PT1470226E - Controlo da expressão génica utilizando um complexo de um oligonucleótido e um péptido regulador - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Controlo da expressão génica utilizando um complexo de um oligonucleótido e um péptido regulador" 0 presente invento refere-se ao controlo da expressão génica e, em particular, refere-se a métodos e meios para modular, de preferência suprimindo, a expressão de um determinado gene seleccionado. A capacidade para suprimir selectivamente a expressão de um gene é útil em muitas áreas da biologia, por exemplo em métodos de tratamento onde a expressão do gene pode ser indesejável; na preparação de modelos de doença onde a falta de expressão de um determinado gene está associada à doença; na modificação do fenótipo para produzir propriedades desejáveis. Assim, a capacidade para suprimir selectivamente a expressão de um gene pode permitir o "knockout" de genes humanos em células humanas (de tipo selvagem ou mutantes) e o "knockout" de genes eucarióticos em estudos de desenvolvimento e diferenciação.

Os presentes métodos para tentar suprimir a expressão de um determinado gene recaem em três categorias principais, nomeadamente a tecnologia anti-sentido, a tecnologia de ribozimas e a deleção direccionada de genes alcançada através de recombinação homóloga.

As técnicas anti-sentido baseiam-se na introdução de uma molécula de ácido nucleico numa célula que seja tipicamente complementar a um ARNm expresso pelo gene seleccionado. A molécula anti-sentido suprime tipicamente a tradução da molécula de ARNm e impede a expressão do polipéptido codificado pelo gene, enquanto que a molécula anti-sentido permanece ligada à molécula de ARNm. Modificações da técnica anti-sentido podem impedir a transcrição do gene seleccionado através da ligação da molécula anti-sentido (oligonucleótido que forma tríplices; TFO) ao adn do gene para formar uma hélice tripla. Neste método, a presença da terceira cadeia bloqueia a transcrição do ADN enquanto permanece ligada. 2 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Grupos químicos modificadores, por exemplo grupos reticulantes psoraleno, foram incluídos em TFO, mas estes podem conduzir a danos e mutações irreversíveis no ADN. O controlo de tais grupos químicos modificadores em células é também difícil. Podem também ter desvantagens em relação à entrega celular das moléculas.

As técnicas de ribozimas baseiam-se na introdução de uma molécula de ácido nucleico numa célula que expressa uma molécula de arn que se liga a, e catalisa a clivagem selectiva de, uma molécula de ARN alvo. A molécula de ARN alvo é tipicamente uma molécula de ARNm, mas pode ser, por exemplo, uma molécula de ARN retroviral.

As técnicas anti-sentido e baseadas em ribozimas provaram ser difíceis de implementar e mostram graus variáveis de sucesso na supressão ou inactivação de genes alvo. Para além disso, estas duas técnicas requerem expressão ou administração persistentes do agente inactivador do gene. A ligação de um TFO a um domínio de activação virai de VP16 (Kusnetsova et al., Nucleic Acids Res. 20: 3995-4000, 1999) foi utilizada para alargar a aplicação de TFO para incluir activação génica (ao contrário das utilizações anteriores em supressão ou inactivação génica). A deleção génica direccionada através de recombinação homóloga requer dois acontecimentos de inactivação génica (um para cada alelo) e não é facilmente aplicável a células primárias, particularmente, por exemplo, células mamárias humanas primárias que apenas podem ser mantidas em cultura durante algumas passagens. A deleção génica direccionada permaneceu difícil de executar em plantas. A integração específica do local mediada por cre-lox foi o método de escolha embora a eficiência dos acontecimentos específicos de integração fosse baixa (Alberts et al., Plant J. 7: 649-659, 1995; Vergunst e Hooykass, Plant Mol. Biol. 38: 393-406, 1998; Vergunst et al., Nuc. Acids Res. 26: 2729-2734, 1998).

Estas principais desvantagens na tecnologia existente levaram-nos a procurar uma estratégia alternativa. 3 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ WO 99/11808 descreve proteínas de fusão ou complexos de proteína/ácido nucleico compreendendo a proteína Antennapedia. WO 01/02019 descreve fusões de dois polipéptidos nos quais um polipéptido é capaz de se ligar de modo específico a uma sequência de ácido nucleico seleccionada e o outro polipéptido inactiva a cromatina.

Lebedeva et al., Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 50: 101-119, 2000, descreve métodos de revisão para entrega de oligonucleótidos a células.

Um aspecto do invento proporciona um método in vitro para supressão da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo a introdução na célula de uma molécula compreendendo (1) uma porção de ligação a ácido nucleico que se liga a um local no gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção repressora da expressão, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção repressora compreende um polipéptido ou um peptidomimético.

Um outro aspecto do invento proporciona um método in vitro para modulação da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo a introdução na célula de uma molécula compreendendo (1) uma porção de ligação a ácido nucleico que se liga a um local no gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção modificadora, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção modificadora compreende um polipéptido ou um peptidomimético que é capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina e que não é uma endonuclease ou KRAB.

Um outro aspecto do invento proporciona uma molécula compreendendo (1) uma porção de ligação a ácido nucleico que se liga a um local num gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção repressora da expressão, em que a porção de ligação ao ácido 4 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção repressora compreende um polipéptido ou um peptidomimético.

Um outro aspecto do invento proporciona uma molécula compreendendo (1) uma porção de ligação a um ácido nucleico que se liga a um local num gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção modificadora, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção modificadora compreende um polipéptido ou um peptidomimético que é capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina e que não é uma endonuclease ou KRAB. É preferido que a célula ou o genoma sejam uma célula ou um genoma eucarióticos, por exemplo uma célula fúngica, animal ou vegetal. É preferido que a porção repressora seja uma porção modificadora. É preferido que a porção repressora ou modificadora seja uma porção de inactivação da cromatina. A porção de inactivação da cromatina pode ser qualquer polipéptido ou sua parte que, directa ou indirectamente, conduzam à inactivação da cromatina. Conduzir "directamente" à inactivação da cromatina significa que o polipéptido ou a sua parte actuam por si próprios na cromatina para a inactivar. Conduzir "indirectamente" à inactivação da cromatina significa que o polipéptido ou a sua parte não actuam por si próprios na cromatina mas que em vez disso podem recrutar ou promover um componente celular para o fazer. A inactivação da cromatina resulta geralmente na supressão ou inactivação da expressão génica. A inactivação da cromatina é tipicamente um acontecimento localizado tal que a supressão ou inactivação da expressão génica está restrita a, tipicamente, um ou poucos genes. Assim, a porção de inactivação da cromatina é qualquer polipéptido adequado que, quando parte do polipéptido do presente invento e quando direccionado para um gene seleccionado pela porção de ligação ao ácido nucleico, inactiva localmente a cromatina associada 5 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ ao gene seleccionado de modo a que a expressão do gene seja inactivada ou suprimida. A desacetilação de histonas está associada à inactivação da cromatina e é assim particularmente preferido que a porção de inactivação da cromatina facilite a desacetilação de histonas. A desacetilação direccionada de histonas associada a um dado gene conduz à inactivação génica de um modo essencialmente irreversível. Por "supressão" ou "inactivação" da expressão génica entenda-se que na presença do polipéptido do presente invento a expressão do gene alvo seleccionado é de 1,2 vezes, 1,4 vezes, 1,6 vezes, duas vezes, três vezes, cinco vezes, dez vezes, vinte vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1000 vezes mais baixa do que na ausência do polipéptido do presente invento sob condições equivalentes. A expressão génica pode ser medida utilizando qualquer método adequado incluindo a utilização da reacção em cadeia com polimerase com transcritase inversa (RT-PCR), hibridação de ARN, ensaios de protecção de ARNase, ensaios nucleares "run-off" e alteração da cromatina tal como avaliado através da hipersensibilidade a ADNase 1.

Em células animais e vegetais a desacetilação de histonas é alcançada através do designado complexo da histona-desacetilase (HDAC) que contém, para além de uma ou mais enzimas histona-desacetilase, proteínas acessórias que estão envolvidas na formação e função do complexo. Além disso, há outros componentes proteicos que embora possam não ser parte do hdac ligam-se ou interagem de outro modo com HDAC e ajudam a facilitar a desacetilação das histonas. A desacetilação e acetilação de histonas são fenómenos bem conhecidos que estão revistos nos seguintes documentos: Chen e Li, Crit. Rev. Eucaryotic Gene Expression 8: 169-190, 1998; Workman e Kingston, Ann. Rev. Biochem. 67: 545-579, 1998; Perlmann e Vennstrom, Nature 377: 387-, 1995; Wolfe,

Nature 387: 16-17, 1997; Grunstein, Nature 389: 349-352, 1997; Pazin e Kadonaga, Cell 89: 325-328, 1997; DePinho,

Nature 391: 533-536, 1998; Bestor, Nature 393: 311-312, 1998; e Grunstein, Cell 93: 325-328, 1998. A composição polipeptídica do complexo HDAC está presentemente sob investigação. Os polipéptidos que podem 6 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ fazer parte, ou estar associados a certos complexos HDAC incluem a histona-desacetilase 1 (HDAC1) (Taunton et al., Nature 272: 408-441, 1996); a histona-desacetilase 2 (HDAC2) (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 12845-12850, 1996); a histona-desacetilase 3 (HDAC3) (Dangond et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242: 648-652, 1998); N-CoR (Horlein et al., Nature 377: 397-404, 1995); SMRT (Chen e Evans, Nature 377: 454-457, 1995); SAP30 (Zhang et al., Molecular Cell 1: 1021-1031, 1998); Sin3 (Ayer et al., Cell 80: 767-776, 1995; Schreiber-Agus et al., Cell 80: 777-786, 1995), SAP18 (Zhang et al., Cell 89: 357-364, 1997); e RbAp48 (Qian et al., Nature 364: 648-652, 1993). Todos estes artigos são aqui incorporados por referência. Acredita-se que possa haver outros componentes do complexo HDAC ou que interajam com o complexo HDAC que, até agora, não tenham sido identificados. Considera-se que estes também serão úteis na prática do presente invento.

Mostrou-se que PLZF interage com N-CoR e SMRT, que por sua vez recrutam um complexo HDAC. PLZF interagirá também directamente com HDAC (Lin et al., Nature 391: 811-814, 1998; Grignani et al., Nature 391: 815-818, 1998; David et al., Oncogene 16: 2549-2556, 1998).

Madl é um membro da família Mad e tem capacidade para agir como repressor da transcrição. Mostrou-se que Madl é capaz de interagir com Sin3, que por sua vez interage com histona-desacetilases de classe I (HDAC1 e HDAC2). Mad/Sin3 funciona como uma grande armação proteica capaz de múltiplas interaeções proteína-proteína (Hassig et al., Cell 89: 341-347, 1997; Laherty et al., Cell 89: 349-356, 1997; Zhang et al., Cell 89: 357- 364, 1997) .

Os complexos formados que contêm qualquer um de N-CoR, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30 e uma histona-desacetilase estão descritos em Heinzel et al., Nature 387: 43-48, 1997; Alland et al., Nature 387: 49-55, 1997; Hassig et al., Cell 89: 341-347, 1997; Laherty et al., Cell 89: 349-356, 1997; Zhang et al., Cell 89: 357-364, 1997; Kadosh e Struhl, Cell 89: 365 — 371, 1997; Nagy et al., Cell 89: 373-380, 1997; e Laherty et al., Molecular Cell 2: 33-42, 1998. Todos estes artigos são aqui incorporados por referência. 7 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Assim, é particularmente preferido, que o componente de um complexo HDAC ou o polipéptido que se liga ou facilita o recrutamento de um complexo HDAC seja qualquer um de MAD1, E7, PLZF, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30 OU N-CoR, OU HDAC incluindo HDACl, HDAC2 OU HDAC3, OU NuRD, MAD2, MAD3, MAD4 OU Rb. Notar-se-á que pode não ser necessário que todos os polipéptidos estejam presentes desde que esteja presente uma sua porção funcional. Por exemplo, em relação às enzimas histona-desacetilases (por exemplo, HDACl, HDAC2 ou HDAC3) a porção funcional pode ser uma porção que retenha a actividade de histona-desacetilase ou pode ser uma porção que contenha um local de ligação a outros componentes de um complexo HDAC ou uma porção que recrute de outro modo o complexo HDAC e promova a desacetilação de histonas. De modo semelhante, em relação a outros componentes do complexo HDAC ou polipéptidos que se ligam ao complexo HDAC a porção funcional pode ser uma porção que contenha um local de ligação a outros componentes do complexo HDAC. Até à data foram descritos seis genes de HDAC de mamifero (Grozinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 4868-4873, 1999), e acredita-se que qualquer um ou mais de um destes podem ser úteis na prática do presente invento.

Para evitar dúvidas, VP16 ou KRAB não estão incluídos no significado do termo "porção modificadora" ou "porção de inactivação da cromatina". VP16 é um activador da transcrição cujo modo da acção não se considera envolver a modificação covalente do ADN ou da cromatina. krab é um repressor da transcrição cujo modo de acção se considera envolver mecanismos diferentes dos da inactivação da cromatina. Embora não seja preferido, qualquer fragmento de KRAB que, quando faz parte da molécula/polipéptido tal como definido acima e quando direccionado a um gene seleccionado através da porção de ligação ao ácido nucleico, inactiva localmente a cromatina associada ao gene seleccionado de modo a que a expressão do gene seja inactivada ou suprimida, está incluído no termo "porção de inactivação da cromatina". Por exemplo, qualquer fragmento de KRAB que seja capaz de se ligar ou facilitar o recrutamento de um complexo HDAC está incluído no termo "porção de inactivação da cromatina". Contudo, não são preferidos quaisquer tais fragmentos. 8 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Acredita-se que estejam presentes motivos de ligação dentro dos componentes do complexo HDAC ou dentro de polipéptidos que se ligam ao complexo HDAC e estes motivos podem ser suficientes para actuar como porções de inactivação da cromatina no polipéptido do presente invento uma vez que podem facilitar a desacetilação de histonas recrutando um complexo HDAC.

Para além disso, notar-se-á que podem ser utilizadas variantes de um componente do complexo HDAC ou variantes de um polipéptido que se liguem ao complexo HDAC. Variantes adequadas incluem não só porções funcionais tais como as descritas acima como também variantes nas quais tenham sido suprimidos ou substituídos ou introduzidos resíduos de aminoácidos desde que a variante seja ainda capaz de facilitar a desacetilação de histonas. Assim, as variantes adequadas incluem variantes de histona-desacetilases nas quais a sequência de aminoácidos foi modificada em comparação com o tipo selvagem mas que mantêm a sua capacidade para desacetilar histonas. De modo semelhante, as variantes adequadas incluem variantes, por exemplo, de Sin3 ou PLZF nas quais a sequência de aminoácidos foi modificada em comparação com o tipo selvagem mas que retêm a sua capacidade para interagir com, ou no, complexo HDAC. De modo semelhante, podem ser utilizadas variantes de outras proteínas que interajam com componentes do complexo HDAC e outros factores de transcrição que possam causar inactivação génica através da actividade de HDAC. A totalidade ou partes das proteínas Rb, MAD e MeCpG2 podem interagir com o complexo HDAC.

Embora a maior parte do trabalho tenha sido feita com complexos HDAC e polipéptidos envolvidos no recrutamento de complexos HDAC em sistemas de mamífero, a natureza fundamental do sistema é tal que se espera identificar polipéptidos funcionalmente equivalentes noutras células eucarióticas, em particular noutras células animais e em células vegetais. Por exemplo, a Figura 5 mostra que polipéptidos muito intimamente relacionados com HDAC1 humana estão presentes em Arabidopsis e em levedura. Um complexo HDAC vegetal foi isolado a partir do milho (Lussen et al., 9 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Science 277: 88-91, 1997) e foi realizado um estudo comparativo de histona-desacetilases de células vegetais, fúngicas e de vertebrado (Lechner et al., Biochim. Biophys. Acta 1296: 181-188, 1996). Mostrou-se que inibidores de histona-desacetilases invertem a repressão de genes de ARNr silenciosos em Brassica (Chen e Pickard, Genes Dev. 11: 2124-2136, 1997) e uma toxina selectiva do hospedeiro de ocorrência natural (toxina HC) de Cochliobolus carbonum inibe as histona-desacetilases vegetais, fúngicas e de mamífero (Brosch et al., Plant Cell 7: 1941-1950, 1995). Não é necessário que a porção de inactivação da cromatina seja do mesmo tipo celular ou da mesma espécie que a célula na qual o polipéptido (ou o polinucleótido que codifica o polipéptido) é introduzido mas é desejável que o seja uma vez que uma tal porção de inactivação da cromatina pode ser capaz de inactivar a cromatina mais eficazmente nessa célula. É particularmente preferido que a porção de inactivação da cromatina do polipéptido seja PLZF, E7, MAD1, Rb ou SAP 18, ou uma porção de PLZF ou E7 ou MADl ou Rb ou SAP 18 que possa facilitar a desacetilação de histonas, ou um polipéptido, ou uma porção de um polipéptido, que se sabe causarem activação génica através de desacetilação de histonas. Por exemplo, acredita-se que a porção de PLZF em PLZF-RARa que está envolvida em APL interage com N-CoR e SMRT.

