KR20060028630A

KR20060028630A - 이노시톨 폴리포스페이트 유도체 및 그의 사용 방법

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Publication number: KR20060028630A
Application number: KR1020057013708A
Authority: KR
Inventors: 알렉시스 트레이노어-카프란; 카르스덴 슐쯔; 슈테판 뢰머; 크리스토프 슈타틀러; 마르코 루돌프
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2006-03-30
Also published as: CN1239894A; EP0954320A1; AU4426697A; JP2002524016A; CA2267348A1; AU721150B2; CN1478783A; EP0954320A4; WO1998011901A1; CN1145489C

Abstract

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제 조성물을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 세포에 접촉시켜 세포에서 염소 이온의 분비를 촉진시키는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 개체에게 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 촉진시키는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 개체에게 투여하여 개체에서 낭포성 섬유증과 관련된 징후 또는 증상을 완화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제 조성물을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제를 세포에 접촉시켜 세포에서 염소 이온의 분비를 저해시키는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제를 개체에게 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 저해시키는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 개체에게 투여하여 개체에서 분비성 설사와 관련된 징후 또는 증상을 완화하는 방법에 관한 것이다.

이노시톨, 폴리포스페이트, 낭포성 섬유증, 세포투과성 길항제, 분비성 설사, 작용제

Description

이노시톨 폴리포스페이트 유도체 및 그의 사용 방법{INOSITOL POLYPHOSPHATE DERIVATIVES AND METHODS OF USING SAME}

도 1은 myo-이노시톨, scyllo-이노시톨 및 대표적인 세포투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체인 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 구조를 도시하는 도면.

도 2는 토끼의 결장에서 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 염소 이온 억제를 보여주는 도면.

도 3은 히스타민 자극된 염소 이온 분비의 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM-중재된 저해의 반전에 기인하여 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 200μM으로 처치된 결장의 상피의 T₈₄ 세포에서 촉진된 염소 이온 분비를 도시하는 도면.

도 4는 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM는 세포 내 칼슘을 증가시키지 않고 탑시가르긴(thapsigargin)에 반응하는 칼슘에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시하는 도면.

*도 5는 D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (도 5A);

1-Bu-2-Bt-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (도 5B);

Bu₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (도 5C);

3-Bt-2-Bu-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (도 5D);

Bu₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (도 5E);

1-Bt-2-Bu-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (도 5F); 및

3-Bu-2-Bt-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (도 5G)

으로 처치된 결정 상피의 T₈₄ 세포에서 촉진된 염소 이온 분비를 도시하는 도면.

도 6은 염소 이온 분비의 EGF-중재된 저해의 반전에 기인하여 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM으로 처치된 결장의 상피의 T₈₄ 세포에서 촉진된 염소 이온 분비를 도시하는 도면.

도 7은 PtdInsP₃의 세포 투과성 유도체 또는 EGF로 처치된 결장의 상피의 T₈₄ 세포에서 저해된 염소 이온 분비를 도시하는 도면으로, Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM는 EGF- 및 PtdInsP₃ 중재된 염소 이온 분비의 저해의 반전에 기인한 염소 이온 분비를 촉진한다.

도 8은 PtdInsP₃/AM의 증가된 농도로 처치된 결장의 상피의 T₈₄세포에서 저해된 염소 이온 분비를 도시하는 도면.

도 9는 세포 투과성 PtdInsP₃ 및 diC₁₆-Bt-PtdInsP₃/AM의 구조를 도시하는 도면.

도 10은 세포 투과성 PtdInsP₃/AM 유도체의 합성의 개략도.

도 11은 1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄//AM의 합성의 개략도.

도 12는 myo-이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 및 2,5,6-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM의 구조를 도시하는 도면. 화합물의 D-배열만이 도시됨.

도 13은 세포 투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 합성의 개략도.

본 발명은 염소 이온의 이동을 조절하는 화합물 및 방법에 관한 것으로, 특히 이노시톨 폴리포스페이트(inositol polyphosphate)에 대한 작용제 및 길항제에 관한 것이다.

모든 생물체는 세포로 이루어져 있다. 이러한 세포의 가장자리는 세포 내부에 있는 물질을 외부에 있는 물질과 분리하는 작용을 하는 플라즈마 막으로 한정된다. 세포막은 영양소와 같은 물질의 세포 내부 또는 외부로의 이동을 조절하는 작용을 한다. 세포막을 통한 이온의 이동은 세포의 팽창압(oncotic pressure)의 조절과 같은 세포에서 많은 중요한 작용에 관여한다. 이온의 이동을 조절함으로써 세포에 적당한 농도를 조절하게 되어 세포의 형태(integrity) 및 기능을 유지하도록 한다. 부적절한 조건이 되면 세포가 기능을 유지하지 못하는데, 예를 들면 세포 내에서 이온 농도가 너무 높아지면, 물이 세포 내로 이동하여 세포가 팽창하고 폭열하게 되고, 세포에서 이온의 농도가 너무 낮아지면 세포가 위축하게 된다.

유기체는 세포막에서 이온의 이동 특성을 이용하여 특히 조직에서 체액을 조절한다. 예를 들면, 장의 내부에 있는 세포는 이온의 이동으로 물의 흡수를 조절한다. 세포에 의해 이동되는 특히 중요한 이온은 염소 이온이다. 염소 이온은 삼투 조절, 세포 내 pH 조절 및 염 및 체액의 분비와 같은 다양한 세포 기능에서 주요한 역할을 담당하고 있다.

장 내에서, 고농도의 염소 이온의 분비는 분비성 설사와 같은 질병과 관련이 있다. 분비성 설사는 Salmonella, Shigella, 및 Escherichia coli의 일련의 균주와 같은 미생물에 의한 감염과 같은 다양한 원인에 의하여 일어난다. 조직 내에서 체액의 조절 및 염소 이온의 분비와 관련된 다른 조건으로는 염증, 감염, 또는 외상과 관련된 조직 팽창 등이 있다. 따라서, 염소 이온이 비정상적으로 되는 것을 방지하면 이러한 증상의 병증을 완화시킬 수 있다.

낭포성 섬유증(cystic fibrosis)은 백인(코카서스인종)에 가장 흔한 치명적인 유전적 질병으로, 유럽에 조상을 둔 미국 출생아 2,000명중 약 1명에 영향을 미친다. 이 질병의 특징은 비정상적으로 점도가 높은 점액인데, 이는 만성 폐질환, 췌장의 기능부전 및 장의 장애를 유도한다. 미국에서, 약 30,000명의 낭포성 섬유증 환자가 있으며 매년 약 1,000명의 새로운 환자가 발생 된다. 과거에는 발병된 어린이가 종종 유아일 때 사망하곤 했지만, 지금은 20대 내지 30대까지 생존할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 낭포성 질병에 관한 치료법은 없고, 현재의 치료는 세포의 결함에 대한 변경이 아니고, 이 질병의 증상을 관리하는 정도이다.

낭포성 섬유증에 대한 현재의 치료는 대부분 증상을 완화시키거나 일시적인 감염을 조절하는 것으로 한정되어 있다. 예를 들면, 바이러스의 병증에 대해서 백신처리하거나, 박테리아성 감염에 배양 특이적인 항생제를 사용하는 것이 감염을 방지하지 위해서 사용될 수 있다. 코티코스테로이드(corticosteroids)가 종종 감염에 대한 염증 반응의 치료에 사용될 수 있지만 여러 가지 바람직하지 않은 장기적인 부작용을 일으킨다. 다른 치료법은 폐에서 비정상적인 점질의 점액 분비와 관련된 만성 폐질환의 증상에 집중되어 있다. 예를 들면, 흉부 타진법(chest percussion) 및 체위변환 객담 배출(postural drainage aid)과 같은 물리적 수단은 폐에서 분비물을 배출하는데 도움을 준다. 기관지 확장은 일부 환자에게는 이익이 되지만 다른 환자에서는 가스 교환을 감소시킨다. 비정상적인 점성의 점액과 관련된 다른 증상은 장의 장애 및 췌장의 기능부전을 포함한다. 장의 장애는 성인의 20%에서 발생되는데, 관장으로, 또는 관장이 부적절한 경우에는 수술로, 치료된다.

췌장 기능부전은 환자의 80 내지 90%에게서 발생되는데, 세포 외부로의 염소 이온의 재순환이 손상되어 중탄산염(bicarbonate) 이온 및 체액의 분비가 감소되는 것에 기인한다. 이 경우, 췌장액의 단백질이 고도로 농축되어서 농후성(濃厚性)이 되어 췌관의 장애를 유발하고 결과적으로 췌장 소포의 위축을 유발한다. 췌장의 기능부전은 적절한 소화 및 흡수 기능을 회복하도록 효소를 보충시켜 영양 부족 증 상을 극복하도록 처치된다. 그러나, 근원적인 질병이 치료되지 않으면, 종종 췌장의 위축을 일으켜 췌장염이 반복적으로 재발을 일으킨다.

정상적인 폐기능, 결장의 정상적인 배출 기능, 또는 정상적인 췌장 기능을 회복하도록 하는 처치 방법은 현재 실시되는 치료 방법에 비하여 커다란 이점을 제공하게 될 것이다. 유전자 치료가 낭포성 섬유증 환장에 사용되어 왔다. 그러나, 유전자 치료에 관한 시도는 유전자의 과도한 크기 및 유전자 전이에 사용되는 아데노바이러스 벡터에 대한 면역 반응 및 상피 조직의 빠른 전환(turnover)과 같은 여러 가지 이유로 성공적이지 못하였다.

따라서, 염소 이온 분비를 변환시켜서 비정상적인 염소 이동과 관련된 분비성 설사 및 낭포성 섬유증과 같은 병증을 개선하도록 하는 수단이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키고 또한 이와 관련된 장점을 제공한다.

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포 투과성 길항제인 조성물을 제공한다. 예를 들면 본 발명은 myo-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트(myo-inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate) 및 포스파티딜이노시톨 트리스포스페이트(phosphatidylinositol trisphosphate)의 길항제를 제공한다. 또한, 본 발명은 세포를 이노시톨 폴리포스페이트의 세포 투과성 길항제에 접촉시켜 세포에서 염소 이온의 분비를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에게 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 촉진하 는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에서 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제를 투여하여 개체에서 낭포성 섬유증과 관련된 징후 또는 증상을 완화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제인 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 myo-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 및 포스파티딜이노시톨 트리스포스페이트의 작용제를 제공한다. 또한, 본 발명은 세포를 이노시톨 폴리포스페이트의 세포 투과성 작용제에 접촉시켜 세포에서 염소 이온의 분비를 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에게 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제를 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에서 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제를 투여하여 개체에서 분비성 설사와 관련된 징후 또는 증상을 완화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포를 이노시톨 폴리포스페이트의 길항제 또는 작용제인 세포투과성 화합물에 접촉시켜 염소 이온 분비를 변화시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "변화(altering)"라는 용어는 세포의 내 또는 외부로 염소 이온의 이동이 본 발명의 작용제 또는 길항제로 처치하지 않은 세포에서 염소 이온의 분비와는 차이가 나게 염소 이온 분비를 촉진하거나 저해한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "길항제(antagonist)"는 다른 화합물의 생리적 활성을 저해하는 기능을 가지는 화합물을 의미한다. 예를 들면 염소 이온의 분비를 저해하 는 화합물의 길항제는 이러한 저해를 역전시킨다. 비슷하게, "작용제(agonist)"라는 용어는 다른 화합물의 생리적 활성과 유사한 기능을 가지는 화합물을 의미한다.

본 발명의 길항제는 세포에서 염소 이온의 분비를 촉진한다. 본 명세서에서 "촉진(enhancing)"이라는 용어는 염소 이온 분비의 촉진에 관하여 사용하는 경우, 세포의 외부로 염소 이온 이동하는 수준이 길항제로 처치하지 않은 해당 세포에서 분비 수치보다 높다는 것을 의미한다. 반대로, "저해(decreasing)"라는 용어는 염소 이온 분비를 저해에 관하여 사용하는 경우, 세포 외부로 염소 이온의 이동 수치가 작용제로 처치하지 않은 해당 세포에서 분비 수치보다 낮다는 것을 의미한다. 본 명세서에서는 "접촉(contacting)"이라는 용어는 세포막을 통과할 수 있는 화합물인 세포 투과성 화합물에서 세포를 배양시키거나 또는 노출시키는 것을 의미한다.

비정상적인 염소 이온 분비는 다양한 병적 조건과 관련되어 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 염소 이온 분비를 촉진하거나 저해하는데 유용하여 이러한 질병의 증상을 완화하는데 유용하며, 낭포성 섬유증과 같은 일련의 질병 증상에서, 염소 이온의 분비를 촉진하는 것에 의하여 이 질병의 증상을 완화하는데 이용할 수 있으나, 분비성 설사와 같은 질병 증상은 염소 이온 분비를 저해하는 것에 의하여 증상을 완화시킬 수 있다. 따라서, 염소 이온의 분비 이상에 따라서, 본 발명은 특정 질병과 관련된 비정상적인 염소 이온의 분비를 보상하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제 또는 길항제인 화합물을 제공 한다. 이노시톨 폴리포스페이트 유도체는 이노시톨 폴리포스페이트 작용제 및 길항제로서 작용할 수 있다. 칼슘 중재된 염소 이온 분비의 Ins(3,4,5,6)P₄- 및 PtdInsP₃-중재된 저해에 대한 본 발명의 화합물의 효과는 실시예들에서 설명하고 있고 표 1에서 요약하고 있다.

본 발명은 칼슘-중재된 염소 이온 분비의 내인성 저해제인 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 활성과 유사하거나 길항하여, 칼슘 의존성 염소 이온 채널을 통한 염소 이온 분비를 조절하는 세포 투과성 화합물을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 세포 내 농도를 증가시키는 화합물은 염소 이온 분비를 저해하는데 유용하다. 반대로, Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 효과를 저해하는 화합물은 염소 이온 분비를 촉진하는데 유용하다.

표 1

염소 이온 분비에 대한 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 효과

유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
1,2-디-O-부티릴-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	+		Ins(3,4,5,6) P₄의 작용제
2-O-부티릴-1-O-메틸-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	-	+	Ins(3,4,5,6) P₄의 길항제
1,2-디-O-메틸-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	-	+	Ins(3,4,5,6) P₄의 길항제
유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
D,L-1,2-디-사이클로헥실리덴-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	D,L-1,2,-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM		+	Ins(3,4,5,6) P₄의 길항제
1-O-부틸-2-O-부티릴-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	1-Bu-2-Bt-Ins(3,4,5,6)P₄/AM		+	Ins(3,4,5,6) P₄의 길항제
1,2-디-O-부틸-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Bu₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM		+	Ins(3,4,5,6) P₄의 길항제
1-O-부티릴-2-O-부틸-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	1-Bt-2-Bu-Ins(3,4,5,6)P₄/AM		-
유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
2,3-디-O-메틸-myo-이노시톨 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM	-	-
2-O-부티릴-3-O-메틸-myo-이노시톨- 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM	-	-
D,L-1,2-O-부티릴-scyllo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	D,L-Bt₂-scyllo-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	+		Ins(3,4,5,6) P₄의 작용제
D,L-1-O-부티릴-2-O-메틸-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	D,L-1-Bt-2-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	+		Ins(3,4,5,6) P₄의 작용제
유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
D,L-1,2-디클로로-1,2-디데옥시-myo-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	D,L-1,2 Cl₂-1,2 디데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM	-
3-O-부티릴-2-O-부틸-myo-이노시톨 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	3-Bt-2-Bu-Ins(1,4,5,6)P₄/AM		-
2,3-디-O-부틸-myo-이노시톨 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Bu₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM		-
3-O-부틸-2-O-부티릴-myo-이노시톨 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	3-Bu-2-Bt-Ins(1,4,5,6)P₄/AM		-
유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
D,L-2,5,6-트리-O-부티릴-myo-이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 hex(아세톡시메틸)에스테르	D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM	+		Ins(3,4,5,6) P₄의 작용제
2,3-디-O-부티릴-myo-이노시톨 1,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM		+	PtdInsP₃의 길항제
sn-디-O-팔미토일-D,L-6-O-부티릴-포스파티딜-이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 hepta(아세톡시메틸)에스테르	diC₁₆-Bt-PtdIns P₃/AM	+		PtdInsP₃의 작용제
유도체¹	약어²	Cl^-분비의 저해성	저해 방지능	영향받은 메카니즘 및 이노시톨 폴리포스페이트 경로
sn-디-O-옥타노일-D,L-6-O-부티릴-포스파티딜-이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 hepta(아세톡시메틸)에스테르	diC₈-Bt-PtdIns (3,4,5)P₃/AM	+		PtdInsP₃의 작용제
D,L-1-O-부티릴-2-O-데옥시-이노시톨 3,4,5,6-TK포스페이트 oct(아세톡시메틸)에스테르	D,L-1-Bt-2-데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM			Ins(3,4,5,6) P₄의 작용제

¹ 나열된 유도체는 다음의 약어를 사용한다: TK - 테트라키스포스페이트; oct - 옥타키스; hex - 헥사키스. 별도로 표시하지 않으면, 모든 화합물은 D 형이다.

