ES2291536T3 - Control de la expresion de gen usando un complejo de un oligonucleotido y un peptido regulatorio. - Google Patents

Abstract

Una molécula para la supresión de la expresión de un gen seleccionado en una célula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico que se enlaza a un sitio en, o se asocia con, un gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción represora de expresión, en la que la porción de enlace del ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o análogo, y en la que la porción represora comprende un polipéptido o péptido mimético.

Description

Control de la expresión de gen usando un complejo de un oligonucleótido y un péptido regulatorio.

La presente invención se refiere al control de la expresión de gen y, en particular, se refiere a los métodos de, y medios para, modular, preferentemente suprimir, la expresión de un gen particular seleccionado.

La habilidad para suprimir selectivamente la expresión de un gen es útil en muchas áreas de la biología, por ejemplo, en métodos de tratamiento en los que la expresión del gen puede ser indeseable; en la preparación de modelos de enfermedad en los que la carencia de expresión de un gen particular está asociada con la enfermedad; en la modificación del fenotipo para producir propiedades deseables. Así, la habilidad para suprimir selectivamente la expresión de un gen puede permitir el "knockout" de genes humanos en células humanas (tanto de tipo silvestre como mutante) y el "knockout" de los genes eucarióticos en estudios de desarrollo y diferenciación.

Los métodos presentes de intentos para suprimir la expresión de un gen particular caen dentro de tres categorías principales, particularmente la tecnología antisentido, la tecnología de ribozima y la supresión del gen objetivo provocada por recombinación homóloga.

Las técnicas antisentido se basan en la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula la cual típicamente es complementaria a un ARNm expresado por el gen seleccionado. La molécula antisentido típicamente suprime la traslación de una molécula de ARNm e impide la expresión del polipéptido codificado por el gen, mientras que la molécula antisentido permanece ligada a la molécula de ARNm. Las modificaciones de la técnica antisentido pueden impedir la transcripción del gen seleccionado por la molécula antisentido (oligonucleótido de formación triple; OFT) que enlaza a los genes ADN para formar una triple hélice. En este método, la presencia de la tercera cadena bloquea la transcripción de ADN mientras permanece ligada.

Los grupos modificantes químicos, por ejemplo, los grupos psoraleno de unión cruzada, han sido incluidos en los OFT, pero estos pueden conducir a lesión y mutación irreversibles del ADN. Controlar tales grupos modificantes químicos en las células es también difícil. Ellos pueden también tener desventajas en relación con la entrega celular de las moléculas.

Las técnicas de ribozima se basan en la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula la cual expresa una molécula de ARN la cual está unida a, y cataliza la escisión selectiva de, una molécula de ARN objetivo. La molécula de ARN objetivo es típicamente una molécula de ARNm, pero puede ser, por ejemplo, una molécula de ARN retroviral.

Las técnicas basadas en antisentido y ribozima tienen dificultad probada para implementar y muestran variables grados de éxito en la supresión o desactivación del gen objetivo. Además, estas dos técnicas requieren la expresión persistente o la administración del agente que inactiva al gen.

La vinculación de un OFT a un dominio de activación viral VP16 (Kusnetsova et al (1999) Nucleic Acids Res 20, 3995-4000) ha sido usada para ampliar la aplicación de los OFT para incluir la activación del gen (como opuesta a los usos previos en la supresión o desactivación de gen).

La supresión del gen indicado por recombinación homóloga requiere dos eventos que inactivan el gen (uno para cada alelo) y no es fácilmente aplicable a las células primarias, particularmente, por ejemplo, a las células mamarias humanas primarias las cuales pueden ser sólo mantenidas en cultivo para unos pocos pasos. La supresión del gen indicado ha permanecido difícil de realizar en plantas. La integración específica del sitio mediado cre-lox ha sido el método de selección aunque la eficiencia de los eventos integradores específicos es baja (Alberts et al (1995) Plant J. 7, 649-659; Vergunst & Hooykass (1998) Plant Mol. Biol. 38, 393-406; Vergunst et al (1998) Nucl. Acids Res. 26, 2729-2734).

Esta deficiencia principal en la tecnología existente nos ha conducido a buscar una estrategia alternativa.

La WO 99/11808 describe las proteínas de fusión o los complejos de proteína/ácido nucleico que comprenden la proteína antennapedia.

La WO 01/02019 describe las fusiones de dos polipéptidos en las cuales un polipéptido es capaz de enlazar específicamente a una secuencia de ácido nucleico seleccionada y el otro polipéptido inactiva la cromatina.

Lebedeva et al (2000) Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 50, 101-119 describe reseñas de métodos para la entrega de oligonucleótidos a las células.

Un aspecto de la invención provee un método in vitro para suprimir la expresión de un gen seleccionado en una célula; el método comprende introducir en la célula una molécula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción represora de expresión, en la que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o un análogo, y en donde la porción represora comprende un polipéptido o un polipéptido imitador.

Un aspecto ulterior de la invención provee un método in vitro para modular la expresión de un gen seleccionado en una célula; el método comprende introducir en la célula una molécula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción modificadora, en la que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido imitador o un análogo, y en donde la porción modificadora comprende un polipéptido o un péptido imitador el cual es capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o cromatina y no es una endonucleasa o KRAB.

Un aspecto ulterior de la invención provee una molécula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción represora de expresión, en la que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonu-
cleótido imitador o un análogo, y en la que la porción represora comprende un polipéptido o un polipéptido imitador.

Un aspecto ulterior de la invención provee una molécula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción modificadora, en la que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido imitador o un análogo, y en la que la porción modificadora comprende un polipéptido o un péptido imitador la cual es capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o cromatina y no es una endonucleasa o KRAB.

Es preferente que la célula o genoma sea una célula eucariótica o genoma, por ejemplo, una célula de hongo, animal o planta.

Es preferente que la porción represora sea una porción modificadora. Es preferente que el represor o la porción modificadora sea una porción de desactivación de cromatina. La porción de desactivación de cromatina puede ser cualquier polipéptido o parte del mismo la cual directamente o indirectamente conduce a la desactivación de cromatina. Por conducir "directamente" a la desactivación de cromatina queremos decir que el polipéptido o parte del mismo actúa por sí mismo en la cromatina para desactivarla. Por conducir "indirectamente" a la desactivación de cromatina queremos decir que el polipéptido o parte del mismo no actúa por sí mismo en la cromatina sino que más bien es capaz de alistar o promover que un componente celular lo haga.

La desactivación de cromatina generalmente resulta en la supresión o desactivación de la expresión de gen. La desactivación de cromatina es típicamente un evento localizado tal que la supresión o desactivación de la expresión de gen están restringidas a, típicamente, uno o unos pocos genes. Así, la porción de desactivación de cromatina es cualquier polipéptido adecuado el cual, cuando parte del polipéptido de la presente invención y cuando es dirigido a un gen seleccionado por la porción de enlace de ácido nucleico, desactiva localmente la cromatina asociada con el gen seleccionado a fin de que la expresión del gen sea desactivada o suprimida. La deacetilación de histona está asociada con la desactivación de cromatina y como tal es particularmente preferente si la porción de desactivación de cromatina facilita la deacetilación de histona. La deacetilación dirigida de histona asociada con un gen dado conduce a la desactivación del gen en una, esencialmente, manera irreversible. Por "supresión" o "desactivación" de la expresión de gen queremos decir que en presencia del polipéptido de la invención del gen objetivo seleccionado es 1,2 veces, 1,4 veces, 1,6 veces, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, ó 1000 veces inferior que en ausencia del polipéptido de la invención bajo condiciones equivalentes. La expresión de gen puede ser medida por el uso de cualquier método adecuado que incluya el uso de la reacción en cadena inversa de la transcriptasa-polimerasa (RT-PCR), hibridización de ARN, ensayos de protección de la ARNsa, ensayos de corrimiento nuclear y alteración de la cromatina como se juzga por la hipersensibilidad a la ADNsa 1.

En las células de animales y plantas la deacetilación de histona es provocada por el así llamado complejo de deacetilasa de histona (CDAH) el cual contiene, en adición a una o más enzimas de deacetilasa de histona, proteínas auxiliares las cuales están implicadas en la formación y funcionamiento del complejo. Además, hay otros componentes protéicos los cuales aunque pueden no ser parte del CDAH enlazan a, o de otra forma interactúan con, el CDAH y ayudan a facilitar la deacetilación de histona.

La deacetilación y acetilación de histonas es un fenómeno bien conocido el cual es reseñado en los siguientes: Chen & Li (1998) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression 8, 169-190; Workman & Kingston (1998) Ann. Rev. Biochem. 67, 545-579; Perlmann & Vennstrom (1995) Nature 377, 387; Wolfe (1997) Nature 387, 16-17; Grunstein (1997) Nature 389, 349-352; Pazin & Kadonaga (1997) Cell 89, 325-328; DePinho (1998) Nature 391, 533-536; Bestor (1998) Nature 393, 311-312; y Grunstein (1998) Cell 93, 325-328.

La composición polipéptida del complejo CDAH está actualmente bajo investigación. Los polipéptidos los cuales pueden formar aparte de, o están asociados con, ciertos complejos de CDAH incluyen deacetilasa de histona 1 (CDAH1) Taunton et al (1996) Nature 272, 408-441); histone deacetylase 2 (CDAH 2) (Yang et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12845-12850); histone deacetylase 3 (CDAH3) (Dangond et al (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 242, 648-652); N-CoR (Horlein et al (1995) Nature 377, 397-404); SMRT (Chen & Evans (1995) Nature 377, 454-457); SAP30 (Zhang et al (1998) Molecular Cell 1, 1021-1031). Sin3 (Ayer et al (1995) Cell 80, 767-776; Scbreiber-Agus et al (1995) Cell 80, 777-786) SAP18 (Zhang et al (1997) Cell 89, 357-364); y RbAp48 (Qian et al (1993) Nature 364, 648-652). Todos estos artículos están incorporados aquí como referencias. Se considera que puede haber componentes adicionales del complejo CDAH o los cuales interactúan con el complejo CDAH los cuales están, hasta el momento, sin descubrir. Es concebible que éstos también serán útiles en la práctica de la invención.

Se ha descrito que PLZF interactúa con N-CoR y SMRT, los cuales a su vez alistan un complejo CDAH. PLZF también interactuará directamente con el CDAH (Lin et al (1998) Nature 391, 811-814; Grignani et al (1998) Nature 391, 815-818; David et al (1998) Oncogene 16, 2549-2556).

Mad1 es un miembro de la familia Mad y tiene una habilidad para actuar como un represor transcripcional. Se ha mostado que Mad1 es capaz de interactuar con Sin3, el cual en cambio interactúa con deacetilasas histonas de clase I (CDAH1 yCDAH2). Mad/Sin 3 funciona como un gran andamio de proteínas capaz de múltiples interacciones proteína-proteína (Hassig et al (1997) Cell 89, 341-347; Laherty et al (1997) Cell 89, 349-356; Zhang et al (1997) Cell 89, 357-364)).

Los complejos formados que contienen cualquiera de los N-CoR, SMRT, Sin3, SAP18, SAP 30 y deacetilasa de histona están descritos en Heinzel et al (1997) Nature 387, 43-48; Alland et al (1997) Nature 387, 49-55; Hassig et al (1997) Cell 89, 341-347; Laherty et al (1997) Cell 89, 349-356; Zhang et al (1997) Cell 89, 357-364; Kadosh & Stuhl (1997) Cell 89, 365-371; Nagy et al (1997) Cell 89, 373-380; y Laherty et al (1998) Molecular Cell 2, 33-42. Todos estos artículos están incorporados aquí como referencias.

Así, es particularmente preferente si el componente del complejo CDAH o el polipéptido el cual enlaza a, o facilita el alistamiento del complejo CDAH es cualquiera de MAD1, E7, PLZF, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30 or N-CoR, o los CDAH que incluyen CDAH1, CDAH2 o CDAH3, o NuRD, MAD2, MAD3, MAD4 o Rb. Será apreciado que puede no ser necesaria para todos los polipéptidos estar presentes mientras una porción de los mismos esté presente. Por ejemplo, con respecto a las enzimas deacetilasa de histona (por ejemplo, CDAH1, CDAH2 o CDAH3) la porción funcional puede ser una porción que retiene la actividad de la deacetilasa de histona o puede ser una porción la cual contiene un sitio de enlace para otros componentes del complejo CDAH o una porción la cual de otro modo alista el complejo CDAH y promueve la deacetilación de histona. Similarmente, con respecto a los otros componentes del complejo CDAH o polipéptidos los cuales enlazan con el complejo CDAH la porción funcional puede ser una porción la cual contiene un sitio de enlace para otros componentes del complejo CDAH. Para citar seis genes de mamíferos CDAH han sido descritos (Grozinger et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873), se cree que cualquier uno o más de éstos pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.

Para evitar dudas, VP16 o KRAB no están incluidas en el significado de los términos "porción modificadora" o "porción de desactivación de cromatina". VP16 es un activador transcripcional cuyo modo de acción no está considerado para implicar modificación covalente de ADN o cromatina. KRAB es un represor transcripcional cuyo modo de acción está considerado para implicar mecanismos que no sean de desactivación de cromatina. Aunque no es preferente, cualquier fragmento de KRAB que, cuando parte de la molécula/polipéptido como se definió antes y cuando está dirigida a un gen seleccionado por la porción de enlace de ácido nucleico, localmente desactiva la cromatina asociada con el gen seleccionado tal que la expresión del gen es desactivada o suprimida, está incluida dentro del término "porción de desactivación de cromatina". Por ejemplo, cualquier fragmento de KRAB que es capaz de enlazar a, o facilitar el alistamiento de, un complejo CDAH está incluido dentro del término "porción de desactivación de cromatina". Sin embargo, cualquiera de tales fragmentos no son preferentes.

Se cree que los motivos de enlace están presentes en los componentes del complejo CDAH o en los polipéptidos los cuales enlazan con el complejo CDAH y estos motivos pueden ser suficientes para actuar como porciones de desactivación de cromatina en el polipéptido de la invención ya que puede facilitar la deacetilación de histona por el alistamiento de un complejo CDAH.

Además, se apreciará que las variantes de un componente del complejo CDAH o variantes de un polipéptido el cual se enlaza al complejo CDAH puede ser usado. Las variantes adecuadas incluyen no sólo porciones funcionales como se describió antes, sino también variantes en las cuales residuos de amino ácidos han sido suprimidas o reemplazadas o insertadas con tal de que esas variantes sean aún capaces de facilitar la deacetilación de histona. Así, las variantes adecuadas incluyen variantes de deacetilato de histona en las cuales la secuencia de aminoácido ha sido modificada en comparación con el tipo silvestre pero el cual retiene su habilidad para deacetilatar histonas. Similarmente, las variantes adecuadas incluyen variantes de, por ejemplo, Sin3 o PLFZ en las cuales la secuencia de aminoácido ha sido modificada en comparación con el tipo silvestre pero la cual retiene su habilidad para interactuar con o en el complejo CDAH. Similarmente, variantes de otras proteínas que interactúan con componentes del complejo CDAH y otros factores de transcripción que pueden provocar la desactivación del gen a través de la actividad CDAH pueden ser usadas.

Todas o partes de las proteínas Rb, MAD y MeCpG2 pueden interactuar con el complejo CDAH.

Mientras la mayoría del trabajo ha sido hecho en el complejo CDAH y los polipéptidos involucrados en el alistamiento de complejos CDAH en sistemas de mamíferos, la naturaleza fundamental del sistema es tal que los polipéptidos funcionalmente equivalentes son previstos a ser encontrados en otras células eucarióticas, en particular en otras células animales y en células de plantas. Por ejemplo, la figura 5 muestra que los polipéptidos cercanamente relacionados con el CDAH1 están presentes en arabidopsis y en la levadura A de planta el complejo CDAH ha sido aislado del maíz (Lussen et al (1997) Science 277, 88-91) y un estudio comparativo de las deacetilasas de histona de células de plantas, micóticas y de vertebrados ha sido abordado (Lechner et al (1996) Biochim. Biophys. Acta 1296, 181-188). Los inhibidores de deacilatasa de histona han sido mostrados para deprimir los genes ARNr silentes en Brassica (Chen & Pickard (1997) Genes Dev. 11, 2124-2136) y una toxina selectiva que surge naturalmente (toxina HC) del Cochliobolus carbonum inhibe las deacetilesas de histonas de plantas, micóticos y de mamíferos (Brosch et al (1995) Plant Cell 7, 1941-1950).