As porções de inactivação da cromatina preferidas são descritas nos Exemplos, e incluem um polipéptido/mimético ou análogo de polipéptido deriváveis de SAP18 com a sequência de aminoácidos XXXMAVESRVTQEEIKKEPEKPIDREKTCPLLLRVF (onde XXX é, por exemplo, um ligante AAA ou DDD) e um polipéptido derivável de MADl com a sequência de aminoácidos XXXMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP (onde XXX é, por exemplo, um ligante AAA ou DDD). É também particularmente preferido que a porção de inactivação da cromatina seja um polipéptido com actividade enzimática de histona-desacetilase tal como contida em HDACl, HDAC2 ou HDAC3. 10 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Alternativamente, a porção modificadora pode ser uma porção que seja capaz de modular uma modificação covalente, por exemplo metilação, de um ácido nucleico, de preferência ADN. Assim, a porção modificadora pode ser ou compreender uma enzima modificadora de ADN, ou pode ser capaz de recrutar uma tal enzima. A modulação tem de preferência o efeito de suprimir o gene seleccionado. É preferido que a porção modificadora não altere a sequência do ácido nucleico. É preferido que a porção modificadora não clive a estrutura do ácido nucleico. A porção modificadora de preferência não é uma recombinase nem uma endonuclease de restrição.

Por exemplo, a porção modificadora pode compreender (ou ser capaz de recrutar) a totalidade ou uma porção de uma metil-transferase ou um componente de um complexo da metil-transferase, por exemplo tal como discutido em Okano, M., Xie, S., Li, E., "Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases". Nat. Genet. 19: 219-220, 1998; Adrian P. Bird e Alan P. Wolffe, "Methylation-Induced Repression: Belts, Braces and Chromatin", Cell 99: 451-454, 1999. É preferido que o repressor ou a porção modificadora não sejam uma endonuclease ou outra molécula que produza uma quebra persistente na cadeia de ADN. É preferido que uma porção do polipéptido/mimético ou análogo de polipéptido da molécula (por exemplo a porção modificadora) tenha uma massa molecular inferior a 11 kDa, de preferência menos de 8 kDa, sendo ainda preferido menos de 6 kDa. Por exemplo, é preferido que a porção do polipéptido/mimético ou análogo de polipéptido tenha menos de 100, sendo ainda preferido menos de 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou 20 aminoácidos (ou seus miméticos ou análogos), sendo ainda preferido entre cerca de 60 e 25 aminoácidos (ou seus miméticos ou análogos). É particularmente preferido que a porção modificadora consista em péptidos deriváveis de SAP18 ou MADl ou Rb e ligantes apropriados, por exemplo os péptidos deriváveis de 11 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ SAP18 ou MADl e ligantes tal como descrito acima e no Exemplo 1. A molécula pode ainda compreender uma porção que facilite a entrada na célula e/ou a localização nuclear (porção de localização). Esta porção pode também ser um polipéptido ou um mimético/análogo de polipéptido. Por exemplo, a porção de localização pode compreender ou consistir num péptido com actividade membranotrópica tal como discutido, por exemplo, em Soukchareun et al., Bioconjugate Chem. 9: 466-475, 1998 e nas referências aí citadas, por exemplo Soukchareun et al., Bioconjugate Chem. 6: 43-53, 1995 (péptidos de fusão virais) ou Eritja et al., Tetrahedron 47: 4113-4120, 1991, (sequências sinal de transporte nuclear).

Pode ser um péptido sinal de localização nuclear ou o péptido lítico endossómico (que pode facilitar a libertação da molécula do compartimento endossómico) mencionado em WO 99/13719. É preferido que esta porção tenha menos de 3 kDa, de preferência menos de 2,5 kDa. É preferido que o teor total de polipéptido/mimético/análogo da molécula seja inferior a 11 kDa. Tipicamente, uma porção de localização pode ter entre aproximadamente 7 e 16 aminoácidos.

Outros exemplos de porções de localização incluem Penetratinas baseadas no homeodomínio de Antennapedia modificado (por exemplo, RQIKIWFQNRRMKWKK) ou TAT (por exemplo C(Acm)GRKKRRQRRRPPQC, onde C(Acm) é um Cys-acetamidometilo) ou moléculas baseadas em VP22 (Prochiantz, Curr. Opin. Cell. Biol. 9: 420-429, 2000) ou péptido de internalização básico TAT de HIV.

As moléculas do presente invento podem ser úteis em métodos e utilizações proporcionados pelos aspectos do presente invento, por exemplo tal como discutido com mais detalhe abaixo. Em particular, os polipéptidos do presente invento podem ser úteis num método do primeiro e segundo aspectos do presente invento. É preferido que as moléculas do presente invento sejam moléculas híbridas que não ocorram na natureza. Por exemplo, é preferido que a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção modificadora não sejam deriváveis de um complexo ou 12 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ molécula de ocorrência natural. As moléculas (se algumas) das quais a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção de inactivação da cromatina são derivadas podem ser da mesma espécie (por exemplo, tal como está descrito em mais pormenor abaixo, a porção de ligação ao ácido nucleico pode ser um oligonucleótido possuindo uma sequência verificada num ácido nucleico humano e a porção de inactivação da cromatina pode ser uma porção de PLZF humana) ou podem ser de diferentes espécies (por exemplo um oligonucleótido possuindo uma sequência não verificada em ácido nucleico humano, por exemplo capaz de se ligar a uma sequência de ADN bacteriana, pode ser fundida com uma porção de PLZF humana).

Assim, numa concretização preferida particular a molécula do presente invento é uma que é produzida através de métodos de síntese química em que a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção modificadora ou de inactivação da cromatografia são seleccionadas tal como descrito em mais pormenor abaixo.

As técnicas de síntese e de união são descritas em WO 01/14737 e nas suas referências (aqui incorporado por referência). São preferidos os métodos de WO 01/147373. Alternativamente, podem também ser utilizadas as técnicas descritas em Kusnetsova et al., Nucleic Acids Res. 27: 3995-4000, 1999. O local presente num genoma eucariótico é um local que está situado num, ou associado a um, gene ou em genes seleccionados cuja expressão se pretende modular, de preferência suprimir ou inactivar. E preferido que o local seja um local que esteja naturalmente presente num genoma eucariótico. Contudo, tal como discutido com mais pormenores adiante, o local pode ser um que tenha sido modificado no genoma, ou pode ser um local associado a uma sequência virai inserida. O local modificado no genoma para estar na vizinhança do gene cuja expressão se pretende suprimir pode ser um local da mesma espécie (mas presente noutro local no genoma) ou pode ser um local presente numa espécie diferente. Em "genoma" incluímos não só o ADN cromossómico como outro ADN presente na célula eucariótica, tal como ADN que foi introduzido na célula, por exemplo ADN plasmídico ou virai. É 13 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ preferido que a porção de ligação ao ácido nucleico se possa ligar a ADN cromossómico ou, tal como é descrito com mais detalhe abaixo, a ARN transcrito a partir de ADN cromossómico.

Numa concretização, é preferido que o gene seja um gene endógeno. O termo "gene endógeno" refere-se a um gene que é nativo da célula, i.e., que não é heterólogo à célula e que está no seu contexto genómico natural. Neste contexto o local presente num genoma eucariótico é um local que está no gene ou genes endógenos seleccionados ou associado a estes cuja expressão é desejável suprimir ou inactivar. O local é um local que está naturalmente presente num genoma eucariótico e está no seu contexto genómico natural.

Pode ser desejável que o local tenha caracteristicas de sequência particulares que promovam a ligação a um oligonucleótido para formar uma hélice tripla, tal como é conhecido dos peritos na especialidade. Contudo, considera-se em relação ao presente invento que tais caracteristicas de sequência podem ser menos importantes que para oligonucleótidos na ausência de uma porção polipeptidica, porque o efeito de supressão ou modulação da molécula do presente invento pode persistir mesmo quando a molécula já não está ligada ao local alvo; assim, a afinidade de ligação pode ser menos critica. A sequência do oligonucleótido ainda é importante para que se obtenha um reconhecimento especifico; contudo as ligações que se formam entre o oligo e a sequência alvo podem não necessitar de ser tão fortes quando está presente a porção polipéptido/peptidomimético. O posicionamento do local de ligação do oligonucleótido relativamente ao gene cuja transcrição se pretende suprimir ou modular pode ser menos critico que para oligonucleótidos, por exemplo TFO, sem uma porção modificadora uma vez que o efeito modulador ou supressor da molécula do presente invento (por exemplo, quando o dominio modificador é, ou é capaz de recrutar, uma metiltransferase ou uma histona-desacetilase) se pode prolongar para ambos os lados do local de ligação do oligonucleótido. A porção de ligação ao ácido nucleico pode ligar-se ao promotor do gene, mas pode alternativamente 14 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ ligar-se a outra sequência dentro ou na vizinhança do gene de interesse. WO 90/06934/EP 0375408 e WO 91/06626 discutem os requisitos de sequência para TFO. Dois motivos para a formação de uma hélice tripla são designados o motivo "CT" e o motivo "GT". O primeiro destes envolve a utilização de um oligonucleótido de polipirimidina como TFO. Para cada par de bases GC, está presente no TFO uma C e por cada par de bases AT, está presente no TFO uma T (ou xantina ou inosina ou um derivado halogenado). Considera-se que o TFO está orientado numa direcção paralela à cadeia rica em purinas do dúplex. Alternativamente, utilizando o motivo "GT", está presente uma G (ou um derivado halogenado) para cada par de bases GC e uma T (ou xantina ou inosina ou um derivado halogenado) para cada par de bases AT, e considera-se que o TFO está orientado numa direcção antiparalela à da cadeia rica em purinas do dúplex. A sequência alvo deve ter pelo menos cerca de 65% de bases de purina ou pelo menos cerca de 65% de bases de pirimidina. A EP 0266099 também discute como podem ser seleccionadas sequências alvo adequadas. W0 94/17086 discute oligonucleótidos que se pretende que se liguem a sequências de ADN que são consideradas capazes de adoptar uma conformação de cadeia simples. Tais sequências podem ser ricas em purina e ter substancial simetria de espelho. Os oligonucleótidos podem ser substancialmente complementares à cadeia de purinas ou ter uma estrutura funcional circular ou de caule-volta que pode formar ligações tanto de Watson-Crick como de Hoogensteen com o ADN alvo de cadeia simples. WO 96/35706 descreve oligonucleótidos com estruturas e caracteristicas de sequência que são consideradas como promovendo a formação de um complexo especifico e estável com o ácido nucleico alvo (ácidos nucleicos de cadeia simples de pirimidinas) e que podem ter maior estabilidade devido à formação de uma estrutura em alfinete de cadeia paralela na ausência do ácido nucleico alvo.

Debin et al., Nucleic Acíds Res. 27(13): 2699-2707, 1999, comenta sobre factores que afectam a estabilidade de 15 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ triplas hélices G,A e as consequências para o desenho do TFO. Xodo et al., Eur. J. Biochem. 268: 656-664, 2001, investiga também factores que afectam a ligação do TFO a locais alvo, por exemplo a ligação de oligonucleótidos curtos a locais vizinhos.

Blume et al., Nucl. Acids Res. 27: 695-702, 1999, investiga o envolvimento de um catião bivalente na formação da hélice tripla e como a formação pode ser positivamente ou negativamente modulada. Faria et al., J. Mol. Biol. 306: 15-24, 2001, descreve um ensaio para avaliação de TFO em células e resultados com vários oligonucleótidos. Cheng et al., Biotech. and Bioeng. 70: 467-472, 2000, apresenta os resultados da modelação matemática de ligações de TFO e as consequências para a escolha dos locais de ligação e das sequências de TFO.

Demidov e Frank-Kamenetskii revêem a ligação de ácidos nucleicos peptidicos (PNA), particularmente PNA catiónicos de pirimidina (cpyPNA) a dúplices de ADN.

As regras para o desenho de potenciais TFO são revistas em Vasquez e Wilson, Trends Biochem Sei. 1: 4-9, 1998. São indicados como sendo eficazes três tipos de TFO: ricos em pirimidinas (CT); ricos em purinas (GA) e mistos (GT ou GAT). Os TFO CT ligam-se num motivo paralelo, no qual a terceira cadeia possui a mesma orientação 5' para 3' que a cadeia de purinas do dúplex. Os TFO GA ligam-se num motivo antiparalelo. Os TFO mistos podem ligar-se de uma ou de outra forma, dependendo da sequência alvo. Outras propriedades diferem também entre os tipos de TFO; por exemplo os TFO CT são dependentes do pH. Cada tipo de TFO pode ser adequado em relação ao presente invento. É preferido que o oligonucleótido ou a porção mimética tenham cerca de 10 a 80, de preferência 15 a 40 bases de comprimento, sendo ainda mais preferido cerca de 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos inferiores a 20 bases podem apresentar uma ligação mais fraca e/ou menos especifica mas podem não obstante ser úteis na prática do presente invento, por exemplo porque apenas é necessárias uma ligação transiente, tal como observado acima. 16 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Por "ADN" ou "oligo(desoxi)nucleótido" entenda-se uma molécula com uma estrutura de açúcar-ligação-açúcar em que o resíduo de açúcar compreende uma 2'-desoxirribose (e portanto inclui uma cadeia de ADN terminada com um nucleósido compreendendo uma porção 2',3'-didesoxirribose) e em que, unida ao resíduo de açúcar na posição 1 está uma base tal como adenina (A), citosina (C), guanina (G), timidina (T), inosina (I), uridina (U) e semelhantes. No ADN normal a ligação entre os resíduos de açúcar (a "ligação açúcar-açúcar" é uma porção fosfato que forma um diéster com os referidos resíduos de açúcar. Contudo, incluímos no termo "ácido nucleico" (e mais particularmente no termo ADN) moléculas com ligações não fosfato.

Assim, incluímos uma ligação fosforotioato e uma ligação fosforosselenoato. Pode ser preferido que a ligações sejam mais resistentes a ataque por nucleases celulares do que o ADN normal. Tais ligações podem incluir também metilfosfato, fosfotriéster e o α-enantiómero do fosfodiéster de ocorrência natural.

Nos termos "ácido nucleico" ou "oligonucleótido" incluímos também moléculas com análogos de bases não naturais; moléculas nas quais as posições 2' e 3' do açúcar pentose são independentemente qualquer uma de -H, -OH ou -NH2; e moléculas nas quais um oxigénio unido ao átomo de fósforo mas não em ligação fosfodiéster é substituído por -SH, SeH, -BH2, -NH2, -PH3, -F, -Cl, -CH3, -0CH3, -CN e -H. 0 oligonucleótido pode ser um oligorribonucleótido ou um oligodesoxirribonucleótido. Os oligodesoxirribonucleótidos são preferidos uma vez que os oligorribonucleótidos podem ser mais susceptíveis a ataque enzimático do que os oligodesoxirribonucleótidos. O oligonucleótido ou análogo ou mimético pode ser um ácido nucleico peptídico, tal como é conhecido dos peritos na especialidade e descrito, por exemplo, em wo 99/13719 e nas referências aí, e em Demidov e Frank-Kamenetskii, 2001, supra. Os PNA são análogos de ácidos nucleicos com uma estrutura de poliamida (péptido) contendo unidades de 2-aminoetilglicina em vez da estrutura de desoxirribose- 17 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ fosfato do ADN. A estrutura do PNA é neutra (ao contrário da estrutura do ADN, que tem carga negativa) e pode portanto ligar-se de modo mais estável a uma molécula de ácido nucleico carregada do que a correspondente molécula de ADN poderia. É preferido que o oligonucleótido ou análogo ou mimético sejam um oligonucleótido de ADN.

As referências a um oligonucleótido incluem (onde apropriado) a referência a um mimético ou análogo de oligonucleótido, por exemplo um PNA. O oligonucleótido pode compreender um ligante, que pode ser unido ao terminal 5' ou 3' do oligonucleótido. Exemplos de ligantes adequados estão descritos, por exemplo, em WO 90/06934.

