DE60221572T2

DE60221572T2 - Kontrolle der genexpression durch verwendung eines komplexes aus einem oligonucleotid und einem regulatorischen peptid

Info

Publication number: DE60221572T2
Application number: DE60221572T
Authority: DE
Inventors: Stephen Div. of Medicine Cancer Cell R. 601b Du Cane Rd. HART; Simak Div. of Medicine Cancer Cell R. 601b De Cane Rd. ALI; Boris Tumi Cyprot Pufong; Andrew Christopher Porter; Laki Div. of Medicine Cancer Cell Du Cane Rd. BULUWELA; Satu Vainikka; John David Cancer JENKINSON; Patrick Activotec-SSP Ltd. KANDA
Original assignee: Imperial Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2022-10-12
Also published as: PT1470226E; ES2291536T3; EP1470226A1; DE60221572D1; WO2003033701A1; DK1470226T3; ATE368737T1; EP1470226B1; CY1107754T1; AU2002334142B2; GB0223605D0; CA2474216C; GB2382581A; GB0124391D0; CA2474216A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Steuerung der Genexpression, und insbesondere betrifft sie Verfahren und Mittel zur Modulierung, vorzugsweise Unterdrückung, der Expression eines bestimmten, ausgewählten Gens.
Die Fähigkeit zur selektiven Unterdrückung der Expression eines Gens ist in vielen Gebieten der Biologie nützlich, zum Beispiel für Behandlungsverfahren, wenn die Expression des Gens unerwünscht ist, für die Generierung von Krankheitsmodellen, bei denen die fehlende Expression eines bestimmten Gens mit der Krankheit assoziiert ist, und für die Modifizierung des Phänotyps zur Erzeugung gewünschter Eigenschaften. Somit könnte die Fähigkeit zur selektiven Unterdrückung der Expression eines Gens den „Knockout" humaner Gene in humanen Zellen (seien sie vom Wildtyp oder Mutanten) und den Knockout eukaryotischer Gene in Untersuchungen der Entwicklung und Differenzierung ermöglichen.
Die derzeitigen Verfahren, die die Unterdrückung der Expression eines bestimmten Gens zum Ziel haben, lassen sich in drei Hauptkategorien einteilen, nämlich die Antisense-Technologie, die Ribozym-Technologie und die durch eine homologe Rekombination herbeigeführte gezielte Gendeletion.
Die Antisense-Techniken beruhen auf der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, das typischerweise komplementär zu einer mRNA ist, die vom ausgewählten Gen exprimiert wird, in eine Zelle. Typischerweise unterdrückt das Antisense-Molekül die Translation des mRNA-Moleküls und verhindert die Expression des vom Gen codierten Polypeptids, wobei das Antisense-Molekül an das mRNA-Molekül gebunden bleibt. Modifikationen der Antisense-Technik können die Transkription des ausgewählten Gens durch die Bindung des Antisense-Moleküls (triplex forming oligonucleotide, TFO) an die DNA des Gens unter Bildung einer Dreifachhelix verhindern. Bei diesem Verfahren blockiert die Gegenwart des dritten Stranges die Transkription der DNA, wobei er gebunden bleibt.
Modifizierende chemische Gruppen wurden in TFOs inkorporiert, zum Beispiel vernetzende Psoralengruppen, aber diese können zu irreversiblen DNA-Schäden und Mutationen führen. Die Kontrolle derartiger modifizierender chemischer Gruppen in Zellen ist auch schwierig. Sie können auch mit Nachteilen bezüglich der Zuführung der Moleküle in die Zellen verbunden sein.
Ribozymtechniken beruhen auf der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls in eine Zelle, das ein RNA-Molekül exprimiert, das an ein Ziel-RNA-Molekül bindet und seine selektive Spaltung katalysiert. Das Ziel-RNA-Molekül ist typischerweise ein mRNA-Molekül, aber es kann zum Beispiel ein RNA-Molekül eines Retrovirus sein.
Für Antisense- und Ribozym-basierte Techniken hat sich eine Implementierung als schwierig erwiesen, und sie sind bezüglich der Unterdrückung oder Inaktivierung des Zielgens unterschiedlich erfolgreich. Außerdem erfordern diese beiden Techniken eine anhaltende Expression oder Verabreichung des das Gen inaktivierenden Agens.
Das Verknüpfen eines TFO mit einer viralen VP16-Aktivierungsdomäne (Kusnetsova et al. (1999) Nucleic Acids Res. 20, 3995-4000) ist zur Ausweitung der Anwendung von TFOs auf eine Genaktivierung eingesetzt worden (im Gegensatz zu früheren Verwendungen zur Unterdrückung oder Inaktivierung von Genen).