No es necesario que la porción de desactivcación de cromatina esté formada de los mismos tipos o especies de célula como la célula en la cual el polipéptido (o el polinucleótido que codifica al polipéptido) es introducido pero es deseable si puesto que tal porción de desactivación de cromatina pueda ser capaz de desactivar la cromatina más efectivamente en esa célula.

Es particularmente preferente si la porción de desactivación de cromatina del polipéptido es PLZF, E7, MAD1, Rb or SAP18, o una porción de PLZF o E7 o MAD1 o Rb o SAP18 que pueden facilitar la deacetilación de histona, o un polipéptido, o porción de un polipéptido, conocidos para causar la activación del gen via deacetilación de histona. Por ejemplo, la porción de PLZF en PLZF-RAR\alpha la cual está implicada en APL es considerada para interactuar con N-CoR y SMRT.

Las porciones de desactivación de cromatina preferentes están descritas en los Ejemplos, e incluyen polipéptido/polipéptido imitador o análogo derivable del SAP18 con la secuencia de aminoácido XXXMAVESRVTQEEIK
KEPEKPIDREKTCPLLLRVF (donde XXX es, por ejemplo, un conectador AAA o DDD) y un polipéptido derivable de MAD1 con la secuencia de aminoácido XXMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP (donde XXX es, por ejemplo, un conectador AAA o DDD).

Es también particularmente preferente si la porción de desactivación de cromatina es un polipéptido con actividad de enzima deacetilasa de histona tal como la contenida en CDAH1, CDAH2 o CDAH3.

Alternativamente, la porción modificadora puede ser una porción que es capaz de modular la modificación covalente, por ejemplo metilación, de ácido nucleico, preferentemente ADN. Así, la porción modificadora puede ser o comprender una enzima modificadora, o puede ser capaz de alistar tal enzima. La modulación preferentemente tiene el efecto de suprimir el gen seleccionado.

Es preferente que la porción modificadora no cambie la secuencia del ácido nucleico. Es preferente que la porción modificadora no divida el eje del ácido nucleico. La porción modificadora es no preferentemente una recombinasa o una endonucleasa de restricción.

Por ejemplo, la porción modificadora puede comprender (o ser capaz de alistar) toda o una porción de una metiltransferasa o un componente de un compuesto de metiltransferasa, por ejemplo, como se discutió en Okano M, Xie S, Li E. (1998) Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nat Genet 19: 219-220; Adrian P. Bird and Alan P. Wolffe (1999) Methylation-Induced Repression: Belts, Braces, and Chromatin. Cell 99,451-454.

Es preferente que la porción modificadora o represora no sea una endonucleasa u otra molécula que produce una ruptura persistente en la cadena de ADN.

Es preferente que un polipéptido/polipéptido imitador o una porción análoga de la molécula (por ejemplo la porción modificadora) tenga una masa molecular menor que 11 kDa, preferentemente menor que 8 kDa, aún más preferentemente menor que 6 kDa. Por ejemplo, es preferente que un polipéptido/ polipéptido imitador o una porción análoga tenga menos que 100, aún más preferentemente menor que 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o 20 aminoácidos (o imitaciones o análogos de los mismos), más preferentemente entre alrededor de 60 y 25 aminoácidos (o imitadores o análogos de los mismos).

Es particularmente preferente que la porción modificadora consista en péptidos derivables de SAP18 o MAD1 o Rb y conectadores apropiados, por ejemplo los péptidos derivables de SAP18 y conectadores como los descritos antes y en el ejemplo 1.

La molécula puede además comprender una porción la cual facilita la entrada celular y/o la localización nuclear (porción localizadora). Esta porción puede ser también un polipéptido o polipéptido imitador/análogo. Por ejemplo, la porción localizadora puede comprender o consistir de un péptido con actividad membranotrópica como se discutió, por ejemplo, en Soukchareun et al (1998) Bioconjugate Chem 9, 466-475 y las referencias citadas en él, por ejemplo Soukchareun et al (1995) Bioconjugate Chem 6, 43-53 (péptidos de función viral) o Eritja et al (1991) Tetrahedron 47, 4113-4120 (secuencias de señal de transporte nuclear). Puede ser un péptido de señal de localización nuclear o un péptido lítico endosómico (el cual facilita la liberación de la molécula del compartimento endosómico) mencionado en WO 99/13719. Es preferente que esta porción sea de menos que 3 kDa, preferentemente de menos que 2,5 kDa. Es preferente que el contenido total de polipéptido/imitador/análogo de la molécula sea menor que 11 kDa. Típicamente, una porción localizadora puede tener entre alrededor de 7 y 16 aminoácidos.

Ejemplos adicionales de porciones localizadoras incluyen el homeodominio Antennapedia basado en Penetratinas (por ejemplo RQIKIWFQNRRMKWKK), o TAT (por ejemplo C(Acm)GRKKRRQRRRPPQC, donde C(Acm) es un Cis-acetamidometil) o moléculas basadas en VP22 (Prochiantz (2000) Curr Opin Cell Biol 9, 420-429) o un péptido de internalización HIV TAT básico.

Las moléculas de la invención pueden ser útiles en métodos y usos facilitados por los aspectos de la invención, por ejemplo como los discutidos en más detalle después. En particular, los polipéptidos de la invención pueden ser útiles en un método del primer o segundo aspecto de la invención.

Se prefiere que las moléculas de la invención sean moléculas híbridas las cuales no ocurren en la naturaleza. Por ejemplo, es preferente que la porción de enlace de ácido nucleico y la porción modificadora no sean derivables de un complejo o molécula que ocurren naturalmente. Las moléculas (si alguna) de las cuales la porción de enlace de ácido nucleico o la porción de desactivación de cromatina son derivadas pueden formar las mismas especies (por ejemplo, como se describe en más detalle debajo, la porción de enlace de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido que tiene una secuencia encontrada en ácido nucleico humano y la porción de desactivación de cromatina puede ser una porción de PLZF humano) o pueden ser de diferentes especies (por ejemplo un oligonucleótido que tiene una secuencia no encontrada en ácido nucleico humano, por ejemplo capaz de enlazar con una secuencia ADN bacteriana, puede ser combinada con una porción de PLZF humano).

Así, en una realización particular preferente la molécula de la invención es una la cual es producida por métodos de síntesis química en los que la porción de enlace de ácido nucleico y la porción modificadora o de desactivación de cromatina son seleccionadas como se describe en más detalle abajo.

Las técnicas de síntesis y de unión son discutidas en la WO 01/14737 y las referencias en este sentido (incorporadas aquí por referencia). Los métodos de la WO 01/147373 son preferentes. Alternativamente, las técnicas descritas en Kusnetsova et al (1999) Nucleic Acids Res 27, 3995-4000 pueden también ser usadas.

El sitio presente en un genoma eucariótico es un sitio el cual está en, o asociado con, el gen seleccionado o los genes cuya expresión es deseable modular, preferentemente suprimir o desactivar. Es preferente si el sitio es un sitio el cual está naturalmente presente en un genoma eucariótico. Sin embargo, como es discutido en más detalle debajo, el sitio puede ser uno el cual ha sido diseñado en el genoma, o puede ser un sitio asociado con una secuencia viral insertada. El sitio diseñado en el genoma para estar en la vecindad del gen cuya expresión va a ser suprimida puede ser un sitio de la misma especie (pero presente en otra parte en el genoma) o puede ser un sitio presente en una especie diferente. Por "genoma" incluimos no sólo el ADN cromosómico sino otro ADN presente en la célula eucariótica, tal como el ADN el cual ha sido introducido en la célula, por ejemplo ADN plásmido o viral. Se prefiera que la porción de enlace de ácido nucleico pueda enlazar al ADN cromosómico o, como es descrito en más detalle abajo, al ARN transcrito del ADN cromosómico.

En una realización, es preferente que el gen sea un gen endógeno. El término "gen endógeno" se refiere a un gen que es originario de la célula en la cual es no heterólogo para la célula y está en su contexto genómico natural. En este contexto el sitio presente en un genoma eucariótico es un sitio el cual está en, o asociado con, el gen endógeno seleccionado o genes cuya expresión es deseable suprimir o desactivar. El sitio es un sitio el cual está presente naturalmente en un genoma eucariótico y está en su contexto genómico natural.

Puede ser deseable que el sitio tenga características particulares de secuencia que promuevan el enlace a un oligonucleótido para formar una hélice triple, como es conocido por los expertos en la técnica. Sin embargo, se considera en relación con la presente invención que tales características de secuencia pueden ser menos importantes que para los oligonucleótidos en ausencia de una porción de polipéptido, ya que el efecto de supresión o de modulación de la molécula de la invención puede persistir aún cuando la molécula no esté más ligada al sitio objetivo; así, la afinidad de enlace puede ser menos crítica. Esta secuencia de oligonucleótido es todavía importante a fin de que el reconocimiento específico sea obtenido; sin embargo, los enlaces que son formados entre el oligo y la secuencia objetivo pueden no necesitar ser tan fuertes cuando la porción de polpeptido/peptidomimética está presente.

El posicionamiento del sitio de enlace del oligonucleótido relativo al gen cuya transcripción va a ser suprimida o modulada puede ser también menos crítica que para los oligonucleótidos, por ejemplo, los OFT, sin una porción modificadora como el efecto de modulación o de supresión de la molécula de la invención (por ejemplo cuando el dominio modificador es o es capaz de alistar una metiltransferasa o deacetilasa de histona) puede extenderse a cualquier lado del sitio de enlace del oligonucleótido. La porción de enlace de ácido nucleico puede enlazar con el gen promotor, pero puede alternativamente enlazar con otra secuencia en o en la proximidad del gen de interés.

Las WO 90/06934/EP 0 375 408 y WO 91/06626 abordan los requerimientos de secuencia para los OFT. Dos motivos para la formación de una hélice triple son llamados el motivo "CT" y el motivo "GT". El primero de estos implica el uso de polipirimidina oligonucleótida como el OFT. Para cada par de base GC, una C está presente en el OFT y para cada par de base AT, una T (o xantina o inosina o derivados halogenados) está presente en el OFT. El OFT es considerado para ser orientada en una dirección paralela a la cadena de purina enriquecida del dúplex. Alternativamente, usando el motivo "GT", una G (o un derivado halogenado) está presente para cada par de base GC y una T (o xantina o inosina o derivados halogenados) para cada par de base AT, y el OFT está considerado para ser orientada en una diracción antiparalela a la cadena de purina enriquecida del dúplex. La secuencia objetivo deberá tener al menos alrededor del 65% de bases de pirimidina. La EP 0 266 099 también aborda cómo las secuencias objetivo adecuadas pueden ser seleccionadas.

La WO94/17086 aborda los oligonucleótidos que son propuestos para enlazar las secuencias de ADN que están consideradas para ser capaces de adoptar una conformación monocatenaria. Tales secuencias pueden ser de purina enriquecida y tener simetría sustancial de reflejo. Los oligonucleótidos pueden ser sustancialmente complementarios a la cadena de purina, o pueden tener una estructura de funcionamiento circular o en tallo de lazo que puede formar enlaces tanto Watson-Crick como Hoogensteen con el ADN monocatenario objetivo.

La WO96/35706 describe los oligonucleótidos con estructuras y características de secuencia que son considerados para promover la formación de un complejo estable y específico con el ácido nucleico objetivo (ácidos nucleicos monocatenarios de pirimidina) y los cuales puede tener mayor estabilidad debido a la formación de estructura de horquilla de cadena paralela en ausencia del ácido nucleico objetivo.

Debin et al (1999) Nucl Acids Res 27_(13), 2699-2707 comenta los factores que afectan la estabilidad de las hélices triples G, A y las consecuencias para el diseño del OFT. Xodo et al (2001) Eur J Biochem 268, 656-664 también investiga los factores que afectan los enlaces del OFTa los sitios objetivo, por ejemplo los enlaces de los oligonucleótidos cortos con los sitios vecinos.

Blume et al (1999) Nucl Acids Res 27, 695-702 investiga la implicación de un catión bivalente en la formación de la hélice triple y cómo la formación puede ser positivamente o negativamente modulada. Faria et al (2001) J Mol Biol 306, 15-24 describe un ensayo para la evaluación del OFT en células con varios oligonucleótidos. Cheng et al (2000) Biotech and Bioeng 70, 467-472 presenta los resultados del modelo matemático de los enlaces OFT y las consecuencias para escoger los sitios de enlace y las secuencias de OFT.

Demidov & Frank-Kamenetskii reseña el enlazamiento de los ácidos nucleicos péptidos (ANPs), particularmente los ANPs (cpiANPs) con los ADN dúplex.

Las reglas para diseñar los OFT potenciales son reseñadas en Vasquez & Wilson (1998) Trends Biochem Sci 1, 4-9. Tres tipos del OFT son indicados para ser efectivos: pirimidina enriquecida (CT); purina enriquecida (GA) y mezclada (GT o GAT). Los OFT CT enlazan en un motivo paralelo; en el cual la tercera cadena tiene la misma orientación 5' a 3' como la cadena de purina del dúplex. Los OFT GA enlazan en un motivo antiparalelo. Los OFT mezcladas pueden enlazar en cualquier manera, en dependencia de la secuencia objetivo. Otras propiedades también difieren entre los tipos de los OFT; por ejemplo los OFT CT son dependientes del pH. Cada tipo de OFT puede ser adecuado en relación con la presente invención.

Es preferente que el oligonucleótido o la porción de imitación sea de alrededor de 10 a 80, preferentemente de 15 a 40 bases de largo, aún más preferentemente de alrededor de 20 a 40 bases de largo. Los oligonucleótidos de menos de 20 bases pueden mostrar enlaces más débiles y/o menos específicos pero pueden no obstante ser útiles en la práctica de la invención, por ejemplo puesto que sólo un enlace transitorio es requerido, como se advirtió arriba.

Por "ADN" u "oligo(deoxi)nucleótido" queremos decir una molécula con un azúcar-enlace-eje de azúcar en el que el residuo de azúcar comprende una 2'-deoxiribosa (y por consiguiente incluye una cadena ADN terminada con un nucleósido que comprende una 2', 3' mitad de dideoxribosa) y en la que, fijada al residuo de azúcar en la posición 1 es una base tal como adenina (A), citosina (C), guanina (G), timidina (T), inosina (I), uridina (U) y similares. En el ADN normal el enlace entre los residuos de azúcar (el "enlace-eje de azúcar") es una mitad de fosfato la cual forma un diester con los dichos residuos de azúcar. Sin embargo, incluimos el término "ácido nucleico" (y más particularmente en el término ADN) moléculas con enlaces de no fosfato.

Así, incluimos un enlace fosforotioato y un enlace fosforoselenoato. Puede ser preferente que los enlaces sean más resistentes al ataque por nucleasas celulares que el ADN normal. Tales enlaces pueden también incluir metil fosfato, fosfotriéster y el \alpha enantiómero del fosfodiéster que ocurre naturalmente.

Por los términos "ácido nucleico" u "oligonucleótido" también incluimos moléculas con análogos de base no naturales; moléculas en las cuales las posiciones 2' y 3' del azúcar pentosa son independientemente cualquiera de -H, -OH o -NH_{2}; y moléculas en las cuales un oxígeno fijado al átomo de fósforo pero no en el enlace de fosfodiéster es reemplazado por -SH, SeH, -BH_{2}, -NH_{2}, -PH_{3}, -F, -Cl, -CH_{3}, -OCH_{3}, -CN y -H.

El oligonucleótido puede ser un oligoribonucleótido o un oligodesoxiribonucleótido. Los oligodesoxiribonucleótidos son preferentes como oligoribonucleótidos pueden ser más susceptibles al ataque enzimático que los oligodesoxiribonucleótidos.