Pode ser preferido que a porção de ligação ao ácido nucleico seja ou compreenda um ácido nucleico peptídico (PNA). A porção de ligação ao ácido nucleico pode ser qualquer porção de ligação adequada tal como definido que se liga a um local presente num genoma eucariota, tal como de uma planta ou de um animal. É particularmente preferido que a porção de ligação ao ácido nucleico se possa ligar a um local que esteja num gene seleccionado ou associado a este cuja expressão se pretenda suprimir através da presença da porção inactivadora da cromatina do polipéptido do presente invento. É preferido que a porção de ligação ao ácido nucleico se ligue selectivamente ao local desejado. Pode haver um ou mais locais desejados aos quais a porção de ligação ao ácido nucleico se pode ligar. Por exemplo, o polipéptido do presente invento pode ser utilizado para suprimir a expressão de um grupo de genes que possuam, cada um, um local de ligação a uma porção comum de ligação ao ADN (por exemplo, estão sob os controlos de um receptor de hormona esteróide tal como o receptor de estrogénio (ER)). Para evitar dúvidas, o local presente no eucariota pode ser um local de ocorrência natural, ou pode ser um local que tenha sido modificado para estar lá. O local não necessita de ser originalmente do mesmo 18 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ ou de qualquer outro eucariota. Por exemplo, pode ser uma sequência bacteriana ou virai ou uma sequência artificial para a qual os TFO foram anteriormente caracterizados, que foi modificada para estar presente no ADN da célula eucariótica, por exemplo uma célula vegetal.

Os exemplos podem incluir elementos de resposta, tais como ERE e IRE tal como descrito nos exemplos aqui, ou outros locais de ligação caracterizados. Pode ser desejável utilizar um tal local numa célula que não contenha um regulador endógeno do local. Alternativamente, o local pode ser uma versão modificada de um elemento de resposta de ocorrência natural, cuja versão modificada pode servir como local de ligação a TFO, mas não pode ser regulada por um regulador de ocorrência natural do elemento de resposta de ocorrência natural. Contudo, é preferido que o local a que a porção de ligação ao ácido nucleico se liga esteja naturalmente presente na célula eucariótica e esteja presente na sua posição natural no genoma. A porção de ligação ao ácido nucleico pode ser uma porção de ligação a ADN ou uma porção de ligação a ARN. Assim, a porção de ligação ao ácido nucleico pode ligar-se a um ácido nucleico de cadeia dupla (por exemplo ADN) ou a um ácido nucleico de cadeia simples (por exemplo ARN ou ADN de cadeia simples). No caso da porção de ligação a ARN, o local presente no genoma eucariótico que se liga à porção de ligação a ARN é, tipicamente, ARN nascente que está a ser transcrito a partir do ADN no local seleccionado para a inactivação. O ARN pode ser aquele que está a ser transcrito pelo gene cuja expressão se pretende suprimir, ou pode ser aquele que está a ser transcrito por um gene adjacente ao, ou pelo menos próximo do, gene cuja expressão se pretende suprimir. É preferido que a porção de ligação ao ARN se ligue a uma sequência de ARN que esteja na extremidade 5' do transcrito ou próximo desta. Notar-se-á que enquanto está a ser transcrito, o ARN nascente permanece no seu local de transcrição ou próximo deste e que se o local de transcrição for no gene ou próximo do gene cuja expressão se pretende suprimir, a utilização de uma porção de ligação ao ARN na molécula do presente invento facilita a localização da porção de inactivação da cromatina no local desejado. 19 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Pode ser útil que a porção de ligação ao ADN se ligue a um local de ligação de um factor de transcrição, por exemplo de modo a que a expressão de mais de um gene ao qual o factor de transcrição se liga possa ser modulada. As bases de dados que listam factores de transcrição e seus locais de ligação são listadas abaixo:

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cqi-bin/wqetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFFACTOR

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFSITE

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFCELL

http://www.embl-heidelberq.de/srs5bin/eqi-bin/wqetz?-fun+pagelibinof+-info+TFCLASS

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cqi-bin/wqetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFMATRIX

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFGENE

Pode ser útil que a porção de ligação ao ADN se ligue a uma região promotora ou a outras regiões ou sequências reguladoras imediatamente a montante do local de inicio da transcrição. Nalgumas aplicações pode ser preferido atingir sequências dentro do gene para diferenciar entre variantes de processamento alternativo.

Tal como observado, os oligonucleótidos podem ser desenhados/concebidos de modo a se ligarem a uma determinada sequência de ADN alvo seleccionada que está num gene seleccionado ou a ele associada. Numa concretização do presente invento o oligonucleótido é um que foi concebido para se ligar a um local que está presente numa sequência génica mutante dentro da célula vegetal ou animal mas que não está presente na sequência de tipo selvagem equivalente. Por exemplo, e tal como é discutido mais detalhadamente abaixo, o oligonucleótido pode ligar-se selectivamente a um gene mutado dominante-negativo, tal como um oncogene mutante e, após a ligação, ocorrer metilação do ADN ou inactivação da cromatina e suprimir a expressão do oncogene mutante. Exemplos de 20 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ oncogenes mutados em cancro humano incluem RAS (H-ras) e Bcl-10.

Tipicamente, a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção de modificação ou inactivação da cromatina são fundidas. A porção de ligação ao ácido nucleico e a porção de modificação ou inactivação da cromatina podem ser sintetizadas como uma única molécula (abordagem de síntese total), por exemplo através da montagem consecutiva do péptido e depois do oligonucleótido num suporte sólido, por exemplo tal como descrito em Soukchareun et al., supra (1998) e referências aí citadas, ou em Basu et ai., Tetrahedron Lett. 36: 4943, 1995. De preferência, é utilizado um procedimento automatizado.

Alternativamente, a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção de modificação ou inactivação da cromatina são sintetizadas separadamente, utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade, e depois unidas. As técnicas adequadas para o acoplamento dos ácidos nucleicos peptídicos aos péptidos incluem a utilização de reagentes de conjugação heterobifuncionais tais como SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato) e SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil(cilo-hexenocarboxilato) e estão descritas, por exemplo, em WO 99/13719, particularmente nos Exemplos 12 a 15. As técnicas adequadas para acoplamento de oligodesoxinucleótidos a péptidos incluem a utilização de oligodesoxinucleótidos derivados com N“-Fmoc-cisteína(S-tiobutilo), tal como descrito em Soukchareun et al., supra (1998). Outras técnicas incluem a utilização de activação de éster de N-hidroxibenzotriazole (HOBT) das extremidades 3' ou 5' de oligonucleótidos-fosfato antes do acoplamento de um péptido desprotegido através de um grupo nucleófilo (tal como um grupo a-NH2) no péptido (ver Ivanovskaya et al., Nucl. Nucl. 6: 931-934, 1995; Ivanovskaya et al., Dokl. Acad. Nauk. SSSR 293: 477-481, 1987; Kuznetsova et al., Nuc. Aclds Res. 27: 3995-4000, 1999). As técnicas de conjugação péptido- olignucleótido são revistas, por exemplo, em Tung e Stein Bioconjugate Chem. 11(5): 605-618, 2000.

De preferência, é utilizada uma técnica de "ligação nativa", tal como descrito em WO 01/15737 e Stetsenko e Gait, 21 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Organic Chem. 65(16): 4900-4908, 2000. Um péptido com a função N-terminal tioéster é ligado a um derivado oligonucleotidico 5'-cisteinilo.

Adequadamente, a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção repressora, de modificação ou de inactivação da cromatina são unidas de modo a que ambas as porções retenham as suas respectivas actividades de modo que, por exemplo, a porção de ligação ao ácido nucleico se possa ligar a um local presente no genoma de uma planta ou de um animal e que, após ligação, a porção modificadora seja ainda capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina, por exemplo que uma porção de inactivação da cromatina possa ainda inactivar a cromatina. As duas porções podem ser unidas directamente, mas podem ser unidas por um péptido ou oligonucleótido ligante. Péptidos ligantes adequados são aqueles que adoptam tipicamente uma conformação em espiral aleatória, por exemplo o polipéptido pode conter alanina ou prolina ou uma mistura de resíduos de alanina mais resíduos de prolina. De preferência os aminoácidos promovem a solubilidade; assim, o ligante pode conter, por exemplo, aminoácidos carregados ou hidrófilos tais como resíduos de ácido aspártico. De preferência o ligante pode conter ou consistir em resíduos de ácido aspártico. É preferido que os aminoácidos não sejam aminoácidos hidrófobos, tais como fenilalanina ou triptofano. De preferência, o ligante contém entre 10 e 100 resíduos de aminoácidos, de maior preferência entre 10 e 50 e ainda de maior preferência entre 10 e 20. Um ligante mais curto, por exemplo de entre 3 e 9 aminoácidos, pode também ser útil. Em qualquer caso, haja ou não um ligante entre as porções da molécula, a molécula é capaz de se ligar ao seu ácido nucleico alvo e é capaz de reprimir a expressão ou modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina, por exemplo de inactivar a cromatina suprimindo ou inactivando desse modo selectivamente a expressão génica.

Os polinucleótidos que codificam porções adequadas repressoras, modificadoras ou de inactivação da cromatina são conhecidos na especialidade ou podem ser facilmente desenhados e produzidos a partir de sequências conhecidas. As sequências polinucleotídicas codificando várias porções de 22 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ inactivação da cromatina adequadas são dadas acima nas referências que se referem aos polipéptidos ou estão disponíveis em GenBank ou EMBL ou dbEST. Uma referência para PLZF é Chen et al., EMBO J. 12: 1161-1167, 1993. Uma referência para E7 é Tommasino et al., Bioessays 17: 509-518, 1995. As referências para SAP18, MADl e Rb são respectivamente Zhang et al., Cell 89: 357-364, 1997; Ayer et al., Cell 12: 211-222, 1993 e Weinberg, Cell 81: 323-330, 1995.

Os polinucleótidos que codificam péptidos ligantes adequados podem ser facilmente desenhados e produzidos a partir de sequências peptidicas ligantes.

Assim, os polinucleótidos que codificam as porções repressoras ou de modificação das moléculas do presente invento podem ser facilmente construídos utilizando técnicas bem conhecidas de engenharia genética. As porções repressoras ou de modificação podem consequentemente ser sintetizadas através de expressão, utilizando técnicas de biologia molecular bem conhecidas dos peritos na especialidade. Contudo, pode ser preferido sintetizar a(s) porção(ões) de polipéptido/análogo/mimético das moléculas do presente invento através de técnicas de química orgânica, tal como conhecido dos peritos na especialidade e como discutido aqui. O presente invento refere-se também a uma célula hospedeira transformada com uma molécula do presente invento. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. As células bacterianas são as células hospedeiras procarióticas preferidas e são tipicamente uma estirpe de E. coli tal como, por exemplo, as estirpes de E. coli DH5 disponíveis em Bethesda Research Laboratories inc., Bethesda, MD, USA, e RRl disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (ATCC N° 31343) . Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem células vegetais, de levedura, de insecto e de mamífero, de preferência células de vertebrado tais como as de um ratinho, rato, macaco ou linhas celulares de fibroblastos e de rim humanas. Células hospedeiras de levedura incluem YPH499, YPH500 e YPH501 que estão geralmente disponíveis em Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Células hospedeiras de mamífero 23 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ preferidas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) disponíveis na ATCC como CCL61, células de embrião de ratinho Swiss NIH NIH/3T3 disponíveis em ATCC como CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco disponíveis em ATCC como CRL 1650; células 293 que são células de rim embrionário humano e células de fibrossarcoma humano HT1080.

Os protoplastos para transformação são tipicamente gerados conforme necessário através de métodos conhecidos na especialidade. Não estão geralmente disponíveis linhas celulares vegetais. Contudo, uma linha celular que é geralmente utilizada é a linha celular Bright Yellow 2 de tabaco (BY2; Mu et ai., Plant Mol. Biol. 34: 357-362, 1997). A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma molécula do presente invento é alcançada através de métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de molécula utilizada. No que diz respeito à transformação de células hospedeiras procarióticas, ver, por exemplo, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2110, 1972, e Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. A transformação de células de levedura é descrita em Sherman et al., "Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1986. O método de Beggs, Nature 275: 104-109, 1978, é também útil. No que diz respeito às células de vertebrado, os reagentes úteis na transfecção de tais células, por exemplo fosfato de cálcio e DEAE-dextrano ou formulações de lipossomas, estão disponíveis em Stratagene Cloning Systems, ou Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA. No que diz respeito às células vegetais e a plantas inteiras podem ser utilizadas as seguintes abordagens de transformação de plantas (J. Draper e R. Scott em D. Grierson (ed.), "Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow and London, 1991, Vol. 1, págs. 38-81): i) transferência génica mediada por ADN, através de entrada de adn em protoplastos estimulada por polietilenoglicol, por electroporação ou por micro-injecção de protoplastos ou células vegetais (J. Draper, R. Scott, A. Kumar e G. Dury, Ibld., págs. 161-198). A transferência directa de genes para protoplastos é também descrita em 24 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. 79: 213-217, 1990; Gad et ai., Physiol. Plant. 79: 177-183, 1990; e Mathur e Koncz, Method Mol. Biol. 82: 267-276, 1998; ii) transformação utilizando bombardeamento de partículas (D. McCabe e P. Christou, Plant Cell Tiss. Org. Cult. 3: 227-236, 1993; P. Christou, Plant J. 3: 275-281, 1992) .

As técnicas preferidas incluem electroporação, micro-injecção e formulação de lipossomas.

Algumas espécies são passíveis de transformação directa, evitando o requisito da cultura de tecidos ou células (Bechtold et ai., Life Sciences, C.R. Acad. Sei. Paris 316: 1194-1199, 1993).

Em todas as abordagens é preferido um marcador de selecção adequado, tal como resistência a canamicina ou a um herbicida, ou alternativamente um gene marcador pesquisável ("repórter"), tal como β-glucuronidase ou luciferase (ver J. Draper e R. Scott em D. Grierson (ed.), "Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow and London, 1991, Vol. 1, pág. 38-81) . A electroporação é também útil para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida na especialidade para transformação de células de levedura, células bacterianas, células de insecto, células de vertebrado e algumas células vegetais (p. ex. células de cevada, ver Lazzeri, Methods Mol. Biol. 49: 95-106, 1995).

Por exemplo, muitas espécies bacterianas podem ser transformadas através dos métodos descritos em Luchansky et ai., Mol. Microbiol. 2: 637-646, 1988 aqui incorporado por referência. O maior número de transformantes é consistentemente recuperado após electroporação da mistura de ADN-células suspensa em peb 2,5x utilizando 6250 v por cm a 25 pFD. 25 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ Métodos para transformação de levedura através de electroporação são divulgados em Becker e Guarente, Methods Enzymol. 194: 182, 1990.

As células transformadas com sucesso, i.e. células contendo uma molécula do presente invento, podem ser identificadas através de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, podem ser utilizados oligos marcados e/ou marcadores de GFP.

Assim, para além das próprias células hospedeiras transformadas, o presente invento contempla também uma cultura dessas células, de preferência uma cultura monoclonal (clonalmente homogénea), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente.

Em relação às plantas, é considerado que o presente invento inclui culturas de células em suspensão derivadas de uma única célula, protoplastos isolados ou plantas estavelmente transformadas.

Embora as moléculas do presente invento possam ser introduzidas em qualquer célula hospedeira adequada, notar-se-á que estas são desenhadas primariamente para serem eficazes em células animais ou vegetais apropriadas, particularmente aquelas que possuem um ou mais locais no seu ADN aos quais a molécula do presente invento se pode ligar.

Assim, as células animais ou vegetais que contêm uma molécula do presente invento cuja presença suprime a expressão de um determinado gene, ou os animais ou plantas contendo estas células, podem ser considerados como tendo o gene "desligado" no sentido em que este já não pode ser expresso. A inactivação da cromatina através de desacetilação das histonas pode ser essencialmente irreversível sem mais intervenção. A repressão através de desacetilação das histonas pode ser invertida através da utilização de um inibidor da histona-desacetilase, por exemplo Tricostatina A (TSA), Trapoxina ou butirato de sódio (NaB), tal como é conhecido dos peritos na especialidade. De modo semelhante, a metilação pode ser essencialmente irreversível sem mais intervenção, por exemplo administração de 26 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ inibidores/inversores da metilação, que são conhecidos na especialidade e incluem o composto azacitidina. Outros inibidores de metilação incluem 5-desoxi-azacitidina, ou, por exemplo, oligos anti-sentido (ou supressores da expressão génica tal como aqui descritos) dirigidos a uma ADN-metiltransferase.