² 상기 표 및 본 명세서를 통해 사용된 약어는 다음을 나타낸다: Ins - 이노시톨; P - 포스페이트; P_n에서 n - 포스페이트의 수; AM - 아세톡시메틸 에스테르; Bt - 부티릴; Me - 메틸; Bu - 부틸; C₁₆- 팔미토일; C₈ - 옥타노일; PtdIns - 포스파티딜이노시톨.

별도로 표시하지 않으면, 모든 유도체는 myo-이노시톨 유도체이다.

본 발명의 세포투과성 화합물은 구조적 유사성으로 인하여 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 세포 내 농도를 직접적으로 증가시키는데 또는 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃와 유사한 효과를 나타내는데 유용하다. 또한, 본 발명의 세포 투과성 화합물은 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 작용을 길항하는데 유용하다. 본 명세서에서 이노시톨 폴리포스페이트 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 세포투과성 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있다.

세포 투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체를 실시예 XI에서 설명한 바와 같이 합성하였다. 이 화합물은 하전된 포스페이트기가 아세톡시메틸에스테르 기에 의해서 둘러싸이고, 하이드록시기가 소수성 작용기에 의해서 둘러싸이기 때문에 세포 투과성을 갖는다(도 1 참조). 친수성기를 둘러싸는데 사용되는 소수성 작용기 는 예를 들면 아실기, 알킬기, 알킬리덴기 또는 다른 이노시톨 폴리포스페이트에 있는 친수성기를 둘러쌀 수 있는 소수성 작용기가 될 수 있다. 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 1-메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2-메틸펜틸, 2,2-디메틸프로필, 펜틸 및 헥실 및 알킬렌기, 사이클로헥실 및 사이클로펜틸기와 같은 탄소 원자의 고리형 사슬 및 메틸-사이클로헥실 또는 사이클로프로필-메틸렌기와 같은 탄소 원자의 선상, 또는 분지상 사슬 및 사이클릭 사슬의 혼합물을 포함한다. 그러나 메틸 유도체에 대해서 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM, 2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 및 D,L-1-Bt-2-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM은 청구된 조성물의 범위에 포함되지 않는다. 또한, 본 명세서에서 정의된 알킬이 치환기로 치환될 수 있다는 것은 인지되어야 한다. 알킬리덴기는 아세탈기로서, 예를 들면 메틸리덴, 에틸리덴, 프로필리덴, 부틸리덴, 펜틸리덴, 헥실리덴, 사이클로부틸리덴, 사이클로펜틸리덴, 사이클로헥실리덴, 및 사이클로헵틸리덴을 포함한다(본 명세서에서 참조문헌으로 인용되는 Kemp and Vellaccio, Organic Chemistry, Worth Publishers, New York(1980)참조). 아실기는 예를 들면 아세틸, 프로판일, 부티릴, 헥사노일 및 발레릴을 포함한다. 그러나, 아실 유도체에 있어서, Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, D,L-Bt₂-scyllo-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 및 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM은 조성물의 범위 내에 포함되지 않는다. 일단 세포 내부로 들어가면, 부티릴 및 아세톡시메틸 에스테르기는 세포 내 에스테라제에 의해서 분해된다. 따라서, 이들 소수성 관능기가 변형되면 화합물이 세포막을 통과할 수 있게 되고, 화합물이 가수분해되어 유도되지 않은 화합물의 친수성기가 노출되도록 한다. 그러나 알킬 및 알킬리덴기는 가수분해되지 않는 작용기들이어서 세포막을 통과한 후에도 유도체에 남아 있게 된다.

이노시톨 폴리포스페이트의 추가적인 변형은 세포투과성 유도체를 제공한다. 예를 들면, Ins(3,4,5,6)P₄유도체는 1,2-디데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 1-Bt-2-데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 2-Bt-1-데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 및 1,2-디클로로-1,2-디데옥시-myo-Ins(3,4,5,6)P₄/AM을 포함하는 것으로 역시 세포투과성 유도체이다(표 1 참조). 또한, 세포투과성 PtdInsP₃ 유도체는 예를 들면, diC₁₆-6-O-Bt-PtdIns(3,4,5)P₃/AM 및 diC₈-6-O-Bt-PtdIns(3,4,5)P₃/AM 및 diC₁₆-2-O-Bt-PtdIns(3,4,5)P₃/AM, diC₈-2-O-Bt-PtdIns(3,4,5)P₃/AM, diC₁₆-2,6-O-Bt₂-PtdIns(3,4,5)P₃/AM 및 diC₈-2,6-O-Bt₂-PtdIns(3,4,5)P₃/AM을 포함한다. 아실화 아세톡시메틸 에스테르 유도체의 합성 방법은 본 명세서의 참조문헌으로 인용된 Roemer et al. (J. Chem. Soc., Chem. Commun. N4:411 (fat 1995); J. Chem. Soc., Perkins Trans, 1 N14:1683 (fat 1996)에 개시되어 있다.

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 길항제인 세포투과성 화합물을 제공한다. 하나의 실시예에서, 세포투과성 화합물은 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제이다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용한다. 예를 들면, 제1위치, 제2위치 또는 2개의 위치 모두에 있는 하이드록시기에 알킬기를 가진 Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용한다 (표 1 및 실시예 III 및 IV 참조). 특히 유용한 알킬기 유도체는 메틸(Me) 및 부틸(Bu) 유도체이다. 예를 들면, 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 1-Bu-2-Bt-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 및 Bu₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 각각은 염소 이온 분비의 Ins(3,4,5,6)P₄-중재된 저해를 역전하는 것으로, Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제이다. 다른 유용한 Ins(3,4,5,6)P₄유도체는 제1위치 및 제2위치에 알킬리덴기를 함유하는 것이다. 예를 들면 D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM은 염소 이온 분비의 카르바콜(carbachol)-중재된 저해를 반전하는 것으로, Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제이다. 또는, 제2위치 및 제3위치에 알킬리덴기를 가진 Ins(1,4,5,6)P₄/AM 유도체는 Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체로서 작용할 수 있다.

다른 실시예에서, 세포투과성 화합물은 PtdInsP₃의길항제이다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 세포투과성 Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체는 PtdInsP₃의길항제이다. 예를 들면, 제2위치 및 제3위치에 부착된 부티릴기를 가진 Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체는 EGF- 및 PtdInsP₃-에 의해서 유도된 칼슘-중재된 염소 이온 분비의 저해를 반전하는 것으로, PtdInsP₃의길항제로 작용한다 (표 1 및 실시예 VII 및 VIII 참 조).

본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제인 세포투과성 화합물을 제공한다. 하나의 실시예에서, 세포투과성 화합물은 Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제이다. 본 명세서에서 개시된 바로는, Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제이다. 예를 들면 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Bt₂-scyllo-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 및 1-Bt-2-데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (36% 저해)는 세포 내 칼슘 농축물에서 염소이온 분비를 떼어놓음으로서 칼슘-중재된 염소 분비를 저해하여, Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제이다(표 1 및 실시예 I 내지 III 참조). 또한, Ins(1,3,4)P₃ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제이다. 예를 들면, Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM은 세포 내 Ins(3,4,5,6)P₄의 농도를 증가하여 칼슘-중재된 염소 이온 분비를 저해하므로, Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제이다 (실시예 V 참조).

다른 실시예에서, 세포투과성 화합물은 PtdInsP₃의작용제이다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, PtdInsP₃유도체는 PtdInsP₃의작용제이다. 예를 들면 diC₁₆-Bt-PtdInsP₃/AM 및 diC₈-Bt-PtdInsP₃/AM은 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해하여 PtdInsP₃의 작용제이다 (표 1 및 실시예 III 참조).

이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 구조의 분자상 모델링은 이노시톨 폴리포 스페이트 유도체의 목적하는 활성을 유사한 구조적 특성을 가진 합성 화합물로 설계하는데 사용될 수 있다. 또한, 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제 또는 길항제 로 작용하는 세포투과성 합성 화합물은 예를 들면 조합 화합물 라이브러리(combinatorial chemical library)를 검색하여 확인할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 방법을 사용하여, 합성 화합물들이 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대해서 주어진 이노시톨 폴리포스페이트와 유사한 효과를 나타내거나 길항하는 지에 대해서 검색될 수 있다. 조합 화합물 라이브러리를 제조하고 검색하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (본 명세서에서 참조문헌으로 인용된 Combinatotial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, Jung, ed., VCH, New York(1996) 참조).

본 발명은 또한 세포를 이노시톨 폴리포스페이트의 길항제 또는 작용제인 세포투과성 화합물과 접촉시켜서 염소 이온의 분비를 변화시키는 방법을 제공한다. 세포는 염소 이온의 이동을 통하여 유기체내에서 물의 이동을 조절한다. 세포는 채널이 개방되면 염소 이온이 막을 통과하도록 허용하는 특정 염소 이온 채널을 가진다. 이들 채널은 뮤신(mucin)을 분비하고 물의 흐름을 조절하는 점막에 있는 세포에서 특히 중요하다. 세포의 내부 및 외부로의 물의 흐름이 결핍되면, 뮤신 분비는 점성의 플러그(plug)가 되어서 폐의 기도와 내장의 내부 점막을 폐쇄하여 낭포성 섬유증과 같은 질병을 초래한다. 염소 이온 채널이 모두 동일한 것은 아니며, 다른 채널은 다른 방법에 의해서 조절된다.

칼슘-의존성 염소 이온 채널과 같은 특정의 염소 이온 채널 등은 칼슘 이온의 이동과 관련되어 있다. 칼슘 이온의 세포 내 농도가 증가되면, 염소 이온 분비 가 증가된다. 본 명세서에서 사용되는 "염소 이온의 분비"라는 용어는 세포의 플라즈마 막을 통과하는 염소 이온의 이동을 의미한다. 히스타민, 이노시톨 폴리포스페이트 대사에 측정가능한 장기적 효과를 미치지 못하는 생리적으로 적절한 작용제 및 히스타민과 같은 일련의 화합물로 세포를 치료하는 것은 염소 이온 분비의 증가를 시키는 세포 내 칼슘 이온 농도의 증가를 초래할 수 있다.

무스카린성(muscarinic) 콜린계 화합물인 카르바콜(carbachol)은 세포 내 칼슘 이온 농도를 증가하고 단기간 치료에서 염소 이온 농도를 자극한다. 그러나, 결장 상피의 T₈₄ 세포를 카르바콜로 장기간 치료하는 것은 세포 내에서 칼슘 이온의 농도를 증가시키나 더 이상 염소 이온의 분비를 자극하지는 않았다 (본 명세서에서 참조문헌으로 인용되는 Kachintorn et al., Am. J. Physiol. Cell 264:C671 (1993) 참조). 카르바콜의 장기간 치료는 세포 내 Ins(3,4,5,6)P₄ 수치의 장기간의 완만한 상승을 유도한다 (본 명세서에서 참조문헌으로 인용되는 Vajanaphanich, et al., Nature 371:711 (1994) 참조). Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 및 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM의 혼합물로 T₈₄ 세포를 치료하는 것은 탑시가르긴(thapsigargin)으로 유도된 세포 내 칼슘의 농도 증가에 대응하여 염소 이온의 분비를 저해시켰으나, Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM는 아무런 효과가 없었다. 본 명세서의 예시된 바와 같이, 거울상 이성체를 포함하지 않는 순수한(enantiomerically pure) Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM는 세포 내 칼슘의 증가된 농도에 대응하여 염소 이온의 분비를 저해한다 (실시예 I 참조). 따라서, Ins(3,4,5,6)P₄는 칼슘이온 농축물에서 염소 이온을 분리시키기 때문에 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 내인성 반대 조절자이다.

Ins(3,4,5,6)P₄에 의해 중재되는 것과 구별되는 칼슘-중재된 염소 이온 분비 저해하는 다른 메카니즘은 PtdInsP₃의 수준을 증가시키는 것에 의한 것이다. EGF는 T₈₄ 세포에서 카르바콜 및 탑시가르긴에 의해 유도된 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다 (Uribe et al., Am. J. Physiol. 271:C914(1996a) 참조). EGF는 Ins(3,4,5,6)P₄수치의 20배까지 증가를 자극하는 카르바콜에 비하여 Ins(3,4,5,6)P₄ 수치의 1.7 배 증가를 자극한다. 이러한 결과는 EGF가 Ins(3,4,5,6)P₄와는 다른 메카니즘을 통해 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 조절한다는 것을 암시한다.

EGF는 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI 3-키나제)를 활성화하고 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 EGF의 저해효과는 PI 3-키나제에 의해서 조절된다 (Uribe et al., J. Biol. Chem. 271:26588 (1996b) 참조). EGF는 PI 3-키나제 산물, 포스파티딜-이노시톨 3,4-바이스포스페이트(PtdInsP₂) 및 PtdInsP₃ 수준의 증가를 자극한다. 이들 PI 3-키나제 산물은 염소 이온의 분비의 EGF 저해와 유사한 기간 동안 증가되었다. 높은 특이성의 PI 3-키나제 저해제인 와트만닌(Wortmannin)은 PtdInsP₃ 및 PtdInsP₃의 형성을 방지하고 EGF 유도성 염소 이온의 분비의 저해를 반 전하였다. 따라서, PtdInsP₃에 간여된 대사는 EGF 유도성 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 원인이 된다.

본 발명의 화합물이 염소 이온의 분비를 조절하는 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제 및 길항제이기 때문에, 이들 화합물은 세포 내에서 염소 이온의 분비를 변화시키는데 유용하다. 이들 화합물은 세포 투과성이기 때문에, 상기 화합물이 세포에 접촉되면 이노시톨 폴리포스페이트가 작용하는 자리인 세포질로 상기 화합물이 운반된다.

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 길항제와 세포를 접촉시켜 세포막을 통과하는 염소 이온의 분비를 촉진하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제는 염소 이온의 분비를 촉진하도록 사용된다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 길항제로 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, PtdInsP₃길항제는 염소 이온의 분비를 촉진하도록 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체는 PtdInsP₃의길항제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제와 세포를 접촉하게하여 세포막을 통과하는 염소 이온의 분비를 저해하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, Ins(3,4,5,6)P₄의 작용제는 염소 이온의 분비를 저해하도록 사용된다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제 로 사용될 수 있다. 또한, Ins(1,3,4)P₃ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄ 작용제로 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, PtdInsP₃작용제는 염소 이온의 분비를 저해하도록 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, PtdInsP₃유도체는 PtdInsP₃의작용제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의길항제를 개체에 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 "개체(individual)"라는 용어는 염소 이온의 분비를 촉진하거나 저해하는 본 발명의 작용제 또는 길항제 화합물로 치료하고자 하는 일반적으로 포유류인 유기체로서 특히 인간을 의미한다. 염소 이온 분비의 증가 또는 감소는 개체에서 세포를 포함하는 하나 이상의 조직 기관에서 발생한다. 본 명세서에서 "투여(administering 또는 administration)"라는 용어는 길항제 또는 작용제가 적절한 표적 조직(target tissue)으로 운반되는 방법 및 형식으로 개체에 길항제 또는 작용제를 유도하는 것을 의미하는 것으로, 표적 조직에 접촉되어 세포의 염소 이온의 분비를 변화시킨다. 본 발명은 또한 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃ 또는 모두의 길항제를 낭포성 섬유증의 증상 및 징후를 보이는 개체에 투여하여 낭포성 섬유증과 관련된 징후 또는 증상을 완화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 작용제를 개체에 투여하여 염소 이온의 분비를 저해하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 분비성 설 사의 징후 또는 증상을 보이는 개체에 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의작용제를 투여하여 분비성 설사와 관련된 증상 및 징후를 완화하는 방법을 제공한다.

일반적으로 길항제 또는 작용제는 약학적 조성물로 개체에 투여한다. 이러한 약학적 조성물은 길항제 또는 작용제 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 약제학적으로 수용가능한 담체는 당업계에서 잘 알려져 있는데, 생리학적으로 완충된 식염수와 같은 수용액 또는 글리콜, 글리세롤, 올리브 오일과 같은 오일, 또는 주사가능한 유기 에스테르와 같은 기타 용매 또는 담체를 포함한다.

약제학적으로 수용 가능한 담체는 예를 들면 길항제 또는 작용제를 안정화하거나, 약제의 흡수를 증가시키는 데에 작용하는 생리적으로 수용 가능한 화합물을 포함한다. 이러한 생리적으로 수용 가능한 화합물은 예를 들면 글루코오스, 슈크로즈 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르빈산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 첨가제를 포함한다. 당업자라면 약제학적으로 수용가능한 화합물과 같은 약제학적으로 수용가능한 담체의 선택은 예를 들면 본 발명의 길항제 또는 작용제의 투여 경로 및 표적 조직에 의존한다는 것을 알 것이다.