El oligonucleótido o el análogo o el imitador puede ser un ácido nucleico péptido, como los conocidos por los expertos en la técnica descritos en, por ejemplo en la WO 99/13719 y las referencias en ésta, y en in Demidov & Frank-Kamenetskii (2001) supra. Los ANP son análogos del ácido nucleico con un eje de poliamida (péptido) que contiene unidades de 2-aminoetil glicina en lugar del eje de desoxribosa-fosfato de ADN. El eje de ANP es neutral (diferente al eje de ADN, el cual está negativamente cargado) y puede por eso enlazar más establemente con la molécula de ácido nucleico cargada que lo que haría la molécula de ADN correspondiente.

Es preferente que el oligonucleótido o el análogo o el imitador sea un oligonucleótido de ADN.

Las referencias a un oligonucleótido incluyen (cuando es apropiado) referencia a un oligonucleótido imitador o un análogo, por ejemplo un ANP.

El oligonucleótido puede comprender un conectador, el cual puede ser fijado a los terminales 5' o 3' del oligonucleótido. Ejemplos de conectadores adecuados están descritos en, por ejemplo, la WO 90/06934.

Puede ser preferente que la porción de enlace de ácido nucleico sea o comprenda un ácido nucleico péptido (ANP).

La porción de enlace de ácido nucleico puede ser cualquier porción de enlace adecuada como se definió la cual enlaza a un sitio presente en una eucariota, tal como un genoma de planta o animal. Es particularmente preferente que la porción de enlace de ácido nucleico sea capaz de enlazar a un sitio el cual esté en, o asociado a, un gen seleccionado cuya expresión va a ser suprimida por la presencia de la porción de desactivación de cromatina del polipéptido de la invención. Es preferente que la porción de enlace de ácido nucleico enlace selectivamente con el sitio deseado. Puede haber uno o más sitios deseados a los cuales la porción de enlace de ácido nucleico puede enlazar. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede ser usado para suprimir la expresión de un grupo de genes cada uno de los cuales tiene un sitio de enlace para una porción común de enlace de ADN (por ejemplo, están bajo los controles de un receptor de hormana esteroide tal como el receptor estrógeno (RE)). Para evitar dudas, el sitio presente en la eucariota puede ser un sitio de ocurrencia natural, o puede ser un sitio el cual ha sido diseñado para estar allí. El sitio no necesita ser originalmente de la misma o de cualquier otra eucariota. Por ejemplo, puede ser una secuencia bacteriana o viral o una secuencia artificial para las cuales los OFT han sido previamente caracterizados, la cual ha sido diseñada para estar presente en el ADN de la célula eucariota, por ejemplo una célula de planta.

Los ejemplos pueden incluir elementos de respuestas, tales como ERE y IRE como se describe en los ejemplos aquí, u otros sitios de enlaces característicos. Puede ser deseable para el uso un sitio tal en una célula la cual no contenga un regulador endógeno del sitio. Alternativamente, el sitio puede ser una versión modificada de un elemento de respuesta de ocurrencia natural, cuya versión modificada puede servir como un sitio de enlace para los OFT, pero no puede ser regulado por un regulador de ocurrencia natural de un elemento de respuesta de ocurrencia natural. Sin embargo, es preferible si el sitio al cual la porción de enlace de ácido nucleico que enlaza está naturalmente presente en la célula eucariótica y está presente en su posición natural en el genoma.

La porción de enlace de ácido nucleico puede ser una porción de enlace de ADN o una porción de enlace de ARN. Así, la porción de enlace de ácido nucleico puede enlazarse a un ácido nucleico bicatenario (por ejemplo ADN) o a un ácido nucleico monocatenario (por ejemplo ARN o ADN monocatenario). En el caso de la porción de enlace de ARN, el sito presente en el genoma eucariótico el cual enlaza la porción de enlace de ARN es tipicamente, un RNA naciente que está siendo transcripto de un ADN en el sitio de selección para la desactivación. EL ARN puede ser ese que está siendo transcripto por el gen cuya expresión va a ser suprimida, o puede ser ese el cual está siendo transcripto por un gen adyacente a, o al menos cerca de, el gen cuya expresión va a ser suprimida. Es preferente que la porción de enlace del ARN se enlace a una secuencia de RNA el cual está en o está cerca del extremo 5' de la transcripción. Se apreciará que mientras que esté siendo transcripto, el RNA naciente permanece en o cerca de su sitio de transcripción y que si el sitio de transcripción está en o cerca del gen cuya expresión será suprimida, usando una porción de enlace de ARN en la molécula de la invención se facilita la localización de la porción de desactivación de cromatina en el sitio deseado.

Puede ser útil si la porción de enlace de ADN se enlaza a un sitio de enlace de factor de transcripción, por ejemplo de tal modo que la expresión de más de un gen al cual los enlaces de factor de transcripción pueden ser modulados. El listado de las bases de datos de los factores de transcripción y sus sitios de enlace son listados abajo:

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFFACTOR

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFSITIO

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFCELULA

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/egi-bin/wgetz?-fun+pagelibinof+-info+TFCLASE

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFMATRIZ

http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFGEN

Puede ser útil si la porción de enlace de ADN se enlaza a una región promotora u otras regiones reguladoras o secuencias justamente contra corriente del sitio de inicio de la transcripción. En algunas solicitudes puede ser preferente dirigir las secuencias dentro del gen para diferenciarlas dentro de las variantes de empalme.

Como se observó, los oligonucleótidos pueden ser diseñados a fin de que se enlacen a una secuencia de ADN objetivo seleccionada particular la cual está en, o asociada con, un gen seleccionado. En una realización de la invención el oligonucleótido es uno el cual ha sido diseñado para enlazarse a un sitio el cual está presente en una secuencia de gen mutante dentro de la célula de planta o de animal pero que no está presente en la secuencia del tipo silvestre equivalente. Por ejemplo, y como es discutido con más detalle abajo, el oligonucleótido puede enlazar selectivamente a un gen mutado negativo dominante, tal como un oncogen mutante y, en el enlace, la metilación o desactivación de la cromatina del ADN ocurre y suprime la expresión del encogen mutante. Ejemplos de oncogenes mutados en cáncer humano incluyen RAS (H-ras) y Bcl-10.

Típicamente, la porción de enlace de ácido nucleico y la porción de modificación o desactivación de cromatina están combinadas. La porción de enlace de ácido nucleico y la porción de modificación o desactivación de cromatina pueden ser sintetizadas como una molécula única (aproximación de síntesis total), por ejemplo por ensamblaje consecutivo del péptido y entonces del oligonucleótido sobre un soporte sólido, por ejemplo como se describió en Soukchareun et al (1998) supra y en las referencias citadas aquí, o en Basu et al (1995) Tetrahedron Lett 36, 4943. Preferentemente, un procedimiento automático es usado.

Alternativamente, la porción de enlace de ácido nucleico y la porción de modificación o desactivación de cromatina son sintetizadas separadamente, usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, y entonces unidas. Las técnicas adecuadas para el acoplamiento de ácidos nucleicos péptidos incluyen el uso de reactivos de conjugación heterobifuncional tales como SPDP (N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato) y SMCC (succinimidil 4-(N-maleimidometil) cilohexeno-carboxilato) y son descritas, por ejemplo, en la WO 99/13719, particularmente en los ejemplos 12 a 15. Las técnicas adecuadas para acoplar oligodesoxinucleótidos a péptidos incluyen el uso de oligodesoxinucleótidos derivados N^{\alpha}-Fmoc-cisteina (S-tiobutil), como los descritos en Soukchareun et al (1998) supra. Otras técnicas incluyen el uso de la activación de éster N-hidroxibenzotriazola (HOBT) de los terminales 3' o 5' de fosfatos de oligonucleótidos antes del acoplamiento de un péptido desprotegido por la vía de un grupo nucleofílico (tal como un grupo \alpha-NH_{2}) en el péptido (ver Ivanovskaya et al (1995) Nucl Nucl 6, 931-934; Ivanovskaya et al (1987) Dokl Acad Nauk SSSR 293, 477-481; Kuznetsova et al (1999) Nuc Acids Res 27, 3995-4000). Las técnicas de conjugación péptido-oligonucleótido son reseñadas en, por ejemplo, Tung & Stein (2000) Bioconjugate Chem 11(5), 605-618.

Preferentemente, una técnica de "enlace originario" es usada, como se describió en WO 01/15737 y Stetsenko & Gait (2000) Organic Chem 65(16), 4900-4908. Un terminal N de un péptido funcionalizado por tioéster es enlazado a un derivado de oligonucleótido 5'-cisteinil.

Convenientemente, la porción de enlace de ácido nucleico y la porción represora, modificadora o desactivadora de cromatina están unidas a fin de que ambas porciones retengan sus actividades respectivas tal que, por ejemplo, la porción de enlace de ácido nucleico pueda enlazarse a un sitio presente en el genoma de planta o de animal y, sobre el enlace, la porción modificadora es aún capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o la cromatina, por ejemplo, una porción de desactivación de cromatina es aún capaz de desactivar la cromatina. Las dos porciones pueden ser unidas directamente, pero deben estar unidas por un péptido u oligonucleótido enlazador. Los péptidos enlazadores son aquéllos que típicamente adoptan una conformación aleatoria enrollada, por ejemplo, el polipéptido puede contener alanina o prolina o una mezcla de alanina más residuos de prolina. Preferentemente los aminoácidos promueven la solubilidad; así, el enlazador puede contener, por ejemplo, aminoácidos cargados o hidrofílicos tales como residuos de ácido aspártico. Preferentemente el enlazador puede contener, o consistir de, residuos de ácido aspártico. Es preferente que los aminoácidos no sean aminoácidos hidrofóbicos, tales como la fenilalanina o el triptofán.

Preferentemente, el enlazador contiene entre 10 y 100 residuos de aminoácido, más preferentemente entre 10 y 50 y aún más preferentemente entre 10 y 20. Un enlazador más corto, por ejemplo, de entre 3 y 9 aminoácidos, puede también ser útil. En cualquier evento, haya o no un enlazador entre las porciones de la molécula, la molécula es capaz de enlazar su ácido nucleico objetivo y es capaz de reprimir la expresión o modular la modificación covalente del ácido nucleico o la cromatina, por ejemplo, desactivar la cromatina y por ello suprimir o desactivar selectivamente la expresión de gen.

Los polinucleótidos que codifican porciones de represión, modificación o desactivación de cromatina son conocidos en la técnica o pueden ser diseñados y hechos fácilmente de secuencias conocidas. Las secuencias de polinucleótidos que codifican varias porciones adecuadas de desactivación de cromatina son dadas arriba en las referencias las cuales se refieren a los polipéptidos o están disponibles de GenBank o EMBL o dbEST. Una referencia para PLZF es Chen et al (1993) EMBO J. 12, 1161-1167. Una referencia para E7 es Tommasino et al (1995) Bioessays 17, 509-518. Las referencias para SAP18, MAD1 y Rb son respectivamente Zhang et al (1997) Cell 89, 357-364; Ayer et al (1993) Cell 72, 211-222 y Weinberg (1995) Cell 81, 323-330.

Los polinucleótidos que codifican los péptidos de enlace adecuados pueden ser fácilmente diseñados y hechos de las secuencias de péptidos de enlace.

Así, los polinucleótidos que codifican las porciones modificadoras o represoras de las moléculas de la invención pueden ser fácilmente construidas usando las bien conocidas técnicas de ingeniería genética. Las porciones modificadoras o represoras pueden por ello ser sintetizadas por expresión, usando técnicas de biología molecular bien conocidas por los expertos en la técnica. Sin embargo, puede ser preferente sintetizar la porción(es) polipeptido/análoga/imitador de las moléculas de la invención por técnicas de química orgánica, como es conocido por los expertos en la técnica y discutido aquí.

La presente invención también se refiere a una célula huésped transformada con una molécula de la presente invención. La célula huésped puede también ser o procariótica o eucariótica. Las células bacterianas son células procarióticas preferentes y son típicamente una cepa de E. coli tal como, por ejemplo, cepas de E. coli DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, y RR1 disponible de American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Las células huéspedes procarióticas preferentes incluyen células de plantas, micóticas, de insectos y de mamíferos, preferentemente células de vertebrados tales como aquéllas de ratón, rata, mono o fibroblásticas humanas y de líneas celulares de riñon. Las células hospereras micóticas incluyen YPH499, YPH500 y YPH501 las cuales están generalmente disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Las células huéspedes de mamíferos incluyen células ováricas de hámter chino (CHO) disponibles de ATCC como CCL61, células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de ATCC como CRL 1658, células derivadas de riñón de mono como COS-1 disponibles de ATCC como CRL 1650; 293 células las cuales son células de riñón de embriones humanos, y células de fibrosarcoma humano HT1080.

Los protoplastos para transformación son típicamente generados como es requerido por los métodos conocidos en la técnica. Ls líneas celulares de plantas no están generalmente disponibles. Sin embargo, una línea celular la cual es comúnmente usada es la línea celular Bright Yellow 2 del tabaco (BY2; Mu et al (1997) Plant Mol. Biol. 34, 357-362).

La transformación de los huéspedes celulares apropiados con una molécula de la presente invención es realizada por los métodos bien conocidos que típicamente dependen del tipo de molécula usada. Con respecto a la transformación de células huéspedes procarióticas, ver, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. La transformación de células micóticas está descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109 es también útil. Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles en la transfección de tales células, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano o formulaciones de liposomas, están disponibles de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA. Con respecto a las células de plantas y a todas las plantas las aproximaciones siguientes de transformación de plantas (J. Draper y R. Scott en D. Grierson (ed.), "Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow and London, 1991, vol. 1, pp 38-81) pueden ser usadas:

i) Transferencia de gen mediada por ADN, la toma de ADN estimulada por polietilenglicol en los protoplastos, por electroporación, o por microinyección de protoplastos de células de plantas (J. Draper, R. Scott, A. Kumar y G. Dury, ibid., pp 161-198). La transferencia directa de gen en los protoplastos está también descrita en Neuhaus & Spangenberg (1990) Physiol. Plant 79, 213-217; Gad et al (1990) Physiol. Plant 79, 177-183; y Mathur & Koncz (1998) Method Mol. Biol. 82, 267-276;

ii) Transformación usando bombardeo de partículas ((D. McCabe y P. Christou, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 3, 227-236 (1993); P. Christou, Plant J., 3, 275-281 (1992)).

Las técnicas preferentes incluyen electroporación, microinyección y formulación de liposoma.

Algunas especies son dóciles a la transformación directa, evitando un requisito para el cultivo celular o de tejido o (Bechtold et al (1993) Life Sciences, C.R. Acad. Sci. Paris 316, 1194-1199).

En todas las aproximaciones un marcador de selección adecuado, tal como kanamicina o resistente al herbicida, es preferente o alternativamente un gen marcador filtrable ("indicador"), tal como \beta-glucuronidasa o luciferasa (ver J. Draper y R. Scott en D. Grierson (ed.), "Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow and London, 1991, vol. 1 pp 38-81).

La electroporación es también útil para transformar y/o transfectar células y es bien conocida en la técnica para transformar células de hongos, células bacterianas, células de insectos, células de vertebrados y algunas células de plantas (por ejemplo, células de cebada, ver Lazzeri (1995) Methods Mol. Biol. 49, 95-106).

Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden ser transformadas por los métodos descritos en Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 incorporadas aquí por referencia. El mayor número de transformadores es consistentemente recobrado a continuación de la electroporación de la mezcla celular de ADN suspendida en 2,5 X PEB usando 6250 V por cm a 25 \muFD.

Los métodos de transformación de hongo por electroporación están dados a conocer en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.

Las células transformadas exitosamente, por ejemplo, células que contienen una molécula de la presente invención, pueden se identificadas por técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los oligos marcados y/o los marcadores GFP pueden ser usados.

Así, en adición a las propias células huéspedes transformadas, la presente invención también contempla un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente.

En relación a las plantas, está concebido que la invención incluye células únicas derivadas de cultivos de células en suspensión, protoplastos aislados o plantas transformadas estables.

Aunque las moléculas de la invención pueden ser introducidas en cualquier célula huésped adecuada, será apreciado que ellas son diseñadas primariamente para ser efectivas en células animales o de plantas, particularmente aquéllas que tienen uno o más sitios en sus ADN a los cuales la molécula de la invención puede enlazar.