Facilmente se notará que a introdução de uma molécula do presente invento numa célula animal ou vegetal permitirá o direccionamento da molécula para um local de ligação apropriado no ácido nucleico, por exemplo ADN (e que é ligada através da porção de ligação ao ADN do polipéptido) e permitirá a supressão ou inactivação ou outra modulação da expressão génica, por exemplo permitindo que a cromatina no local de ligação alvo ou associada a este seja inactivada. Tipicamente, a molécula do presente invento é seleccionada de modo a que atinja um gene seleccionado. Assim, adequadamente, o gene alvo possui um local ao qual se liga a porção de ligação ao ADN da molécula associada a este. O local ao qual se liga assim pode estar no próprio gene, por exemplo num intrão ou num exão do gene; ou pode estar numa região a 5' da porção transcrita do gene, por exemplo numa região promotora ou estimuladora ou adjacente a esta; ou pode estar numa região a 3' da porção transcrita do gene.

Os genes regulados pelo receptor do estrogénio (ER) incluem o gene do receptor da progesterona (PR) e o gene de PS2 (proteina relacionada com a sindrome de Holtermueller Wiedmann). Assim, o método do presente invento pode ser utilizado para inactivar o gene de PR ou o gene de PS2 quando a porção de ligação ao ADN do composto do presente invento for capaz de se ligar ao local de ligação de ER. A terapia anti-estrogénio é utilizada no tratamento de cancro da mama. O repertório completo dos genes regulados pelo estrogénio envolvidos em cancro da mama é actualmente desconhecido. Considera-se geralmente que a terapia anti-estrogénio resulta na expressão alterada de genes chave regulados por estrogénio envolvidos no crescimento e na transformação das células de cancro da mama. Os métodos do presente invento descritos abaixo, podem proporcionar um modo alternativo, potencialmente mais eficaz, de regular a expressão (particularmente de inibir) de genes que respondem a 27 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ estrogénio. Pode ser que para certas porções de ligação ao ADN, numa dada célula vegetal ou animal exista somente um local alvo e a expressão de apenas um gene seja suprimida ou modulada pela porção repressora, modificadora ou de inactivação da cromatina. Contudo, pode haver mais de um local alvo e a introdução de uma molécula do presente invento pode conduzir à supressão da expressão de vários genes. A capacidade de suprimir a expressão de um gene seleccionado é útil em muitas áreas da biologia.

Tipicamente, quando o gene cuja expressão é suprimida está numa célula animal, a célula animal é uma célula dentro de um animal e o método do presente invento é utilizado para suprimir a expressão de um gene seleccionado num animal (que pode ser um ser humano ou um animal não humano). Exemplos de utilizações particulares em células animais incluem a inactivação especifica de alelos de proteínas oncogénicas tais como Ras mutante e Bcl-10 mutante; a inibição da expressão de genes regulados pelo receptor de estrogénio em cancro da mama; a inibição do receptor de androgénio; a inibição de genes de interesse para estudos de desenvolvimento; a inibição de genes para desenvolvimento de modelos transgénicos de doenças humanas, por exemplo cancro; a elucidação de vias bioquímicas, por exemplo vias de sinalização; estudos de validação de alvos de fármacos/modelos celulares para doenças; e a inibição de genes envolvidos em modelação de tecidos, tal como verificado em cancro e na cicatrização de feridas.

Também tipicamente, a célula vegetal é uma célula dentro de uma planta e o método do presente invento é utilizado para suprimir a expressão de um gene seleccionado numa planta.

Numa concretização, o método do presente invento é utilizado para suprimir a expressão de genes socialmente ou ambientalmente inaceitáveis ou indesejáveis em plantas transgénicas comercialmente modificadas. Tais genes podem incluir, por exemplo, genes marcadores seleccionáveis por antibióticos ou herbicidas. Nesta concretização, o gene na planta transgénica é direccionado para silenciação. 28 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Noutra concretização do presente invento pode ser alcançada uma nova arquitectura da planta ou morfologia floral atingindo alguns genes homeóticos conhecidos envolvidos nestas vias de desenvolvimento.

Adequadamente, o método do presente invento é utilizado para suprimir ou inactivar a expressão de um gene cuja expressão seja desejável suprimir ou inactivar. Tais genes incluem oncogenes, genes virais incluindo genes presentes em genomas pró-virais e assim o método em relação a animais pode constituir um método de tratamento médico. Os oncogenes podem ser sobre-expressos em certos cancros e pode ser desejável suprimir a sua expressão. Alguns oncogenes são oncogénicos em virtude de terem uma mutação activadora. Utilizando o método do presente invento a supressão selectiva da expressão de um oncogene mutante pode ser conseguida utilizando uma porção de ligação ao ADN que se ligue selectivamente à sequência do oncogene mutante e em que a porção repressora ou modificadora, por exemplo a porção de inactivação da cromatina suprima a expressão do oncogene mutante, por exemplo através da inactivação da cromatina na qual reside o oncogene ou com a qual este está associado. A supressão da sobre-expressão do oncogene ou da expressão do oncogene mutante (especialmente activado) é geralmente desejável no tratamento de cancros em que os oncogenes têm um papel. Os oncogenes mutantes que podem ser atingidos pelo método do presente invento incluem Ras e Bcl-10. Estes podem ser atingidos por porções de ligação ao ADN capazes de reconhecer os genes mutados de um modo especifico da sequência. A expressão de genes virais numa célula animal ou vegetal é geralmente indesejável uma vez que esta expressão está frequentemente associada a patogénese. O ácido nucleico de certos virus pode ser formado na cromatina e a expressão de tais genes virais pode ser controlada através da modificação desta cromatina. Por exemplo, os pró-virus retrovirais (i.e., cópias de ADN de ARN retrovirais) estão frequentemente incorporados em genomas animais e vegetais onde se tornam parte da cromatina, por exemplo, pró-vírus de HIV integrado e papilomavírus humano integrado. Retrotransposões semelhantes a Gypsy e Copia parecem estar amplamente distribuídos no reino vegetal. Os retrotransposões 29 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ semelhantes a Copia, ou pelo menos os seus domínios de transcritase inversa, surgem amplamente distribuídos nas plantas superiores enquanto que os elementos semelhantes a Gypsy (que partilham a sua organização com os retrovírus mas não possuem os domínios do envelope retroviral) são menos abundantes (Suoniemi et al., Plant J. 13: 699-705, 1998). A integração do ADN virai no genoma vegetal foi demonstrada para o ADN geminiviral no genoma nuclear de tabaco (Bejarano et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 759-764, 1996). Potenciais retrovírus foram também recentemente descritos em plantas (Wright e Voytus, Genetics 149: 703-715, 1998). Utilizando o método do presente invento pode ser alcançada a supressão selectiva da expressão de um gene virai. O domínio de ligação ao ácido nucleico do oligonucleótido/mimético/ análogo pode ser utilizado para atingir uma porção repressora ou de modificação, por exemplo de inactivação da cromatina, e conduzir à inactivação do genoma proviral através da ligação a transcritos de ARN genómico nascentes, alcançando (por exemplo) desacetilação das histonas por proximidade.

Certas doenças genéticas são causadas por mutações dominantes, tais como a acondroplasia. A supressão da expressão do alelo mutante pode ser útil no tratamento destas doenças. Utilizando o método do presente invento a supressão selectiva da expressão do alelo mutante pode ser alcançada utilizando uma porção de ligação ao ADN que se ligue selectivamente à sequência do alelo mutante e em que (por exemplo) a porção de inactivação da cromatina inactiva a cromatina em que o alelo mutante reside ou com a qual este está associado de modo a que a expressão do alelo mutante seja suprimida.

Estes métodos do presente invento envolvem tipicamente a transferência da molécula do presente invento para uma célula animal ou vegetal.

Os sistemas de transferência úteis com oligonucleótidos ou fusões oligonucleótido-péptido serão conhecidos dos peritos na especialidade e podem ser úteis na prática dos métodos do presente invento em que a molécula do presente invento é introduzida numa célula dentro ou fora do corpo do animal. Por exemplo, podem ser utilizados métodos baseados em 30 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ lipossomas ou vírus. A electroporação (ver, por exemplo, Kuznetsova et al., Nuc. Acids Res. 27(20): 3995-4000, 1999), métodos balísticos, lípidos catiónicos (por exemplo tal como descrito em Felgner et al., Hum. Gene Ther. 8: 511-512, 1997 ou WO 99/13719) ou ligandos específicos unidos à porção oligonucleótido ou polipéptido da molécula, ou ao transportador podem ser utilizados, por exemplo tal como descrito em WO 99/13719.

Podem ser utilizados métodos de transferência virai ou não virai. Vários vírus foram utilizados como vectores de transferência génica, incluindo papovavirus, p. ex. SV40 (Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992), adenovírus (Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992; Berkner, et al., BioTechniques 6: 616-629, 1988; Gorziglia e Kapikian, J. Virol. 66: 4407-4412, 1992; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 2581-2584, 1992; Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155, 1992; Wilkinson et al., Nucleic Acids Res. 20: 2233-2239, 1992; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1: 241-256, 1990), vírus vacínia (Moss, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992), vírus adeno-associado (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992; Ohi et al., Gene 89: 279-282, 1990), herpesvírus incluindo HSV e EBV (Margolskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 67-90, 1992; Johnson et al., J. Virol. 66: 2952- 2965, 1992; Fink et al., Hum. Gene Ther. 3: 11-19, 1992; Breakfield e Geller, Mol. Neurobiol. 1: 337-371, 1987; Freese et al., Biochem. Pharmacol. 40: 2189-2199, 1990), e retrovírus de origem aviária (Brandyopadhyay e Temin, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984; Petropoulos et al., J. Virol. 66: 3391-3397, 1992), de murídeo (Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5: 431-437, 1985; Sorge et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1730-1737, 1984; Mann e Baltimore, J. Virol. 54: 401-407, 1985; Miller et al., J. Virol. 62: 4337-4345, 1988) e humana (Shimada et al., J. Clin. Invest. 88: 1043-1047, 1991; Helseth et al., J. Virol. 64: 2416-2420, 1990; Page et al., J. Virol. 64: 5370-5276, 1990; Buchschacher e Panganiban, J. Virol. 66: 2731-2739, 1992). Até à data a maioria dos protocolos de terapia génica humana basearam-se em retrovírus de murídeo incapacitados. 31 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ Métodos de transferência génica não virais conhecidos na especialidade incluem técnicas químicas tais como co-precipitação com fosfato de cálcio (Graham van der Eb, Virology 52: 456-467, 1973; Pellicer et al., Science 209: 1414-1422, 1980); técnicas mecânicas, por exemplo micro- injecção (Anderson et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5399-5403, 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., Cell 27: 223-231, 1981; Constantini e Lacy, Nature 294: 92-94, 1981); transferência mediada por fusão de membranas através de lipossomas (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7413-7417, 1987; Wang e Huang, Biochemistry 28: 9508-9514, 1989; Kaneda et al., J. Biol. Chem. 264: 12126-12129, 1989; Stewart et al., Hum. Gene Ther. 3: 267-275, 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., Círculation 83: 2007-2011, 1992); e

tomada directa de ADN e transferência de ADN mediada por receptores (Wolff et al., Science 247: 1465-1468, 1990; Wu et al., J. Biol. Chem. 266: 14338-14342, 1991; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3655-3659, 1990; Wu et al., 1989b; Wolff et al., BioTechniques 11: 474-485, 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 4255-4259, 1991; Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4033-4037, 1990; Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8850-8854, 1991a; Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1991b). A transferência génica mediada por virus pode ser combinada com transferência génica directa in vivo utilizando entrega por lipossomas, permitindo dirigir os vectores virais para as células tumorais e não para as células vizinhas que não se dividem.

Outros sistemas adequados incluem o sistema híbrido retroviral-adenoviral descrito por Feng et al., Nature Biotechnology 15: 866-870, 1997, ou sistemas virais com ligandos direccionadores tais como fragmentos Fv de cadeia simples.

Numa abordagem que combina métodos de transferência génica biológicos e físicos, o ADN plasmídico (ou, por exemplo, a fusão oligonucleótido/péptido) de qualquer tamanho é combinado com um anticorpo conjugado com polilisina específico para a proteína hexão adenoviral, e o complexo resultante é ligado a um vector adenoviral. O complexo trimolecular é então utilizado para infectar células. O 32 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ vector adenoviral permite uma ligação, internalização e degradação do endossoma eficientes antes do ADN acoplado ser danificado.

Ebbinghaus et ai., Gene Ther. 3(4): 287-297, 1996, descreve métodos através dos quais os TFO podem ser distribuídos às células utilizando complexos de adenovírus-polilisina. Pichon et ai., Nucl. Acids Res. 28(2), 2000, descreve métodos através dos quais a tomada, entrega citosólica e acumulação nuclear dos oligonucleótidos podem ser melhoradas utilizando oligolisinas histidiladas.

Mostrou-se que os complexos lipossomas/ADN são capazes de mediar transferência génica directa in vivo. Embora em preparações padrão de lipossomas o processo de transferência génica não seja especifico, tomada localizada in vivo e expressão foram relatadas em depósitos tumorais, por exemplo, após administração directa in situ (Nabel, Hum. Gene Ther. 3: 399-410, 1992) . São preferidas técnicas de transferência génica que dirigem a molécula directamente para uma célula ou tecido alvo. A transferência génica mediada por receptores, por exemplo, é alcançada através da conjugação do ADN com um ligando proteico através de polilisina. Os ligandos são escolhidos com base na presença dos correspondentes receptores do ligando na superfície celular do tipo de célula/tecido alvo. Estes conjugados ligando/ADN podem ser injectados directamente no sangue se desejado e dirigem-se ao tecido alvo onde ocorre a ligação ao receptor e a internalização do complexo ADN-proteina. Para superar o problema da destruição intracelular do ADN, pode ser incluida co-infecção com adenovirus para destruição da função do endossoma.

De preferência, o método de supressão ou modulação da expressão de um gene seleccionado é utilizado para suprimir (ou modular) a expressão de um gene numa célula humana; numa concretização particularmente preferida a célula humana está dentro do corpo de um ser humano. 33 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Contudo, ο método do presente invento pode envolver a modificação de células animais (incluindo células humanas) fora do corpo de um animal (i.e. um tratamento ex vivo das células) e as células assim modificadas podem ser reintroduzidas no corpo do animal. O método do presente invento pode também envolver a investigação ou caracterização in vitro de células modificadas, por exemplo na identificação de potenciais fármacos alvo ou na pesquisa de compostos candidatos quanto a actividades ou propriedades potencialmente farmaceuticamente úteis.

Do antecedente, notar-se-á que o método do presente invento pode ser útil para suprimir a actividade de uma pluralidade de genes seleccionados. Em particular, o método do presente invento pode ser utilizado para suprimir a actividade de um grupo de genes cuja expressão seja controlada, pelo menos em grande medida, por um único factor de transcrição. Por exemplo, o método pode ser utilizado para suprimir genes regulados por estrogénio.

As moléculas do presente invento, e os métodos do presente invento, podem ser utilizados para analisar o papel de genes em, entre outras coisas, desenvolvimento floral, regulação/adaptação ao frio e respostas das plantas ao etileno ou a patogénios nestes processos de desenvolvimento e noutros processos.

Outro aspecto do presente invento proporciona a utilização de uma molécula do presente invento no fabrico de um agente para supressão (ou modulação) da expressão do gene seleccionado numa célula (de preferência eucariótica). É preferido que o gene seleccionado seja um gene endógeno. Outras preferências indicadas acima em relação a aspectos iniciais do presente invento também se aplicam.

Notar-se-á que é particularmente preferido que a molécula seja utilizada na preparação de um medicamento para supressão (ou modulação) da expressão de um gene seleccionado num animal. Para evitar dúvidas, por "animal" incluímos animais humanos e não humanos. 34 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Outro aspecto do presente invento proporciona um método de tratamento de um paciente a necessitar de supressão (ou modulação) da expressão de um gene seleccionado, compreendendo o método a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma molécula do presente invento.

Notar-se-á que a supressão da expressão de um gene seleccionado é útil quando a expressão ou a sobre-expressão do gene seleccionado é indesejável e contribui para um estado de doença no paciente. Exemplos de expressão indesejável de um gene incluem a expressão de certos oncogenes activados em cancro. Um aumento na expressão do gene seleccionado pode ser útil quando a falta ou a expressão insuficiente do gene seleccionado é indesejável e contribui para um estado de doença no paciente. Por exemplo, a expressão insuficiente de um gene supressor tumoral pode contribuir para cancro; do mesmo modo, pode ser útil aumentar a expressão do gene supressor tumoral. A supressão da expressão dos genes supra-regulados por ER é desejável no tratamento de cancro da mama. De modo semelhante, a supressão da expressão de genes regulados pelo receptor de androgénio (AR) é desejável no tratamento de cancro da próstata.

Outros aspectos do presente invento proporcionam a utilização de uma molécula do presente invento no fabrico de um medicamento para supressão (ou modulação) da expressão de um gene seleccionado num paciente a necessitar de tal supressão (ou modulação).