여러 가지 투여의 경로는 치료하고자 하는 개체 및 표적 조직 또는 조직에 따라 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들면 구강, 직장, 또는 정맥내, 근육내, 피하의, 안내의, 모세혈관내, 복강내, 시스턴내를 포함한 다양한 경로에 의해서 투여되거나, 예를 들면 피부 패치, 경피성 이온침투 요법을 이용하는 피부를 통한 수동 흡수 또는 촉진된 흡수를 이용하여 투여할 수도 있다. 또한, 조성물은 주사, 삽관, 또는 국부로 투여될 수 있고, 예를 들면 연고 또는 파우더의 직접 적용으로 수동화될 수 있고, 비강 스프레이 또는 흡입을 사용한 능동형이 될 수도 있다.

총 유효량이 큰 볼러스(bolus) 또는 주입 등과 같이 비교적 단시간 내에 1회량으로 대상에게 투여될 수 있고, 또는 다회의 분량이 연장된 기간동안 투여되는 분할된 처방을 사용하여 투여될 수 있다. 당업자는 대상에서 유효량을 획득하기에 요구되는 제제의 농도가 대상의 나이 및 일반적인 건강 및 투여 경로 및 투여하고자 하는 치료의 수를 포함하는 많은 요인에 의존한다는 것이 알려져 있다. 이들 인자에 대해서 당업자는 특정 투여량을 조절하여 유효량을 얻을 수 있다.

특정 화합물의 투여량은 예를 들면 염소 이온의 분비를 촉진하거나 저해하는 목적하는 효과를 달성하는데 요구되는 세포 내 농도에 의해서 결정한다. 유효한 세포 내 농도는 본 명세서 내에서 개시된 바와 같은 방법 또는 당 기술 분야에서 알려진 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 작용제의 유효 세포 내 농도는 실험실 내에서 Ins(1,3,4)P₃-5/6-키나제 분석(Vajanaphanich et al. 동일 논문, 1994)을 이용하여 약 4μM이 되도록 측정하였다. 따라서, Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM에 대해서 투여량은 약 4-20μM, 바람직하게는 4μM의 세포 내 유도체 농도가 제공되도록 선택한다. 초기 연구는 특정 화합물의 효과를 판단하는 모델 시스템에서 수행하였다. 개체에서 병증을 치료하는데 필요한 유효농도의 판 단은 제1기 및 제2기의 임상적 시도에서 판단한다.

본 발명의 화합물은 단독으로 또는 서로 혼합하여 사용될 수 있으며, 또는 비정상적인 염소 이온 분비와 관련되는 다른 치료제와 함께 혼합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료 처방은 하나의 화합물로 시작할 수 있고, 부가적인 화합물은 첫번째 화합물의 효과가 불충분한 경우, 첫번째 화합물과 함께 투여할 수 있다. 치료는 우리딘 5'-트리포스페이트와 아밀로라이드(amiloride)의 투여와 같은 치료의 다른 방식과 함께 혼합할 수 있다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Bennett et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153:1796(1996) 참조).

본 발명의 조성물 및 방법은 부분적으로 비정상적인 염소 이온의 분비를 특징으로 하는 낭포성 섬유증 또는 분비성 설사와 같은 다양한 병증을 치료하는데 유효하다. 불완전한 염소 이온의 분비는 상피 세포의 염소 이온의 채널인 낭포성 섬유증 경막 조절자(CFTR)에서 돌연변이에 기인한 낭포성 섬유증을 유발한다. 상피세포의 최외부 표면과 관련된 염소 이온 채널은 원칙적으로 염 및 체액 분비를 조절하는 조절점이다. 대부분의 낭포성 섬유증은 ΔF508 돌연변이로 알려진 단일점 돌연변이의 결과로, 아미노산 위치 508에서 아미노산 페닐알라닌의 결손을 초래한다. 이 돌연변이는 세포막으로 CFTR의 전이를 방해하여 세포에 의한 염소 이온의 분비를 저해한다.

낭포성 섬유증의 치료에 대한 하나의 접근은 다른 염소 이온 채널을 인위적으로 활성화하는 것이다. 예를 들면, 상피세포에서 외부로 교정되는 염소 채널(ORCC)은 사이클릭 AMP로 조절되는 염소 이온 채널이다. 그러나, ORCC는 CFTR로 조절되는 것으로 믿어지고 따라서 낭포성 섬유증의 활성이 낮아진다 (Schwiebert et al., Cell 81:1063 (1995); Egan, et al., Nature 358:581 (1992); 및 Gabriel, et al., Nature 363:263 (1993) 참조). 반대로, 칼슘 의존성 염소 이온 채널은 낭포성 섬유증의 마우스 모델의 세포에서 더욱 풍부하다 (Grubb et al., Am. J. Physiol. 266:C1478 (1994) 참조). 칼슘 의존성 염소 이온 채널은 CFTR과는 다르고 낭포성 섬유증을 가진 환자의 세포에서 더욱 풍부한 것이므로 CFTR을 통한 용매의 부족을 보상하기 위해서 이들 채널을 통한 CFTR을 통한 용매를 보충할 수도 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의 하나 이상의 길항제는 CFTR에서 손상으로 영향받은 상피세포에서 염소 이온 분비를 회복하도록 사용될 수 있다.

여러 가지 모델 시스템이 본 발명의 이노시톨 폴리포스페이트의 염소 이온 분비를 촉진하는 능력을 검증하기 위해서 사용된다. 이러한 모델 중 하나는 인간 결장의 상피의 T₈₄ 세포주로, 모델 분비성 상피세포로서 연장되어 연구되었다(Dharmsathaphorn et al., Am. J. Physiol. 246:G204 (1984)). T₈₄ 세포는 투과성 지지대에서 접합되어 성장되는 경우 조밀한 접합 및 벡터의 이송으로 극성 단층을 형성하는 상대적으로 차별적인 페노타입을 보인다. T₈₄ 단층은 유리 사이토졸 칼슘 및 CFTR에서 변화를 포함하는 많은 수용체-중재된 염소 이온 분비 대사를 유지한다 (Cohn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2340 (1992)). 히스타민, 카르바콜, 칼슘 이온운반체 및 탑시가르긴과 같은 약제는 세포 내 칼슘 이온을 상승시키 고 T₈₄ 단층을 통과하는 염소 이온의 분비의 변화를 자극한다 (Dharmsathaphorn et al., J. Clin. Invest. 84:945 (1989); Kachintorn et al., 동일 논문 1993). 사이클릭 AMP는 또한 T₈₄ 세포에서 CFTR을 통한 염소 이온의 분비를 자극한다 (Anderson 및 Welsh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6003(1991)). 따라서, T₈₄ 세포는 낭포성 섬유증과 같은 결핍된 염소 이온 이동을 포함하는 정상 및 병적 증상에서 염소 이온 분비를 조절하는 실험실내의 모델을 제공한다. 또한, 토끼 결장의 상피세포는 결장 상피 세포의 모델을 제공한다.

낭포성 섬유증의 더욱 악화된 3가지의 증상은 만성 폐질환, 췌장 기능부전 및 장의 장애이다. 여러 가지 모델 시스템이 이들 증상을 치료하기 위한 본 발명의 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 치료적 효과를 특정하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, T₈₄ 세포에서 CFTR 유전자(CFTR^- T₈₄ 세포)의 넉아웃(knockout)이 낭포성 섬유증 환자의 결장세포의 유전자와 유사한 유전자 배경(background)을 가지는 결장의 상피세포의 모델로 제공된다 (실시예 X 참조). CFTR^- T₈₄ 세포주는 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제인 본 발명의 화합물의 염소 이온의 분비에 대한 효능을 검사하는데 유용하다.

인간의 비강 상피세포는 다양한 화합물의 염소 이온의 분비에 대한 효과를 검증하기 위한 호흡기 상피의 모델이다. 인간의 비강 상피세포는 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제인 본 발명의 화합물의 이들 세포에서 염소 이온의 분비에 대한 기능을 검증하는데 유용한 것이다 (실시예 IX 참조).

췌장 기능을 연구하는 적당한 모델 시스템은 ΔF508 돌연변이에 대한 동종(homozygous) 환자의 췌장 선암으로 유래된 인간 세포주인 췌관 상피세포 CFTR^- 세포주인 CFPAC를 사용한다. CFPAC 세포는 cAMP-자극된 채널 기능이 부족하지만 칼슘-활성화된 염소 이온 채널 기능을 보인다 (Shoemacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4012(1990)). 개의 췌관 상피세포도 본 발명의 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제인 본 발명의 화합물의 염소 이온의 분비에 대한 이들 세포에서의 효과를 검증하는데 유효하다 (본 명세서에서 참조문헌으로 인용되는 Nguyen et al., Am. J. Physiol. 272:G172 (1997)).

낭포성 섬유증의 동물 모델 또한 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제의 활성을 조사하기 위해서 사용한다. 예를 들면, CFTR 넉아웃 마우스는 낭포성 섬유증의 모델로 제공되도록 성장시켰다 (본 명세서에서 인용 참증으로 인용되는 Rozmahel et al. Nature Gen. 12:280 (1996); Snouwaert et al., Science 257:1083 (1992); Ratiff et al., Nature Gen. 4:35 (1992); O' Neal et al., Hum. Molec. Genet. 2:1561 (1993); 및 Dorin et al., Nature 359:211 (1992)). 칼슘 의존성 염소 이온 채널의 발현의 수준이 증가된 것은 CFTR 넉아웃 마우스에서 생명력이 개선된 것에 해당한다 (Clarke et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:479(1994); 및 Rozmahel et al. 동일 논문, 1996). 동물 모델은 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제인 본 발명의 화합물의 이들 동물에서 염소 이온의 분비에 대한 효능을 검증하는데 사용된다. 동물 모델도 본 발명의 화합물의 이들 동물에서 특정 조직에 대한 효능을 검증하는데 사용된다.

낭포성 섬유증은 여러 가지 기관에서 발생되기 때문에 당업자는 치료하고자 하는 증상에 따른 화합물의 특정 투여방법 및 경로를 선택할 것이다. 화합물은 어느 정도 양친매적(amphipathic)이고 수용액에 가용성이다. 또한, 화합물은 계면활성제를 함유한 디메틸 술폭사이드에 용해될 수 있다. 화합물은 또한 FREON(1,1,2 트리클로로트리플루오로메탄)을 함유한 용액에 용해될 수 있는 것으로, 낮은 점성을 가지고 더욱 악화된 조직에 접근가능하여 급성 염증동안 또는 질병의 초기 단계 동안 치료에 유용하다. 예를 들면, 호흡기 병증을 앓고 있는 환자에서 본 발명의 길항제는 적절한 약제학적으로 수용가능한 담체에 현탁되거나 용해될 수 있고 흡식 분무기 또는 터보흡입기와 같은 흡입장치를 사용하여 직접 폐로 투여된다. 따라서 폐의 점액의 축적을 완화하기 위해서 화합물은 에어로졸 형태로 바로 목적 폐 조직으로 투여할 수 있다. 또한, 화합물은 FREON에 용해될 수 있고 폐의 살포에 의해서 운반될 수 있다. 이러한 치료는 분무된 수용액의 주기적인 호흡으로 유지될 수 있다.

점액을 함유한 점성과 같은 낭포성 섬유증의 임상적 징후는 잘 알려져 있고, 낭포성 섬유증의 호흡기의 증상 및 징후를 완화하거나 방지하는데 효과적인 처방을 어떻게 판단하는 지는 당업자라면 알고 있을 것이다. 예를 들면, (^99MTc) 산화철 입자를 사용한 점액 제거성의 측정은 본 발명의 화합물에 의한 치료의 효과성을 판단하는데 사용될 수 있다 (Bennett, 동일 문헌, 1996).

낭포성 섬유증의 기타 임상적인 징후는 또한 투여의 적당한 방법을 사용하여 Ins(3,4,5,6)P₄ 또는 PtdInsP₃의길항제로 치료될 수 있다. 예를 들면, 시너스 복합증은 비강 스프레이의 약제학적 조성물을 투여하여 치료될 수 있다. 이 치료는 낭포성 섬유증을 가진 환자에서 얼굴의 기형을 초래할 수 있는 다수의 내시경 수술을 종종 요구하는 현재의 시너스 복합증의 치료방법에 비해 이점이 있다. 낭포성 섬유증에서 장의 이상을 완화하기 위해서, 약제를 적절한 약제학적 담체 내에서 좌약 또는 관장제로 투여할 수도 있다. 또한, 장용 코팅된 정제를 구강으로 투여할 수 있다. 췌장염을 앓고 있는 대상에게 약제학적 조성물은 정맥내, 구강 또는 화합물이 췌장을 포함하는 전신으로 분포되는 다른 방법으로 투여할 수 있다.

낭포성 섬유증 외에, 조직 내에서 만들어지는 체액과 관련된 기타 병증은 염소 이온의 분비를 변화하여 완화된다. 예를 들면 염증, 감염 또는 외상과 관련된 뇌팽창과 같은 팽창은 염소 이온의 분비를 저해하여 완화될 수 있다 (Berger et al., Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 60:534 (1994); 및 Staub et al., J. Neurotrauma 11:679 (1994)).

염소 이온의 분비가 비정상적으로 낮은 낭포성 섬유증과 같은 병증과는 반대로, 다른 병증은 부분적으로 염소 이온의 분비의 수치가 비정상적으로 높은 것으로 특징된다. 예를 들면, 염소 이온의 분비의 수치가 높으면 분비성 설사가 초래된다. 감염성 장내 박테리아인 Salmonella는 분비성 설사를 유발하여 개발 도상국가에서 유아 사망의 가장 중요한 원인 중 하나이고, 선진국에서는 건강 문제를 유발하는 원인 중 하나이다. Salmonella 감염에 의해 13억명 이상에게 위장염 증상을 일으키고, 약 300만 명이 사망한다. 분비성 설사는 소화관의 상피세포를 통한 염소 이온 분비의 증가와 관련된 것으로, 염소 이온의 분비를 감소시키는 것이 분비성 설사의 증상을 완화할 수 있다. 당업자는 분비성 설사의 증상을 완화하기 위해서 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제를 개체에게 처치하는 방법이 상기 개시된 것과 유사하다는 것을 인정할 것이다.

본 발명은 이노시톨 폴리포스페이트의 세포투과성 작용제 또는 길항제로 세포를 접촉하여 세포막을 통과하는 염소 이온의 분비를 변화하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제 또는 길항제를 개체에 투여하여 개체에서 염소 이온의 분비를 변화하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이노시톨 폴리포스페이트의 작용제 또는 길항제를 함유하는 약제학적 조성물을 투여하여 비정상적 염소 이온의 분비와 관련된 병증과 관련된 증상을 완화하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 부분적으로 비정상적인 염소 이온의 분비로 특징되는 병증의 증상 및 징후를 완화하는 약품으로 유용한 것이다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이지 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 I

T ₈₄ 세포에서 Ins(3,4,5,6)P ₄ 의 세포투과성 유도체에 의한 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 저해

본 실시예는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체가 결장 상피의 T₈₄세포주에서 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포 내 농도를 증가시켜서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 감소시킨다는 것을 보여준다.

거울상 이성체 없이 순수한 1,2-Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM을 1,2-Bt₂-Ins(3,4,5,6) P₄/AM이 세포 내 칼슘 농축물에서 염소 이온 분비의 해리를 중재하는 지 알아보기 위해서 합성하였다. T₈₄세포(통로 18-48)는 앞에서 설명한 바와 같이 유지하였다 (본 명세서에서 참조문헌으로 원용된 Weymer, et al., J. Clin. Invest. 76:1828 (1985) 참조). SNAP-WELLs (Corning Costar; Cambridge, MA)에서 배양 7-10일 후, 단일막이 밀착결합(tight junction)을 형성하였다. 세포 단일막을 100, 200 또는 400 μM의 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM로 시작 전 30분간 예비 배양하였다. 추가 30분 후, 히스타민 0.1 mM을 첨가하고 염소 이온의 분비를 관찰하였다. 접합되도록 성장시키고 전압 클램프가 장착된 Ussing 챔버(Physiologic Instruments; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 고정시킨 T₈₄단일막을 통과하는 단락 전류(I_SC)로 염소 이온의 분비를 측정하였다. 데이터는 "Acquire and Analyze" 소프트웨어(Physiologic Instruments)를 사용하여 획득하고 분석하였다.

히스타민-자극된 염소 이온 분비의 최대 감소를 1,2-Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 200μM에서 관찰하였고, 400μM에서는 더 이상 감소하지 않았다(표 II). 이 결과는 세포외 농도 200μM과 동등한 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 수준이 최대의 저해를 발현시킨다는 이전의 연구와 일치한다(Vajanaphanich, et al., 동일 논문, 1994).