Así, las células animales o de plantas las cuales contienen una molécula de la invención cuya presencia suprime la expresión de un gen particular, o los animales o las plantas que contienen esas células, pueden ser considerados que tienen el gen "noqueado" en el sentido de que éste no puede ser expresado. La desactivación de cromatina por deacetilación de histona puede ser esencialmente irreversible sin intervención ulterior. La represión por deacetilación de histona puede ser revertida por el uso de un inhibidor de deacetilasa de histona, por ejemplo, Tricostatina A (TSA), Trapoxina o butirato de sodio (NaB), como es conocido por los expertos en la técnica. Similarmente, la metilación puede ser esencialmente irreversible sin intervención ulterior, por ejemplo, la administración de inhibidores/inversores de mutilación, los cuales son conocidos en la técnica e incluyen el complejo de azacitidina. Otros inhibidores de metilación incluyen 5 deoxazacitidina, o, por ejemplo, oligos antisentido (o supresores de expresión de gen como se describió aquí) dirigidos a una metiltransferasa de ADN.

Será fácilmente apreciado que la introducción de una molécula de la invención en una célula animal o de planta permitirá dirigir la molécula a un sitio de enlace apropiado dentro del ácido nucleico, por ejemplo, ADN (y el cual está enlazado por la porción de enlace de ADN del polipéptido) y permite la supresión o desactivación u otra modulación de la expresión de gen, por ejemplo, para permitir que la cromatina en, o asociada con, el sitio de enlace objetivo sea desactivada. Típicamente, la molécula de la invención es seleccionada tal que apunte a un gen seleccionado. Así, Convenientemente, el gen objetivo tiene un sitio el cual es enlazado por la porción de enlace de ADN de la molécula asociada con él. El sitio el cual es así enlazado puede estar dentro del gen mismo, por ejemplo, dentro de un intrón o dentro de un exón del gen; o puede estar en una región 5' de la porción transcrita del gen, por ejemplo, dentro o adyacente a la región promotora o acentuadora; o puede estar en una región 3' de la porción transcrita del gen.

Los genes regulados por receptor de estrógeno (RE) incluyen el gen receptor de progesterona (RP) y el gen PS2 (proteína relacionada al trébol). Así, el método de la invención puede ser usado para desactivar el gen RP o el gen PS2 cuando la porción de enlace de ADN del compuesto de la invención es capaz de enlazar al sitio de enlace RE. La terapia anti-estrógeno es usada en el tratamiento de cáncer de mama. El repertorio completo de los genes regulados por estrógeno implicados en el cáncer de mama es actualmente desconocido. Es generalmente considerado que la terapia anti-estrógeno resulta en la expresión alterada de los genes claves regulados por estrógeno implicados en el crecimiento y transformación celular del cáncer de mama. Los métodos de la invención descritos abajo pueden proveer un modo alternativo, potencialmente más efectivo, de la regulación de la expresión (particularmente la inhibición) de los genes sensibles al estrógeno. Puede ser que para ciertas porciones de enlace de ADN, en una célula animal o de planta dada haya un solo sitio objetivo y la expresión de sólo un gen es suprimida o modulada por la porción de represión, moduladora, o desactivadora de cromatina. Sin embargo, puede haber más que un sitio objetivo y la introducción de una molécula de la invención puede conducir a la supresión de la expresión de un número de genes.

La habilidad para suprimir la expresión de un gen seleccionado es útil en muchas áreas de la biología.

Típicamente, cuando un gen cuya expresión es suprimida está en una célula animal, la célula animal en una célula en un animal y el método de la invención son usados para suprimir la expresión de un gen seleccionado en un animal (el cual puede ser un animal humano o un animal no humano). Los ejemplos de usos particulares en células animales incluyen la desactivación de alelo específico de proteínas oncogénicas tales como la Ras mutante y la Bcl-10 mutante; la inhibición de la expresión de gen regulado por receptor de estrógeno en el cáncer de mama, la inhibición del receptor andrógeno, la inhibición de genes de interés para estudios de desarrollo, la inhibición de genes para el desarrollo de modelos transgénicos de enfermedades humanas, por ejemplo, cáncer, elucidación de caminos bioquímicos, por ejemplo, caminos de señalización, estudios objetivos de validación/modelos celulares para enfermedades; e inhibición de genes implicados en el modelaje tisular, como los encontrados en la curación del cáncer y lesiones.

También típicamente, la célula de planta es una célula dentro de una planta y el método de la invención es usado para suprimir la expresión de un gen seleccionado en una planta.

En una realización, se usa el método de la invención para suprimir la expresión de genes socialmente o ambientalmente inaceptables o indeseables en las plantas transgénicas comercialmente diseñadas. Tales genes pueden incluir, por ejemplo, antibióticos o genes marcadores seleccionables herbicidas. En esta realización, el gen transgénico en la planta transgénica es identificado para silenciarse.

En una realización ulterior de la invención la arquitectura de plantas novedosas o la morfología floral puede ser lograda por la identificación de algunos genes homeóticos conocidos implicados en esas vías de desarrollo.

Convenientemente, el método de la invención es usado para suprimir o desactivar la expresión de un gen cuya expresión es deseable para suprimir o desactivar. Tales genes incluyen oncogenes, genes virales incluyendo genes presentes en genomas provirales y así el método en relación con animales puede constituir un método de tratamiento médico. Los oncógenos pueden estar sobreexpresados en ciertos cánceres y pueden ser deseables para suprimir su expresión. Algunos oncogenes son oncogénicos en virtud de tener una mutación activa. Usando el método de la invención la supresión selectiva de la expresión de un oncogen mutante se puede lograr por el uso de una porción de enlace de ADN que enlaza selectivamente a una secuencia de oncogen mutante y en la que la porción modificadora o represora, por ejemplo, la porción de desactivación de la cromatina suprime la expresión del oncogen mutante, por ejemplo, por la desactivación de la cromatina en la cual el oncogen reside o con la cual él está asociado. La supresión de la sobreexpresión del oncogen o la expresión del oncogen mutante (especialmente activado) es generalmente deseable en el tratamiento de cánceres en los cuales los oncogenes juegan un papel. Los oncogenes mutantes los cuales pueden ser identificados por el método de la invención incluyen Ras y Bcl-10. Estos pueden ser identificados por porciones de enlace de ADN capaces de reconocer los genes mutantes en una manera específica de secuencia.

La expresión de genes virales en células animales o de plantas es generalmente indeseable ya que esta expresión está a menudo asociada con patogénesis. El ácido nucleico de ciertos virus puede estar formado en la cromatina y la expresión de tales genes virales puede ser controlada por la modificación de esta cromatina. Por ejemplo, los provirus retrovirales (o sea, copias de ADN de ARN retrovirales) son a menudo incorporados en los genomas animales y de plantas en los que se convierten en parte de la cromatina, por ejemplo, los provirus VIH integrados y los papilomavirus humanos integrados. Los retrotransposones similares a Gypsy y a Copia aparecen para ser ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Los retrotransposones similares a Copia, o al menos sus dominios de transcriptasa inversa, aparecen ampliamente distribuidos en las plantas superiores mientras que los elementos similares a Gipsy (los cuales comparten su organización con los retrovirus pero carecen de dominios de cubierta retroviral) son menos abundantes (Suoniemi et al (1998) Plant J. 13, 699-705). La integración del ADN viral en el genoma de las plantas ha sido demostrado por el ADN geminiviral en el genoma nuclear del tabaco (Bejarano et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 759-764). Los retrovirus potenciales han también recientemente descritos en las plantas (Wright & Voytus (1998) Genetics 149, 703-715). Por el uso del método de la invención la supresión selectiva de la expresión de un gen viral puede ser lograda. El dominio de enlace de ácido nucleico oligonucleótido/imitador/análogo puede ser usado para identificar un represor o modificador, por ejemplo, la porción de desactivación de cromatina y conduce a la desactivación del genoma proviral por enlazar a los transcripciones de ARN genómicos nacientes, logrando (por ejemplo) la deacetilación de histona por proximidad.

Ciertas enfermedades genéticas son causadas por mutaciones dominantes, tales como la acondroplasia. La supresión de la expresión del alelo mutante puede ser útil en el tratamiento de estas enfermedades. Por el uso del método de la invención, la supresión selectiva de la expresión del alelo mutante puede ser lograda usando una porción de enlace de ADN que selectivamente enlaza a la secuencia del alelo mutante y en la que (por ejemplo) la porción de desactivación de cromatina desactiva la cromatina en la cual el alelo mutante reside o con la cual éste está asociado a fin de que la expresión del alelo mutante sea suprimida.

Estos métodos de la invención típicamente implican la transferencia de la molécula de la invención en una célula animal o de planta.

Los sistemas de transferencia útiles con las fusiones de oligonucleótidos o oligonucleótido-péptido serán bien conocidas a los expertos en la técnica y pueden ser útiles en la práctica de los métodos de la presente invención en los cuales la molécula de la invención es introducida o bien dentro o fuera del cuerpo del animal. Por ejemplo, los métodos basados en liposoma o virus pueden ser usados. La electroporación (ver, por ejemplo, Kuznetsova et al (1999) Nucl Acids Res 27(20), 3995-4000), los métodos balístico, lípidos catiónicos (por ejemplo, como los descritos en Felgner et al (1997) Hum Gene Ther 8, 511-512 o WO 99/13719) o ligandos específicos fijados al oligonucleótido o a la porción polipéptida de la molécula, o al portador pueden ser usados, por ejemplo, como los descritos en la WO 99/13719.

Los métodos de transferencia viral o no viral pueden ser usados. Un número de virus han sido usados como vectores de transferencia de gen, incluyendo los papovavirus, por ejemplo, SV40 (Madzak et al (1992) J. Gen. Virol. 73, 1533-1536), los adenovirus (Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 39-61; Berkner et al (1988) BioTechniques 6, 616-629; Gorziglia and Kapikian (1992) J. Virol. 66, 4407-4412; Quantin et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,2581-2584; Rosenfeld et al (1992) Cell 68, 143-155; Wilkinson et al (1992) Nucleic Acids Res. 20, 2233-2239; Stratford-Perricaudet et al (1990) Hum. Gene Ther. 1, 241-256), los virus vacuna (Moss (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 25-38), los virus adeno-asociados (Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-123; Ohi et al (1990) Gene 89, 279-282), los herpes virus incluyendo HSV y EBV (Margolskee (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 67-90; Johnson et al (1992) J. Virol. 66, 2952-2965; Fink et al (1992) Hum. Gene Ther. 3, 11-19; Breakfield and Geller (1987) Mol. Neurobiol. 1, 337-371; Freese et al (1990) Biochem. Pharmacol. 40, 2189-2199), y retrovirus de aves (Brandyopadhyay and Temin (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 749-754; Petropoulos et al (1992) J. Virol. 66,3391-3397), los murinos (Miller (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1-24; Miller et al (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 431-437; Sorge et al (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1730-1737; Mann and Baltimore (1985) J. Virol. 54, 401-407; Miller et al (1988) J. Virol. 62, 4337-4345), y de origen humano (Shimada et al (1991) J. Clin. Invest. 88, 1043-1047; Helseth et al (1990) J. Virol. 64, 2416-2420; Page et al (1990) J. Virol. 64, 5370-5276; Buchschacher and Panganiban (1992) J. Virol. 66, 2731-2739). Hasta hoy la mayoría de los protocolos de las terapias de genes humanos ha estado basada en retrovirus de retrovirus murinos desactivados.

Los métodos de transferencia de gen no viral conocidos en la técnica incluyen técnicas químicas tales como la coprecipitación de fosfato de calcio (Graham and van der Eb (1973) Virology 52, 456-467; Pellicer et al (1980) Science 209, 1414-1422); las técnicas mecánicas, por ejemplo, la microinyección (Anderson et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5399-5403; Gordon et al, 1980; Brinster et al (1981) Cell 27, 223-231; Constantini and Lacy (1981) Nature 294, 92-94); la transferencia de membrana por fusión mediada por la vía de liposomas Felgner et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Wang and Huang (1989) Biochemistry 28, 9508-9514; Kaneda et al (1989) J. Biol. Chem. 264, 12126-12129; Stewart et al (1992) Hum. Gene Ther. 3, 267-275; Nabel et al, 1990; Lim et al (1992) Circulation 83, 2007-2011); y la toma de ADN directa y la transferencia de ADN mediada por receptor (Wolff et al (1990) Science 247, 1465-1468; Wu et al (1991) J. Biol. Chem. 266, 14338-14342; Zenke et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659; Wu et al, 1989b; Wolff et al (1991) Bio- Techniques 11, 474-485; Wagner et al, 1990; Wagner et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259; Cotten et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037; Curiel et al (1991a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850-8854; Curiel et al (1991b) Hum. Gene Ther. 3, 147-154). La transferencia de gen mediada por virus puede ser combinada con la transferencia de gen in vivo usando la entrega de liposoma, que permite dirigir los vectores virales a las células tumorales y no a las células no divididas circundantes.

Otros sistemas adecuados incluyen el sistema híbrido retroviral-adenoviral descrito por Feng et al (1997) Nature Biotechnology 15, 866-870, o sistemas virales con ligandos identificadores como los fragmentos monocatenarios Fv adecuados.

En una aproximación la cual combina los métodos de transferencia biológica y física de gen, el ADN plásmido (o, por ejemplo, la fusión oligonucleótido/péptido de cualquier tamaño es combinada con un anticuerpo específico conjugado por polilisina a la proteína de exón de adenovirus, y el complejo resultante es enlazado a un vector de adenovirus. El complejo trimolecular es entonces usado para infectar las células.

El vector adenovirus permite el enlace eficiente, la internalización, y la degradación del endosoma antes de que el ADN sea dañado.

Ebbinghaus et al (1996) Gene Ther 3(4), 287-297 describe los métodos por los cuales los OFT pueden ser entregados a las células usando complejos de adenovirus-polilisina. Pichon et al (2000) Nucl Acids Res 28(2), describe los métodos por los cuales la toma, la entrega citosólica y la acumulación de oligonucleótidos pueden ser mejoradas, usando oligosinas histidilatadas.

Los complejos liposoma/ADN han mostrado ser capaces de transferencia de gen por mediación directa in vivo. Mientras en las preparaciones estándar de liposoma el proceso de transferencia de gen es no específico, la toma localizada in vivo y la expresión ha sido reportada en depósitos tumorales, por ejemplo,a continuación de la administración directa in situ. (Nabel (1992) Hum. Gene Ther. 3,399-410).

Las técnicas de transferencia de gen que dirigen la molécula directamente a una célula o tejido objetivo, son preferentes. La transferencia de gen mediada por receptor, por ejemplo, es lograda por la conjugación de ADN a un ligando proteico por la vía de la polilisina. Los ligandos son escogidos sobre la base de la presencia de los correspondientes ligando-receptores en la superficie celular del tipo de célula/tejido objetivo. Estos conjugados ligando-ADN pueden ser inyectados directamente en la sangre si es deseado y son dirigidos al tejido objetivo en el que el receptor de enlace y la internalización del compuesto ADN-proteína ocurre. Para vencer el problema de la destrucción intracelular de ADN, la coinfección con adenovirus puede ser incluida para desestabilizar la función de endosoma.

Preferentemente, el método de suprimir o modular la expresión de un gen seleccionado es usado para suprimir (o modular) la expresión de un gen en una célula humana; en una particularmente preferente realización la célula humana está en un cuerpo humano.

Sin embargo, el método de la invención puede implicar la modificación de células animales (incluyendo células humanas) fuera del cuerpo de un animal (o sea, un tratamiento ex vivo de las células) y las células así modificadas pueden ser reintroducidas en el cuerpo animal.

El método de la invención puede también implicar la investigación in vitro o la caracterización de las células modificadas, por ejemplo, en la identificación de los objetivos del medicamento potencial o el filtraje de los compuestos candidatos para las actividades o propiedades potencialmente útiles farmacológicamente.

De lo precedente, será apreciado que el método de la invención puede ser útil para suprimir la actividad de una pluralidad de genes seleccionados. En particular, el método de la invención puede ser usado para suprimir la actividad de un grupo de genes cuya expresión está controlada, al menos en una gran extensión, por un factor de transcripción único. Por ejemplo, el método puede ser usado para suprimir genes regulados por estrógeno.