Ainda outros aspectos do presente invento proporcionam uma molécula do presente invento para utilização em medicina. Assim, a molécula do presente invento é embalada e apresentada para utilização em medicina.

Contudo ainda outros aspectos do presente invento proporcionam uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula do presente invento e um transportador farmaceuticamente aceitável. 35 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Por "farmaceuticamente aceitável" fica incluído que a formulação é estéril e apirogénica. Os transportadores farmaceuticamente adequados são bem conhecidos na especialidade de farmácia. 0 presente invento será agora descrito mais detalhadamente em referência às seguintes Figuras e Exemplos em que:

Figura 1: Representação esquemática de moléculas de fusão e ligação a um local alvo

Em A, "1" representa o módulo 1 do oligonucleótido do Exemplo 1; "2" representa o módulo 2 do polipéptido. "L" indica uma região ligante. Em B, D representa um péptido de entrega adicional. Os péptidos podem ser ligados a qualquer uma ou a ambas as extremidades do oligonucleótido; por exemplo, o polipéptido repressor/modificador pode ser ligado a uma extremidade e o péptido de entrega à outra. C representa a situação onde a porção oligonucleotidica formou uma hélice tripla com adn de cadeia dupla e o péptido repressor recrutou o complexo Sin3-HDAC para o local.

Figura 2: Quantificação de ARNm de receptor de androgénio

As colunas representam a expressão de ARNm como percentagem do valor de controlo. Cada coluna é um representante da DO média e do erro padrão da média de quatro reacções em cadeia da polimerase independentes. Foram determinadas as densidades ópticas médias.

Figura 3: Efeito de ARP-L218 e R1881 na quantidade de ARNm do receptor de androgénio

Análise de RT-PCR do ARNm do receptor de androgénio. Após coloração com brometo de etídio foi determinada a quantidade de amplicões sujeitos a electroforese em unidades arbitrárias utilizando um leitor de imagens Labworks. As colunas representam uma experiência N=l.

Figura 4: Efeito de ARP-L218 e acetato de ciproterona na quantidade de ARNm do receptor de androgénio

Análise de RT-PCR do ARNm do receptor de androgénio. Após coloração com brometo de etidio foi determinada a quantidade de amplicões sujeitos a electroforese em unidades 36 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ arbitrárias utilizando um leitor de imagens Labworks. As colunas são um representante de uma experiência N=l, respectivamente.

Figura 5: Infra-regulação do gene incorporado no genoma estimulado por interferão Células portadoras de EGFP sob o controlo do elemento de resposta estimulado por interferão (ISRE) do gene 6-16 humano foram transfectadas transientemente com diferentes compostos. As células foram então tratadas com 300 unidades/ml de IFN durante um dia e analisadas através de FACS quanto à expressão de GFP. a) Linha celular parental, sem tratamento b) Células que expressam a construção transfectada estavelmente (C8), sem tratamento c) C8 tratadas com interferão (+INF)

d) C8 transfectadas com TFO 500 pm, +INF

e) C8, TFO especifico 1000 pM, +INF

f) C8, GenelCE 500 pM, +INF

g) C8, GenelCE 2500 pM, +INF

h) C8, TFO de controlo inespecífico 500 pM, +INF

i) C8, TFO de controlo inespecifico 1000 pM, +INF

Figura 6: Imunoprecipitação de Cromatina do ADN do receptor de androgénio

Um exemplo do tipo de dados que podem ser produzidos pelo Exemplo 10. Os dados mostram a Imunoprecipitação da

Cromatina de células Parentais MCF-7 Tet-OFF e de linhas celulares estavelmente transfectadas PLZF-ER. As linhas MCF7-TO ou MCF7 JP13 (com PLZF-ER, um gene de remodelação da cromatina indutivel por tetraciclina ligado a um péptido de ligação ao ADN do receptor da progesterona) foram criadas até 80% de confluência em vermelho de fenol sem DMEM, DSS a 5%, P/S/G mais reagentes de selecção e Dox conforme necessário. As células foram tratadas com E2 (10 8 M) ou com um controlo de etanol durante 30 minutos a 37°C antes de ligação cruzada com formaldeido e ultra-sons. O painel superior mostra o produto de PCR PR utilizando ADN associado a cromatina imunoprecipitada (P) ou ADN total extraído das células (S), 37 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

utilizando anticorpo de histona H4 acetilada. As células sem (MCF7-TO) ou com (MCF7 JP13) a construção PLZF-ER foram criadas na presença ( + ) ou na ausência (-) de TET. O painel inferior mostra o produto de PCR PR expresso relativamente à quantidade de produto de PCR PR utilizando ADN imunoprecipitado com uma histona H4 acetilada.

Figura 7: Infra-regulação da secreção da proteína PSA em células LNCap através de ARP-L218

As células foram incubadas na presença de R1881 durante 3 dias. Os niveis de PSA nos sobrenadantes foram medidos através de ELISA. Cada coluna representa o antigénio específico da próstata (PSA) total.

Exemplo 1: Construção e utilização de moléculas de fusão oligo-péptido regulador.

Foi produzida uma série de conjugados oligopeptídicos úteis como moléculas reguladoras de genes. Estes consistem em pelo menos duas porções ou módulos específicos, nomeadamente um oligonucleótido capaz de forma uma hélice tripla de ADN com uma sequência alvo de cadeia dupla seleccionada (Oligonucleótido Formador de Tríplex, ou TFO; Módulo 1); e uma sequência peptídica discreta derivada de um repressor ou activador do gene (Módulo 2) . O TFO é fundido com o péptido repressor ou activador.

Como exemplo, o TFO é desenhado para formar um tríplex com o Elemento de Resposta Estimulável por Interferão (ISRE) do Gene 6-16 Estimulado por Interferão (ISG) humano (Porter, A., et al., EMBO J. 7: 85-92, 1988). O ISRE é muito rico em purinas numa cadeia de ADN e é, consequentemente, uma sequência candidata para formar um tríplex de ADN através de emparelhamento de bases de Hõogsteen. As regras para desenhar potenciais TFO estão resumidas em: Vasquez K.M. e Wilson J.H., Trends. Biochem. Sei. 1: 4-9, 1998. A sequência 5'-AAAGTAAAAGGGGAGAGAGGG-3' foi produzida como um oligonucleótido (Módulo 1) com uma extremidade 5' activada para ligação química aos péptidos do Módulo 2. Os péptidos do Módulo 2 explorados neste estudo incluem (pelo menos uma cópia do domínio mínimo activador da transcrição da proteína Activadora da Transcrição VP16 do Vírus de Herpes Simples, por exemplo a sequência 38 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ de aminoácidos GGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDML ou GGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDML-CONH2 (incluindo o ligante GGG)), e o domínio repressor da transcrição humano MADl (por exemplo os aminoácidos XXXMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP (onde XXX é, por exemplo, um ligante AAA ou DDD)) . O último é uma região que se sabe que interage com a proteína Sin3a do complexo histona-desacetilase. Adicionalmente, explorámos a utilização dos aminoácidos XXXMAVESRVTQEEIKKEPEKPIDREKTCPLLLRVF (onde XXX é, por exemplo, um ligante AAA ou DDD) da proteína Sapl8 humana, que também se sabe que se associa com a proteína Sin3a. Esta região corresponde a uma sequência de elevada conservação evolutiva e sobrepõe-se a uma região que pode mediar repressão génica. Os péptidos do Módulo 2 foram sintetizados numa forma activada para permitir a subsequente ligação ao oligonucleótido activado do Módulo 1 através de química de "ligação nativa" (ver WO 01/15737 e Stetsenko e Gait, Organic. Chem. 65(16): 4900-4908, 2000), em que um péptido N-terminal com função tioéster é ligado a um oligonucleótido 5'-cisteinilo.

As linhas celulares para o trabalho de transfecção incluíram células COS e células de fibrossarcoma humano HT1080. As células foram transfectadas transientemente utilizando um método de transfecção padrão baseado em lipossomas (ou alternativamente outro método de entrega, por exemplo electroporação ou micro-injecção) com um gene repórter de luciferase regulado por ISRE juntamente com uma quantidade variável de conjugado oligopeptídico. Isto permite fazer uma comparação da expressão de luciferase dependente do Interferão com os efeitos reguladores do gene mediados pelo oligopéptido. Como controlos da especificidade, as células foram também tratadas com o oligonucleótido, o péptido ou ambos (i.e., como moléculas separadas, não ligadas). Após tempos adequados, por exemplo 0,5, 1, 2, 4, 8 e/ou 12 horas, as células foram estimuladas com IFN e a actividade do gene repórter foi medida utilizando um ensaio da enzima luciferase baseado num luminómetro. A correcção para a eficiência de transfecção foi determinada através da utilização de um gene de controlo de GFP não dependente do interferão. 39 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Investigou-se a capacidade dos vários conjugados oligopeptídicos para activar ou reprimir a transcrição de genes que respondem a IFN. A entrega da concentração crescente da molécula de fusão oligo-MADl reprime a actividade do gene repórter de um modo dependente da concentração. De modo semelhante, a entrega da molécula de fusão Sapl8-oligo reprime a actividade do gene. Adicionalmente, a entrega de oligoVPlô a células contendo o gene repórter resulta em actividade do gene repórter na ausência de IFN. Após o TFO (i.e. sem um domínio peptídico) ter sido distribuído às células para além de uma molécula de fusão oligo-péptido, a repressão da actividade do gene foi menor do que a observada com a molécula de fusão sozinha, i.e. a repressão foi equivalente à observada com uma concentração mais baixa da molécula de fusão. Este resultado mostra que as moléculas com o péptido repressor são reguladores mais eficazes da actividade génica do que o TFO sem um domínio peptídico, e o TFO pode competir com a molécula de fusão oligo-péptido pela ligação à sequência alvo. O oligo e o péptido sozinhos ou adicionados juntos não tiveram nenhum efeito repressor, demonstrando a especificidade dos conjugados oligopeptídicos na regulação génica.

Este exemplo demonstra o desenho e a construção de moléculas de fusão consistindo em oligonucleótidos de ligação ao ADN e péptidos funcionais, e a sua entrega às células. Os conjugados oligopeptídicos podem atingir genes específicos e as sequências peptídicas repressoras que medeiam GenelCE podem reprimir genes de um modo específico, direccionado. Assim, podem ser desenhados conjugados oligopeptídicos para serem potentes reguladores da actividade génica.

Exemplo 2: Repressão de genes cromossómicos por moléculas de fusão oligo-regulador

As moléculas de fusão são capazes de regular a actividade génica, quando tais genes são integrados no genoma. Moléculas de fusão contendo um oligonucleótido de ligação ao ADN (TFO) fundido com um péptido MADl, Sapl8 ou VP16 foram desenhadas e construídas tal como descrito no Exemplo 1. 40 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

As células foram transfectadas tal como descrito no Exemplo 1 com genes repórteres contendo ISRE, e foram seleccionadas linhas celulares que expressavam estavelmente estes genes. Nestas linhas celulares estáveis, o gene é integrado no genoma e pode portanto funcionar como um gene endógeno.

As moléculas de fusão foram distribuídas às células e as experiências foram realizadas tal como descrito no Exemplo 1. Para além disso, a repressão foi medida a diferentes momentos para estabelecer um curso de tempo dos efeitos repressores. As moléculas de fusão foram repressores mais eficazes que os TFO sozinhos. O efeito foi também especifico (por exemplo, o péptido e o oligonucleótido não fundidos não tiveram o mesmo efeito que a fusão oligo-péptido). Adicionalmente, a repressão através de moléculas de fusão foi observada a momentos mais tardios do que qualquer repressão observada pelo TFO sozinho, sugerindo um efeito mais permanente. Novamente, a molécula de fusão com o péptido VP16 foi capaz de activar a expressão do gene.

Assim, as moléculas de fusão descritas no Exemplo 1 são capazes de regular a actividade génica cromossómica. As moléculas de fusão com uma porção direccionadora oligonucleotidica de ligação ao ADN são capazes de atingir genes cromossómicos específicos. Um péptido repressor GenelCE fundido com o oligonucleótido de ligação ao ADN pode reprimir a actividade génica cromossómica predeterminada. Assim, as moléculas de fusão descritas são potentes reguladores da actividade de genes cromossómicos. A regulação de genes endógenos é medida, por exemplo através da avaliação da transcrição do gene (por exemplo utilizando PCR) ou através da avaliação da quantidade ou da actividade do polipéptido codificado. Num exemplo, o oligonucleótido é dirigido para o local regulador do gene do receptor de Androgénio. Em particular, o oligonucleótido possui a sequência 5'-gggaaaggaaaagaggggaggg-3' ou 5'-gggaggggaaaggaaaagagg-3'.

Num exemplo, a linha celular de cancro da próstata LnCap é tratada com a fusão oligonucleótido-péptido compreendendo um péptido MADl ou Sapl8 tal como descrito no Exemplo 1. As 41 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ células transfectadas são opcionalmente identificadas e/ou isoladas (por exemplo utilizando um marcador de GFP e técnicas de FACS) e ensaiadas quanto à expressão do gene do receptor de androgénio bem como quanto ao marcador clássico do cancro da próstata PSA. Por exemplo, células positivas para GFP, separadas por FACS foram cultivadas na presença ou ausência do agonista de AR, R1881. Após 72 horas, os meios de cultura foram recolhidos e a quantidade de proteína PSA regulada por androgénio foi determinada através de imunoensaio. A adição de R1881 resulta num aumento de aproximadamente 25 vezes nos níveis de PSA segregada em células de controlo (sem nenhuma fusão oligonucleótido-péptido, ou com uma fusão oligonucleótido-péptido irrelevante). Por contraste os níveis de PSA no teste de células transfectadas com o oligonucleótido-péptido foram elevados apenas cerca de 5 vezes, demonstrando uma diminuição de cerca de 5 vezes nos níveis de PSA, relativamente às células de controlo. Isto demonstra repressão de um gene endógeno.

Alternativamente, é utilizada PCR para detectar e quantificar a expressão e mostrar que as fusões oligonucleótido-péptido reprimem a expressão do gene endógeno do receptor de androgénio bem como a expressão do gene regulado por Androgénio. A linha celular T47D humana positiva para o Receptor de Androgénio (AR) é infectada com a fusão oligonucleótido-péptido de teste (por exemplo marcada com proteína fluorescente verde (GFP)) ou com uma fusão olignucleótido-péptido irrelevante (que pode também ser marcada com GFP). As células infectadas podem ser purificadas através de FACS e as células positivas para GFP cultivadas na presença do ligando de AR, R1881, antes de serem colhidas e de ser preparado o ARN. A expressão do gene do receptor de androgénio bem como dos genes regulados por androgénio PSA e DRG-1 e de um gene não regulado por androgénio GAPDH, foi determinada através de PCR. Isto demonstra a repressão de um gene endógeno.

Exemplo 3: Ligação da molécula de fusão a uma sequência alvo e complexo histona-desacetilase.

Este Exemplo demonstra que a molécula de fusão se liga a uma sequência alvo específica bem como a um componente do 42 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ complexo histona-desacetilase. As moléculas de fusão contendo um oligonucleótido (TFO) e um péptido repressor foram produzidas tal como descrito no Exemplo 1.

As diferentes moléculas de fusão foram incubadas com oligonucleótido marcado, que foi tornado complementar à parte oligo de uma fusão. As mesmas moléculas de fusão foram também incubadas com Sin3, que é um componente de um complexo de desacetilação da histona. Para além disso, as fusões foram também incubadas tanto com o oligonucleótido complementar como a proteína Sin3.

Os complexos foram então analisados através de métodos padrão de análise do deslocamento de bandas. As moléculas de fusão foram capazes de se ligar separadamente e simultaneamente tanto ao oligonucleótido complementar marcado bem como à proteína Sin3. As fusões inespecíficas não foram capazes de se ligar ao oligo marcado ou a Sin3, demonstrando assim a especificidade do efeito com fusões repressoras.

Pode-se concluir que as fusões repressoras se podem ligar especificamente às suas sequências alvo. As fusões repressoras são capazes de recrutar complexos de histona-desacetilase através da ligação a proteínas que são parte deste complexo, e através da ligação às suas sequências alvo e do recrutamento de complexos de histona-desacetilase simultaneamente, as moléculas de fusão descritas são repressores muito potentes e específicos da actividade génica.

Exemplo 4: Protocolo de validação do alvo. A sequência de ADN disponível para o gene de interesse (incluindo a sequência flanqueadora) é analisada para seleccionar um local adequado para lhe direccionar um oligo/péptido. O oligo/péptido é sintetizado e pode ser testado antes da utilização nas células ou animais ou seres humanos pretendidos, por exemplo utilizando um sistema de gene repórter. O oligo/péptido pode ser utilizado ou melhor testado em células in vitro ou em animais ou seres humanos.