표 2

Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체에 의한 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 감소

Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (농도)	히스타민(100μM) 투여후 피크 ΔIsc(% control) 평균 ± SEM	n	vs control (100%)
100μM	75.1±7.4	8	p<0.012
200μM	57.2±15.1	6	p<0.037
400μM	69.3±8.7	4	p<0.041

Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체에 의한 염소 이온의 분비의 감소와는 달리, 디부티릴 사이클릭 AMP 아세톡시메틸 에스테르 자극된 염소 이온의 분비의 저해는 관찰되지 않았다(피크 ΔI_sc = 96.3 ± 9.1% 또는 컨트롤; 평균 ± SEM; n=4). 이 결과는 사이클릭 AMP-중재된 염소 이온 분비가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 관련된 채널과는 다른 염소 이온 채널을 통해 발생한다는 관찰과 일치한다(McRoberts et al., J. Biol. Chem. 260:14163 (1985)).

이들 결과는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체에 세포를 노출하여 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시키는 것이 세포내 칼슘 농축물에서 염소 이온의 분비를 해리시켜서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것과 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체가 Ins(3,4,5,6)P₄의 작용제라는 것을 보여준다.

실시예 II

토끼의 결장에서 Ins(3,4,5,6)P ₄ 의 세포투과성 유도체에 의한 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 감소

본 실시예는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체를 이용하여 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시키는 것이 토끼의 결장 조직에서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 감소시킨다는 것을 보여주는 것이다.

T₈₄결장 상피세포를 사용하여 배양한 상기에서 얻어진 결과를 토끼 결장 모델 시스템에서 확인하였다 (본 명세서에서 참고 문헌으로 원용된 Frizzell et al., J. Membrane Biol. 27:297 (1976); 및 Frizzell 및 Schults, Int. Rev. Physiol. 19:205 (1976)). 토끼 결장의 조각을 절취하고 토끼 결장 상피의 원료로 사용하였다. 간략하게, 토끼 결장의 조각은 141 mM Na⁺, 5 mM K⁺, 1.2 mM Ca²⁺, 1.2 mM Mg²⁺, 122 mM Cl^-, 25 mM HCO₃. 1.6 mM HPO₄, 0.4 mM H₂PO₄ 및 10 mM 글루코스를 함유한 Ringers 용액으로 세척하였다.

37℃에서, 이 용액은 5% CO₂ 및 95% O₂로 가스화된 경우 pH 7.4이다. 상피 조직은 아래에 있는 근육층을 스트립핑하였고 변형된 SNAP WELLS(Frizzell et al., 동일 논문, 1976)에 고정시켰다. 상피조직은 37℃에서 30분간 1,2-Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 200 μM으로 예비 배양하였고 Ussing 챔버에 고정시켰다. 단락 전류, 컨덕턴스(conductance) 및 저항을 실시예 1에 설명한 바와 같이 4초의 간격으로 측정하였다. 피크 I_sc는 담체로 배양시킨 대조군의 50.9%±10.4이다 (도 2; Student's two tailed t-test에서 평균 ±SEM, n=3; p<0.05). 도 2에 나타난 % 컨트롤은 히스타민으로 자극된 대조군의 단일층의 피크 I_sc에 대한 ΔI_sc를 나타낸다.

결과는 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 세포투과성 유도체가 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시켜 Ins(3,4,5,6)P₄의 작용제로 작용하고 토끼 결장에서 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 보여준다. 이 결과는 또한 세포내에서 Ins(3,4,5,6)P₄의 증가가 결장 상피 조직에서 세포내 칼슘 농축물에서 염소 이온의 분비를 시킨다는 것을 입증한다.

실시예 III

Ins(3,4,5,6)P ₄ 의 길항제를 사용하여 히스타민-자극된 염소 이온의 분비의 Ins(3,4,5,6)P₄저해의 반전

본 실시예는 히스타민-자극된 염소 이온의 분비에 대한 Ins(3,4,5,6)P₄의 저 해 효과가 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용하는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체에 의해서 반전될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 I 및 II에서 도시된 결과는 Ins(3,4,5,6)P₄의 농도를 증가시키는 것이 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 보여준다. 따라서, 세포에서 Ins(3,4,5,6)P₄의 작용을 길항하는 화합물은 이러한 저해를 반전할 것이다.

초기 연구는 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 저해효과에 대해 관여하는 Ins(3,4,5,6)P₄의 구조적 결정자를 이해하고자 하는 것이었다. 일련의 세포투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체를 합성하였다. 이들 유도체는 1, 2, 또는 3 위치에 1개 또는 2개의 비-가수분해성 작용기를 함유하였다. T₈₄ 단일층을 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 또는 2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 200 μM으로 30분 동안 예비배양시켰다.

배양 후에, 세포를 Ussing 챔버에 고정시켰다. 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 히스타민(10^-4M)으로 자극시켰다. 비교값(control value)은 함께 배양된(coincubated) 단일층에서 히스타민에 대한 반응이다. 데이터는 평균 피크 ΔI_sc±SEM로 나타나는 것으로, 8 내지 10개의 실험에 대한 % 컨트롤로 표현한다. 유의적인 차이는 Student's two-tailed t-test를 사용하여 확인하였다.

표 3에 나타난 바와 같이, 어떠한 유도체로 처치된 세포에서도 저해 효과는 나타나지 않았다. 이들 결과는 1 및 2 위치에서 수소결합 도너 전위가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 Ins(3,4,5,6)P₄의 저해 효과를 중재하는데 참여한다는 것을 나타내는 것이다. 세포투과성 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 scyllo 유도체는 적어도 myo 유도체와 같이 저해제로서 유효한 것으로, 2-하이드록시 위치의 방향자가 저해제 활성과 관련이 없다는 것을 나타낸다.

이상에서 설명한 바와 같이 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 어떤 것이 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 Ins(3,4,5,6)P₄의 저해의 길항제로서 작용하는지를 판단하기 위해서 T₈₄세포를 이노시톨 폴리포스페이트로 예비배양시켰다.

히스타민 자극 이후, 단락 전류를 측정하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM가 대조군의 세포에 비해서 히스타민-자극된 염소 이온의 분비를 저해시켰다. 도 3에 도시된 % 컨트롤은 히스타민으로 자극된 대조군의 단일막에서 피크 I_sc에 대한 ΔI_sc를 나타낸다. 그러나 2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM으로 예비배양한 것은 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 저해효과를 반전하였다.

표 3

Ins(3,4,5,6)P₄의 유도체에 의한 염소 이온의 분비에서 Ins(3,4,5,6)P₄-중재된 저해의 반전

Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (농도)	길항제	히스타민(100μM) 투여후 피크 ΔI_sc 평균±SEM	n	대조군(100%)
100μM		75.1±7.4	8	p<0.012
200μM		57.2±15.1	6	p<0.037
400μM		69.3±8.7	4	p <0.041
-	2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (200μM)	87.3±6.6	8	ns
-	Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (200μM)	103.9±11.1	8	ns
-	Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (200μM)	120.8±10.6	8	ns
-	2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (200μM)	105.5±3.7	10	ns
200μM	2-Bt-1-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (200μM)	117.7±10.6	8	ns
200μM	Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (200μM)	107.13±10.2	8	ns
200μM	2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (200μM)	69.7±5.04	8	p<0.0005
200μM	Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (200μM)	68.4±7.3	8	p<0.003
-	Bt₂AMP/AM (2μM)	96.3±9.1	4	ns
-	Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (400μM)	137.9±20.7	4	ns
-	D,L-1-Bt-2-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (800μM)	114.2±23.7	8	ns
200μM	D,L-1-Bt-2-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (400μM)	96.7±14.8	3	ns
-	D,L-1,2-Cl₂-디데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM (400μM)	89.39±7.8	8	ns

히스타민-자극된 염소 이온의 분비에 대한 다양한 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 효과를 표 3에 도시하였다. Ins(3,4,5,6)P₄의 유도체인 2-Bt-1-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM (200μM) 및 Me₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM는 히스타민-자극된 염소 이온의 분비에 대해서 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 저해 효과를 반전시킨다. 반대로, Ins(1,4,5,6)P₄의 유도체인 Me₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 및 2-Bt-3-Me-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 는 본질적으로 아무런 효과가 없다. 이 결과는 염소 이온의 분비에 대한 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 저해의 반전이 입체특이성이라는 것을 나타내고 Ins(3,4,5,6)P₄의 알킬 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용한다는 것을 보여준다.

다른 유도체 또한 실험되었다. Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM으로 예비배양한 것은 염소 이온의 분비를 저해하지 않았고 실제적으로 염소 이온의 분비를 약간 촉진하였다. Ins(3,4,5,6)P₄의 유도체인 D,L-1,2-Cl₂-디데옥시-Ins(3,4,5,6)P₄/AM은 염소 이온의 분비에 대해서 약간의 저해 효과를 보였다. D,L-1-Bt-2-Me-Ins(3,4,5,6)P₄/AM는 염소 이온의 분비를 저해하지 않고 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM의 저해를 반전시키지 않았다.

세포내 칼슘 농도를 상승시키는 것은 염소 이온의 분비를 유도한다. 염소 이온의 분비에 대한 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 효과의 어떤 것도 칼슘 수치의 변동에 기인한 것은 아니라는 것을 확인하기 위해서, 세포내 칼슘의 농도를 이노시톨 폴리포스페이트 유도체로 처치된 세포에서 측정하였다. 도 4에서 도시된 바와 같이, Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM은 세포내 칼슘 또는 탑시가르긴에 반응하는 칼슘을 상승시키지 않았다. 테스트된 화합물의 어떤 것도 그 자체로 세포내 칼슘 수준을 변화시키지 않았고 카르바콜 또는 탑시가르긴(thapsigargin)으로 자극시킨 세포내 칼슘의 수준을 변경시켰다. 따라서, 염소 이온의 분비에 대한 이노시톨 폴리포스페이트의 효과는 세포 내 칼슘 농도에 대한 효과에 기인한 것이 아니다.

이들 결과는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체가 1,2-Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM으로 세포를 치료하는데 기인하여 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시켜서 이들 세포에서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 촉진시켜서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 저해를 반전한다는 것을 보여준다. 반대로, 입체 이성체 Ins(1,4,5,6)P₄의 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄에 의해서 중재된 염소 이온의 분비의 저해에 영향을 미치지 않는다. 따라서, Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로서 작용한다.

실시예 IV

Ins(3,4,5,6)P ₄ 의 길항제를 사용한 카르바콜-중재된 염소 이온의 분비의 저해의 반전

본 실시예는 카르바콜-중재된 염소 이온 분비의 저해가 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용하는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체에 의해서 반전될 수 있다는 것을 보여준다.

상기 실시예 III에서, 세포내 Ins(3,4,5,6)P₄은 Ins(3,4,5,6)P₄를 생성하는 내재성(endogenous) 에스테라제에 의해서 가수분해되는 세포투과성인 Bt₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM의 첨가에 의해서 증가되었다. 본 실시예에서, 세포내 Ins(3,4,5,6)P₄은 세포를 카르바콜로 장기 치료하는 것으로 증가된다.

T₈₄결장의 상피세포는 D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 1-Bu-2-Bt-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, Bu₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 3-Bt-2-Bu-Ins(1,4,5,6)P₄/AM , Bu₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM, 1-Bt-2-Bu-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 또는 3-Bu-2-Bt-Ins(1,4, 5,6)P₄/AM으로 세포를 처리하였고 단락 전류를 측정하였다.

일종의 세포를 이노시톨 폴리포스페이트 유도체로 30분 동안 예비배양시켰다. 다른 2종의 세포를 담체만으로 예비배양시켰다. I_sc의 측정은 0 시간에서 개시하였다. 5분에서, 카르바콜(10^-4 M)을 담체만으로 예비배양시킨 일종의 세포에 첨가하고 (도 5의 "카르바콜"로 설정됨) 이 일종의 세포를 이노시톨 폴리포스페이트 유도체로 예비배양시켰다 (도 5A의 "카르바콜 + D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM"로 설정됨). 30분에, 1μM 탑시가르긴을 첨가하였다. 데이터는 n=4 내지 6 실험에 대해서 수집하였다.

도 5A는 D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM을 사용한 실험을 도시한다. 카르바콜을 첨가하는 것은 Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체로 예비배양된 세포 및 카르바콜 단독으로 처리된 세포에서 단락 회로의 일시적 증가를 유도하였다. 30분에, ΔI_sc의 대조군 수준의 회귀 이후, 탑시가르긴 1 μM을 세포내 칼슘의 증가를 자극하기 위해 첨가하였다. ΔI_sc에서 예정된 증가를 대조군의 세포로 처리된 탑시가르긴으로 관찰하였으나, ΔI_sc는 카르바콜로 장기간 처리를 받은 세포에서 약화되었다. D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM로 예비처리하는 것은 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 카르바콜의 저해 효과를 반전시켰다. 따라서, D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM은 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용한다.

도 5에 도시된 바와 같이, Ins(3,4,5,6)P₄유도체인 D,L-1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄/AM, 1-Bu-2-Bt-Ins(3,4,5,6)P₄/AM 및 Bu₂-Ins(3,4,5,6)P₄/AM는 탑시가르긴에 의해서 자극된 염소 이온의 분비의 카르바콜-중재된 저해를 반전한 것으로, 이들 Ins(3,4,5,6)P₄유도체가 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로서 작용한다는 것을 나타낸다. 반대로, 3-Bt-2-Bu-Ins(1,4,5,6)P₄/AM, 2,3-Bu₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 및 3-Bu-2-Bt-Ins(1,4,5,6)P₄/AM 뿐 아니라 1-Bt-2-Bu-Ins(3,4,5,6)P₄/AM은 탑시가르긴에 의해 자극된 카르바콜-중재된 염소 이온의 분비의 저해를 반전시키지 않았다(각각 도 5D 내지 5G).

이들 결과는 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포투과성 유도체가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대한 카르바콜로 장기간 처리하는 저해 효과를 반전시키고, 따라서 Ins(3,4,5,6)P₄의 길항제로 작용한다는 것을 보여준다.

실시예 V

세포내 Ins(1,3,4)P ₃ 수치의 상승이 Ins(3,4,5,6)P ₄ 을 증가시키고, 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 감소시킨다.

본 실시예는 Ins(1,3,4)P₃/AM의 세포투과성 유도체로 세포를 처리하는 것이 Ins(3,4,5,6)P₄를 증가하여 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 보여준다.

약 30종의 이노시톨 폴리포스페이트를 세포 내에서 확인하였다. Ins(1,4,5,6)P₄는 5'이노시톨 폴리포스페이트 포스파타제에 의해서 Ins(1,3,4)P₄로 전환된다. 실험실내의 분석 시스템에서, Ins(1,3,4)P₃는 Ins(3,4,5,6)P₄이 Ins(1,3,4,5,6)P₅/AM으로 전환되는 것을 촉매하는 이노시톨 1 키나제를 저해한다 (본 명세서에서 인용 참증으로 원용되는 Tan et al., J. Biol. Chem. 272: 2285 (1997)).

세포투과성 유도체인 D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM을 합성하였다. 결장의 상피의 T₈₄세포를 D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM 400 μM로 30분간 예비배양시킨 후 Ussing 챔버에서 고정시켜 ΔI_sc를 측정하였다. 10분에, 카르바콜(10^-4 M)을 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 일시 자극하기 위해서 첨가하였다. 쌍을 이루지 않은 2 면 스튜던트 t-테스트에서 p<0.04로 8회의 실험의 평균으로 자료를 얻었다.

D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM 400μM와 세포를 배양한 경우, (³H)-이노시톨로 표지시킨 세포에서 측정된 Ins(3,4,5,6)P₄가 3배 증가하였는데, 이는 Ins(1,3,4)P₃가 생체 내에서 Ins(3,4,5,6)P₄/AM를 증가시켰다는 것을 가리킨다. 담체로 예비배양시킨 대조군의 세포는 15.2±2.8의 피크 ΔT_sc를 가진다. D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM로 예비배양시킨 세포는 7.9±1.6의 피크 ΔT_sc를 가진다. 따라서, 칼슘-중재된 염소 이온의 분비가 D,L-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM의 세포투과성 유도체로 세포를 처리하여 약 50%정도 감소되었다.

이 결과는 세포투과성 Ins(1,3,4)P₃유도체가 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시켜서 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 감소를 초래하여 Ins(3,4,5,6)P₄의 작용제로 작용한다는 것을 보여준다.

실시예 VI

Salmonella 에 의한 인간 결장의 상피세포의 감염이 세포내 Ins(1,4,5,6)P ₄ 의 농도를 증가시킴.