Las moléculas de la invención, y los métodos de la invención, pueden ser usados para analizar el papel de los genes en, entre otras cosas, el desarrollo floral, la regulación/adaptación en frío, y las respuestas de las plantas al etileno o a los patógenos, estos procesos de desarrollo y otros.

Un aspecto ulterior de la invención provee el uso de una molécula de la invención en la fabricación de un agente para suprimir (o modular) la expresión del gen seleccionado en una (preferentemente eucariótica) célula. Es preferente que el gen seleccionado sea un gen endógeno. Otras preferencias indicadas arriba en relación con los aspectos anteriores de la invención también se aplican.

Será apreciado que es particularmente preferente si la molécula es usada en la preparación de un medicamento para suprimir (o modular) la expresión de un gen seleccionado en un animal. Para evitar dudas, por "animal" incluimos humanos y animales no humanos.

Un aspecto ulterior de la invención provee un método de tratar un paciente en necesidad de la supresión (o modulación) de la expresión de un gen seleccionado, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad efectiva de una molécula de la invención.

Será apreciado que la supresión de la expresión de un gen seleccionado es útil donde la expresión o la sobreexpresión del gen seleccionado es indeseable y contribuye a un estado de enfermedad en el paciente. Ejemplos de la expresión indeseable de un gen incluyen la expresión de ciertos oncogenes activados en el cáncer. Un incremento en la expresión de un gen seleccionado puede ser útil donde la ausencia de, o la expresión insuficiente, del gen seleccionado es indeseable y contribuye a un estado de enfermedad en el paciente. Por ejemplo, la expresión insuficiente de un gen supresor de un tumor puede contribuir al cáncer, en concordancia, puede ser útil para incrementar la expresión del gen supresor del tumor.

La supresión de la expresión de los genes regulados de RE es deseable en el tratamiento del cáncer de mama. Similarmente, la supresión de la expresión de los genes receptores de andrógenos (RA)-regulados es deseable en el tratamiento del cáncer de próstata.

Aspectos adicionales de la invención proveen el uso de una molécula de la invención en la fabricación de un medicamento para suprimir (o modular) la expresión de un gen seleccionado en un paciente en necesidad de tal supresión (o modulación).

Aún aspectos ulteriores de la invención proveen una molécula de la invención para usar en medicina. Así, la molécula de la invención es empacada y presentada para usar en medicina.

Aún todavía aspectos ulteriores de la invención proveen una composición farmacéutica que comprende una molécula de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Por "farmacéuticamente aceptable" está incluido que la formulación es estéril y libre de pirógenos. Los portadores farmacéuticamente adecuados son bien conocidos en la técnica de farmacia.

La invención será ahora descrita en más detalle con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos aquí:

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Figura 1 Representación esquemática de moléculas de fusión y enlace a un sitio objetivo

En A, "1" representa el módulo 1 del oligonucleótido del ejemplo 1; "2" representa el módulo 2 del polipéptido. "L" indica una región connectiva. En B, "D" representa un péptido de entrega adicional. Los polipéptidos pueden estar conectados o bien uno a otro o a ambos extremos del oligonucleótido; por ejemplo, el polipéptido represor/modificador puede estar conectado a un extremo y el péptido de entrega al otro.

"C" representa la situación donde la porción oligonucleótida ha formado una hélice triple con el ADN bicatenario y el péptido represor ha enganchado el complejo Sin3-CDAH al sitio.

Figura 2 Cuantificación del receptor de andrógeno ARNm

Las columnas representan la expresión del ARNm como un porcentaje del valor de control. Cada columna es una representación de la DO promedio y del error estándar del promedio de cuatro reacciones en cadena independientes de polimerasa. Las densidades ópticas (DO) promedio fueron determinadas.

Figura 3 Efecto del ARP-L128 y el R1881 sobre la cantidad de ARNm receptor de andrógeno

Los análisis RT-PCR del ARNm receptor de andrógeno. Después del teñido del bromuro de etidio la cantidad de amplicones electroforizados fueron determinados en unidades arbitrarias usando un lector de imagen Labworks. Las columnas representan un experimento N=1.

Figura 4 Efecto del ARP-L218 y el acetato de ciproterona sobre la cantidad de ARNm receptor de andrógeno

Los análisis RT-PCR del ARNm receptor de andrógeno. Después del teñido del bromuro de etidio la cantidad de amplicones electroforizados fueron determinados en unidades arbitrarias usando un lector de imagen Labworks. Las columnas representan un experimento N=1 respectivamente.

Figura 5 Regulación deprimida de interferón estimulado, gen de genona incorporado

Las células huéspedes EGFP bajo el control del elemento de respuesta de interferón estimulado (ERIE) del gen humano 6-16 fueron transientemente transfectadas con diferentes compuestos. Las células fueron entonces tratadas con 300 unidades/ml de IFN por un día y analizadas por FACS para la expresión GFP.

a) Línea celular progenitora, ningún tratamiento.

b) Células que expresan la construcción establemente transfectada (C8), ningún tratamiento.

c) C8 tratadas con interferón (+INF)

d) C8 transfectadas con 500 pm OFT, +INF

e) C8 específico OFT 1.000 pM, +INF

f) C8, GeneICE1 500 pM, +INF

g) C8, GeneICE 2.500 pM, +INF

h) C8, control no especificado OFT 500 pM, +INF

i) C8, control no especificado OFT 1000 pM, +INF

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Figura 6 Inmunoprecipitación de cromatina de ADN receptor de andrógeno

Un ejemplo del tipo de datos que pueden ser producidos por el ejemplo 10. Los datos muestran la inmunoprecipitación de cromatina de células progenitoras MCF-7 Tet-OFF y líneas celulares establemente transfectadas. Las líneas celulares MCF7-TO o MCF7 JP13 (con PLZF-ER, un gen de remodelación de cromatina inducible por tetraciclina conectado a un péptido de enlace de ADN receptor de progesterona) fueron cultivadas al 80% de concentración en DMEM libre de fenol rojo, el 5% de DSS, P/S/G más una selección de reactivos y Dox como se requirió. Las células fueron tratadas con E2 (10^{-8} M) o con un control de etanol por 30 minutos a 37ºC antes del entrecruzamiento de formaldehído y sonicación. El panel superior muestra el producto PR-PCR usando ADN asociado con cromatina inmunoprecipitada (P) o el ADN total extraído de las células (S), usando anticuerpo H4 de histona acetilada. Las células sin (MCF7-TO) o con (MCF7 JP13) y la construcción de PLZF-ER fueron cultivadas en presencia (+) o ausencia (-) de TET. El panel inferior muestra el producto PR PCR relativo a la cantidad de producto PR PCR usando ADN inmunoprecipitado con histona acetilada H4.

Figura 7 Regulación deprimida de la secreción de proteína PSA en las células LNCap por ARP-L218

Las células fueron incubadas en presencia de R1881 por 3 días. Los niveles de PSA en los sobrenadantes fueron medidos por ELISA. Cada columna representa el antígeno específico prostático (PSA) total.

Ejemplo 1 Construcción y uso de moléculas de fusión de péptido oligo-reguladoras

Unas series de compuestos oligopéptidos útiles como moléculas reguladoras han sido producidas. Éstas consisten de al menos de dos porciones específicas o módulos, a saber, un oligonucleótido capaz de formar una hélice triple de ADN con una secuencia de acceso bicatenaria (Oligonucleótido de Formación Triple, o OFT; Módulo 1); y una secuencia de péptidos discreta derivada de o bien un gen represor o de un activador (Módulo 2). El OFT es combinado al péptido represor o activador.

Como un ejemplo, el OFT es diseñado para formar un triplex con el Elemento de Respuesta Estimulada por Interferón (EREI) el Gen Estimulado por Interferón humano (GEI) 6-16. (Porter A., et al., EMBO J. 7: 85-92, 1988). El EREI es muy rico en purina en un ADN monocatenario y es, por esto, una secuencia candidata para formar un ADN triplex por apareamiento de base de Höogsteen. Las reglas para diseñar el OFT potencial son resumidas en: Vasquez KM and Wilson JH, Trends Biochem Sci, 1: 4-9, 1998. La secuencia 5'-AAAGTAAAAGGGGAGAGAGGG-3' fue producida como un oligonucleótido (Módulo 1) con un terminal 5' activado para acoplamiento químico a los péptidos del Módulo 2. Los péptidos del Módulo 2 explorados en este estudio incluyen (al menos una copia del dominio activador transcripcional mínimo de la proteína del Activador Transcripcional del Virus de Herpes Simples VP16, por ejemplo, la secuencia de aminoácido GGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDML o GGGPADALDDFDLDML
PADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPA DALDDFDLDML-CONH_{2} (incluyendo el conectador GGG)), y el dominio represor transcripcional MAD1 humano, por ejemplo, los aminoácidos XXXMNIQMLLEAADYLERRER
BABHGYASMLP (donde XXX es, por ejemplo, es un conectador AAA o DDD). La última es una región conocida para actuar con la proteína compleja de histona acetilasa Sin 3a.

Adicionalmente, hemos explorado el uso de los aminoácidos XXXMAVESRVTQEEIKKEPEKPIDREKTCPLLL
RVF (donde XXX son, por ejemplo, conectadores AAA o DDD) de la proteína humana Sap18, también conocida por asociarse con la proteína Sin3a. Esta región corresponde a una secuencia de conservación altamente evolutiva y se superpone con una región que puede mediar la represión del gen. Los péptidos del Módulo 2 fueron sintetizados en una forma activada para permitir el subsiguiente acoplamiento al oligonucleótido activado del Módulo 1 por "ligadura originaria" química (ver WO 01/15737 y Stetsenko & Gait (2000) Organic Chem 65(16), 4900-4908), en el cual un terminal N péptido tioéster-funcionalizado es acoplado a un oligonucleótido cisteinil 5'.

Las líneas celulares para los trabajos de transfección incluyeron los COS, células y células de fibrosarcoma humano HT1080. Las células fueron transientemente transfectadas usando un método de transfección basado en liposoma estándar (o alternativamente otro método de entrega, por ejemplo, electroporación o microinyección) con un gen indicador de luciferasa regulado por EREI junto con una cantidad variable de un conjugado de polipéptido. Esto permite hacer una comparación de la expresión de luciferasa dependiente de interferón con los efectos reguladores del gen mediado por oligopéptido. Como controles de especificidad, las células fueron también tratadas con o bien el oligonucleótido, el péptido o ambos (o sea, como moléculas separadas, desconectadas). Después de tiempos adecuados, por ejemplo, 0,5, 1, 2, 4, 8 y/o 12 horas, las células fueron estimuladas con IN y la actividad del gen indicador fue medida usando un ensayo basado en luminómetro para la enzima luciferasa. La corrección para la eficiencia de la transfección fue determinada por el uso de un gen de control GFP no dependiente de interferón.

La habilidad de los compuestos oligopéptidos variados para activar o reprimir la transcripción de los genes sensibles a IFN fue investigada. La entrega de la creciente concentración de la molécula oligo-MAD1 de fusión reprime la actividad del gen indicador en una manera dependiente de la concentración. Similarmente, la entrega de la molécula de fusión Sap18-oligo reprime la actividad del gen. Además, la entrega de oligo VP16 en las células que contienen gen indicador resulta en la actividad del gen indicador en ausencia de IFN. Después que el OFT (o sea, sin un dominio péptido) fue entregada a las células en adición a una molécula de fusión de oligopéptido, la represión de la actividad fue menor que la vista con la molécula de fusión sola, o sea la represión fue equivalente a esa vista con una concentración más baja de la molécula de fusión. Estos resultados muestran que las moléculas con el péptido represor son reguladores más efectivos de la actividad del gen que el OFT sin un péptido dominante, y OFT puede competir con la molécula de fusión del oligopéptido para enlazar a la secuencia objetivo. El oligo y el péptido solos o juntos no tienen efecto represor, demostrando la especificidad del oligopéptido combinado en la regulación del gen.

Este ejemplo demuestra el diseño y la construcción de las moléculas de fusión consistente de oligonucleótidos enlaces de ADN y péptidos funcionales, y su entrega dentro de las células. Los oligopéptidos conjugados son capaces de apuntar a genes específicos y a secuencias peptídicas represoras por medio del Gen ICE puede reprimir genes en una manera objetiva, específica. Así, los oligopéptidos combinados pueden ser diseñados para ser reguladores potentes de la actividad del gen.

Ejemplo 2 Represión de genes cromosómicos por moléculas de fusión oligo-reguladoras

Las moléculas de fusión son capaces de regular la actividad del gen, cuando tales genes están integrados en el genoma. Las moléculas de fusión contienen un oligonucleótido enlace de ADN (OFT) fusionado a MAD1, los péptidos Sap18 o VP16 fueron diseñados y construidos como se describió en el Ejemplo 1.

Las células fueron transfectadas como se describió en el ejemplo 1 con genes indicadores que contienen EREI, y líneas celulares que expresan establemente estos genes fueron seleccionadas. En estas líneas celulares estables, el gen está integrado en el genoma y por lo tanto puede funcionar como un gen endógeno.

Las moléculas de fusión fueron entregadas dentro de las células y los experimentos fueron realizados como se describió en el ejemplo 1. Además, la represión fue medida en tiempos diferentes para establecer un curso de tiempo para los efectos represores. Las moléculas de fusión fueron represores más efectivos que los OFT solos. El efecto fue también específico (por ejemplo, el péptido no fusionado y el oligonucleótido no tenian el mismo efecto que el oligopéptido fusionado). Además, la represión por las moléculas de fusión fue vista en puntos de tiempo más tardíos que cualquier represión vista por el OFT solo, lo que sugiere un efecto más permanente. Otra vez, la molécula de fusión con el péptido VP 16 fue capaz de activar la expresión del gen.

Así, las moléculas de fusión descritas en el ejemplo 1 son capaces de regular la actividad del gen cromosómico. Las moléculas de fusión con una porción seleccionadora de oligonucleótido de enlace de ADN son capaces de seleccionar genes cromosómicos específicos. Un péptido represor de un gen ICE fusionado a un oligonucleótido de enlace de ADN es capaz de reprimir la actividad de gen cromosómico predeterminado. Asi, las moléculas de fusión descritas son reguladores potentes de la actividad del gen cromosómico.

La regulación del gen endógeno es medida, por ejemplo, por la valoración de la transcripción del gen (por ejemplo usando PCR) o por la valoración de la cantidad o la actividad del polipéptido codificado. En un ejemplo, el oligonucleótido está dirigido al sitio regulador del gen receptor de andrógeno. En particular, el oligonucleótido tiene la secuencia 5' gggaaaggaaaagaggggaggg 3' o 5' gggaggggaaaggaaaagagg 3'.

En un ejemplo, la línea celular del cáncer de próstata LnCap es tratada con la fusión del oligonucleótido y el péptido que comprende un péptido MAD1 o Sap18 como se describió en el ejemplo 1. Las células transfectadas son opcionalmente identificadas y/o aisladas (por ejemplo, usando el marcador GFP y las técnicas FACS) y son analizadas para la expresión del gen receptor de andrógeno así como para el marcador clásico del cáncer de próstata PSA. Por ejemplo, un GFP positivo, las células ordenadas FACS fueron cultivadas en la presencia o ausencia del AR agonista R1881. Después de 72 horas, el medio de cultivo fue recogido y la cantidad de proteína PSA regulada por andrógeno fue determinada por inmunoensayo. La adición de R1881 resulta en niveles incrementados aproximadamente en 25 veces del PSA segregado en las células de control (con fusión no oligonucleótida-péptida, o una fusión oligonucleótida-péptida irrelevante). Por contraste los niveles de PSA en las pruebas de las células transfectadas se elevaron sólo 5 veces, demostrando una disminución de alrededor de 5 veces en los niveles de PSA, relativos a las células de control. Esto demuestra la represión de un gen endógeno.