Uma vez proporcionada uma sequência génica, o processo envolverá: 43 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ - Ο gene de interesse (incluindo sequências flanqueadoras se necessário) será pesquisado em busca de elementos de sequência únicos que não se encontram noutras partes do genoma humano utilizando ferramentas de escrutínio de dados bio-informáticas (por exemplo o programa do Genetics Computer Group (GCG) tal como utilizado em Perkins et al., Biochemistry 37: 11315-11322, 1998). Uma molécula de ligação ao ADN baseada num ácido nucleico que se preveja que se liga à sequência única identificada (por exemplo como um TFO) é desenhada e sintetizada. É provável que a molécula de ligação ao ADN seja um oligonucleótido, de preferência com as seguintes caracteristicas: a) pelo menos 16 nucleótidos de comprimento b) dirigida a um promotor do gene ou ao local de iniciação da transcrição do gene ou perto deste. É preferido que o local alvo para a ligação a um TFO seja rico em purinas numa cadeia. O TFO pode ser rico em pirimidinas (predominantemente C ou T) ; rico em purinas (predominantemente G ou A) ou misto (predominantemente G ou T, ou G, A ou T) . TFO CT são considerados ligarem-se num motivo paralelo, no qual a terceira cadeia (TFO) tem a mesma orientação de 5' para 3' que a cadeia de purinas do dúplex. Os TFO GA são considerados como ligando-se num motivo antiparalelo, em que o TFO é orientado de forma oposta à cadeia de purinas. Os TFO mistos podem-se ligar num motivo paralelo ou antiparalelo, dependendo da sequência alvo. O emparelhamento de bases surge da formação de ligações de hidrogénio de Hoogsteen em tríplices paralelos (T:AT, C+:GC e G:GC) e ligações de hidrogénio inversas de Hoogsteen em tríplices antiparalelos (G:GC, A:AT e T:AT).

Pretende-se que o oligonucleótido seja um oligonucleótido de ADN, possivelmente com modificações químicas estabilizantes. Podem ser utilizadas bases alternativas, por exemplo N6-metil-8-oxo-2-desoxiadenina em 44 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ vez de citosina, 2-desoxi-6-tioguanina em vez de guanina ou 7-desaza-2-desoxixantina em vez de timina. - O péptido ou péptidos repressores podem ser produzidos em bruto utilizando um sintetizador de péptidos e podem ser armazenados congelados até serem utilizados. - A construção de péptido repressor-molécula de ligação ao ADN é preparada e purificada. A guimica utilizada pode ser a descrita em WO 01/15737. Estão disponíveis estojos em Link Technologies. - A construção pode ser controlada na sua qualidade através de espectroscopia de massa e/ou através da utilização do um oligonucleótido complementar marcado ou de porções de anticorpo marcadas (utilizando por exemplo marcadores fluorescentes, quimioluminescentes ou enzimáticos). Tipicamente num tal método a construção é adicionada a um suporte sólido no qual um anticorpo que se ligue à porção peptidica da construção é imobilizado e é adicionado um oligonucleótido marcado que se liga à porção oligonucleotidica da construção. Neste método a detecção do marcador ligado ao suporte sólido demonstra que a construção está intacta. Noutro formato típico o oligonucleótido pode ser unido a um suporte sólido e o anticorpo marcado. - Uma construção do gene repórter pode ser preparada para o gene de interesse (embora isto não seja geralmente necessário). - O oligonucleótido de ligação ao ADN candidato ou o oligo/péptido podem ser testados quanto ao seguinte: - Afinidade de ligação à sequência alvo; - Especificidade da ligação através de exposição a um chip de ADN do genoma inteiro. - O oligo/péptido pode ser testado quanto à eficácia utilizando o sistema do gene repórter. O oligo/péptido pode então ser utilizado para modular ou suprimir a expressão do gene de interesse na célula ou animal de interesse. 45 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Exemplo 5: Validação do alvo

As moléculas de fusão oligo/péptido serão utilizadas para validar fármacos alvo. Isto envolverá: - Realização do protocolo exposto no Exemplo 1. - Entrega da construção a células ou tecidos. Estes podem ser tecidos normais ou de doença, linhas celulares ou células primárias apropriadas ao estudo da molécula de interesse. - Análise do fenótipo através de gualquer método de análise da expressão; ou qualquer análise funcional tal como a avaliação da mobilidade e do crescimento celular ou análise da apoptose. - Comparação com quaisquer dados disponíveis para uma determinada doença e análise dos efeitos desejados tais como morte ou mobilidade celulares.

Os dados obtidos serão utilizados para validar os fármacos alvo predeterminados para programas de desenvolvimento de fármacos.

Exemplo 6: Exemplo de tratamento de um paciente. É produzida uma fusão oligo/péptido tal como descrito direccionada para genes regulados por androgénio ou estrogénio. As moléculas de fusão são preparadas num ambiente estéril e formuladas em lipossomas. Os lipossomas contendo a fusão são direccionados à vizinhança da mama ou da próstata. Os lipossomas são tomados pelas células de cancro e a transcrição mediada pelo receptor de androgénio ou de estrogénio é suprimida selectivamente nas respectivas células.

Exemplo 7: Pesquisa de identificação do alvo

As moléculas de fusão oligo/péptido será utilizadas para identificar fármacos alvos, isto envolverá: - Preparação de uma molécula de fusão tal como exposto no Exemplo 1. 46 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ - Entrega da molécula de fusão às células ou tecidos. Estas podem ser tecidos normais ou de doença, linhas celulares ou células primárias. - Análise do perfil de expressão génica resultante do silenciação génico, utilizando chips de ADN. Isto indica o efeito da construção na expressão génica global no modelo. - Análise do fenótipo através de qualquer método de análise da expressão, ou de qualquer análise funcional tal como mobilidade e crescimento celular ou análise de apoptose.

Os dados obtidos serão utilizados para encontrar potenciais fármacos alvo para doenças tais como cancro da mama ou da próstata. Estes alvos ainda podem ser validados através de métodos apropriados incluindo quaisquer outras pesquisas semelhantes, métodos in vitro e modelos celulares e animais.

Exemplo 8: Moléculas de fusão oligo/péptido dirigidas ao receptor de androgénio.

Tal como discutido no Exemplo 2, as moléculas de fusão oligo/péptido são capazes de regular a actividade génica quando os genes estão integrados no genoma. Neste exemplo proporcionamos mais dados experimentais que apoiam isto.

Construímos fusões entre um oligonucleótido de ligação ao ADN (TFO) direccionado para sequência promotora do gene do receptor de androgénio (ARP), e um péptido contendo uma sequência de 14 ou 29 aminoácidos do repressor MADl ligado a uma sequência de penetratina de 16 aminoácidos. A sequência do TFO de ARP utilizada neste exemplo foi: ARP TFO: (5') GFGUGGTGFGGTTGTGTT (3') U= 5-fluro-desoxiuracilo F= 2'-desoxi-6-tioguanina

Os TFO são modificados na extremidade 5' para conjugação tal como descrito por Gait et al., J. Org. Chem. 65: 4900-4908, 2000, e na extremidade 3' com uma ligação amino padrão para proteger de degradação. 47 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ A sequência oligonucleotídica é desenhada para formar um tríplex com a sequência promotora do receptor de androgénio. O TFO foi fundido com dois fragmentos peptidicos diferentes. Os fragmentos peptidicos utilizados neste exemplo foram: L217: HHHHHH-Penetratina-DDD-14aaMAD(Ligação)HHHHHHRQIKI WFQNRRMKWKKDDDMNIAMLLEAADYLE(amida) L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratina(Ligação)HHHHHHMNIAM LLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDRQIKIWFQNRRMKWKK(amida)

As sequências peptidicas de 14 e 29 aminoácidos são do domínio repressor da transcrição da proteína MADl, uma região que se sabe interagir com a proteína do complexo histona-desacetilase, Sin3a.

Os três resíduos de ácido aspártico (DDD) são uma sequência ligante, enquanto que a sequência peptídica de Penetratina medeia a translocação eficiente na membrana plasmática da molécula de fusão oligo/péptido.

Os resíduos HIS foram adicionados para proporcionar mais opções de purificação.

As experiências foram conduzidas na linha celular de tumor da próstata humano LNCap (Carcinoma da Próstata do Nódulo Linfático). As células LNCap foram obtidas na European Collection of Cell Cultures, número de acesso B9110211. As culturas foram criadas e propagadas em laboratório e utilizadas como monocamadas em material de laboratório descartável de cultura de tecidos. No dia de testar, as células foram observadas como possuindo uma integridade celular correcta e portanto eram aceitáveis para utilização neste estudo. A entrega intracelular e intranuclear de moléculas de fusão oligo/péptido às células LnCAP foi demonstrada utilizando um oligopéptido marcado com fluorescência (Cy3). A construção marcada (5 pmol em 1 ml) e Lipofectamine 2000 (utilizada tal como nas instruções do fabricante) foram adicionadas às células LnCAP e deixadas a incubar durante 48 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 24 horas. As células foram então examinadas através de microscopia de fluorescência. A localização intranuclear da construção foi demonstrada através de co-localização com um corante nuclear (DAPI). O efeito das moléculas de fusão oligo/péptido ARP-L217 e ARP-L218 na expressão do gene do receptor de androgénio foi medido nas seguintes experiências. 1) Tratamento de células LNCap com ARP-L217

Para medir o efeito de ARP-L217 na expressão do gene do receptor de androgénio foram conduzidas as seguintes experiências. A ARP-L217 foi preparada em solução salina tamponada com fosfato (PBS), filtrada numa seringa de 0,2 pm e utilizada no dia da montagem de teste. Células LNCap foram transfectadas com ARP-L217 utilizando Lipofectamine 2000 (dendrimero catiónico activado, InVitrogen Life Technologies). Várias quantidades de ARP-L217 foram misturadas com uma quantidade fixa de Lipofectamine 2000 (3 μΐ) num volume total de 100 μΐ de meio suplementado com soro (FBS a 10%) sem antibióticos. Após uma incubação de 20 min à temperatura ambiente, a mistura de transfecção foi adicionada às células a 70% de confluência e as células foram incubadas durante 3 dias.

As condições de RT-PCR foram estabelecidas para dar uma sensibilidade óptima dentro da fase exponencial do processo de amplificação. O ARN celular total foi isolado das células LNCap tratadas utilizando o RNeasy Kit (Qiagen). O ARN (1 pg de cada amostra) foi retrotranscrito de forma inversa em ADNc utilizando o estojo Omniscript RT (Qiagen). O ADNc sintetizado (2 μΐ de cada amostra) foi sujeito a amplificação por PCR (Qiagen Taq Kit) com iniciadores do receptor de androgénio humano com sentido 5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3' e anti-sentido 5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3' para dar um produto de 281 pb. Para verificar a qualidade da preparação de ARN/ADNc, foi realizada uma amplificação por PCR com os iniciadores da β-actina humana (Promega, UK) . Para verificar que o produto de PCR não era amplificado a partir de ADN residual deixado 49 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ nas amostras de ARN, um controlo negativo de RT foi sujeito a amplificação de PCR da β-actina.

As sequências do iniciador de AR utilizadas neste estudo foram sintetizadas através de Qiagen-Operon e desenhadas para evitar complementaridade 5'-3' e incluíram pelo menos um intrão no produto para detectar contaminação com ADN genómico. A electroforese dos produtos de PCR foi efectuada em géis de agarose a 2% e os géis foram pré-polimerizados com brometo de etídio (diluição 1:10). Os géis foram fotografados utilizando o sistema GelDoc. A comparação e análise da expressão de ARNm foram feitas através da quantificação das bandas utilizando o sistema de suporte lógico Labworks. A relação de DO amostra/b-actina foi calculada para cada amostra e depois utilizada para comparação. Assim, a expressão aumentada de ARNm é apresentada como uma percentagem do valor de controlo (células não tratadas).

Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela 1 abaixo e também como um gráfico de barras na

Figura 2.

Tabela la Dados que ilustram a quantificação das bandas após exposição de ARP-L217 a células LNGap durante 3 dias.

Quantificação d as (D: m ta V .-.4 tdas de ....................................... PCR de AR ;;ϊ$^ iDOa IDOa IDOb IDOb Média Não tratada 2280 2406 2105 2162 2238,25 PBS 25 μΐ 2283 1908 2106 2544 2210,25 PBS 50 μΐ 1799 1799 2677 2268 2135,75 ARP-L217+Lipofectamine 0,25 μΜ 1428 1749 1419 1325 1480,25 ARP-L217+Lipofectamine 0,5 μΜ 783 971 1037 1191 995,5 Quantificação das de È-aetina Bandas de PCR fDia ' ) IDOa IDOa IDOb IDOb Média Não tratada 8957 9589 8996 9663 9301,25 PBS 25 μΐ 8228 7980 9098 8544 8462,5 PBS 50 μΐ 7413 8762 8920 9005 8525 ARP-L217+Lipofectamine 0,25 μΜ 6632 6322 6605 7924 6870,75 ARP-L217+Lipofectamine 0,5 μΜ 6323 6180 5834 6695 6258 50 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Tabela lb Determinação da razão por beta-actina e da percentagem de inibição do controlo. ID da amostra Razão/β-actina Percentagem de controlo não tratado Não tratada 0,2406 100 PBS 25 μΐ 0,2611 108,5364073 PBS 50 μΐ 0,2505 104,1091143 ARP-L217+Lipofectamine 0,25 μΜ 0,2154 89,52898226 ARP-L217+Lipofectamine 0,5 μΜ 0,1590 66,10562717 A partir destes dados pode-se observar que as amostras celulares que foram incubadas com ARP-L217 reduziram extremamente os niveis de expressão do gene do receptor de androgénio em comparação com as tratadas com soluções de PBS de controlo. 2) Tratamento de células LNCap com ARP-L218 e R1881 0 efeito de ARP-L218 na expressão do gene do receptor de androgénio com e sem um androgénio sintético (RI881) foi medido utilizando o protocolo delineado na secção acima. A ARP-L218 foi preparada em solução salina tamponada com fosfato (PBS), filtrada numa seringa de 0,2 pm e utilizada no dia da montagem do teste. 0 R1881 (androgénio sintético) foi adquirido em Perkin Elmer, número de Catálogo NLP005005MG.

As células LNCap foram transfectadas com ARP-L218 utilizando Lipofectamine-2000 (dendrimero catiónico activado, InVitrogen life technologies) com/sem agonista. Várias quantidades de ARP-L218 foram misturadas com uma quantidade fixa de Lipofectamine 2000 (3 μΐ) num volume total de 100 μΐ de meio livre de soro sem antibióticos (OptiMEM) . Após uma incubação de 20 min à temperatura ambiente, a mistura de transfecção foi adicionada a células a 70% de confluência e as células foram incubadas durante 3 dias. A entrega intracelular e intranuclear de moléculas de fusão oligo/péptido às células LnCAP foi demonstrada utilizando um oligopéptido marcado com fluorescência (Cy3). A construção marcada (5 pmol em 1 ml) e Lipof ectamine 2000 (utilizada tal como nas instruções do fabricante) foram 51 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ adicionadas a células LnCAP e deixadas a incubar durante 24 horas. As células foram então examinadas através de microscopia de fluorescência. A localização intranuclear da construção foi demonstrada através de co-localização com um corante nuclear (DAPI). O ARN foi extraido e a análise de RT-PCR dos niveis de ARNm de AR foi conduzida tal como descrito acima.

Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela 2 abaixo e também como um gráfico de barras na Figura 3.