감염성 장 박테리아는 아래의 점막에 침투하도록 장의 상피를 들어가고 통과하여 전신적 감염을 개시한다. 상피세포의 Salmonella 침입이 이노시톨 폴리포스페이트 턴오버(turnover)의 증가를 초래한다는 것을 보여주는 이전의 연구가 이노시톨 폴리포스페이트가 박테리아 감염에 대한 상피세포의 반응에 역할을 할 수 있 다는 것을 나타냈다 (Ruschkowski et al., FEMS Microbiol. Lett. 74:121(1992)). 박테리아 감염에 의한 이노시톨 폴리포스페이트의 변화의 특징을 규명하기 위해서, 결장 상피세포에 박테리아의 감염 효과를 조사하였다.

6개의 웰 플레이트에서 합류된 결장 상피의 T₈₄세포를 4일 동안 이노시톨이 없는 50% 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium) 및 투석된 새로 태어난 송아지 혈청 5%로 보충된 50% Ham's F12 배지에서 (³H)-이노시톨의 50 μCi/웰로 배양시켰다. 배양물을 미리 가열된 매질(50% DME, 50% Ham's F12 및 1 ㎎/㎖ 소의 혈청 알부민)로 3회 세척하고 여러 시기 동안 동일한 배지에서 5×10⁸ 박테리아/웰로 접종시켰다. 배양물울 얼음으로 냉각한 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 2회 소독하고 10% 트리클로로아세트산 및 10 mM 피틱산에서 5분 동안 얼음으로 동결시켰다. 추출물은 FREON/알라민을 사용하여 중화시키고 Adsorbosphere SAX 컬럼에서 분석하여 (³H)-이노시톨 폴리포스페이트를 분리하였다. 방사활성(radioactive) 피크는 온라인 방사활성의 검출기를 장착한 HPLC를 사용하여 이전에 설명한 바와 같이 정량하였다 (Kachintorn et al., 동일 논문, 1993). HPLC 상에서 분해되지 않은 거울상 이성체를 정량하기 위해서 (³H)-Ins(3,4,5,6)P₄ 및 Ins(1,4,5,6)P₄에 해당하는 피크는 HPLC에 의해서 모든 다른 (³H)-InsP₄ 이성체로부터 분리하고, 탈염화시킨 후 이전에 설명한 바와 같이 (³²P)- 표지된 Ins(1,4,5,6)P₄으로 부분적으로 정제된 Ins(1,4,5,6)P₄3-키나제로 배양시켰다 (Vajanaphanich et al., 동일 논문, 1994). 형성된 (³H)- 및 (³²P)-표지된 Ins(1,3,4,5,6)P₅의 상대적인 함량을 비교하여 원래의 피크에서 (³H)-Ins(3,4,5,6)P₄대 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄의 비율을 결정하였다.

T₈₄세포의 단일층을 (³H)-이노시톨로 표지하고 Salmonella dublin으로 다양한 기간동안 감염시켰다. 감염 직후 60분 동안, myo-이노시톨 헥사키스포스페이트(InsO₆) 또는 포스포리파제 C가 활성화되는 경우 통상적으로 축적하는 Ins(1,4,5)P₃와 같은 상이한 이노시톨 폴리포스페이트의 수준에 현저한 변화는 없었다. 반면에, 분석하지 않은 거울상 이성체인 (³H)-Ins(3,4,5,6)P₄ 및 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄의 농도는 S. dublin으로 감염후 10분내에 증가되었다. 이 피크의 약 85%가 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄에 해당하였다. 감염후 30-40분에, 감염되지 않은 세포의 대조군에 대해서 최대 14배 증가하였다. (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄의 레벨이 40분 후 서서히 감소되었고 감염후 3시간에 기저선까지 회귀되었다 (표 IV 참조). 다른 인간 장의 상피세포주인 LS174T를 사용하여 유사한 관찰이 제공되었다. (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄는 S. dublin 감염 후 11.3배 증가하는 것으로, 감염 후 세포의 이노시톨 폴리포스페이트의 변화가 상피 세포의 일반적인 반응을 나타낸다는 것을 지적하였다.

다른 감염성 Salmonella 균주인 Salmonella typhi BRD 691로 T₈₄세포를 감염하는 것도 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄수준을 증가시켰다(표 IV 참조). 반대로, 통상 상피세포에 부착되지만 이를 감염시키지는 않는 S. doblin의 돌연변이 균주인 SB133는 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄수준을 최소로 증가시키는 것으로, Salmonella에 의한 호스트 세포의 감염이 이 반응을 위해서 요구된다는 것을 나타낸다. 그러나 Shigella Flexneri, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica 및 장내감염성 Escherichia coli(serotype O29:NM)을 포함하는 여러 가지 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 T₈₄세포의 감염은 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄ 수준에서 소폭의 증가만을 가져오기 때문에 박테리아 감염만은 Ins(1,4,5,6)P₄ 수준을 증가시키기에 충분하지 않았다. 또한, 장내 출혈성 E. coli(serotype O157) 또는 비병인성 E. coli(DH5α)와 같은 비감염성 그람음성 박테리아를 T₈₄단일층에 첨가하는 것은 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄ 수준에 영향이 거의 없다. 10㎍/㎖ 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS)의 첨가는 (³H)-Ins(1,4,5,6)P₄수준에서 효과가 없었다.

표 4

상피세포의 Salmonella 감염후의 Ins(1,4,5,6)P₄ 수준의 증가

첨가된 박테리아	경과 시간	(³H)-Ins(1,4,5,6)P₄ 수준 (감염된/대조군의 비)	n
Salmonella dublin 세포주	30	13.9±0.8	4
Salmonella dublin 세포주	60	10.3±1.3	5
Salmonella dublin 세포주	120	3.6	2
Salmonella dublin 세포주	180	1.9	2
Salmonella typhi BRD 691 세포주	30	10.5	2
Salmonella dublin 세포주	30	1.9±0.1	3
Shigella flexneri	60	1.9	2
Shigella dysenteriae	60	2.3	2
Yersinia enterocolitica	60	2.6±0.1	3
Escherichia coli 029:NM	60	2.0±0.1	5
Escherichia coli O157	60	2.3±0.2	4
Escherichia coli DH5α	60	2.1±0.2	4
LPS	60	1.0	2

결과는 결장의 상피세포의 Salmonella에 의한 감염은 Ins(3,4,5,6)P₄의 세포내 농도를 증가시킨다는 것을 보여준다. 촉진된 염소 이온 분비는 분비성 설사, Salmonella 감염의 병증을 유발하는 것으로 Ins(3,4,5,6)P₄ 농도와 상관도를 제안한다.

실시예 VII

Ins(1,4,5,6)P ₄ 는 EGF-유도된 염소 이온의 분비의 저해를 반전한다.

본 실시예는 세포투과성 Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체로 세포를 배양하여 Ins(1,4,5,6)P₄의 세포 내 농도를 증가시키는 것이 상피의 성장인자(EGF)로 유도된 염소 이온의 분비의 저해를 반전시킨다는 것을 나타내는 것이다.

상기 실시예 III 및 IV에서, Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체는 Ins(3,4,5,6)P₄-중재된 염소 이온의 분비의 저해에 영향을 미치지 않았다. Ins(1,4,5,6)P₄이 EGF 유도된 염소 이온의 분비의 저해에 영향을 미치는지를 실험하기 위해서, T₈₄세포 단일층은 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM으로 30분간 예비 배양시켰다. ΔT_sc의 측정을 개시하고(실시예 I 참조), 측정 5분 후, 16.3 nM EGF를 세포의 기저외측(基底外側; basolateral) 표면에 첨가하였다. 추가 15분 배양 후, 100μM 카르바콜을 세포 내 칼슘 농도를 급격하게 상승하기 위해서 첨가하였다. 대조군은 카르바콜에 의해서 자극되었지만 EGF로 전처리시키지 않았다. 데이터는 대표적인 실험(3번의 실험값의 총합)에서 2회 측정의 평균이다.

도 6 및 도7(면 a 및 b)에서 도시되는 바와 같이, EGF는 카르바콜 자극된 염소 이온의 분비를 저해하였다. 내재성 세포 에스테라제에 의해서 Ins(1,4,5,6)P₄로 가수분해되는 세포투과성 유도체인 Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM으로 예비배양하는 것은 EGF 유도된 염소 이온의 분비의 저해를 현저하게 반전시킨다. 반대로, EGF의 저해 작용은 Ins(1,3,4,5,6)P₅의 세포투과성 유도체의 첨가에 의해서 완화되지 않았다 (도 7, 패널C). Ins(1,4,5,6)P₄의 거울상 이성체인 세포투과성 Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체를 첨가하는 것은 염소 이온의 분비에 대한 EGF 저해 작용을 완화시키지 않았다. Bt₂-Ins(1,4,5,6)P₄/AM을 첨가한 것은 사이클릭 AMP-중재된 염소 이온의 분비의 EGF 저해를 반전시키지 않은 것으로, Ins(1,4,5,6)P₄의 작용이 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에 대해서 특이적이라는 것을 나타낸다.

이들 결과는 세포투과성과 같이, 세포로 전달되는 Ins(1,4,5,6)P₄의 증가된 수준이 EGF-중재된 염소 이온의 분비의 저해를 역전시켜 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 촉진한다는 것을 설명한다.

실시예 VIII

Ins(1,4,5,6)P ₄ 은 칼슘-중재된 염소 이온의 분비에서 PtdInsP ₃ 의 저해를 역전한다.

본 실시예는 PtdInsP₃의 세포투과성 유도체가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 보여준다. 세포투과성 Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체는 염소 이온의 분비에서 PtdInsP₃-중재된 저해를 역전시킨다.

T₈₄ 세포 단일층을 PtdInsP₃/AM으로 30분간 예비배양시키고 ΔT_sc을 측정하였다. 도 8에서 도시된 바와 같이, PtdInsP₃/AM의 농도를 증가시키는 것이 카르바콜-자극된 염소 이온의 분비를 저해하고, Ins(3,4,5,6)P₄과는 다른 이노시톨 폴리포스페이트가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 지시한다.

부가적인 3-키나제 산물 PtdInsP₃의세포투과성 유도체를 합성하였고 염소 이온의 분비에 대한 효과를 검사하였다. 세포를 diC₁₆-Bt-PtdInsP₃/AM 또는 diC₈- Bt-PtdInsP₃/AM으로 예비배양시켜 실시예 VII에 설명한 바와 같이 측정하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, diC₁₆-Bt-PtdInsP₃/AM으로 T₈₄ 세포를 예비처리하는 것은(도 7d) 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 74%까지 저해시켰다. 유사하게 diC₈-Bt-PtdInsP₃/AM은 79%까지 염소 이온의 분비를 저해하였다. 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 저해는 세포가 PtdInsP₃로 예비처리하는 경우 관찰되지 않았고 이는 세포로 들어가지 않은 것으로 보인다. 이들 PtdInsP₃의 세포투과성 유도체는 카르바콜 자극 후 칼슘 수준에 대한 영향은 없었다. PtdInsP₃의유도체에서 관찰된 저해의 수준은 세포의 EGF 치료에서 관찰되는 것과 비교할 만하였다. 또한, 세포투과성 PtdInsP₃의 유도체로 예비배양시킨 단일층으로 EGF를 첨가하는 것은 칼슘-중재된 염소 이온의 분비의 추가적인 저해를 초래하지 않은 것으로, PtdInsP₃와 EGF가 동일한 메커니즘을 통해 반응한다는 것을 나타낸다.

T₈₄세포는 Ins(1,4,5,6)P₄가 PtdInsP₃-중재된 염소 이온의 분비의 저해를 반전시킬 수 있는지를 판단하기 위해서 세포투과성 Ins(1,4,5,6)P₄ 유도체로 미리 배양시켰다.

결과는 PtdInsP₃가 칼슘-중재된 염소 이온의 분비를 저해한다는 것을 지시한다. 또한 Ins(1,4,5,6)P₄가 PtdInsP₃에 의한 칼슘-중재된 염소 이온의 분비 저해를 반전시킨다.

실시예 IX

인간 비강 상피에서 염소 이온의 이동

본 실시예는 호흡기 상피에서 염소 이온의 분비를 변화하는 화합물의 효능을 검사하기 위한 모델로서 유용한 인간 비강 상피세포 시스템을 제공한다.

인간 비강 상피는 생체검사에 의해서 획득하였다. 단일층에서 생체전기 및 칼슘 측정에서, 인간 비강 상피세포를 O-링에 첨부되는 다공성의 Transwell Coll 여과기(공극 지름 : 0.4㎛ ; Costar)에 위치시키고, 파종후 5-7일간 최대 경피성 잠재적 차이의 발달과 동일하게 되는 시간을 연구하였다. 세포는 인슐린(10 ㎍/㎖), 트렌스페린(5 ㎍/㎖), 상피세포 성장 보충물(3.75 ㎍/㎖), 하이드로코티손(5nM), 상피세포 성장 보충물(3.75 ㎍/㎖), 트리아이오도티로닌(30 nM) 및 1mM CaCl₂로 보충된 혈청이 없는 Hams' F12 배지에서 유지시켰다. 인간의 비강 상피 단일층을 축소형 Ussing 챔버에서 접종후 5-7일간 고정시켰다.

경피의 전위차를 Voltage-Clamp/Pulse 발생기(Physiologic Instruments, 캘리포니아 센디에고)에 의해서 검사하고, 생물전기(bioelectrics)를 2개의 채널 기록기에서 기록하였다. 단일층을 나트륨 없는 링거액에 노출시켜 경피의 염소 저항의 변화를 산출하였고, 원래의 나트륨 흡수성 상태에서 염소 이온 분비 상태까지의 변화량을 측정하였다. 세포내 칼슘 측정에서, 단일층을 Fura-2에 부가시켜 마이크로플루오리메터(microfluorimeter)와 결합된 현미경의 대물로 고정시켰다. 형광 강도비를 30-40 세포의 필드에서 또는 단일 세포에서 수집하였다. 세포내 칼슘 수준에 대한 ΔI_sc은 각 제조에서 정상화한다. 결과가 실재 단일층에 대한 반응을 반영하는지 확인하기 위해서, 단일층을 주기적으로 고정하고 단면의 시편으로 실험하였다.

인간의 비강 상피세포는 실시예 III, IV, VII 및 VIII에서 설명한 바와 같이 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의 길항제로 처리하는데 유용하다. 인간의 비강 상피에서 염소 이온의 분비를 자극하는데 효과적인 화합물은 폐의 기능부전과 같은 낭포성 섬유증의 증상을 완화하는 우수한 후보자이다.

실시예 X

CFTR ^- T ₈₄ 세포의 발생

본 실시예는 낭포성 섬유증의 모델로 유용한 CFTR^- T₈₄세포를 제조하는 방법을 제공한다.

Ins(3,4,5,6)P₄ 유도체를 검색하고, 궁극적으로 CFTR이 Ins(3,4,5,6)P₄-중재된 염소 이온의 분비를 저해하는 인자의 발현을 조절하는지 판단하기 위해서, CFTR^- T₈₄세포를 발생시켰다.

T₈₄세포에서 CFTR 유전자를 마우스의 배간 세포 (ES 세포)에서 유전자 넉아웃 돌연변이를 발생하도록 발육시키는 이중 선택 접근법으로 비활성화시켰다 (본 명세서에 참고문헌으로 인용되는 Mansour et al., Nature 336:348 (1988)). 돌연변이 유발성의 CFTR 유전자 표적 구조물이 pSSC-9 벡터에서 발생한다 (본 명세서에 참고문헌으로 인용되는 Chauhan와 Gottesman, Gene 120:281 (1992) 참조). 이 벡터는 네오마이신 저항성 유전자를 운반하는 것으로 티미딘 키나제 촉진제에 의해서 운전되는 것으로 hsv-tk 유전자의 양측에 위치한다. 또한 pSSC-9는 유전자 표적 자리를 삽입하는데 사용될 수 있는 유전자의 양측의 편리한 콜론 자리 및 직선상의 돌연변이 유발 카세트를 절개하는데 사용할 수 있는 2개의 Sfil 제한 자리를 운반한다. G418에 저항하여 네오마이신 유전자의 발현을 선택하는 것은 안정하게 트렙스펙트된 클론을 검색하도록 한다. hsv-tk 발현에 대한 선택은 사이클로비어(cyclovir)를 사용하여 표적된 자리로 동종 재조합으로 통합되는 구조인 클론을 익스팬드(expand)한다 (Mansour et al., 동일 논문, 1988). CFTR 유전자의 8.5 kb. 단편(TE 2611E8.5 엑손 21을 함유)을 CFTR 유전자 서열의 소스로 사용한다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Rommen wt al., Science 245:1059 (1989); 및 Rommens et al., Am. J. Hum. Genet. 45:932(1989)). 또한, 폴리머라제 체인 반응(PCR)을 T₈₄세포에서 적당한 서열의 클론에 직접 사용할 수 있다. CFTR 유전자 서열을 증폭하기 위한 여러가지 PCR 프라이머가 개시되어 있다 (본 명세서의 참조문헌으로 인용되는 Zielinski et al., Gnomics 10:214 (1991)). 적어도 2-4 kb 길이의 단편이 동족의 재조합을 위한 유사한 서열을 충분히 보장하기 위해서 증폭될 것이다. PCR 프라이머는 pSSC-9 클론 자리와 상용성인 제한 자리 익스펜션을 운반 한다.