Alternativamente, la PCR es usada para detectar y cuantificar la expresión y muestra que las fusiones oligonucleótido-péptidas reprimen la expresión de gen receptor andrógeno endógeno así como la expresión de gen regulado por andrógeno. La línea celular de Receptor Andrógeno (RA) positivo T47D es infectada con la prueba de fusión oligonucleótido-péptida por ejemplo, marcada con proteína fluorescente verde (PFV)) o una fusión irrelevante oligonucleótido-péptida (la cual puede ser también marcada con PFV). Las células infectadas pueden ser purificadas por FACS y las células PFV positivas cultivadas en presencia de ligandos RA R1881 antes de cultivar y de la preparación del ARN. La expresión del gen receptor de andrógeno así como de los genes regulados por andrógeno PSA y DRG-1 y de un gen no regulado por el andrógeno GAPDH, fue determinada por PCR. Esto demuestra la represión de un gen endógeno.

Ejemplo 3 Molécula de fusión que enlaza a una secuencia objetivo y a un complejo de deacetilasa de histona

Este ejemplo demuestra que la molécula de fusión enlaza a una secuencia objetivo específica así como a un componente del complejo de deacetilasa de histona. Las moléculas de fusión que contienen un oligonucleótido (OFT) y un péptido represor fueron producidas como se describió en el ejemplo 1.

Las moléculas de fusión diferentes fueron incubadas con oligonucleótido marcado, el cual fue hecho complementario a la parte oligo de una fusión. Las mismas moléculas de fusión fueron también incubadas con Sin3, el cual es un componente de un complejo de deacetilación de histona. Además, las fusiones fueron también incubadas tanto con el oligonucleótido complementario como la proteína Sin3.

Los complejos fueron entonces analizados por métodos de análisis de cambio de banda estándares. Las moléculas de fusión fueron capaces de enlazar con el oligonucleótido complementario marcado así como con la proteína Sin3, tanto separadamente como simultáneamente. Las fusiones no específicas no fueron capaces de enlazar el oligo marcado o la Sin3, así demostrando la especificidad del efecto con las fusiones represoras.

Se puede concluir que las fusiones represoras pueden enlazar específicamente sus secuencias objetivo. Las fusiones represoras son capaces de enganchar los complejos de deacetilación de histona por proteicas de enlace que son parte de este complejo, y por el enlazamiento de sus secuencias objetivo y enganchar los complejos de deacetilación de histona simultáneamente, las moléculas de fusión descritas son muy potentes y represoras específicas de la actividad del gen.

Ejemplo 4 Protocolo de validación de objetivo

La secuencia disponible de ADN para el gen de interés (incluyendo la secuencia de flanqueo) es analizada para seleccionar un sitio adecuado para dirigir un oligo/péptido. El oligo/péptido es sintetizado y puede ser previamente probado para el uso en las células deseadas o en animales o en humanos, por ejemplo usando un sistema de gen indicador. El oligo/péptido puede ser usado o probado además en células in vitro o en animales o en humanos.

Una vez que la secuencia del gen ha sido proporcionada, el proceso involucrará:

El gen de interés (incluyendo la secuencia de flanqueo si es necesario) será escaneada para elementos de secuencia única no encontrada en otra parte en el genoma humano usando herramientas de datos de minería bioinformáticas (por ejemplo el programa de Genetics Computer Group (GCG) como se usó en Perkins et al (1998) Biochemistry 37, 11315-11322. Un ácido nucléico basado en una molécula de enlace de ADN prevista para enlazar la secuencia única identificada (por ejemplo como el OFT) es diseñada y sintetizada.

La molécula de enlace de ADN es probable que sea un oligonucleótido, preferentemente con las siguientes características:

(a)

al menos 16 nucleótidos de longitud

(b)

apuntada a un gen promotor en, o cercano, al sitio de iniciación de la transcripción del gen.

Es preferente que el sitio objetivo para enlazar al OFT sea una purina enriquecida monocatenaria.

El OFT puede ser pirimidina enriquecida (predominantemente C o T); purina enriquecida (predominantemente G o A) o mezclada (predominantemente G o T, o G, A o T). Los OFT CT son considerados para enlazar en un motivo paralelo, en el cual la tercera cadena (OFT) tiene la misma orientación 5' a 3' como la cadena de purina del dúplex. Los OFT GA son consideradas para enlazar en un motivo antiparalelo, en la cual el OFT es orientado opuestamente a la cadena de purina. Los OFT mezclados pueden enlazar en un motivo paralelo o antiparalelo, en dependencia de la secuencia objetivo. Las bases de apareamiento emergen de la formación de enlaces de hidrógenos Hoogsteen en triplexes paralelos (T: AT, C^{+}: GC y G: GC) y enlaces inversos de hidrógenos Hoogsteen en antiparalelos triples (G: GC, A: AT y TAT).

Es deseado que el oligonucleótido sea un oligonucleótido de ADN, posiblemente con las modificaciones químicas que estabilizan. Por ejemplo, pueden usarse bases alternativas N6metil-8-oxo-2-desoxiadenina, en lugar de citosina, 2-desoxi-6-tioguanina en lugar de guanina o 7-deasa-2-deoxixantina en lugar de timina.

El péptido represor o los péptidos pueden ser producidos en masa usando un sintetizador de péptido y almacenado en congelación hasta su uso.

La construcción de la molécula de enlace péptido-ADN represora es preparada y purificada. La química usada puede ser como la descrita en la WO 01/15737. Los equipos están disponibles de Link Technologies.

La construcción puede ser controlada cuantitativamente por espectrocopía de masa y/o por el uso de oligonucleotido complementario marcado o mitades de anticuerpo marcado (usando por ejemplo marcas fluorescentes, quimiluminiscentes o enzimas. Típicamente en tal método la construcción es añadida a un soporte sólido sobre el cual un anticuerpo que enlaza a la porción de péptido de la construcción es inmovilizado y un oligonucleótido marcado que enlaza a la porción oligonucleótida de la construcción es añadido. En este método la detección del enlace marcado al soporte sólido demuestra que la construcción está intacta. En otro formato típico el oligonucleótido puede ser unido a un soporte sólido y el anticuerpo marcado.

Una construcción de gen indicador puede ser preparada para el gen de interés (aunque esto no es generalmente necesario).

El oligonucleótido de enlace ADN candidato o el oligo/péptido puede ser probado para lo siguiente:

\medcirc

Afinidad de enlace a la secuencia objetivo;

\medcirc

Especificidad de enlace por exposición a una pieza total del genoma ADN.

El oligo/péptido puede ser probado para efectividad usando un sistema de gen indicador.

El oligo/péptido puede entonces ser usado para modular o suprimir la expresión del gen de interés en la célula o en el animal de interés.

Ejemplo 5 Validación del objetivo

Las moléculas de fusión de oligo/péptido serán usadas para validar medicamentos objetivos. Esto implicará:

Realización del protocolo establecido en el ejemplo 1.

Entrega de la construcción dentro de las células o los tejidos. Estos pueden ser tejidos normales o enfermos, líneas celulares o células primarias apropiadas para el estudio de la molécula de interés.

Análisis del fenotipo por cualquiera de los métodos de análisis de expresión; o cualquier análisis funcional tal como valoración de la motilidad, el crecimiento o el análisis de apoptosis de la célula.

Comparación con cualquier dato disponible para una enfermedad particular y análisis de los efectos deseados tales como la muerte o la motilidad celular.

Los datos obtenidos serán usados para validar los objetivos de medicamentos predeterminados para los programas de desarrollo de medicamentos.

Ejemplo 6 Ejemplo de tratamiento del paciente

Una fusión de oligo/péptido es producida como se describió la cual dirige los genes regulados por andrógenos o estrógenos. Las moléculas de fusión son preparadas en un ambiente estéril y formuladas en los liposomas. Los liposomas que contienen la fusión son dirigidos en la vecindad de la mama o la próstata. Los liposomas son tomados por células cancerosas y la transcripción mediada del receptor de andrógeno o estrógeno es suprimida selectivamente en las células respectivas.

Ejemplo 7 Examen de identificación del objetivo

Las moléculas de fusión de oligo/péptido serán usadas para identificar los objetivos de los medicamentos. Esto implicará:

La preparación de una molécula de fusión como se determinó en el ejemplo 1.

La entrega de la molécula de fusión dentro de las células o los tejidos. Estos pueden ser tejidos normales o enfermos, líneas celulares o células primarias.

El análisis del perfil de expresión del gen silenciador, usando arreglos de ADN. Esto indica el efecto de la construcción en conjunto del gen de expresión global en el modelo.

El análisis del fenotipo por cualquiera de los métodos de análisis de expresión, o cualquier análisis funcional tal como la motilidad, el crecimiento o los análisis de apoptosis celular.

Los datos obtenidos serán usados para encontrar objetivos de medicamento potencial para las enfermedades tales como el cáncer de mama o de próstata. Estos objetivos pueden ser validados además por métodos apropiados que incluyen cualquiera de los exámenes suplementarios similares, los métodos in vitro y los modelos celulares y de animales.

Ejemplo 8 Moléculas de fusión de oligo/péptido dirigidas al receptor de andrógeno

Como se discutió en el ejemplo 2, las moléculas de fusión de oligo/péptido son capaces de regular la actividad del gen cuando los genes están integrados en el genoma. En este ejemplo proporcionamos además datos experimentales que sustentan esto.

Construimos fusiones entre un ologonucleótido de enlace ADN (OFT) dirigido a la secuencia promotora de un gen receptor de andrógeno (ARP), y un péptido que contiene una secuencia represora de aminoácido 14 o 29 MAD1 conectada a una secuencia de aminoácido penetratina 16.

La secuencia del ARP OFT usada en este ejemplo fue:

ARP FTO: (5') GFGUGGTGFGGTTGTGTT (3')

U=5-fluro-deoxiuracil

F= 2'-deoxi-6-tioguanina

Los OFT son modificados en el extremo 5' para la conjugación como fue descrito por Gait et al (2000) J.Org. Chem, 65, 4900-4908, y en el extremo 3' con un enlace amino estándar para proteger de la degradación.

La secuencia de oligonucleótidos está diseñada para formar un triplex con la secuencia promotora del receptor de andrógeno.

El OFT fue fusionado a dos fragmentos diferentes de péptido. Los fragmentos usados en este ejemplo fueron:

	L217: HHHHHH-Penetratina-DDD-14aaMAD
	(Enlace)HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKDDDMNIAMLLEAADYL E(amida)
	L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratina
	(Enlace)HHHHHHMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDRQIKIWFQNRRMKWKK(amida)

Las secuencias péptidas de aminoácido 14 y 29 son del dominio represor transcripcional de la proteína MAD1, una región conocida para interactuar con la proteína Sin3a del complejo de deacetilasa de histona. Los tres residuos de ácido aspártico (DDD) son una secuencia enlazadora, mientras que la secuencia péptida de Penetratina media la eficiencia de transalocación de la membrana de plasma de la molécula de fusión de oligo/péptido.

Los residuos HIS fueron añadidos para proveer opciones de purificación opcionales.

Los experimentos fueron conducidos en la línea celular de un tumor prostático humano LNCap (Carcinoma Prostático del Nodo Linfático). Las células del LNCap fueron obtenidas de la Colección Europea de Cultivos Celulares, número de acceso B9110211. Los cultivos fueron cultivados y propagados en la institución y usados como capas unimoleculares en el laboratorio de cultivo de tejidos desechables. En el día de la prueba, las células fueron observadas que tienen integridad celular apropiada y por esto, fueron aceptables para usar en este estudio.

La entrega intracelular e intranuclear de moléculas de fusión de oligo/péptido a las células del LNCap fue demostrada usando un oligopéptido marcado fluorescente Cy3. La construcción marcada (5 pmol en 1 ml) y lipofectamina 2000 (usada según las instrucciones del fabricante) fueron añadidas a las células del LNCap y dejadas incubar pro 24 horas. Las células fueron entonces examinadas por microscopía fluorescente. La localización intranuclear de la construcción fue demostrada por colocación con una tintura nuclear (DAPI).

El efecto de las moléculas de fusión oligo/péptida ARP-L217 y ARP-L218 o la expresión de gen receptor de andrógeno fueron medidas en los siguientes experimentos.

1) Tratamiento de células del LNCap con ARP-L217

Para medir el efecto de la ARP-L217 sobre la la expresión de gen receptor de andrógeno los siguientes experimentos fueron conducidos.

La ARP-L217 fue preparada en una solución salina tampón de fosfato (PBS), filtrada e inyectada con jeringuilla y usada el día de la prueba prevista.

Las células del LNCap fueron transfectadas con ARP-L217 usando lipofectamina 2000 (dendrímero activado catiónico, en tecnologías en vivo InVitrogen). Cantidades diversas de ARP-L217 fueron mezcladas con una cantidad fija de lipofectamina 2000 (3 \mul) en un volumen total de un medio suplementado de 100 \mul de suero (10% FBS) sin antibióticos. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de transfección fue añadida a las células al 70% de confluencia y las células fueron incubadas por 3 días.

Las condiciones RT-PCR fueron establecidas para dar óptima sensibilidad con la fase exponencial de los procesos de amplificación. El ARN celular total fue aislado de las células del LNCap tratadas usando el equipo RNeasy (Qiagen). El ARN (1 \mug por cada muestra) fue transcrito inverso en el ADNc (clon de ADN) usando el equipo Omniscript RT (Qiagen). El ADNc sintetizado (2 \mul por cada muestra) fue sometido a amplificación PCR (equipo Qiagen Taq) con cebadores receptores de andrógeno humanos de homosentido 5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3' y de antisentido 5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3' para cosechar un producto de 281bp. Para verificar la calidad de la preparación ARN/ADNc, la amplificación PCR fue realizada con cebadores \beta-actina (Promega, UK). Para verificar que el producto PCR no fuera amplificado del ADN residual dejado en las muestras de ARN, un control negativo de RT fue sometido a la amplificación de \beta-actina.

Las secuencias de cebador AR usadas en este estudio fueron sintetizadas por Qiagen-Operon y diseñadas para evitar la complementaridad 5'-3' e incluyeron al menos un intrón en el producto para detectar la contaminación con el ADN genómico.

La electroforesis de los productos PCR fue realizada en geles de agarosa al 2% y los geles fueron prefundidos con bromuro de etidio (dilución 1:10). Los geles fueron fotografiados usando el sistema GelDoc.

La comparación y los análisis de la expresión de ARNm fueron hechos por cuantificación de banda de gel usando en sistema de software Labworks. La relación muestra/\betaactina DO fue calculada para cada muestra y entonces usada para la comparación. Así, la expresión incrementada del ARVm es presentada como un porcentaje del valor de control (células no tratadas).

Los resultados de este experimento son mostrados en la Tabla 1 debajo y también como un gráfico de barras en la figura 2.

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TABLA 1a Datos que ilustran la cuantificación de banda después de la exposición de ARP-L217 a las células LNCap por 3 días

1

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TABLA 1b Determinación del índice de beta-actina y del porcentaje de inhibición del control

2

De estos datos puede ser visto que las muestras de células las cuales fueron incubadas con ARP-L217 tienen niveles altamente reducidos de expresión de gen receptor de andrógeno comparadas con aquéllas tratadas con soluciones PBS de control.

2) Tratamiento de las células del LNCap con ARP-L218 y R1881

El efecto del ARP-L218 sobre la expresión de gen receptor de andrógeno con o sin un andrógeno sintético (R1881) fue medido usando el protocolo esbozado en la sección de arriba.

El ARP-L218 fue preparado en una solución salina de tampón de fosfato (PBS) filtrada e inyectada con jeringuilla y usada el día de la prueba prevista. El R1881 (andrógeno sintético) fue adquirido de Perkin Elmer, Catálogo número NLP005005MG.

Las células del LNCap fueron transfectadas con ARP-L218 usando lipofectamina 2000 (dendrímero activado catiónico, en tecnologías en vivo InVitrogen), con/sin agonista. Cantidades variadas de ARP-L218 fueron mezcladas con una cantidad fija de lipofectamina 2000 (3 \mul) en un volumen total de 100 \mul de medio libre de suero sin antibióticos (OptiMEM). Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de transfección fue añadida a las células al 70% de confluencia y las células fueron incubadas por 3 días.

