビタールで麻酔させた後、皮膚を1cmの長さに切開して気管支を露出させたた。シャム群のマウスには、PBS緩衝液(50μl)を気管支に投与した後、縫合し、実験群及び対照群のICRマウスには、LPS(6μg/50μlPBS緩衝液)を気管支に直接投与した後、縫合した。その後、実験群−1、−2及び−3のマウスに、LPS投与2時間及び14時間後に、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を5、10及び20mg/kgの量でそれぞれ皮下注射で投与した。一方、対照群のマウスには、LPCの代わりに、同量の脂肪酸を含有していない1%BSA溶液を同一方式で投与した。LPS投与24時間後、各群のマウスの肺組織における、好中球の指標である、MPO活性を、参考例2に記載したように、測定し、その平均値を図9Aに示す。図9Aに示すように、LPSを気管支内に投与したとき、MPO活性が有意に増加した(p<0.001)。実験群のマウスは、対照群のマウスに比べ、MPO活性が濃度依存的に抑制された。LPCを20mg/kgの量でICRマウスに投与した場合(実験群−3)が最も優れた効果を表した(p<0.01)。
LPSの全身投与による間接的な急性肺損傷を引き起こして急性呼吸窮迫症候群を誘発した。
参考例<1−1>b)によるLPS−誘発敗血症モデルの35匹のICRマウスを7匹ずつ5群(シャム群、実験群−1、―2、−3及び対照群)に分けた。シャム群のマウスには、LPSの代わりに、PBS緩衝液(0.5ml/100g体重)を腹腔内に投与した。実験群−1、−2及び−3のマウスには、LPS投与2時間及び14時間後、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)をそれぞれ5、10、20mg/kgの量でそれぞれ皮下注射で投与した。一方、対照群のマウスには、LPCの代わりに、同量の脂肪酸を含有していない1%BSA溶液を同様な方式で投与した。LPS投与24時間後、各群のマウスの肺組織における、好中球の指標であるMPO活性を、参考例2に示すように、測定し、その平均値を図9Bに示す。図9Bに示すように、LPSを腹腔内に投与したとき、MPO活性が有意に増加した(p<0.01)。実験群のマウスは、対照群のマウスに比べ、MPO活性が濃度依存的に抑制された。LPCを20mg/kgの用量でICRマウスに投与場合(実験群−3)、最も優れた効果を表した。(p<0.01)。
CLP−誘発敗血症モデルを用い、間接的な急性肺損傷を引き起こして急性呼吸窮迫症候群を誘発した。
参考例<1−2>によるCLP−誘発敗血症モデルのICRマウス20匹を2群に分けた。10匹の実験群マウスにはCLP手術2時間及び14時間後にそれぞれ1回ずつ脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶かした1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を10mg/kgの量で皮下注射で投与した。残り10匹の対照群マウスには、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液のみを投与した。一方、10匹のICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)はペントバルビタールで麻酔させた後、腹部右側部を1cmの長さに切開し、盲腸を露出させた後、縫合した(シャム群)。CLP手術直後、及び4、8、16時間後にに各群のマウスの肺組織における、好中球の指標であるMPO活性を参考例2と同様に測定し、図9Cに示した。図9Cに示すように、MPO活性はCLP手術後4時間から著しく増加し、16時間まで同一水準に維持された。実験群のICRマウスにおいては、CLP手術により増加したMPO活性が対照群に比べて著しく抑制された。
敗血症はその合併症により多臓器不全症候群をもたらし、代表的な器官として肺、肝臓、腎臓などが損傷を被る。多臓器不全症候群の一つとして、肝臓損傷に対するLPCの効果を調査した。参考例<1−2>によるCLP−誘発敗血症モデルのICRマウス20匹を2群に分けた。10匹の実験群マウスには、CLP手術2時間及び14時間後、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液に溶解した1−ステアロイルLPC(Sigma Chemical Co., USA)を10mg/kgの量でそれぞれ皮下注射で投与した。残り10匹の対照群マウスには、脂肪酸を含有していない1%BSA溶液のみを投与した。一方、10匹のICRマウス(体重25〜30g;MJ Ltd.)をペントバルビタールで麻酔させた後、腹部右側部を1cmの長さに切開し、盲腸を露出させた後、縫合した(シャム群)。CLP手術の16時間後に各群のマウスから血液を採取し、肝毒素の指標であるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の濃度をライトマン−フランケル法(Witter & Grubbs, Clin Chim Acta, 13:524-7, 1966)によって測定した。その結果、図10に示すように、実験群ICRマウスにおいては、CLP手術により増加したALT濃度が対照群に比べて著しく抑制された。
本発明者らは、前記実施例5において、LPCの投与によりマウスの腹腔内大腸菌数が著しく減少する機序を調査するため、次のような実験を行った。
前記参考例<1−1>(a)で作成した細菌−誘発敗血症モデルマウスから血液を採取し、好中球を分離した。分離された好中球を、37℃の細胞培養器内で、ポリ−L−リシン(0.01%)でコートされたカバースリップに106個/mlの濃度で1時間付着させた。その後、そこへ大腸菌を106個/mlの濃度で添加し、1時間培養した。好中球に取り込まれなかった大腸菌を、カバースリップをPBS緩衝液で洗浄して、除去した。カバースリップを30μMの1−ステアロイルLPCで処理し、さらに1時間培養した。この際、対照群は、LPCの代わりに、PBS緩衝液で処理した。その後、新鮮ななRPMI−1640倍地に交換し、さらに1時間培養すると、殺菌が始まった。ついで、Triton X−100(0.05%)で好中球を破砕して、大腸菌を回収した。回収された大腸菌をプレートに塗末し37℃の培養器で培養した。その後、培地上の成長した大腸菌の数をカウントして統計処理を行った。その結果、図11に示すように、LPCで処理した実験群は生きている大腸菌の数が有意に減少したことが確認できた。これは、LPCが好中球を直接刺激して好中球の殺菌能力を増加させることを示すものである。これによって、LPCが好中球の抑制されたアポトーシスを阻害し、好中球/単球のIL−8の放出を抑制することができるだけでなく、好中球の殺菌作用を増加させることが分かる。
Claims (3)
- 前記リゾホスファチジルコリンが、1−ステアロイルリゾホスファチジルコリン、1−オレオイルリゾホスファチジルコリン、1−ミリストイルリゾホスファチジルコリン、及び1−パルミトイルリゾホスファチジルコリンからなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、敗血症又は敗血症性ショックである、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
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