돌연변이 구조물은 DNA 트렌스펙션 방법, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 또는 전기적 포레이션-계통의 프로토콜을 사용하여 T₈₄세포로 트렌스펙션된다 (본 명세서에서 참조문헌으로 인용되는 Molecular Biology, A Laboratory Manual, 2판, Sambrook et al., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory, Press, Plainview, NY (1989). 안정한 트렌스펙션자는 G418을 사용하여 익스펜드되고 사이클로비어를 사용하여 2차로 선택한다. 저항 클론은 벡터의 동족 재조합에 의해서 CFTR 군집으로 운전되는 것으로 G418의 증가량을 사용하여 선택을 실행한다. 이러한 접근은 마우스에서 ES 세포를 사용하여 이중 넉아웃 돌연변이의 발생을 실행하도록 추가의 선택 단계를 세포주에서 동족의 돌연변이의 선택에 적용할 수 있다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Chen etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4528 (1993)); 및 Mortenson, Hypertension 22:646 (1993)). 선택된 클론은 서던 블롯 및 PCR 분석법으로 분석하여 네오 카세트가 CFTR 유전자에 삽입되었다는 것을 검증한다.

"이중 구조 방법"은 2개의 다른 돌연발이 유발 구조물을 사용하여 표적 유전자의 돌연변이 발생이 서열에 의해서 실행되어 선택적으로 사용할 수 있다 (본 명세서에 인용참증으로 인용되는 Mortenson, 동일 논문, 1993; Feldhaus et al., EMBO J. 12: 2763 (1992); 및 Porter 및 Itshaki Eur. J. Bioche. 218:273(1993)). 이들 구조물은 네오 유전자 또는 gpt 유전자 카세트를 운반하여 서열적 트렌스펙션 및 마이코페놀산(mycophenolic acid)과 크산틴을 사용하여 gpt 유전자의 선택 및 G418로 네오 유전자를 선택하도록 한다. T₈₄ 세포의 이중 넉아웃 CFTR 돌연변이는 Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제의 효능을 검사하는데 사용한다.

이들 결과는 낭포성 섬유증의 모델로 사용할 수 있는 T₈₄세포의 CFTR^-돌연변이의 발생을 설명한다. 이들 세포는 낭포성 섬유증 환자의 상피세포에서 발견되는 것과 유사한 유전적 배경을 제공한다. Ins(3,4,5,6)P₄ 및 PtdInsP₃의길항제는 낭포성 섬유증 환자에서 염소 이온의 분비를 촉진하는 우수한 후보자이다.

실시예 XI

세포투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 제조

본 실시예는 세포 투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체를 개시한다.

일정한 세포투과성 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 합성 반응은 이미 개시되어 있다 (Roemer et al. 동일 논문, 1996; 및 Roemer et al., 동일 논문, 1995).

추가적인 이노시톨 폴리포스페이트 유도체의 합성 반응은 이하에 개시되어 있다. 도 9는 세포투과성 PtdInsP₃ 및 diC₁₆-Bt-PtdInsP₃/AM의 구조체를 도시한다. 도 10은 PtdInsP₃/AM의 유도체의 개략적인 합성을 도시한다. 도 11은 1,2-사이클로헥실리덴-Ins(3,4,5,6)P₄//AM의 개략적인 합성을 도시한다. 도 12는 myo-이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 및 2,5,6-Bt₃-Ins(1,3,4)P₃/AM의 구조를 도시한다. 화합물 의 D-배열만을 도시하였다. 도 13은 세포투과성 이노시톨 폴리포스페이트의 합성의 개략도를 도시한다. 도 13에서, 다음의 조건을 사용하였다: (i)Bt₂O, DMAP, pyr.; (ii) TFA, CH₃CN/H₂O; (iii) Bu₂SnO, 톨루엔, refl., b BnBr, CsF, DMF; (iv) Bt₂O, DMAP, pyr., v Pd/C(10%), AcOH; (vi) a (BnO)₂PNiPr₂, 테트라졸, CH₃CN, b AcOOOH, -40℃; (Vii) Pd/C(10%), AcOH; 및 (Viii)AMBr, DIEA, CH₃CN.

모든 반응 시약은 가장 순도 높은 것으로 선택하였다. 필요하면, 용매는 사용 전에 건조시키거나 및/또는 증류시켰다. 아세토니트릴은 디메틸포름아미드(DMF)에서와 같이, 포스포로스(V) 옥사이드로부터 증류시켰고 입자채 3Å으로 저장하였다. 피리딘 및 톨루엔은 입자채 4Å으로 저장하였다. 에틸-디이소프로필아민(DIEA)이 소디움 와이어 상에서 건조시켰다. 숯에 있는 팔라듐 및 트리플루오로아세트산은 Acros chemie사 제품이다. 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미다이트, 퍼아세트산 (32% v/w), 테트라졸 및 아세톡시메틸 브로마이드는 Aldrich사 제품이다. Milwaukee, Wisconsin 부티릭 무수물, DIEA 및 트리스(트리페닐포스핀)-로듐(I)-클로라이드는 Merck사 제품이다. 벤질 브로마이드, 알킬 브로마이드, 부틸, 아이다이드, 세슘 플로라이드 및 4-디메틸아미노 피리딘 (DMAP)은 Fluka사 제품이다. 이온 교환 수지 Dowex 50 WX 8, H⁺-형은 독일의 하이델베르그 소재의 Serva 사의 제품이다. 모든 기타 시약은 Riedel-de Haёn사 제품이다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 LDC/Milton Roy UV Monitor D(254 nm) 또는 Knaur 반사성 인덱스 검출기를 가진 LDC/Milton Roy Consta Metric III 펌프에서 실행하였다. 분석가능한 칼럼은 RP 18 물질(Merck, Lichrosrb; 10㎛)로 충진된 Merck Hibar 강철관(250 ㎜ × 4 ㎜)이다. 제조용 HPLC는 제조용 LDC UV III 모니터(254 nm) 또는 Knaur 반사성 인덱스 검출기를 가진 Shimadzu LC 8A 펌프 및 RP 18 물질(Merck, Lichrospher 100; 10㎛)로 충진된 Merck Prepbarr 강철관(25°㎜ × 50 ㎜)을 사용하여 실행하였다. 용출액은 메탄올-물 혼합물이고; 조성물은 % 메탄올(MeOH)로 주어졌다.

¹H-NMR 및 ³¹P-NMR 스펙트럼은 Brucker AM 360 AM 스펙트로메터에서 기록하였다. 화학적 전이(Chemical Shift)는 ¹H NMR 스펙트럼에서는 테트라메틸실란에 대해서, ³¹P NMR 스펙트럼에서는 외부 85% H₃PO₄에 대해서 ppm단위로 측정하였다. J-부피를 Hz로 얻었다. 메스 스펙트럼은 빠른 원자 충격(FAB) 이온화로 Finnigan Mat 822 매스 스펙트로메터로 기록하였다. 고해상도 질량은 10% 이상 차이가 나지 않는 질량을 가진 기지의 화합물에 대해서 결정하였다. 융점(MP)(수정되지 않음)은 Bucji B-540 장치를 사용하여 측정하였다. 광학적 회전율은 10cm 세포에서 Perkin-Elmer 1231 편광기를 가지고 나트륨 D-선에서 측정하였다. 팔라듐/숯 촉매의 한외여과는 재생된 셀룰로즈의 여과기(Sartorius SM 116 04, Sartorius Edgewood, 뉴욕)를 사용한 사토리우스 여과 장치로 실행하였다. 인자 분석은 Mikroanalytisches(독일 Gottingen의 Labor Beller)로 실행하였다.

D-1,4,5,6-테트라-O-벤질-myo-이노시톨 (ent-9) 및 D-3,4,5,6-테트라-O-벤질-myo-이노시톨 (9)은 이전에 설명한 바와 같이 합성하였다 (Roemer et al., 동일 논문, 1996) 화합물 rac-1,2-디-O-사이클로헥실리덴-myo-이노시톨은 Angyal 및 Tate 방법(본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Angyal 및 Tate, J.Chem. Soc. 1965:6949 (1965)에 의해서 합성하였다.

포스포릴레이션의 표준 공정

선택적으로 보호되는 myo-이노시톨 유도체 및 테트라졸은 아르곤 분위기 하에서 드라이 아세토니트릴에 용해시키고, 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미다이드가 첨가되었다. 실온에서 지시된 시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물은 -40℃까지 냉각되고 퍼아세트산(32% v/w; 포스포르아미다이트의 각 몰당량에 대해서 1몰 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 반응시킨 후, 용매를 감압하에서 제거하고 잔류 오일은 제조용 HPLC로 정제하여 바람직한 이노시톨 테트라키스포스페이트 유도체를 얻었다.

수소첨가분해에 의한 벤질 기를 제거하는 표준 공정

완전히 보호되는 myo-이노시톨 테트라키스포스페이트 또는 테트라벤질-이노시톨은 각각 아세트산에서 수소의 분위기 하에서 탄소의 팔라듐(10%; 벤질기의 각 몰의 0.1 몰 팔라듐)과 자기-제조 수소화 장치에서 지정된 시간동안 격렬하게 교반시켰다. 촉매를 한외여과에 의해서 제거하고 여과물을 동결건조시켜 해당 생성물을 얻었다.

아세톡시메틸 에스테르의 도입을 위한 표준 공정

완전히 건조된 이노시톨 테트라키스포스페이트 유도체(유리산)를 아르곤 분위기 하에서 드라이 아세토니트릴에서 현탁시킨 후, 드라이 DIEA(수산기 1 mol당 2.25 mol DIEA)를 첨가하였다. 혼합물을 실온의 암실에서 4일간 교반 후, 모든 휘발성 성분을 증발시키고, 조잔류물을 특정 용매로 제조용 HPLC에 의해서 정제하여 시럽 상의 테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르를 얻었다.

D-3,4,5,6-테트라-O 벤질 1 -O- 부틸- myo -이노시톨 (10)

드라이 9(250㎎, 463 μmol) 및 건조 디부틸틴 옥사이드(116 ㎎, 167μmol)를 18시간 동안 활성화시킨 입자체(molecular sieve)(3Å)를 가진 속실렛(Soxhlet) 장치에서 드라이 톨루엔(100 ㎖)으로 환류하여 건조시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압하에서 건조되도록 증발시켰다. CsF(140㎎, 926μmol)을 잔류 오일에 첨가하고 혼합물을 높은 진공하에서 유지시켰다. 잔류 시럽을 아르곤 분위기 하에서 건조 DMF(10 ㎖)에서 용해시켰고, 1-부티릴 아이오다이드(300 ㎕, 2.62mmol)를 첨가하였다. 용액을 48시간 교반한 후, HPLC 분석(90% MeOH; 1.5㎖/분; t_R=7.43분)은 더 이상의 반응이 없음을 보여주었다. 과잉의 1-부틸 아이오다이드 및 DMF를 높은 진공하에서 제거하였다. 조생성물을 제조용 HPLC(93%MeOH; 40㎖/분; t_R=22.30 분)에 의해서 크로마토그래피시켜 고체상의 화합물 10(175㎎, 74%)을 획득하였다. Mp: 75.4∼75.9 ℃(메탄올로부터).

D-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질 3 -O- 부틸- myo -이노시톨 (ent-10)

디올 ent-9의 유사한 반응 및 작업으로 화합물 ent-10을 얻었다. [α]²⁴ _D - 8.7°(c = CHCl₃에서 1.01). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 10에서 얻어진 데이터와 동일하엿다.

D-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-1 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (11)

10(178 ㎎, 298 μmol), 부티릭 무수물(210㎕, 596 μmol) 및 DMAP(38 ㎎, 30μmol)의 드라이 피리미딘(3 ㎖)의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 높은 진공하에서 증발시켜 오일을 얻었다. 잔류 피리딘을 옥탄으로 3회 증류시켜 제거하였다. 잔류물을 tert-부틸 메틸 에테르(10 ㎖)에 용해시켰고, 일단 포스페이트 버퍼(10 ㎖), 소디움 하이드로겐 카보네이트(10 ㎖), 소디움 하이드로겐 설페이트(10 ㎖), 다시 포스페이트 버퍼(10 ㎖), 및 식염수(10 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고 여과하였다. 용매를 증발시켜 순수한 화합물 11(194 ㎎, 98%)을 오일상으로 획득하였다.

D-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질-3 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (ent-11)

화합물 ent-10을 다른 거울상 이성체에 대해 상기 설명한 바와 같이 부티릴화시켜 화합물 ent-11을 얻었다. [α]²⁴ _D: +10.7°(c - CHCl₃에서 2.05). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 11의 데이터와 동일한 것이다.

D-1 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (12)

화합물 11(178 ㎎, 267 μmol)을 일반 공정에서 설명한 바와 같이 수소 분위기 하에서 탄소의 팔라듐(10%)을 수소화하여 동결건조한 후 고체상의 테트론 12 (81 ㎎, 99%)를 얻었다.

D-3 -O- 부틸-2 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (ent-12)

*완전하게 보호되는 화합물 ent-11과 유사한 반응 및 작업으로 테트론 ent-12를 얻었다. [α]²⁴ _D: - 26.6°(c = MeOH에서 0.76). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 12에서 얻어진 데이터와 동일한 것이다.

D-1 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 (디벤질) 포스페이트 (20)

테트롤 12(63 ㎎ 206 μmol) 및 테트라졸(174㎎, 2.47 mmol)의 아세토니트릴(2 ㎖) 용액을 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미다이트(834 ㎕, 2.47 mmol)로 18시간 동안 처리하고, 퍼아세트산으로 산화시키고 설명한 바와 같이 작업하였다. 제조용 HPLC(93% MeOH; 40㎖/분; t_R = 26.45 분)로 정제시켜 오일상의 화합물 20(165㎎, 60%)을 얻었다.

D-3 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스(디벤질) 포스페이트 (ent-20)

테트롤 ent-12를 포스피틸화시키고 화합물 20에서 설명한 바와 같이 산화시켜, 완전히 보호되는 포스페이트 ent-20을 얻었다. [α]²⁴ _D: +4.8°(c = CHCl₃에서 2.09). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 20에서 얻어진 데이터에 따른 것이었다.

D-1 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 포스페이트 (21)

화합물 20(160㎎, 118μmol)을 표준 공정에서 설명한 바와 같이 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화시켜 동결건조 후 고체상의 표제 화합물 21을 얻었다(73 ㎎, 99%).

MS: m/z(+ve 이온 FAB) 627 [(M + H)⁺, 4], 71[Bt⁺, 100].

MS: m/z(-ve 이온 FAB) 625 [(M - H⁺) 100].

D-3 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 (ent-21)

완전히 보호된 물질 ent-20과 유사한 반응으로 동결건조 후에 유리산 ent-21을 얻었다. [α]²⁴ _D: 4.1°(c = H₂O에서 0.78, pH 1.6). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 21에서 얻어진 데이터와 동일한 것이었다.

D-1 -O- 부틸- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 포스페이트 (5)

화합물 21(17㎎, 27μmol)을 1M KOH (260㎕)로 처리시켜 12.8 pH값을 조정ㅎ하였다. 용액은 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 반응 혼합물은 정제를 위해서 이온 교환 칼럼(Dowex 50 WX 8, Ht)에 직접 부여시켰다. 동결건조로 화합물 5(14 ㎖, 94%)를 얻었다.

D-3 -O- 부틸- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 (ent-5)

물질 ent-21의 부티릴기를 상기 설명된 동일한 방법으로 가수분해시켜 테트라키스포스페이트 ent-5을 얻었다 - [α]²⁴ _D: + 4.6°(c = H₂O에서 0.35, pH 1.6). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 5에서 얻어진 것과 동일한 것이었다.

D-1 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (1)

표준 공정에 설명한 바와 같이, DIEA (131 ㎕, 768 μmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드 (77㎕, 768 μmol)를 화합물 21(30㎎, 47 μmol)의 아세토니트릴 (2㎖)의 분산액에 첨가하였다. 제조용 HPLC (73% MeOH, 37.5 ㎖/분, t_R=19.30)에 의한 정제에 의해서 시럽상 화합물 1(31 ㎎, 55%)을 얻었다.

D-3 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (ent-1)

상기에서 설명한 바와 같이 포스페이트 ent-21를 알킬화하여 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 ent-1을 얻었다. [α]²⁴ _D: + 1.9°(c = 톨루엔에서 1.46). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 1에서 얻어진 것과 동일한 것이었다.