La entrega intracelular e intranuclear de las moléculas de fusión de oligo/péptido a las células del LNCap fue demostrada usando un oligopéptido marcado fluorescente Cy3. La construcción marcada (5 pmol en 1 ml) y la lipofectamina 2000 (usada según las instrucciones del fabricante) fueron añadidas a las células del LNCap y dejadas incubar por 24 horas. Las células fueron entonces examinadas por microscopía fluorescente. La localización intranuclear de la construcción fue demostrada por colocación con una tintura nuclear (DAPI).

El ARN fue extraído y el análisis de RT-PCR de los niveles de AR ARNm se condujo como se describe abajo.

Los resultados de este experimento son mostrados en la Tabla 2 y también como un gráfico de barras en la figura 3.

TABLA 2 Datos que ilustran la cuantificación de banda después de la exposición de ARP-L218 en presencia/ausencia de andrógeno sintético (R1881) en las células del LNCap por 3 días. Determinación del índice de beta-actina y del porcentaje de inhibición del control

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3

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De estos datos puede ser visto que las muestras de células las cuales fueron incubadas con ARP-L218 tienen niveles altamente reducidos de expresión de gen receptor de andrógeno comparados con aquéllas tratadas con soluciones que contienen R1881. Ambos tipos de muestras tuvieron reducidos niveles de AR ARNm comparados con las muestras de las células de control tratadas con PBS.

Por consiguiente, mientras el R1881 puede actuar para reducir la expresión de gen AR esta reducción puede ser mejorada por coincubar las células con la molécula de fusión de oligo/péptido ARP-L218.

3) Tratamiento de las células del LNCap con el ARP-L218 y el acetato de ciproterona

El efecto del ARP-L218 con y sin el acetato de ciproterona, un receptor ligado a un antagonista de receptor andrógeno, sobre la expresión de gen receptor de andrógeno fue medido usando el protocolo esbozado en la sección de arriba.

El ARP-L218 fue preparado en solución salina de tampón de fosfato (PBS), filtrado e inyectado con jeringuilla y usado el día de la prueba prevista. El acetato de ciproterona fue adquirido de Sigma, lote número 41K1195.

Las células del LNCap fueron transfectadas con ARP-L218 usando lipofectamina 2000 (dendrímero activado catiónico, en tecnologías en vivo InVitrogen), con/sin agonista. Cantidades variadas de ARP-L218 fueron mezcladas con una cantidad fija de lipofectamina 2000 (3 \mul) en un volumen total de 100 \mul de medio libre de suero sin antibióticos (OptiMEM). Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de transfección fue añadida a las células al 70% de confluencia y las células fueron incubadas por 3 días.

La entrega intracelular e intranuclear de las moléculas de fusión de oligo/péptido a las células del LNCap fue demostrada usando un oligopéptido marcado fluorescente Cy3. La construcción marcada (5 pmol en 1 ml) y la lipofectamina 2000 (usada según las instrucciones del fabricante) fueron añadidas a las células del LNCap y dejadas incubar por 24 horas. Las células fueron entonces examinadas por microscopía fluorescente. La localización intranuclear de la construcción fue demostrada por colocación con una tintura nuclear (DAPI).

El ARN fue extraído y el análisis de RT-PCR de los niveles de AR ARNm se condujo como el descrito abajo.

Los resultados de este experimento son mostrados en la Tabla 3 y también como un gráfico de barras en la figura 4.

TABLA 3 Datos que ilustran la cuantificación de banda después de la exposición de ARP-L218 en presencia/ausencia de antagonista receptor de andrógeno (acetato de ciproterona) en las células del LNCap por 3 días. Determinación del índice de beta-actina y el porcentaje de inhibición del control

4

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De estos datos puede ser visto que las muestras de las células las cuales fueron incubadas con ARP-L218 y acetato de ciproterona tienen niveles reducidos de expresión de gen receptor de andrógeno comparadas con aquéllas tratadas con acetato de ciproterona solamente. Ambos tipos de muestras tuvieron reducidos niveles de AR ARNm comparados con las muestras de células de control tratadas con PBS.

Por consiguiente, mientras el acetato de ciproterona puede actuar para reducir la expresión de gen AR esta reducción puede ser mejorada por coincubar las células con la molécula de fusión de oligo/péptido ARP-L218.

Ejemplo 9 Regulación deprimida de un gen de genoma incorporado, estimulado por interferón

Como se discutió en el ejemplo 2, las moléculas de fusión oligi/péptidas son capaces de regular la actividad de gen cuando los genes están integrados en el genoma. En este ejemplo suministramos datos experimentales adicionales que sustentan esto.

Construimos fusiones entre un oligonucleótido de enlace de ADN (OFT) dirigido a un elemento de respuesta estimulada por interferón (REI), y un péptido que contiene una secuencia represora de MAD1 de aminoácido 29 conectada a una secuencia de penetratina de aminoácido 16.

La secuencia del REI OFT usada en el ejemplo fue:

IRE FTO: (5') GGGUGGTGGGGTTGTGTT (3')

U=5-fluro-deoxiuracil

Las FTO son modificadas en el terminal 5' para la conjugación como se describió por Gait et al (2000) J.Org. Chem, 65, 4900- 4908, y en el terminal 3' con un enlace amino estándar para protegerlos de la degradación

La secuencia oligonucleótida esta diseñada para formar un triplex con el Elemento de Respuesta Estimulable (EREI) del Gen Estimulado por Interferón humano (ISG) 6-16 (Porter et al., (1988) EMBO J, 7, 85-92).

El OFT fue fusionado a dos fragmentos péptidos diferentes. Los fragmentos de péptidos usados en este ejemplo fueron:

	L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratina
	(Enlace)HHHHHHMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDR QIKIWFQNRRMKWKK
	(carboxamida)
	L219: DDD-29aaMAD-HHHHHH-Penetratina
	(Enlace)DDDMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK
	(carboxamida)

La secuencia de péptido aminoácido 29 es del dominio represor transcripcional de la proteína MAD1, una región conocida para interactuar con la proteína Sin3a del complejo de deacetilasa de histona.

Los tres residuos de ácido aspártico (DDD) son una secuencia de enlace, mientras que el péptido penetratina media la traslocación de la membrana de plasma eficiente de la molécula de fusión oligopéptida.

Estos residuos HIS fueron añadidos para suministrar las opciones de purificación adicionales.

Las células de fibrosarcoma humano HT1080 modificadas fueron usadas para demostrar la capacidad de las moléculas de fusión oligopéptidas para deprimir la regulación de una expresión de gen indicador estimulado por interferón. Estas células tienen un gen establemente incorporado EGFP que se expresa bajo el control del elemento de respuesta estimulado por interferón del gen humano 6-16.

Para los siguientes datos, las células fueron transitoriamente transfectadas con diferentes complejos usando protocolos estándares de lipofectamina. Las células fueron entonces tratadas con 300 unidades/ml de interferón (INF) por un día y analizadas por FACS para la expresión de GFP.

La figura 5 muestra los análisis FACS de un número de poblaciones de células diferentes, en las cuales las siguientes condiciones experimentales fueron aplicadas:

a)

Línea de célula progenitora, ningún tratamiento

b)

Células que expresan la construcción transfectada establemente (C8), ningún tratamiento

c)

C8 tratada con interferón (+ INF)

d)

C8 transfectada con 500 pM de FTO, + INF

e)

C8 específico FTO 1000 pM + INF

f)

f) C8, IRE-L218 500 pM, + INF

g)

C8, IRE-L219 500 pM, + INF

h)

C8, control no específico FTO 500 pM, + INF

i)

C8, control no específico FTO 1000 pM, + INF

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La Tabla 4 muestra la expresión GFP inducida por interferón de la figura 5 presentada como porcentaje.

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TABLA 4 Expresión de GPF inducida por interferón

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5

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El sistema REI-OFT, el cual fue usado como un sistema modelo, ha sido previamente descrito (Roy, 1994, Eur. J. Biochem. 220, 493-503). Los resultados de los análisis FACS muestran que IRE-L218 e IRE-L219 fueron capaces de reprimir la expresión por un promedio del 59%, mientras que el OFT específico de la misma secuencia ejecutó un promedio de 42% de represión. Las FTO de control tuvieron sólo un efecto marginal sobre el control positivo.

Estos resultados ilustran claramente que las moléculas de fusión de oligopéptido son más efectivas en la represión de la expresión del gen GFP inducida por INF.

Ejemplo 10 La regulación deprimida de la expresión de gen por moléculas de fusión de oligopéptidos está asociada con la deacetilación de cromatina de histona

Como se vio en los ejemplos 8 y 9 las moléculas de fusión oligo/péptidas son efectivas en la represión de la expresión del gen. Proponemos que esto es debido a un cambio mediado por MAD1 en el estado de acetilación de histona de ADN a o cerca de donde se enlaza el RAP o REI.

Para mostrar que la expresión de gen reducida está asociada con la deacetilación de histona cromatina, el método de inmunoprecipitación de Cromatina (CIP) puede ser usado. La inmunoprecipitación de Cromatina es realizada usando un equipo de ensayo CIP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Upstate Biotechnology, Bucks, UK).

Las células tumorales de próstata humana LNCap son cultivadas y propagadas e incubadas con moléculas de fusión de oligo/péptidos las cuales son efectivas en reprimir la expresión de gen receptor de andrógeno. Las células del LNCap no tratadas son usadas como control.

Las células son cultivadas a confluencia del 95% en placas de cultivo de tejidos de 35 cm en DMEM, carente de fenol rojo, suplementado con DSS al 5%, P/S/G y G418 (100 \mug/ml). Higromicina B (80 \mug/ml) y doxiciclina (1 \mug/ml) son añadidos como apropiados. 30 minutos antes de la fijación, E2 (10-8M) o etanol (como un control) es añadido a las células. El formaldehído al 37% es añadido a gotas directamente al medio a una concentración final del 1%. Las células son incubadas por 10 minutos a 37ºC.

En hielo, el medio es aspirado de las placas, las células son lavadas dos veces con PBS en frío que contiene inhibidores de proteasa (PI) x 1(Sigma, Dorset, UK). Para cosechar, 1ml de PBS en frío conteniendo 1 x PI es añadido a la placa y las células raspadas dentro de tubos de microcentrífuga preenfriados, usando un agente de caucho. Las células son granuladas por centrifugación a 2000 r.p.m por 4 minutos, a 4ºC. Los gránulos son resuspendidos en 400 \mul de tampón de SDS-lisis de CIP (1% de SDS; 10 mM de Na EDTA pH 8,0; 50 MM deTris-HCl pH 8,1) que contiene PI e incubados en hielo por 10 minutos.

Los lisatos son sonicados para cortar el ADN en longitudes de 200 - 1000 bp. Durante la sonicación, las muestras son colocadas en una cubeta de agua fría, para mantenerlas frías para impedir la degradación de la muestra. La sonificación es realizada usando el sonicador Soniprep 150 con una sonda de titanio exponencial Soniprep 150 unida (Sanyo-Gallenkamp, Leics, UK) con cuatro explosiones de 10 segundos, separadas por intervalos de 30 segundos.

Las muestras son centrifugadas a 13000 r.p.m por 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante es recogido en tubos falcon estériles de 15 ml y diluidas 10 veces con 3600 \mul de tampón de dilución CIP (0,01% de SDS; 1,1% de Tritón-X-100; 1,2 mM de Na EDTA pH 8,0; 16,7mM de Tris-HCl, pH 8.1; 167mM de NaCl). Estas muestras son entonces divididas en 2 partes alícuotas en dos tubos de 2,5 ml, uno para la incubación con un anticuerpo H4 de histona anti-acetilada, grado CIP (Upstate Biotechnology, Bucks, UK), y el otro para usar como un control no anticuerpo.

Para reducir el entorno no específico, cada parte alícuota de 2 ml es preaclarada por la adición de 80 \mul de una suspensión de ADN/proteína A de agarosa al 50% de esperma de salmón (suspendida en 10 mM de Tris-HCl pH 8,0; 1mM de Na EDTA pH 8,0) por 30 minutos a 4ºC en una plataforma rotatoria vertical (Stuart Scientific, Staffs, UK). Las cuentas de agarosa son entonces granuladas por una centrifugación de 30 minutos a 1000 rpm y las fracciones sobrenadantes recogidas en tubos frescos de 2,5 ml. El anticuerpo de Inmunoprecipitación es añadido a una dilución de 1:500 a la primera muestra pero no a la muestra de control de no anticuerpo. Ambos tubos son incubados durante la noche a 4ºC en una plataforma rotatoria vertical (Stuart Scientific, Staffs, UK).

60 \mul de una suspensión de ADN/proteína A de agarosa al 50% de esperma de salmón son incubados con cada tubo por 1 hora a 4ºC, con rotación, para recoger los complejos de anticuerpo/histona o las proteínas ligadas no específicamente en el caso del control de no anticuerpo. Las cuentas de agarosa son granuladas por centrifugación breve a 800 rpm por 1 minuto. Los sobrenadantes son transferidos cuidadosamente a tubos frescos de 2,5 ml y almacenados a -20ºC.

El complejo de cuentas de proteína A agarosa/anticuerpo/histona es lavado durante 5 minutos en una plataforma rotatoria vertical a 4ºC con 1 ml de cada uno de los siguientes tampones en el orden listado abajo:

(a)

Tampón de lavado del compuesto inmune bajo de sal - una lavada (0,1% SDS; 1% Triton-X-100; 2 mM Na EDTA pH 8,0; 20 mM Tris-HCl pH 8,1; 150 mM NaCl)

(b)

Tampón de lavado del compuesto inmune alto de sal - una lavada (0,1% SDS; 1% Triton-X-100; 2 mM Na EDTA pH 8,0; 20 mM Tris-HCl pH 8,1; 500 mM NaCl)

(c)

Tampón de lavado del compuesto inmune LiCl - una lavada (0,25M LiCl; 1% NP40 (no ident); 1% deoxicolato; 1mM Na EDTA pH 8,0; 10 mM Tris-HCl pH 8,1)

(d)

1 x TE - dos lavadas (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na EDTA pH 8,0).

El complejo de histona/inmune es extraído de las cuentas de agarosa por adición de 250 \mul de tampón extraído por elución (1% SDS; 0,1 M NaHCO_{3}) recién preparado. Las muestras son vortizadas brevemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente por 15 minutos en una plataforma rotatoria vertical. Las cuentas son centrifugadas a 1000 r.p.m por 2 minutos a temperatura ambiente y la disolución transferida a tubos frescos de microfuga. El paso de elución es repetido con un tampón ulterior de elución de 250 \mul y los eluatos combinados.

20 \mul de 5M NaCl son añadidos a los eluatos y los enlaces cruzados de histona-ADN revertidos por calentamiento a 65ºC por al menos 4 horas. 10 \mul de 0,5 M de Na EDTA pH 8,0, 20Pl de 1M Tris-HCl, pH 6,5 y 2 \mul de 10 mg/ml de Proteinasa K son añadidos a las muestras eluídas. Los enlaces cruzados son también revertidos en la fracción sobrenadante del IP. 40 \mul de 0,5M de Na EDTA pH 8,0, 80 \mul de 1 M de Tris-HCl, pH 6.5y 8 \mul de 10 mg/ml de Proteinasa K son añadidos a las muestras sobrenadantes. Las muestras son incubadas por 1 hora a 45ºC para degradar la proteína en las muestras.

20 \mug de glicógeno son añadidos a las muestras como un portador inerte y entonces las muestras de ADN son recobradas por extracción de fenol/cloroformo/ alcohol isoamílico y precipitación de etanol. Los gránulos de ADN son resuspendidos en 50 \mul de agua estéril para las reacciones PCR. 1 \mul de muestra y 30 - 40 ciclos son usados para cada amplificación PCR. El análisis de imagen basado en computadora (programa de análisis de imagen NIH) es empleado para evaluar los niveles relativos del producto PCR del gen receptor de andrógeno regulado por estrógeno, comparado con la \beta-actina y con los controles de no anticuerpo. Esto permitió un cálculo de la cantidad relativa del gen trascripto contenido con una muestra a ser comparada con esa en otras muestras.