Tabela 2: Dados que ilustram a quantificação das bandas após exposição de ARP-L218 na presença/ausência de androgénio sintético (R1881) a células LNCap durante 3 dias. Determinação da relação por beta-actina e da inibição da percentagem do controlo. AR AR Média beta- actina beta- actina Média Razão/beta- actina Percentagem do controlo Controlo tratado ccm PBS 3142 - 3142 9521 - 9521 0,330 100 ARP-L218 (0,125 μΜ) 2327 2647 2487 10592 14178 12385 0,201 60,84 ARP-L218 (0,25 μΜ) 2728 2212 2470 17103 15691 16397 0,151 45,64 R1881 1 μΜ + ARP-L218 1291 - 1291 14949 - 14949 0,086 26,16 R1881 100 nM + ARP-L218 1068 - 1068 16258 - 16258 0,066 19,90 R1881 1 nM + ARP-L218 1393 - 1393 16950 - 16950 0,082 24,90 R1881 0,01 nM + ARP-L218 2532 - 2532 16607 - 16607 0,152 46,20 R1881 1 μΜ 1388 - 1388 8424 - 8424 0,165 49,92 R1881 100 nM 1455 - 1455 12536 - 12536 0,116 35,17 R1881 1 nM 1471 - 1471 14242 - 14242 0,103 31,29 R1881 0,01 nM 2083 - 2083 8799 - 8799 0,237 71,73 A partir destes dados pode-se observar que as amostras celulares que foram incubadas com ARP-L218 e R1881 reduziram extremamente os niveis de expressão do gene do receptor de androgénio em comparação com as tratadas com as soluções contendo R1881. Ambos os tipos de amostras tiveram niveis de ARNm de AR reduzidos em comparação com a amostra celular de controlo tratada com PBS. 52 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Portanto embora R1881 possa actuar reduzindo a expressão do gene de AR esta redução pode ser aumentada através da co- incubação das células com a molécula de fusão oligo/péptido ARP-L218. 3) Tratamento de células LNCap com ARP-L218 e acetato de ciproterona 0 efeito de ARP-L218 com ou sem acetato de ciproterona, um antagonista do receptor de androgénio ligado ao receptor, na expressão do gene do receptor de androgénio foi medido utilizando o protocolo delineado na secção acima. A ARP-L218 foi preparada em solução salina tamponada com fosfato (PBS), filtrada numa seringa de 0,2 pm e utilizada no dia da montagem do teste. O acetato de ciproterona foi adquirido em Sigma, lote número 41K1195.

As células LNCap foram transfectadas com ARP-L218 utilizando Lipofectamine 2000 (dendrímero catiónico activado, invitrogen life technologies) com/sem antagonista, várias quantidades de ARP-L218 foram misturadas com uma quantidade fixa de Lipofectamine 2000 (3 μΐ) num volume total de 100 μΐ de meio isento de soro sem antibióticos (OptiMEM) . Após uma incubação de 20 min à temperatura ambiente, a mistura de transfecção foi adicionada às células a 70% de confluência e as células foram incubadas durante 3 dias. A entrega intracelular e intranuclear de moléculas de fusão oligo/péptido às células LnCAP foi demonstrada utilizando um oligopéptido marcado com fluorescência (Cy3). A construção marcada (5 pmol em 1 ml) e a Lipofectamine 2000 (utilizada tal como nas instruções do fabricante) foram adicionadas às células LnCAP e deixadas a incubar durante 24 horas. As células foram então examinadas através de microscopia de fluorescência. A localização intranuclear da construção foi demonstrada através de co-localização com um corante nuclear (DAPI). O ARN foi extraído e a análise de RT-PCR dos níveis de ARNm de AR conduzida tal como descrito acima. 53 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela 3 abaixo e também como um gráfico de barras na Figura 4.

Tabela 3: Dados que ilustram a quantificação das bandas após exposição de ARP-L218 na presença/ausência de antagonistas do receptor de androgénio (acetato de ciproterona) às células LNCap durante 3 dias. Determinação da relação por beta-actina e da inibição da percentagem do controlo. ID da amostra AR beta- actina Razão % do controlo controlo tratado com PBS 3142 9521 0,330 100 Acetato de ciproterona 10 μΜ 1568 14691 0,107 32,4 Acetato de ciproterona 1 μΜ 1868 11856 0,158 47,8 Acetato de ciproterona 1 μΜ + ARP-L218 (0,0625 μΜ) 1583 14861 0,107 32, 4 Acetato de ciproterona 10 nM 2401 14112 0,170 51,5 Acetato de ciproterona 10 nM + ARP-L218 (0,03125) 1241 16885 0, 074 22, 4 Acetato de ciproterona 0,1 nM 2357 13278 0,178 54,0 A partir destes dados pode-se observar que as amostras celulares que foram incubadas com ARP-L218 e acetato de ciproterona reduziram os níveis de expressão do gene do receptor de androgénio em comparação com as tratadas apenas com o acetato de ciproterona. Ambos os tipos de amostras tinham niveis de ARNm de AR reduzidos em comparação com a amostra celular de controlo tratada com PBS.

Portanto embora o acetato de ciproterona possa actuar reduzindo a expressão do gene de AR esta redução pode ser realçada através de co-incubação das células com a molécula de fusão oligo /péptido ARP-L218.

Exemplo 9: Infra-regulação de um gene incorporado no genoma estimulado por interferão.

Tal como discutido no Exemplo 2, as moléculas de fusão oligo/péptido são capazes de regular a actividade génica quando os genes estão integrados no genoma. Neste exemplo proporcionamos mais dados experimentais que apoiam isto.

Construímos fusões entre um oligonucleótido de ligação ao ADN (TFO) direccionado a um elemento de resposta 54 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ estimulado por interferão (IRE), e um péptido contendo uma sequência de 29 aminoácidos do repressor MADl ligado a uma sequência de 16 aminoácidos de penetratina. A sequência do TFO do IRE utilizada neste exemplo foi: IRE TFO: (5') GGGUGGTGGGGTTGTGTT (3') U= 5-fluro-desoxiuracilo

Os TFO são modificados na extremidade 5' para conjugação tal como descrito por Gait et al., J. Org. Chem. 65: 4900-4908, 2000, e na extremidade 3' com uma ligação amino padrão para proteger de degradação. A sequência oligonucleotídica é desenhada para formar um triplex com o Elemento de Resposta Estimulável por Interferão (ISRE) do Gene Estimulado por Interferão (ISG) humano 6-16 (Porter et al., EMBO J. 7: 85-92, 1988). O TFO foi fundido com dois fragmentos peptídicos diferentes. Os fragmentos peptídicos utilizados neste exemplo foram: L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratina(Ligação)HHHHHHMNIAM LLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDRQIKIWFQNRRMKWKK(carboxamida) L219: DDD-29aaMAD-HHHHHH-Penetratina(Ligação)DDDMNIAMLLE AADYLERREREAEHGYASMLPHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK(carboxamida) A sequência peptídica de 29 aminoácidos é do domínio repressor da transcrição da proteína MADl, uma região que se sabe interagir com a proteína do complexo histona-desacetilase, Sin3a.

Os três resíduos de ácido aspártico (DDD) são uma sequência ligante, enquanto que a sequência peptídica de Penetratina medeia a translocação eficiente da membrana plasmática da molécula de fusão oligo/péptido.

Os resíduos HIS foram adicionados para proporcionar mais opções de purificação. 55 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

As células de fibrossarcoma humano HT1080 modificadas foram utilizadas para demonstrar a capacidade das moléculas de fusão oligo/péptido para infra-regular a expressão de um gene repórter estimulado por interferão. Estas células possuem um gene incorporado de modo estável que expressa EGFP sob o controlo do elemento de resposta estimulado por interferão (IRE) do gene 6-16 humano.

Para os seguintes dados, as células foram transfectadas transientemente com diferentes compostos utilizando protocolos padrão de Lipofectamine. As células foram então tratadas com 300 unidades/ml de interferão (IFN) durante um dia e analisadas através de FACS quanto à expressão de GFP. A Figura 5 mostra a análise de FACS de várias populações celulares diferentes, nas quais foram aplicadas as seguintes condições experimentais: a) Linha celular parental, sem tratamento b) Células expressando a construção estavelmente transfectada (C8), sem tratamento c) C8 tratadas com interferão (+INF)

d) C8 transfectadas com TFO 500 pm, +INF

e) C8, TFO especifico 1000 pM, +INF

f) C8, IRE-L218 500 pM, +INF

g) C8, IRE-L219 500 pM, +INF

h) C8, TFO de controlo inespecifico 500 pM, +INF

i) C8, TFO de controlo inespecifico 1000 pM, +INF A Tabela 4 mostra a expressão de GFP induzida pelo interferão da Figura 5 apresentada como percentagem. 56 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Tabela 4: Expressão de GFP induzida por interferão.

Condição aplicada Expressão de GFP a) 0% b) <1% c) 90% d) 53% e) 63% f) 40% g) 42% h) 87% i) 85% 0 sistema IRE-TFO, que foi utilizado como sistema modelo, foi anteriormente descrito (Roy, Eur. J. Biochem. 220: 493-503, 1994). Os resultados da análise de FACS mostram que IRE-L218 e IRE-L219 foram capazes de reprimir a expressão numa média de 59%, enquanto que o TFO especifico da mesma sequência efectuou uma repressão média de 42%. Os TFO de controlo tiveram apenas um efeito marginal sobre o controlo positivo.

Estes resultados ilustram claramente que as moléculas de fusão oligo/péptido são muito eficazes na repressão da expressão do gene de GFP induzida por INF.

Exemplo 10: A infra-regulação da expressão génica por moléculas de fusão oligo/péptido está associada à desacetilação das histonas da cromatina

Tal como observado nos Exemplos 8 e 9 as moléculas de fusão oligo/péptido são eficazes na repressão da expressão génica. Propomos que isto é devido a uma mudança mediada por MADl no estado de acetilação das histonas do ADN onde ou perto de onde o oligo ARP ou IRE se liga.

Para mostrar que uma expressão génica reduzida está associada à desacetilação das histonas da cromatina, pode ser utilizado o método de Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP). A Imunoprecipitação da Cromatina é realizada através da utilização de um estojo de Ensaio ChIP de acordo com as instruções do fabricante (Upstate Biotechnology, Bucks, UK). 57 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ Células do tumor da próstata humano LNCap são criadas e propagadas e incubadas com as moléculas de fusão oligo/péptido que são eficazes na repressão da expressão do gene do receptor de androgénio. Células LNCap não tratadas são utilizadas como controlo.

As células são criadas até 95% de confluência em placas de cultura de tecidos de 35 cm em DMEM, sem vermelho de fenol, suplementado com DSS a 5%, P/S/G e G418 (100 pg/ml). É adicionado conforme apropriado higromicina B (80 pg/ml) e doxiciclina (1 pg/ml). 30 minutos antes da fixação, são adicionados às células E2 (10-8 M) ou etanol (como controlo). Formaldeido a 37% é adicionado às gotas directamente ao meio até uma concentração final de 1%. As células são incubadas durante 10 minutos a 37°C.

Sobre gelo, o meio é aspirado das placas, as células são lavadas duas vezes com PBS gelado contendo inibidores de proteases lx (PI) (Sigma, Dorset, UK) . Para a colheita, é adicionado à placa 1 ml de PBS gelado contendo pi lx e as células são raspadas para tubos de microcentrifuga previamente arrefecidos, utilizando um policia de borracha. As células são sedimentadas através de centrifugação a 2000 rpm durante 4 minutos, a 4°C. Os sedimentos são ressuspensos em 400 μΐ de tampão de lise-ChIP SDS aquecido (SDS a 1%; Na EDTA pH 8,0 10 mM; Tris-HCl pH 8,1 50 mM) contendo PI, e incubadas em gelo durante 10 minutos.

Os lisados são sujeitos a ultra-sons para fragmentar o ADN em comprimentos de 200-1000 pb. Durante os ultra-sons, as amostras são colocadas num gobelé com água e gelo, para as manter frias a fim de impedir a degradação da amostra. Os ultra-sons são aplicados utilizando um aparelho de ultra-sons Soniprep 150 com uma sonda de titânio exponencial Soniprep 150 anexada (Sanyo-Gallenkamp, Leics, UK) com quatro pulsos de 10 segundos, separadas por intervalos de 30 segundos.

As amostras são centrifugadas a 13000 rpm durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é recolhido para tubos Falcon estéreis de 15 ml e diluído 10 vezes com tampão de diluição de ChIP 3600 μΐ (SDS a 0,01%; Triton-X-100 a 1,1%; Na-EDTA pH 8,0 1,2 mM; Tris-HCl, pH 8,1 16,7 mM; NaCl 58 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 167 mM). As amostras são então divididas em duas alíquotas de 2 ml em tubos de 2,5 ml, um para incubação com um anticorpo anti-histona H4 acetilada, de grau ChIPs (Upstate Biotechnology, Bucks, UK), e o outro para utilização como controlo sem anticorpo.

Para reduzir o fundo inespecífico, cada alíquota de 2 ml é previamente clarificada através da adição de 80 μΐ de uma pasta de ADN de esperma de salmão/proteina A-agarose-50% (suspensa em Tris-HCl pH 8,0 10 mM; Na-EDTA pH 8,0, 1 mM) durante 30 minutos a 4°C numa plataforma de rotação vertical (Stuart Scientific, Staffs, UK) . As contas de agarose são então sedimentadas através de uma segunda centrifugação de 30 segundos a 1000 rpm e as fracções de sobrenadante recolhidas para tubos frescos de 2,5 ml. O anticorpo de imunoprecipitação é adicionado a uma diluição de 1:500 à primeira amostra mas não à amostra de controlo sem anticorpo. Ambos os tubos são incubados de um dia para o outro a 4°C numa plataforma de rotação vertical (Stuart Scientific, Staffs, uk). 6 0 μΐ de uma pasta de ADN de esperma de salmão/proteina A-agarose-50% são incubados com cada tubo durante 1 hora a 4°C, com rotação, para recolher os complexos anticorpo/histona ou as proteinas inespecíficamente ligadas no caso do controlo sem anticorpo. As contas de agarose são sedimentadas através de uma rápida centrifugação a 800 rpm durante 1 minuto. Os sobrenadantes são cuidadosamente transferidos para tubos frescos de 2,5 ml e armazenados a -20°C. O complexo de contas de proteína A-

Agarose/anticorpo/histona é lavado durante 5 minutos numa plataforma de rotação vertical a 4°C com 1 ml de cada um dos seguintes tampões na ordem listada abaixo: a) Tampão de Lavagem do Complexo Imunitário Pobre em Sais -uma lavagem (SDS a 0,1%; Triton-X-100 a 1%; Na-EDTA 2 mM pH 8,0; Tris-HCl 20 mM pH 8,1; NaCl 150 mM) . b) Tampão de Lavagem do Complexo Imunitário Rico em Sais -uma lavagem (SDS a 0,1%; Triton-x-100 a 1%; Na-EDTA 2 mM pH 8,0; Tris-HCl 20 mM pH 8,1; NaCl 500 mM). 59 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ c) Tampão de Lavagem do Complexo Imunitário LiCl - uma lavagem (LiCl 0,25 Μ; NP40 a 1% (nonidet); desoxicolato a 1%; Na-EDTA 1 mM pH 8,0; Tris-HCl 10 mM pH 8,1)

d) TE lx - duas lavagens (Tris-HCl 10 mM, Na-EDTA 1 mM, pH 8,0) . O complexo histona/imunitário eluiu das contas de agarose através da adição de 250 μΐ de tampão de Eluição preparado de fresco (SDS a 1%; NaHC03 0,1 M). As amostras são momentaneamente sujeitas a vórtice para misturar e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos numa plataforma de rotação vertical. As contas são centrifugadas a 1000 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente e o eluato é transferido para tubos novos de microcentrífuga. O passo de eluição é repetido com mais 250 μΐ de tampão de Eluição e os eluatos são combinados.

Adicionam-se 20 μΐ de NaCl 5 M aos eluatos e as ligações cruzadas histona-ADN são revertidas através de aquecimento a 65°C durante pelo menos 4 horas. 10 μΐ de Na EDTA 0,5 M, pH 8,0, 20 μΐ de Tris-HCl 1 M, pH 6,5 e 2 μΐ de Proteinase K a 100 mg/ml são adicionados às amostras eluidas. As ligações cruzadas são também revertidas na fracção sobrenadante da IP. 40 μΐ de Na-EDTA 0,5 M pH 8,0, 80 μΐ de Tris-HCl 1 M, pH 6,5, e 8 μΐ de Proteinase K a 10 mg/ml são adicionados às amostras de sobrenadante. As amostras são incubadas durante 1 hora a 45°C para degradar a proteína nas amostras. São adicionados 20 pg de glicogénio às amostras como transportador inerte e depois os ADN das amostras são recuperados através de extracção com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e precipitação em etanol. Os sedimentos de ADN são ressuspensos em 50 μΐ de água estéril para as reacções de PCR. É utilizado 1 μΐ de amostra e 35-40 ciclos para cada amplificação por PCR. É empregue análise de imagem por computador (programa de análise de imagem de NIH) para avaliar os níveis relativos do produto de PCR do gene do receptor de androgénio regulado por estrogénio, em comparação com a β-actina e sem controlos de anticorpo. Isto permitiu um cálculo da quantidade relativa do transcrito do gene contido numa amostra a ser comparada com a de outras amostras. 60 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Oligonucleótidos utilizados para a análise de ChIP:

Iniciador directo do Receptor da Progesterona: 5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3'

Iniciador inverso do Receptor da Progesterona: 5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3'

Iniciador directo da β-actina: 5/-TTTTCGCAAAAGGAGGGGAG-3'

Iniciador inverso da β-actina: 5'-AAAGGCAACTTTCGGAACGG-3'

Um exemplo do tipo de resultado que pode ser alcançado é mostrado na Figura 6. A quantidade de ADN do receptor de androgénio precipitado, e assim do grau de acetilação das proteínas histonas da cromatina associadas ao receptor de androgénio, pode ser diminuída em aproximadamente 75% nas células nas quais a expressão do receptor de androgénio é inibida através do método descrito em comparação com células não tratadas.