D-1 -O- 알킬-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질- myo -이노시톨 (13)

드라이 9(690 ㎎, 1.28 mmol) 및 드라이 디부틸틴 옥사이드(324 ㎎, 1.3 mmol)을 활성화 입자체(3Å)를 가진 속실렛 장치에서 20시간 동안 드라이 톨루엔으로 환류하에 가열시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에서 건조시키고 증류하였다. CsF(399 ㎎, 2.56 mol)를 잔류 오일에 첨가하였고 혼합물을 높은 진공 하에서 2시간 동안 유지시켰다. 잔류 시럽을 아르곤 분위기 하에서 드라이 DMF(10㎖)에서 용해시키고 1-알릴 아이오다이드(329㎕, 3.58mmol)를 첨가시켰다. 20시간 동안 용액을 교반한 후, HPLC 분석(95% MeOH; 1.5㎖/분; t_R=3.20분)은 추가의 반응이 없다는 것을 보여주었다. 과잉의 1-알릴 아이오다이드 및 DMF는 높은 진공으로 제거하였다. 조생성물을 제조용 HPLC(90% MeOH; 40㎖/분; t_R=26.15분)로 크로마토그래피시켜 고체상의 화합물 13(448 ㎎, 60%)을 얻었다.

D-3 -O- 알릴-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질- myo -이노시톨 (ent-13)

디올 ent-9의 작업과 유사한 반응으로 화합물 ent-13을 얻었다 - [α]²⁴ _D: + 3.9°(c = CHCl₃에서 0.82). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 13에서 얻어진 것과 동일한 것이다.

D-1 -O- 알릴-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 (14)

수산화나트륨(46㎎, 1.92 mmol)을 실온의 암실에서 드라이 DMF(5 ㎖) 중 화합물 13의 교반된 용액에 첨가하였다. 1-부틸 아이오다이드(306 ㎕, 2.68 mmol)를 첨가한 후 5시간 동안 혼합물을 교반하였다. 현탁액을 80℃에서 18시간 동안 교반 한 후 HPLC(95% MeOH; 1.5 ㎖/분; t_R = 7.35)로 생성물을 도시하였다. 과잉의 1-부틸 아이오다이드 및 DMF를 감압 하에서 증발시켰다. 혼합물을 이후 tert-부틸 메틸 에테르(40㎖)에 용해시키고 포스페이트 버퍼(20㎖), 수성 소디움 디티오네이트(20㎖) 및 소금물(20㎖)에 계속적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과하고 에테르를 증발시켜 오일상으로 남겼다. 조오일을 제조용 HPLC (93% MeOH; 40㎖/분; t_R = 37.10 분)으로 정제하여 표제 화합물 14(458㎎, 94%)을 오일상으로 얻었다.

D-3 -O- 알릴-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 (ent-14)

화합물 ent-13의 작업과 유사한 반응으로 화합물 ent-14를 얻었다. [α]²⁴ _D: - 1.6°(c = CHCl₃에서 1.87). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 14에서 얻어진 것이었다.

D-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 (15)

트리스(트리페닐포스핀)-로듐(I)-클로라이드(140㎎, 150μmol) 및 DIEA(25㎕, 140μmol)을 50% 에탄올(90㎖)이 있는 14(458㎎, 720μmol)의 현탁액에 첨가한 후, 현탁액을 7시간 동안 환류하에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 트리플루오로아세트산(7㎖)을 첨가하고, 용액을 추가의 24시간 동안 교반하였다. 이후 HPLC(90% MeOH; 1.5 ㎖/분; t_R = 4.03분)에서 출발물질이 나타나지 않았다. 물로 중성화시켰다. 2N NH₄OH 에탄올을 감압하에서 증발시켜 시럽을 얻었다. 이 시럽은 tert-부틸 메틸 에테르(40㎖)에 용해시키고 포스페이트 버퍼(20㎖) 및 식염수(20㎖)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고 여과하고 에테르를 증발시켜 오일을 얻었다. 조오일은 제조용 HPLC(92% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 27.40분)로 정제하여 고체상의 화합물 15(275 ㎎, 74%)을 얻었다.

C: 계산치 76.48, 실험치 76.52; H: 계산치 7.43, 실험치 7.40.

D-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 (ent-15)

디올 ent-15의 작업과 유사한 반응으로 화합물 ent-15를 얻었다. [α]²⁴ _D: + 24.9°(c = CHCl₃에서 1.00). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 15에서 얻어진 것이었다.

D-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2 -O- 부틸-1 -O- 부티릴 myo -이노시톨 (16)

드라이 피리딘(4㎖)에 있는 알콜 15(178㎎, 298 μmol)의 용액을 부티릭 무수물 (158㎕, 447μmol) 및 DMAP(38㎎, 29μmol)로 처리하고 실온에서 교반하였다. HPLC 분석(90% MeOH; 1.5 ㎖/분; t_R = 6.40분)에서 더 이상의 출발 물질이 없다는 것을 지시한 경우(18시간), 반응 혼합물을 감압하에서 증류하고 조오일을 얻었다. 잔류 피리딘을 제거하기 위해서, 오일을 옥탄에 용해시키고 3회 증발시켰다. 잔류물을 tert-부틸 메틸 에테르에 용해시키고 포스페이트 버퍼(10 ㎖), 소디움 하이드로겐 카보네이트(10㎖) 및 소디움 하이드로겐 설페이트(10㎖), 다시 포스페이트 버퍼(10㎖) 및 식염수(10㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고 여과하였다. 용매를 증발시켜 순수한 16(176 ㎎, 89%)을 얻었다.

D-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질-3 -O- 부틸-2 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (ent-16)

화합물 ent-15를 다른 거울상 이성체에 대해서 상기에서 설명한 바와 같이 부티릴화시켜 화합물 ent-16을 얻었다. -[α]²⁴ _D: + 15.9°(c = CHCl₃에서 1.10). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 16에서 얻어진 것에 일치하는 것이다.

D-2 -O- 부틸-1 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (17)

화합물 16(170㎎, 255μmol)을 표준 공정에 따라서 수소 분위기 하에서 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화시켜 동결건조 후 고체상의 테트롤 17(75㎎, 97%)을 얻었다.

D-2 -O- 부틸-3 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (ent-17)

완전하게 보호되는 화합물 ent-16의 작업과 유사한 반응으로 테트롤 ent-17을 얻었다. [α]²⁴ _D: - 40.5°(c = MeOH에서 1.00). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 17에서 얻어진 것과 동일한 것이었다.

D-2 -O- 부틸-1 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스(디벤질)포스페이트(22)

화합물 17(55㎎, 178μmol) 및 테트라졸(152㎎, 2.15mmol)의 아세토니트릴 (2㎖)의 용액을 22시간 동안 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미다이트(726㎕, 2.15 mmol) 처리하고, 퍼아세트산으로 산화시키고 상기에서 설명한 바와 같이 작업하였다. 제조용 HPLC(92% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 29.00분)에 의해 정제하여 오일상의 화합물 22를 얻었다.

D-2 -O- 부틸-3 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스(디벤질) 포스페이트 (ent-22)

화합물 ent-12를 포스피틸화시키고 화합물 22에 대해서 설명한 바와 같이 산화시켜서 완전히 보호된 포스페이트 ent-22를 얻었다. [α]²⁴ _D: + 3.1°(c = CHCl₃ 에서 1.10). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 22에서 얻어진 것과 동일하였다.

D-2 -O- 부틸-1 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 (23)

화합물 22(190㎎, 141μmol)을 표준 공정에서 설명한 바와 같이 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화시켜 동결건조 후 고체상의 표제 화합물 23(87㎎, 99%)을 수득하였다.

D-2 -O- 부틸-3 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 (ent-23)

완전하게 보호되는 물질 ent-23을 동일한 반응으로 동결건조 시킨 후 자유 유리산 ent-23을 얻었다. [α]²⁴ _D: - 9.7°(c = H₂O에서 1.00, pH 1.6). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 23에서 얻어진 데이터와 동일한 것이었다.

D-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 (6)

pH 값을 12.8로 조정하기 위해서 화합물 23(33 ㎎, 52μmol)을 1M KOH(453 ㎕)로 처리하였다. 용액을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얻어서 바로 이온 교환 칼럼으로 정제하였다. 동결건조시켜 화합물 6(27㎎, 93%)을 얻었다.

D-2 -O- 부틸- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 (ent-6)

물질 ent-23의 부티릴 기를 상기에서 설명한 방법과 동일하게 가수분해시켜 테트라키스포스페이트 ent-6을 얻었다. -[α]²⁴ _D: +1.6°(c = H₂O에서 0.60, pH 1.6). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 6에서 얻어진 데이터와 동일한 것이었다.

D-2 -O- 부틸-1 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스 (아세톡시메틸)에스테르 (2)

표준 공정에 설명한 바와 같이 DIEA(182 ㎎, 1.06 mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드 (107 ㎕, 1.06 mmol)를 화합물 23(37 ㎎, 59μmol)의 아세토니트릴(2㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 제조용 HPLC(72% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 21.12분)로 정제하여 시럽상의 화합물 2(33 ㎎, 46%)을 얻었다. [α]²⁴ _D: +1.1°(c = 톨루엔에서 1.07).

D-2 -O- 부틸-3 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스 포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (ent-2)

상기 설명한 바와 같이 포스페이트 ent 23의 알킬화로 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 ent-2를 얻었다. [α]²⁴ _D: 1.3°(c = 톨루엔에서 0.60). 스펙트럼 데이터는 거울상 이성체 2에서 얻어진 데이터와 동일한 것이었다.

D-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-1,2-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 (18)

실온에서, 수산화나트륨(13㎎, 522μmol)을 실온의 암실에서 드라이 DMF(3㎖)에서 9(94㎎, 174μmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1-부틸 아이오다이드(120㎕, 1.04 mmol)가 첨가된 후 5시간 동안 교반하였다. HPLC(95% MeOH; 1.5 ㎖/분; t_R = 7.26)에서 산물을 도시한 후 현탁액을 80℃에서 36시간 동안 교반 시켰다. 과잉의 1-부티릴 아이오다이드 및 DMF를 감압 하에서 증발시켰다. 혼합물을 이후 tert-부틸 메틸 에테르(30㎖)에 용해시키고 포스페이트 버퍼(10㎖), 수계 소디움 디티오네이트(10㎖) 및 식염수(10㎖)에 계속적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고 에테르를 증발시켜 오일상으로 남겼다. 조오일은 제조용 HPLC (95% MeOH; 40㎖/분; t_R = 27.24 분)로 정제하여 표제 화합물 18(100㎎, 88%)을 오일상으로 얻었다.

D-1,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2,3-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 (ent-18)

화합물 ent-9의 작업과 유사한 반응으로 화합물 ent-18을 얻었다. [α]²⁴ _D: 1.2°(c = CHCl₃에서 2.20). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 18에 대해서 얻어진 데이터와 동일하였다.

D-1,2-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 (19)

화합물 18(100㎎, 153μmol)을 표준 공정에서 설명한 바와 같이 수소 분위기 하에서 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화시켜서 동결건조 후에 고체상의 테트롤 19(40㎎, 92%)를 획득하였다. (에탄올로부터)

D-2,3-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 (ent-19)

완전하게 보호되는 화합물 ent-18의 작업과 유사한 반응으로 테트롤 ent-19를 얻었다. [α]²⁴ _D: - 18.9°(c = MeOH에서 1.36). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 19에서 얻어진 것과 동일한 것이었다.

D-1,2-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스(디벤질)포스페이트 (24)

화합물 19(40㎎, 137μmol) 및 테트라졸(115㎎, 1.64 mmol)의 아세토니트릴 (2㎖)의 용액을 디벤질 N,N-디이소프로필 포스포르아미다이트(552 ㎕, 1.64 mmol)로 18시간 동안 처리하고 퍼아세트산으로 산화하고 설명한 바와 같이 처리하였다. 제조용 HPLC(93% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 26.05분)에 의해 정제하여 오일상의 화합물 24(133㎎, 73%)을 얻었다.

D-2,3-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스 (디벤질) 포스페이트 (ent-24)

화합물 ent-19를 화합물 24에 대해서 상기에서 설명한 바와 같이 포스피틸화시키고 산화시켜 완전히 보호되는 포스페이트 ent-24를 얻었다. [α]²⁴ _D: +2.5°(c = CHCl₃에서 1.15). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 24에서 얻어진 것과 동일한 것이었다.

D-1,2-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 (7)

화합물 24(134 ㎎, 100 μmol)를 표준 공정에서 설명한 바와 같이 탄소의 팔라듐으로 수소화시켜 동결건조 후에 고체상의 표제 화합물 7(52 ㎎, 87%)을 얻었다. (C=H₂O에서 1.10, pH 1.6)

D-2,3-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 (ent-7)

완전하게 보호되는 화합물 ent-24의 작업과 유사한 반응으로 동결건조 후 유리산 ent-7을 얻었다. (c = H₂O에서 1.00, pH 1.6). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 7에서 얻어진 것과 동일하였다.

D-1,2-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (3)

*DIEA (187㎕, 1.00 mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(111㎕, 1.00 mmol)를 표준 공정에서 설명한 바와 같이 화합물 7(34 ㎎, 55μmol)의 아세토니트릴(2㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 제조용 HPLC(73% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 20.40분)로 정제하여 시럽상의 화합물 3(42 ㎎, 65%)을 얻었다.

D-2,3-디 -O- 부틸- myo -이노시톨 1,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (ent-3)

상기에서 설명한 바와 같이 포스페이트 ent-7의 알킬화로 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 ent-3을 얻었다. [α]²⁴ _D: + 2.5°(c = 톨루엔에서 1.10). 스펙트럼의 데이터는 거울상 이성체 3에서 얻어진 것과 동일하였다.

rac-1,2-디 -O- 사이클로헥실리덴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 (디벤질)포스페이트 (rac-26)

화합물 rac-25(130 ㎎, 200 μmol) 및 테트라졸 (350㎎, 5.00 mmol)의 아세토니트릴(6 ㎖)의 용액을 26시간 동안 디벤질 N,N-디이소프로필폴리포스포르아미다이트(1.68 ㎖, 5.00 mmol)로 처리하고 퍼아세트산으로 산화하여 설명한 바와 같이 작업하였다. 제조용 HPLC(93% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 22.35분)로 정제하여 오일상의 화합물 rac-26(306 ㎎, 47%)을 수득하였다.

rac-1,2-디 -O- 사이클로헥실리덴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 포스페이트 (rac-8) 에틸-디이소프로필아미노산염

rac-26(91 ㎎, 70 μmol)을 드라이 에탄올 (4 ㎖)에 용해시켜 드라이 에틸-디이소프로필아민(95㎕, 560μmol)을 첨가하고 이어서 탄소의(84㎎, 840μmol) 팔라듐(10%)으로 수소화하였다. 수소 분위기ㅍ하에서 용액을 실온에서 6일간 교반한 후, 촉매는 한외여과로 제거하였고 여과물은 동결건조시켜 표제 화합물 rac-8 (108 ㎎, 96%)을 얻었다.

rac-1,2-디 -O- 사이클로헥실리덴- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (rac-4)

DIEA (205㎕, 1.20 mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(120㎕, 1.20 mmol)를 표준 공정에서 설명한 바와 같이 화합물 rac-8(108 ㎎, 66 μmol)의 아세토니트릴 (2 ㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 제조용 HPLC(68% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 19.35분)로 정제하여 시럽상의 화합물 rac-4(50 ㎎, 65%)를 얻었다.

rac-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2-데옥시-2-아이오도-1 -O- (4-메톡시벤질)- myo -이노시톨 (rac-56)

드라이 rac-55 (rac-3,4,5,6-테트라-O-벤질-1-O-(4-메톡시벤질)-myo-이노시톨)(1.32 g, 2 mmol), 트리페닐포스핀(2.15 g, 8.2 mmol), 이미다졸(549 ㎎, 8.2 mmol) 및 아이오다인(1.52 g, 6 mmol)의 혼합물을 41시간 동안 드라이 톨루엔(100㎖)에서 환류 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 포화된 수계 중탄산 나트륨(100㎖)을 첨가하고 그 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 요오드를 분할하여 첨가하였다. 톨루엔 상에 요오드-착색이 남으면, 추가의 15분 동안 교반한다. 과잉의 요오드를 추가의 소디움 디티오나이트 수용액을 첨가하여 제거하였다. 유기 및 수상은 분리 깔때기로 분리하였고, 유기상은 식염수로 2회 세척하였다. 톨루엔 상을 Na₂SO₄로 건조하고 여과하였다. 혼합물을 증발하고 결정화하여 순수한 rac-56(1.01 g, 73%)을 수득하였다.

rac-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2-데옥시-1 -O- (4-메톡시벤질)- myo -이노시톨 (rac-57)