Oligonucleótidos usados para análisis de CIP:

Cebador directo de receptor de progesterona: 5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3'

Cebador inverso de receptor de progesterona: 5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3'

Cebador directo de \beta-actina: 5'-TTTTCGCAAAAGGAGGGGAG-3'

Cebador inverso de \beta-actina: 5'-AAAGGCAACTTTCGGAACGG-3'

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Un ejemplo del tipo de resultado que puede ser logrado está mostrado en la figura 6.

La cantidad de ADN receptor de andrógeno precipitado, y por lo tanto el grado de acetilación de las proteínas de histona cromatina asociadas con el receptor andrógeno, puede ser disminuida por aproximadamente el 75% en las células en las cuales la expresión del receptor de andrógeno está inhibida por el método descrito comparada con las células no tratadas.

Ejemplo 11 Ensayo de cambio de gel

Los ejemplos previos han demostrado que las moléculas de fusión oligo/péptidas ARP-L217 y ARP-L218 son capaces de regular la actividad del gen objetivo. Esto es considerado para ser debido al cambio mediado por MAD1 en estado de acetilación de histona del ADN a o cerca de donde el ARO o el IRE enlaza.

Un ensayo de cambio de gel es usado para demostrar que las moléculas de fusión oligo/péptidas pueden enlazar al fragmento de ADN que contiene el promotor objetivo.

Un fragmento receptor de andrógeno 281 bp que contiene la secuencia del promotor objetivo es incubado con AR-PL217. Las muestras son sometidas a electroforesis de gel no desnaturalizado para caracterizar la fotoaducción mediada por triplex. Los aductos son detectados en muestras que contienen el producto AR-PL217 el cual cambió con dosis crecientes.

De esta forma es posible mostrar que las moléculas de fusión oligo/péptidas pueden enlazar con los fragmentos de ADN que contienen el promotor objetivo.

Ejemplo 12 Moléculas de fusión oligo/péptidas con una señal de localización nuclear

La porción péptida de la molécula puede tener una señal de localización nuclear (NLS) para dirigir la molécula al núcleo. Los péptidos usados en este ejemplo son:

a)

DDD-MAD1-DDD-NLS,

\newpage

el cual tiene la secuencia de aminoácido:

(Enlace)DDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDPKKKRK V (carboxamida)

y,

b)

DDD-NLS-DDD-MAD1,

el cual tiene la secuencia de aminoácido:

(Enlace)DDDPKKKRKVDDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASML P (carboxamida)

El NLS es una señal de localización nuclear funcional (secuencia PKKKRKV) de aminoácido 7 derivada del SV40 T-antígeno.

La secuencia de enlace DDD y la secuencia de aminoácido MAD1 29 son las mismas que aquéllas discutidas en ejemplos anteriores.

Para demostrar que las secuencias péptidas DDD-MAD1-DDD-NLS, y DDD-NLS-DDD-MAD1 son dirigidas al núcleo, las células de carcinoma de pulmón humanas A459 fueron transfectadas usándolas con oligopéptidos GeneICE que consisten de ambas secuencias de péptidos DDD-MAD1-DDD-NLS, y DDD-NLS-DDD-MAD1 enlazadas a un oligonucleótido marcado Cy3 por protocolos estándar Lipofectamin 2000. Las células fueron entonces fijadas en formaldehído y teñidas con tintura nuclear DAPI usando el procedimiento recomendado por el fabricante. El examen de las células por microscopía fluorescente mostró que las moléculas del oligopéptido GeneICE marcado Cy3 fueron colocalizadas con la tintura nuclear DAPI. De los datos experimentales resultantes fue concluido que el NLS es muy efectivo para dirigir el péptido al núcleo.

Las secuencias péptidas DDD-MAD1-DDD-NLS, y DDD-NLS-DDD-MAD1 pueden mediar la expresión del gen objetivo cuando es incorporado en las moléculas oligo/péptidas de la invención. Esto puede ser demostrado usando la aproximación experimental esbozada en los ejemplos 8 y 9.

Por ejemplo, las secuencias péptidas DDD-MAD1-DDD-NLS, y DDD-NLS-DDD-MAD1 pueden ser incorporadas en las moléculas:

ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS, y

ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1.

ARP es la secuencia oligo OFT mostrada en el ejemplo 8.

Las moléculas ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS y ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1 son entonces transfectadas en las células de LNCap, como en el ejemplo 8, o en las células modificadas HT1881, como en el ejemplo 9. Usando el procedimiento esbozado en esas secciones es posible mostrar el efectos de las moléculas ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS y ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1 en la expresión del gen objetivo.

Ejemplo 13 Regulación de los niveles de antígenos específicos prostáticos usando las moléculas de fusión oligo/péptidas

Como se discutió en los ejemplos 2, 8 y 9 las moléculas de fusión oligo/péptidas son capaces de regular la actividad del gen cuando los genes están integrados en el genoma. En este ejemplo suministramos datos experimentales adicionales que sustentan esto.

Los niveles de proteína de antígenos específicos prostáticos (PSA) son regulados por la proteína receptora de andrógeno (AR). Ya que hemos mostrado en el ejemplo 8 que los niveles de AR UNAM son reducidos en las células transfectadas con las moléculas de fusión oligo/péptidas ARP-L218, razonamos que debería haber una disminución en los niveles de proteína PSA en las células transfectadas con ARP-L218.

Por consiguiente, usando los protocolos descritos en el ejemplo 8 el ARP-L218 fue transfectado en las células del LCap (GET/LNC/W39/P6) con Lipofectamina 2000 (InVitrogen) con o sin R1881 (Perkin Elmer), un andrógeno sintético, por 3 días, después de lo cual el sobrenadante fue cosechado para la cuantificación del total de proteína PSA en el Pathology Centre, Hammersmith Hospital, London, U.K.

Las mediciones de PSA fueron realizadas por ensayo inmunométrico marcado quimiluminiscente usando un analizador de inmunoensayo automatizado (Abbott Architect Immunoassay Analyser).

Los resultados de este experimento están mostrados en la Tabla 5 debajo y también como un gráfico de barras en la figura 7.

TABLA 5 Total de PSA cuantificado de los sobrenadantes celulares

6

De estos datos puede ser visto que las células que fueron incubadas con el andrógeno sintético R1881 muestran un incremento en los niveles de PSA, como sería esperado. Sin embargo, cuando las células son transfectadas con R1881 y ARP-L218, el incremento de los niveles PSA es grandemente reducido. Como puede ser visto de las muestras transfectadas con ARP-L218 pero no con R1881, el ARP-L218 no tiene efecto directo sobre los niveles de PSA.

Por consiguiente, proponemos que el R1881 actúa para incrementar la actividad RA la cual, a su vez, conduce a un incremento en los niveles de PSA. Sin embargo, ARP-L218 actúa para bloquear la expresión de gen AR (como se muestra en el ejemplo 8), y así los niveles de PSA son subsecuentemente reducidos. Los datos sugieren que las moléculas de fusión oligo/péptidas de la invención pueden ser usadas para regular directa o indirectamente un gen objetivo.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en la compilación de las referencias, los errores u omisiones no pueden ser excluidos y la OEP niega toda responsabilidad a este respecto.

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Claims (44)

1. Una molécula para la supresión de la expresión de un gen seleccionado en una célula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico que se enlaza a un sitio en, o se asocia con, un gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción represora de expresión, en la que la porción de enlace del ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o análogo, y en la que la porción represora comprende un polipéptido o péptido mimético.

2. Una molécula para modular la expresión de un gen seleccionado en una célula que comprende (1) una porción de enlace de ácido nucleico la cual se enlaza a un sitio en, o se asocia con, un gen seleccionado cuyo sitio está presente en un genoma y (2) una porción modificadora, y en la que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o análogo, y en la que la porción modificadora comprende un polipéptido o un péptido mimético el cual es capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o la cromatina y no es una endonucleasa o KRAB.

3. La molécula de la reivindicación 1 o 2 en la que la porción represora o modificadora es una porción de desactivación de cromatina y no es KRAB.

4. La molécula de la reivindicación 1 o 2 en la que la porción represora o modificadora es toda o una porción de un componente de un complejo de metilasa de ADN o toda o una porción de un polipéptido el cual se enlaza a, o facilita el alistamiento de un complejo de metilasa de ADN y no es KRAB.

5. La molécula de la reivindicación 1 o 2 en la que la porción represora o modificadora es toda o una porción de un componente de una acetiltransferasa de histona o toda o una porción de un polipéptido la cual se enlaza a, o facilita el alistamiento de un complejo de una acetiltransferasa de histona y no es KRAB.

6. La molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el polipéptido o parte de la molécula del polipéptido mimético tiene una masa molecular menor que 11 kDa.

7. Una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que la porción de enlace de ácido nucleico es una porción de enlace de ADN.

8. Una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6 en la que la porción de enlace de ácido nucleico es una porción de enlace de ARN y el sitio presente en un genoma es un RNA naciente siendo transcrito de un ADN.

9. La molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el oligonucleótido o análogo a nucleótido o mimético es un oligonucleótido de formación triple (OFT).

10. La molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el análogo a, o mimético de, nucleótido es un ácido nucleico péptido (ANP).

11. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 3 o las reivindicaciones dependientes de ella en la que la porción de desactivación de cromatina facilita la deacetilación de histona.

12. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 3 o las reivindicaciones dependientes de ella en las que la porción de desactivación de cromatina es toda o una porción de un componente de un complejo de deacetilación de histona (CDAH) o toda o una porción de un polipéptido la cual enlaza a, o facilita el alistamiento de un complejo CDAH.

13. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 12 en la que el componente del complejo CDAH o el polipéptido el cual enlaza a, o facilita el alistamiento de un complejo CDAH es uno cualquiera de PLZF, N-CoR, SMRT, Sin3, SAP 18, SAP 30, HDAC, NuRD, MAD1, MAD2, MAD3, MAD4, Rb o E7.

14. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 13 en la que la porción de desactivación de cromatina es toda o una parte de enlace de N-CoR o SMRT de PLZF.

15. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 13 en la que la porción de desactivación de cromatina es toda o una parte activa enzimáticamente de una CDAH.

16. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 13 en la que la porción de desactivación de cromatina es toda o una parte de enlace del complejo de deacetilasa de histona de E7.

17. Una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en las que la molécula además comprende una porción que facilita la entrada celular y/o la localización nuclear.

18. Una molécula de acuerdo a la reivindicación 17 en la que la porción que facilita la entrada celular y/o la localización nuclear es un péptido pequeño de 7-16 aminoácidos, por ejemplo, el homeodominio de Antennapedia Modificada de acuerdo a la secuencia RQIKIWFQNRRMKWKK o un péptido de internalización básica HIV TAT de acuerdo a la secuencia (Acm) GRKKRRQRRRPQC, donde C (Acm) es un Cis-acetamidometilo.

19. Una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la que la porción de enlace de ácido nucleico y la porción modificadora o represora están fusionadas.

20. Uso de una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en la fabricación de un agente para modular la expresión del gen seleccionado en una célula.

21. El uso de la reivindicación 20 en el que el agente es para suprimir la expresión del gen seleccionado.

22. El uso de acuerdo a la reivindicación 20 o 21 en el que el agente es un medicamento para modular o suprimir la expresión de un gen seleccionado en un animal, en el que el animal tiene cáncer.

23. Uso de una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en la fabricación de un medicamento para suprimir la expresión de un gen seleccionado en un paciente que tiene cáncer.

24. Una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para el uso en medicina.

25. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. La composición de la reivindicación 25 que comprende medios para promover la toma celular de una molécula.

27. La composición de la reivindicación 26 en la que los medios para promover la toma celular de la molécula son liposomas o un portador viral.

28. Una célula huésped que comprende una molécula de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

29. Una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 28 la cual es una célula bacteriana.

30. Una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 28 la cual es una célula de animal.

31. Una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 28 la cual es una célula de una planta.

32. Un animal no humano que comprende una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 30.

33. Una planta que comprende una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 31.

34. Un método para diseñar una molécula para suprimir la expresión de un gen seleccionado en una célula, comprendiendo el método:

(1)

la identificación de un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado.

(2)

la identificación o diseño de una porción de enlace de un ácido nucleico el cual se enlaza a, o está previsto para enlazarse a, el sitio.

(3)

la preparación de una molécula que comprende la porción de enlace de ácido nucleico y una porción represora de expresión,

en el que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mímico o análogo, y en el que la porción represora comprende un polipéptido o un polipéptido mimético.

35. Un método para diseñar una molécula para modular la expresión de un gen seleccionado en una célula, comprendiendo el método:

(1)

la identificación de un sitio en, o asociado con, el gen seleccionado.

(2)

la identificación o diseño de una porción de enlace de un ácido nucleico el cual se enlaza a, o está previsto para enlazar a, el sitio.

(3)

la preparación de una molécula que comprende la porción de enlace de un ácido nucleico y una porción modificadora,

en el que la porción de enlace del ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mímico o análogo, y en el que la porción modificadora comprende un polipéptido o un polipéptido mimético el cual es capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o cromatina.

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36. Un método para diseñar una molécula para suprimir la expresión de un gen seleccionado en una célula, comprendiendo el método:

(1)

la identificación de un sitio a, o asociado con, el gen seleccionado.

(2)

la identificación o el diseño de una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a, o está prevista a enlazar a, un polinucleótido que tiene o comprende la secuencia nucleótida del sitio.

(3)

la preparación de una molécula que comprende la porción de enlace de ácido nucleico y una porción represora de expresión,

en el que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o un análogo, y en el que la porción represora comprende un polipéptido o un péptido mimético.

37. Un método para diseñar una molécula para modular la expresión de un gen seleccionado en una célula, comprendiendo el método:

(1)

la identificación de un sitio a, o asociado con, el gen seleccionado

(2)

la identificación o el diseño de una porción de enlace de ácido nucleico la cual enlaza a, o está prevista a enlazar a, un polinucleótido que tiene o comprende la secuencia nucleótida del sitio.

(3)

la preparación de una molécula que comprende la porción de enlace de ácido nucleico y una porción modificadora,

en el que la porción de enlace de ácido nucleico comprende un oligonucleótido o un oligonucleótido mimético o un análogo, y en el que la porción modificadora comprende un polipéptido o un polipéptido mimético el cual es capaz de modular la modificación covalente del ácido nucleico o la cromatina.

38. El método de la reivindicación 34 o 35 comprendiendo además los pasos de:

(4)

la realización de una valoración de control de calidad en la preparación molecular para determinar que la porción de enlace de ácido nucleico y la porción represora o modificadora están fijadas una a otra, y/o

(5)

la prueba de afinidad y/o especificidad del enlace de la porción de enlace de ácido nucleico al sitio; y/o

(6)

la prueba de afinidad y/o especificidad del enlace de la molécula al sitio; y/o

(7)

la prueba de la eficacia de la molécula o polinucleótido en modular o suprimir la expresión del gen y/o de un gen indicador que comprende la secuencia nucleótida del sitio.

39. El método de la reivindicación 36 o 37 comprendiendo además los pasos de:

(4)

la realización de una valoración de control de calidad en la preparación molecular para determinar que la porción de enlace de ácido nucleico y la porción represora o modificadora están fijadas una a otra, y/o

(5)

la prueba de afinidad y/o especificidad del enlace de la porción de enlace de ácido nucleico a un polinucleótido que tiene o comprende la secuencia nucleótida del sitio; y/o

(6)

la prueba de afinidad y/o especificidad del enlace de la molécula a un polinucleótido que tiene o comprende la secuencia nucleótida del sitio; y/o

(7)

la prueba de la eficacia de la molécula o polinucleótido en modular o suprimir la expresión del gen y/o de un gen indicador que comprende la secuencia nucleótida del sitio.

40. Un método in vitro para suprimir la expresión de un gen seleccionado en una célula comprendiendo el método introducir en la célula una molécula de acuerdo a las reivindicaciones 1 o 3 a 19.

41. Un método in vitro para modular la expresión de un gen seleccionado en una célula; comprendiendo el método introducir en la célula una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19.

42. Un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 41 en las que la célula es una célula eucariótica.

43. Un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 41 en las que la célula es una célula de una planta y está contenida en una planta.

44. Un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 34, 36, 38, 39, 40, 42 o 43, en el que se suprime la expresión de una pluralidad de genes seleccionados.