Exemplo 11: Ensaio de deslocação em gel

Os exemplos anteriores demonstraram que as moléculas de fusão oligo/péptido ARP-L217 e ARP-L218 são capazes de regular a actividade de um gene alvo. Isto é considerado ser devido a uma mudança mediada por MADl no estado de acetilação das histonas do adn onde ou próximo de onde o oligo arp ou IRE se liga. É utilizado um ensaio de deslocamento em gel para demonstrar que as moléculas de fusão oligo/péptido se podem ligar ao fragmento de ADN contendo o promotor alvo.

Um fragmento de ADN do receptor de androgénio de 281 pb contendo a sequência promotora alvo é incubado com ARP-L217. As amostras são sujeitas a electroforese em gel não desnaturante para caracterizar o foto-aducto mediado pelo tríplex. Os aductos são detectados em amostras contendo o produto ARP-L217 que se deslocou com doses crescentes. 61 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Deste modo é possível mostrar que as moléculas de fusão oligo/péptido se podem ligar ao fragmento de ADN contendo o promotor alvo.

Exemplo 12: Moléculas de fusão oligo/péptido com um sinal de localização nuclear. A porção péptido da molécula pode ter um sinal de localização nuclear (NLS) para direccionar a molécula para o núcleo. Os péptidos utilizados neste exemplo são: a) DDD-MADl-DDD-NLS, que possui a sequência de aminoácidos: (Ligação)DDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDPKKKRKV(carboxamida) e, b) DDD-NLS-DDD-MADl, que possui a sequência de aminoácidos: (Ligação)DDDPKKKRKVDDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP(carboxamida) O NLS é um sinal de localização nuclear funcional de 7 aminoácidos (sequência PKKKRKV) derivado do antigénio T de SV40 . A sequência ligante DDD e a sequência de aminoácidos de MADl de 29 aminoácidos são as mesmas discutidas nos exemplos anteriores.

Para demonstrar que as sequências peptídicas DDD-MADl-DDD-NLS e DDD-NLS-DDD-MADl são direccionadas para o núcleo, células de carcinoma do pulmão humano A459 foram transfectadas utilizando oligopéptidos GenelCE que consistem em ambas as sequências peptídicas DDD-MADl-DDD-NLS e DDD-NLS-DDD-MADl ligadas a um oligonucleótido marcado com Cy3 através de protocolos padrão de Lipofectamine 2000. As células foram então fixadas em formaldeído e coradas com corante nuclear DAPI utilizando o procedimento recomendado pelo fabricante. O exame das células através de microscopia de fluorescência mostrou que a molécula oligopeptídica GenelCE marcada com Cy3 foi co-localizada com o corante nuclear DAPI. Dos dados 62 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ experimentais resultantes concluiu-se que o NLS é muito eficaz a direccionar o péptido para o núcleo.

As sequências peptidicas DDD-MADl-DDD-NLS e DDD-NLS-DDD-MADl podem mediar a expressão do gene alvo quando incorporadas em moléculas oligo/péptido do presente invento. Isto pode ser demonstrado utilizando a abordagem experimental delineada nos Exemplos 8 e 9.

Por exemplo, as sequências peptidicas DDD-MADl-DDD-NLS e DDD-NLS-DDD-MADl podem ser incorporadas nas moléculas oligo/péptido: ARP:-DDD-MADl-DDD-NLS, e ARP:-DDD-NLS-DDD-MADl. ARP é a sequência do oligo TFO mostrada no Exemplo 8.

As moléculas ARP:-DDD-MADl-DDD-NLS e ARP:-DDD-NLS-DDD-MADl são então transfectadas para células LNCap, tal como no Exemplo 8, ou células HT1080 modificadas, tal como no Exemplo 9. Utilizando os procedimentos experimentais delineados naquelas secções é possível mostrar o efeito das moléculas ARP:-DDD-MADl-DDD-NLS e ARP:-DDD-NLS-DDD-MADl na expressão do gene alvo.

Exemplo 13: Regulação dos níveis de antigénios específicos da próstata utilizando moléculas de fusão oligo/péptido.

Tal como discutido nos Exemplos 2, 8 e 9 as moléculas de fusão oligo/péptido podem regular a actividade génica quando os genes são integrados no genoma. Neste exemplo proporcionamos mais dados experimentais que apoiam isto.

Os níveis proteicos de antigénios específicos da próstata (PSA) são regulados pela proteína receptora de androgénio (AR) . Uma vez que mostrámos no Exemplo 8 que os níveis de ARNm de AR são reduzidos em células transfectadas com as moléculas de fusão oligo/péptido ARP-L218, deduzimos que deveria haver uma diminuição nos níveis da proteína PSA em células transfectadas com ARP-L218. 63 ΕΡ 1 470 226/ΡΤ

Portanto, utilizando os protocolos descritos no Exemplo 8, ARP-L218 foi transfectado para células LNCap (GET/LNC/W39/P6) com Lipofectamlne 2000 (InVitrogen) com ou sem R1881 (Perkin Elmer), um androgénio sintético, durante 3 dias, após o que o sobrenadante foi colhido para quantificação da proteína PSA total no Pathology Centre, Hammersmith Hospital, Londres, UK.

As medições de PSA foram realizadas através de um ensaio imunométrico marcado com quimioluminescência utilizando um analisador de imunoensaios automático (Abbott Architect Immunoassay Analyser).

Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela 5 abaixo e também como um gráfico de barras na

Figura 7.

Tabela 5: PSA total quantificado a partir dos sobrenadantes celulares

Identificação da Amostra PSA Total (ng/ml) Controlo tratado com PBS 279 ARP-L218 (0,125 μΜ) 279 ARP-L218 (0,125 μΜ) 270 ARP-L218 (0,25 μΜ) 287 ARP-L218 (0,25 μΜ) 282 R1881 100 ηΜ + ARP-L218 (0,25 μΜ) 757 R1881 100 ηΜ 1980 R1881 0,01 ηΜ + ARP-L218 (0,25 μΜ) 330 R1881 0,01 ηΜ 372 A partir destes dados pode-se observar que as células que foram incubadas com o androgénio sintético R1881 mostram um aumento nos níveis de PSA, tal como se esperaria. No entanto, quando as células são transfectadas com R1881 e ARP-L218, o aumento nos níveis de PSA é grandemente reduzido. Tal como se pode observar a partir das amostras transfectadas com ARP-L218 mas não com R1881, ARP-L218 não tem nenhum efeito directo nos níveis de PSA.

Portanto, propomos que R1881 actua aumentando a actividade de AR que, por sua vez, conduz a um aumento nos ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 64 níveis de PSA. No entanto, ARP-L218 actua bloqueando a expressão do gene de AR (tal como mostrado no Exemplo 8), e assim os níveis de PSA são subsequentemente reduzidos. Os dados sugerem que as moléculas de fusão oligo/péptido do presente invento podem ser utilizadas para regular directa ou indirectamente um gene do alvo.

Lisboa,

Claims (44)

1. ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula para suprimir a expressão de um gene seleccionado numa célula compreendendo (1) uma porção de ligação a ácido nucleico que se liga a um local num gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção repressora da expressão, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção repressora compreende um polipéptido ou um peptidomimético.
2. 2. Molécula para modular a expressão de um gene seleccionado numa célula compreendendo (1) uma porção de ligação ao ácido nucleico que se liga a um local num gene seleccionado ou a ele associado, local este que está presente num genoma e (2) uma porção modificadora, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção modificadora compreende um polipéptido ou um peptidomimético que é capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina e não é uma endonuclease nem KRAB.
3. 3. Molécula da reivindicação 1 ou 2 em que a porção repressora ou modificadora é uma porção de inactivação da cromatina e não é KRAB.
4. 4. Molécula da reivindicação 1 ou 2 em que a porção repressora ou modificadora é a totalidade ou uma porção de um componente de um complexo de ADN-metilase ou a totalidade ou uma porção de um polipéptido que se liga a, ou facilita o recrutamento de, um complexo de ADN-metilase, e não é KRAB.
5. 5. Molécula da reivindicação 1 ou 2 em que a porção repressora ou modificadora é a totalidade ou uma porção de um componente de uma histona-acetiltransferase ou a totalidade ou uma porção de um polipéptido que se liga a, ou facilita o recrutamento de, um complexo de histona-acetiltransferase e não é KRAB.
6. 6. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a parte polipéptido ou ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 2/7 peptidomimético da molécula tem uma massa molecular inferior a 11 kDa.
7. 7. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a porção de ligação ao ácido nucleico é uma porção de ligação a ADN.
8. 8. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que a porção de ligação ao ácido nucleico é uma porção de ligação a ARN e o local presente num genoma é um ARN nascente que está a ser transcrito do ADN.
9. 9. Molécula de qualquer uma das reivindicações anteriores em que o oligonucleótido ou o análogo ou mimético de oligonucleótido é um oligonucleótido formador de triplex (TFO) .
10. 10. Molécula de qualquer uma das reivindicações anteriores em que o análogo ou mimético de oligonucleótido é um ácido nucleico peptídico (pna).
11. 11. Molécula de acordo com a reivindicação 3 ou com as reivindicações desta dependentes em que a porção de inactivação da cromatina facilita a desacetilação das histonas.
12. 12. Molécula de acordo com a reivindicação 3 ou com as reivindicações desta dependentes ou com a 11 em que a porção de inactivação da cromatina é a totalidade ou uma porção de um componente de um complexo de desacetilação das histonas (HDAC) ou a totalidade ou uma porção de um polipéptido que se liga a, ou facilita o recrutamento de, um complexo HDAC.
13. 13. Molécula de acordo com a reivindicação 12 em que o componente do complexo HDAC ou o polipéptido que se liga a, ou facilita o recrutamento de, um complexo HDAC, é qualquer um de PLZF, N-CoR, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30, HDAC, NuRD, MADl, MAD2, MAD3, MAD4, Rb OU E7.
14. 14. Molécula de acordo com a reivindicação 13 em que a porção de inactivação da cromatina é a totalidade ou uma parte de PLZF de ligação a N-CoR ou SMRT. ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 3/7
15. 15. Molécula de acordo com a reivindicação 13 em que a porção de inactivação da cromatina é a totalidade ou uma parte enzimaticamente activa de um HDAC.
16. 16. Molécula de acordo com a reivindicação 13 em que a porção de inactivação da cromatina é a totalidade ou uma parte de E7 de ligação ao complexo da histona-desacetilase.
17. 17. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a molécula compreende ainda uma porção que facilita a entrada celular e/ou a localização nuclear.
18. 18. Molécula de acordo com a reivindicação 17 em que a porção que facilita a entrada celular e/ou a localização nuclear é um péptido pequeno de 7-16 aminoácidos, por exemplo o homeodominio de Antennapedia Modificado de acordo com a sequência RQIKIwf QNRRMKWKK ou o péptido básico TAT de internalização de HIV de acordo com a sequência C(Acm)GRKKRRQRRRPQC, onde C(Acm) é um Cys-acetamidometilo.
19. 19. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 em que a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção repressora ou modificadora estão fundidas.
20. 20. Utilização de uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 no fabrico de um agente para modulação da expressão do gene seleccionado numa célula.
21. 21. Utilização da reivindicação 20 em que o agente é para supressão da expressão do gene seleccionado.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21 em que o agente é um medicamento para modular ou suprimir a expressão de um gene seleccionado num animal, em que o animal tem cancro.
23. 23. Utilização de uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 no fabrico de um medicamento para supressão da expressão de um gene seleccionado num paciente que tem cancro. ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 4/7
24. 24. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 para utilização em medicina.
25. 25. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
26. 26. Composição da reivindicação 25 compreendendo meios para promoção da assimilação celular da molécula.
27. 27. Composição da reivindicação 26 em que os meios para promoção da assimilação celular da molécula são lipossomas ou um transportador virai.
28. 28. Célula hospedeira compreendendo uma molécula de acordo com qualquer uma reivindicações 1 a 19.
29. 29. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 28 que é uma célula bacteriana.
30. 30. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 28 que é uma célula animal.
31. 31. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 28 que é uma célula vegetal.
32. 32. Animal não humano compreendendo uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 30.
33. 33. Planta compreendendo uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 31.
34. 34. Método para desenhar uma molécula para supressão da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo: 1) a identificação de um local no gene seleccionado ou a ele associado 2) a identificação ou o desenho de uma porção de ligação ao ácido nucleico que se liga, ou se preveja que se ligue, ao local ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 5/7 3) a preparação de uma molécula compreendendo a porção de ligação ao ácido nucleico e uma porção repressora da expressão, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção repressora compreende um polipéptido ou peptidomimético.
35. 35. Método para desenhar uma molécula para modulação da expressão de um gene seleccionado numa célula, compreendendo o método: 1) a identificação de um local no gene seleccionado ou a ele associado 2) a identificação ou o desenho de uma porção de ligação ao ácido nucleico que se liga, ou se preveja que se ligue, ao local 3) a preparação de uma molécula compreendendo a porção de ligação ao ácido nucleico e uma porção modificadora, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou um análogo de oligonucleótido, e em que a porção modificadora compreende um polipéptido ou peptidomimético que é capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina.
36. 36. Método para desenhar uma molécula para supressão da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo: 1) a identificação de um local no gene seleccionado ou a ele associado 2) a identificação ou o desenho de uma porção de ligação ao ácido nucleico que se liga, ou se preveja que se ligue, a um polinucleótido possuindo ou compreendendo a sequência nucleotídica do local 3) a preparação de uma molécula compreendendo a porção de ligação ao ácido nucleico e uma porção repressora da expressão, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 6/7 e em que a porção repressora compreende um polipéptido ou peptidomimético.
37. 37. Método para desenhar uma molécula para modulação da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo: 1) a identificação de um local no gene seleccionado ou a ele associado 2) a identificação ou o desenho de uma porção de ligação ao ácido nucleico que se liga, ou se preveja que se ligue, a um polinucleótido possuindo ou compreendendo a sequência nucleotídica do local 3) a preparação de uma molécula compreendendo a porção de ligação ao ácido nucleico e uma porção modificadora, em que a porção de ligação ao ácido nucleico compreende um oligonucleótido ou um mimético ou análogo de oligonucleótido, e em que a porção modificadora compreende um polipéptido ou peptidomimético que é capaz de modular a modificação covalente do ácido nucleico ou da cromatina.
38. 38. Método da reivindicação 34 ou 35 compreendendo ainda os passos de: 4) realização de uma avaliação de controlo da qualidade sobre a preparação da molécula para determinar que a porção de ligação ao ácido nucleico e a porção repressora ou modificadora estão unidas uma à outra; e/ou 5) teste da afinidade e/ou da especificidade da ligação ao local, da porção de ligação ao ácido nucleico; e/ou 6) teste da afinidade e/ou da especificidade da ligação da molécula ao local; e/ou 7) teste da eficácia da molécula ou do polinucleótido na modulação ou supressão da expressão do gene e/ou de um gene repórter compreendendo a sequência nucleotídica do local.
39. 39. Método da reivindicação 36 ou 37 compreendendo ainda os passos de: 4) realização de uma avaliação de controlo da qualidade sobre a preparação da molécula para determinar que a porção de ΕΡ 1 470 226/ΡΤ 7/7 ligação ao ácido nucleico e a porção repressora ou modificadora estão unidas uma à outra; e/ou 5) teste da afinidade e/ou da especificidade da ligação da porção de ligação do ácido nucleico a um polinucleótido possuindo ou compreendendo a sequência nucleotidica do local; e/ou 6) teste da afinidade e/ou da especificidade da ligação da molécula a um polinucleótido possuindo ou compreendendo a sequência nucleotidica do local; e/ou 7) teste da eficácia da molécula ou do polinucleótido na modulação ou supressão da expressão do gene e/ou de um gene repórter compreendendo a sequência nucleotidica do local.
40. 40. Método ín vitro para supressão da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo a introdução na célula de uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 19.
41. 41. Método in vitro para modulação da expressão de um gene seleccionado numa célula, o método compreendendo a introdução na célula de uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 19.
42. 42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41 em que a célula é uma célula eucariótica.
43. 43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41 em que a célula é uma célula vegetal e está contida dentro de uma planta.
44. 44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 36, 38, 39, 40, 42 ou 43, em que a expressão de uma pluralidade de genes seleccionados é suprimida. Lisboa