화합물 rac-56을 드라이 톨루엔 (150㎖)에 용해하고, AIBN (63 ㎎, 355 μmol) 및 n-Bu₃SnH (1.63 ㎖, 6.3 mmol)을 첨가하였다. 용액을 2시간 동안 아르곤 분위기 하에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고 포스페이트 버퍼(30㎖), 및 식염수(30㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고 여과하였다. 혼합물의 증류 및 결정화로 57 (692㎎, 76%)을 수득하였다. Mp.: 76.2-76.8℃(메탄올로부터).

rac-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-2-데옥시- myo -이노시톨 (58)

DDQ(367㎎, 1.62 mmol)를 rac-57(600 ㎎, 931μmol)의 소량의 물(5%)을 함유한 CH₂Cl₂(10㎖)의 용액에 첨가하였다. 이 현탁액을 실온에서 28분 동안 교반한 후 , HPLC (90% MeOH; 1.5 ㎖/분; t_R = 4.27분) 분석은 반응이 종결된 것을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에서 증발하여 제조용 HPLC(90% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 20.00분)로 정제하여 고상의 rac-58(232 ㎎, 48%)을 얻었다. Mp.:126.7℃(메탄올에서).

rac-3,4,5,6-테트라 -O- 벤질-1 -O- 부티릴-2-데옥시- myo -이노시톨 (rac-59)

rac-58(186㎎, 355μmol), 부티릭 무수물 (70㎕, 426μmol) 및 DMAP(12 ㎎, 10 μmol)의 드라이 피리미딘 (5㎖)의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 높은 진공에서 오일을 얻었다. 잔류 피리딘은 옥탄으로 3회 증류하여 제거하였다. 잔류물은 tert-부틸-메틸 에테르(30㎖)에 용해시켰고, 포스페이트 버퍼(20㎖), 중탄산나트륨 (20㎖), 소디움 하이드로겐 설페이트(20 ㎖), 다시 포스페이트 버퍼(20㎖) 및 식염수(20㎖)로 세척하였다. 유기층은 Na₂SO₄로 건조하고 여과하였다. 용매의 증발로 고상의 순수한 rac-59(196 ㎎, 94%)를 얻었다. Mp.:110.1-110.3℃ (메탄올로부터).

rac-1 -O- 부티릴-2-데옥시- myo -이노시톨 (rac-60)

화합물 rac-59(177㎎, 297μmol)를 표준 공정에서 설명한 바와 같이, 수소에서 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화시켜 동결건조 후 고체상의 테트롤 rac-60(68㎎, 98%)을 얻었다. Mp: 174.9 - 175.9 ℃(에탄올로부터).

rac-1 -O- 부티릴-2-데옥시- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스 (디벤질) 포스페이트 (rac-61)

테트롤 rac-60(44㎎, 190μmol) 및 테트라졸(160 ㎎, 2.28 mmol)의 아세토니트릴 (2 ㎖)의 용액을 36시간 동안 디벤질 N,N-디이소프로필폴리포스포르아미다이트(767 ㎕, 2.28 mmol)로 처리하고 퍼아세트산으로 산화시켜서 설명한 바와 같이 작업하였다. 제조용 HPLC (92% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 21.55분)로 정제하여서 오일상의 화합물 rac-61 (172 ㎎, 71%)을 얻었다.

rac-1 -O- 부티릴-2-데옥시- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 (rac-62)

화합물 rac-61(165 ㎎, 130 μmol)을 표준 공정에서 설명한 바와 같이 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화하여 동결건조 후 고체상의 표제 화합물 rac-62 (65 ㎎, 90%)을 얻었다.

rac-1 -O- 부티릴-2-데옥시- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르 (rac-51)

DIEA (201㎕, 1.19 mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(119㎕, 1.19 mmol)를 표준 공정에 설명한 바와 같이 화합물 rac-62 (37 ㎎, 66 μmol)의 아세토니트릴(2㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 제조용 HPLC(69% MeOH; 40.00 ㎖/분; t_R = 12.10분)로 정제하여서 시럽상의 화합물 rac-51 (31 ㎎, 50%)을 얻었다.

rac-2-데옥시- myo -이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 (rac-53)

화합물 62를 pH 12.8이 되도록 조정하기 위해서 1M KOH(260㎕)로 처리하였다. 용액을 실온에서 2일간 교반하였다. 반응 혼합물을 정제하기 위해 직접 이온 교환 칼럼(Dowex 50 WX8, H⁺)에 제공하였다. 동결건조시켜 화합물 rac-53을 수득하였다.

rac-1 -O- 벤질-6 -O- 부티릴-2,3,4,5-디 -O- 사이클로헥실리덴- myo -이노시톨 (rac-100)

rac-1-O-벤질-2,3,4,5-디-O-사이클로헥실리덴-myo-이노시톨 (200㎎, 465μmol), 부티릭 무수물 (144㎕, 571μmol) 및 DMAP(6 ㎎, 50 μmol)의 드라이 피리미딘 (3 ㎖)의 용액을 실온에서 36시간 동안 교반하였다. 용매를 높은 진공 하에서 증발시켜 오일을 얻었다. 잔류 피리딘은 옥탄으로 3회 증류하여 제거하였다. 잔류물은 tert-부틸-메틸 에테르(40㎖)에 용해하였고, 포스페이트 버퍼(20㎖), 소디움 하이드라이드 카보네이트 (20㎖), 소디움 하이드로겐 설페이트(20 ㎖), 다시 포스페이트 버퍼(20㎖) 및 식염수(20㎖)로 세척하였다. 유기층은 Na₂SO₄로 건조하고 여과하였다. 용매의 증발로 오일상의 순수한 rac-100(186 ㎎, 80%)을 얻었다.

rac-1 -O- 벤질-6 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (rac-101)

rac-100(186 ㎎, 372 μmol)의 CH₃CN/H₂O(100:1, 8㎖)의 용액을 실온에서 2시간 동안 트리플루오로아세트산(4 ㎖)으로 교반하였다. 용매를 높은 진공에서 증발하여서 오일상의 표제 화합물 rac-101(125 ㎎, 98%)을 얻었다.

rac-1 -O- 벤질-6 -O- 부티릴- myo -이노시톨 2,3,4,5-테트라키스 (디벤질)포스페이트 (rac-102)

화합물 rac-101(145 ㎎, 426 μmol) 및 테트라졸 (358㎎, 5.11 mmol)의 아세토니트릴(3 ㎖)의 용액을 22시간 동안 디벤질 N,N-디이소프로필폴리포스포르아미다이트(1.72 ㎖, 5.11 mmol)로 처리하고 퍼아세트산으로 산화시켜서 설명한 바와 같이 작업하였다. 제조용 HPLC(94% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 22.40분)로 정제하여서 오일상의 화합물 rac-102(297 ㎎, 50%)을 수득하였다.

rac-6 -O- 부티릴- myo -이노시톨 2,3,4,5-테트라키스포스페이트 (rac-103)

화합물 rac-102(290 ㎎, 210 μmol)을 탄소의 팔라듐(10%)으로 수소화하여서 동결건조시켜 고체상의 표제 화합물 rac-103(119 ㎎, 99%)을 얻었다.

rac-1 -O- [1,2-디팔미토일-sn-글리세롤]-6 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 헥사키스(아세톡시메틸)에스테르 (rac-104)

DIEA (190㎕, 1.12mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(126㎕, 1.26 mmol)를 화합물 rac-103(40 ㎎, 70μmol)의 드라이 아세토니트릴(1.5㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 실온의 암실에서 3시간동안 혼합물을 교반한 다음, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤(20㎎, 35μmol)을 첨가하고 용액을 4℃ 암실에서 4일 동안 교반하였다. 용매 를 감압 하에서 증발시키고 조잔류물을 톨루엔으로 추출하여 시럽상의 표제 화합물 rac-104를 얻었다.

rac-1 -O- [1,2-디옥타노일-sn-글리세롤]-6 -O- 부티릴- myo -이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 헥사키스(아세톡시메틸)에스테르 (rac-105)

DIEA (136㎕, 800μmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(90㎕, 900 μmol)를 화합물 rac-103(28 ㎎, 50μmol)의 드라이 아세토니트릴(1.5㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 암실에서 실온으로 3시간 동안 혼합물을 교반한 다음, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤(23㎎, 70μmol)을 첨가하고 용액은 4℃ 암실에서 4일 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고 조잔류물을 톨루엔으로 추출하여 시럽상의 표제 화합물 rac-105를 얻었다.

재료 - 모든 반응 시약은 가장 순도 높은 것으로 선택하였다. 필요하면, 용매는 사용 전에 건조하거나 및/또는 증류하였다. 아세토니트릴은 디메틸포름아미드(DMF)와 같이 포스포로스(V) 옥사이드로부터 증류시켰고 입자채 3Å으로 저장시켰다. 피리딘 및 톨루엔은 입자채 4Å으로 저장하였다. 에틸-디이소프로필아민(DIEA)이 소디움 와이어 상에서 건조하였다. 숯에 있는 팔라듐 및 트리플루오로아세트산은 Acros chemie사 제품이다. 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미다이트, 퍼아세트산 (32% v/w), 테트라졸 및 아세톡시메틸 브로마이드는 Aldrich사 제품이다. 부티릭 무수물, DIEA는 Merck사 제품이다. Benzyl 브로마이드 세슘 플로라이드 및 4-디메틸아미노 피리딘 (DMAP)은 Fluka사 제품이다. 모든 기타 시약은 Riedel-de Haёn사 제품이다. rac-3,4-디-O-벤질-1,2-사이클로헥실리덴-myo-이노 시톨 (1)은 이전에 설명한 바와 같이 myo-이노시톨로부터 3 단계로 합성하였다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용하는 Angyal et al., J. Chem. Soc. 4116 (1961); Jiang 및 Baker Carbohydr. Chem. 5:615 (1986)). 모든 화합물은 라세믹이다.

3,4-디 -O- 벤질-5,6-디 -O- 부티릴-1,2-사이클로헥실리덴- myo -이노시톨 (152)

151(130㎎, 295 μmol), 부티릭 무수물 (193 ㎕, 1.18 mmol) 및 DMAP(40 ㎎, 33 μmol)의 드라이 피리미딘 (2 ㎖)의 용액을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 용매는 높은 진공에서 증발시켜서 오일을 얻었다. 잔류 피리딘은 옥탄으로 3회 증류하여 제거하였다. 잔류물을 tert-부틸-메틸 에테르(10 ㎖)에 용해시켰고, 포스페이트 버퍼(10 ㎖), 소디움 하이드로겐 카보네이트 (10 ㎖), 소디움 하이드로겐 설페이트(10 ㎖), 다시 포스페이트 버퍼(10 ㎖) 및 식염수(10 ㎖)로 세척하였다. 유기층은 Na₂SO₄로 건조시키고 여과하였다. 용매의 증발로 오일상의 순수한 152(171 ㎎, 98%)를 얻었다.

3,4-디 -O- 벤질-5,6-디 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (153)

152(166 ㎎, 286 μmol)의 CH₃CN/H₂O(100:1, 5 ㎖)의 용액을 실온에서 2시간 에서 트리플루오로아세트산(2 ㎖)으로 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 증발시켰고 생성물을 tert-부틸 메틸 에테르로 추출하였다. 유기층은 식염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조하고 여과하고 증발시켜서 오일상의 153(140 ㎎, 99%)을 얻었다.

1,3,4-트리 -O- 벤질-5,6-디 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (154)

드라이 153(143 ㎎, 286 μmol) 및 드라이 디부틸틴 옥사이드(71 ㎎, 300 μmol)를 4시간 동안 활성화된 입자채(3Å)를 가진 속실렛 장치에서 드라이 톨루엔(100 ㎖)으로 환류하여 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압하에서 건조되도록 증발시켰다. CsF(92㎎, 572 μmol)을 잔류오일에 첨가하고 혼합물을 높은 진공 하에서 2시간 동안 유지하였다. 잔류시럽을 아르곤 분위기 하에서 드라이 DMF(5 ㎖)에서 용해시켰고, 벤질 브로마이드(270 ㎕, 2.28 mmol)를 첨가하였다. 용액을 18시간 교반한 후, HPLC 분석(RP 18 물질(Merck, Lichrosrb; 10㎛)로 충진한 Merck Hibar 강철관(250 ㎜ × 4 ㎜) 분석 (95% MeOH; 1.5㎖/분; t_R=3.20 분)은 더 이상의 반응이 없음을 보여주었다. 과잉의 벤질 브로마이드 및 DMF를 높은 진공하에서 제거하였다. 조생성물을 제조용 HPLC (RP 18 물질(Merck, LiChrospher; 10㎛)로 충진된 Merck Prepbarr 강철관(250 ㎜ × 50 ㎜)(88% MeOH; 40㎖/분; t_R=17.20 분)에 의해서 크로마토그래피시켜서 고상의 화합물 154을 획득하였다(448㎎, 75%).

1,3,4-트리 -O- 벤질-2,5,6-트리 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (155)

154(98㎎, 166 μmol), 부티릭 무수물 (68 ㎕, 415 μmol) 및 DMAP(5 ㎎, 4 μmol)의 드라이 피리미딘 (2 ㎖)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 화합물 2와 동일한 작업 방법으로 순수한 오일상의 155(106 ㎎, 99%)를 얻었다.

2,5,6-트리 -O- 부티릴- myo -이노시톨 (156)

155(105 ㎎, 159 μmol)를 아세트산(3㎖)에 용해한 후 숯(80㎎, 795μmol)이 있는 팔라듐(10%)을 첨가하였다. 용액을 수소 분위기 하에서 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 촉매를 한외여과로 제거하고 여과물은 동결건조시켜 표제 화합물 156 (53㎎, 86%)을 얻었다. M_p: 113.4-114.4℃ (MeOH로부터)

2,5,6-트리 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,3,4-트리스 (디벤질) 포스페이트 (157)

트리올 156(48㎎, 123 μmol) 및 테트라졸(104 ㎎, 1.48 mmol)의 아세토니트 릴 (2 ㎖)의 용액을 18시간 동안 디벤질 N,N-디이소프로필폴리포스포르아미다이트(500 ㎕, 1.48 mmol)로 처리하고 -40℃로 냉각하고 격렬한 교반 하에서 퍼아세트산(32% v/w, 340㎕, 1.48 mmol)으로 산화하였다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Yu 와 Fraiser-Reid, Tetrahedron Lett. 29:979 (1988)). 혼합물을 실온으로 가열하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류 오일을 제조용 HPLC (92% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 17.50분)로 정제하여 오일상의 화합물 157 (104 ㎎, 72%)을 수득하였다.

2,5,6-트리 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 (158)

유리산 157 (100 ㎎, 85 μmol)을 상기 설명한 바와 같이 수소화시켜 동결건조 후 표제 화합물 158(47 ㎎, 88%)을 얻었다.

2,5,6-트리 -O- 부티릴- myo -이노시톨 1,3,4-트리포스페이트 헥사키스 (아세톡시메틸)에스테르 (159)

DIEA (209㎕, 1.23 mmol) 및 아세톡시메틸 브로마이드(123㎕, 1.23 mmol)를 화합물 158 (39 ㎎, 61 μmol)의 아세토니트릴(2 ㎖)의 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온의 암실에서 4일 동안 교반한 후, 모든 휘발성 성분을 감압하에서 증발시키고 조잔류물을 제조용 HPLC(73% MeOH; 40 ㎖/분; t_R = 20.25분)로 정제시켜 시럽상의 화합물 159 (44 ㎎, 67%)를 얻었다.

비록 본 발명은 상기 제공된 실시예를 참고로 하여 설명되었지만, 다양한 수정이 본 발명의 사상에서 이탈함 없이 만들어 질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구의 범위에 의해서만 제한될 것이다.

Claims

분비성 설사 치료용 조성물로서,

1-O-아실-2-O-데옥시-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아실옥시알킬)에스테르,

2,5,6-트리-O-아실-myo-이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 헥사키스(아실옥시알킬)에스테르,

디-아실-6-O-아실-포스파티딜 myo-이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 헥사키스(아실옥시알킬)에스테르, 및

1,2-디-O-아실-scyllo-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아실옥시알킬)에스테르

를 포함하는 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 조성물.
분비성 설사 치료용 조성물로서,

1-O-부티릴-2-O-데옥시-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르,

2,5,6-트리-O-부티릴-myo-이노시톨 1,3,4-트리스포스페이트 헥사키스(아세톡시메틸)에스테르,

디-O-팔미토일-D,L-6-O-부티릴-포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 헵타키스(아세톡시메틸)에스테르,

디-O-옥타노일-D,L-6-O-부티릴-포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 헵타키스(아세톡시메틸)에스테르, 및

1,2-디-O-부티릴-scyllo-이노시톨 3,4,5,6-테트라키스포스페이트 옥타키스(아세톡시메틸)에스테르

를 포함하는 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 조성물.