Die gezielte Gendeletion durch eine homologe Rekombination erfordert zwei geninaktivierende Ereignisse (eines für jedes Allel), und sie kann nicht ohne weiteres auf Primärzellen angewandt werden, insbesondere zum Beispiel primäre humane Brüstdrüsenzellen, die nur für wenige Passagen in Kultur gehalten werden können. Die Durchführung einer gezielten Gendeletion in Pflanzen ist immer noch schwierig. Die cre-lox-vermittelte ortsspezifische Integration ist das Verfahren der Wahl, auch wenn die Effizienz bezüglich spezifischer Integrationsereignisse niedrig ist (Alberts et al. (1995) Plant J. 7, 649-659, Vergunst & Hooykass (1998) Plant Mol. Biol. 38, 393-406, Vergunst et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26, 2729-2734).
Diese Hauptnachteile der verfügbaren Technologien haben uns dazu gebracht, nach einer alternativen Strategie zu suchen.
WO 99/11808 beschreibt Fusionsproteine oder Protein/Nucleinsäure-Komplexe, die das Antennapedia-Protein umfassen.
WO 01/02019 beschreibt Fusionen von zwei Polypeptiden, von denen ein Polypeptid in der Lage ist, spezifisch an eine ausgewählte Nucleinsäuresequenz zu binden, und das andere Polypeptid das Chromatin inaktiviert.
Lebedeva et al. (2000) Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 50, 101-119 ist eine Übersichtsarbeit über Verfahren für die Einführung von Oligonucleotiden in Zellen.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren das Einführen eines Moleküls in eine Zelle umfasst, wobei das Molekül umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen Abschnitt aus einem Expressionsrepressor, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der Repressorabschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Modulierung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren das Einführen eines Moleküls in eine Zelle umfasst, wobei das Molekül umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen modifizierenden Abschnitt, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der modifizierende Abschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst, das in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren, und das keine Endonuclease oder KRAB ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Molekül bereit, das umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen Abschnitt aus einem Expressionsrepressor, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der Repressorabschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Molekül bereit, das umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen modifizierenden Abschnitt, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der modifizierende Abschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst, das in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren, und das keine Endonuclease oder KRAB ist.
Es wird bevorzugt, dass die Zelle oder das Genom eine eukaryotische Zelle oder ein eukaryotisches Genom ist, zum Beispiel eine Pilz-, Tier- oder Pflanzenzelle.
Es wird bevorzugt, dass der Repressorabschnitt ein modifizierender Abschnitt ist. Es wird bevorzugt, dass der Repressorabschnitt oder modifizierende Abschnitt ein Chromatin-inaktivierender Abschnitt ist. Der Chromatin-inaktivierende Abschnitt kann ein beliebiges Polypeptid oder ein Teil von ihm sein, das bzw. der direkt oder indirekt zur Chromatininaktivierung führt. Mit „direkt" zur Chromatininaktivierung führen meinen wir, dass das Polypeptid oder der Teil von ihm selbst auf das Chromatin wirkt, um es zu inaktivieren. Mit „indirekt" zur Chromatininaktivierung führen meinen wir, dass das Polypeptid oder der Teil von ihm nicht selbst auf das Chromatin wirkt, sondern in der Lage ist, eine Zellkomponente, die das tut, zu rekrutieren oder zu unterstützen.
Eine Chromatininaktivierung führt im Allgemeinen zur Unterdrückung oder Inaktivierung der Genexpression. Die Chromatininaktivierung ist typischerweise ein lokal begrenztes Ereignis, sodass die Unterdrückung oder Inaktivierung der Genexpression typischerweise auf ein Gen oder wenige Gene beschränkt ist. Dementsprechend ist der Chromatin-inaktivierende Abschnitt ein beliebiges geeignetes Polypeptid, das, wenn es ein Teil des erfindungsgemäßen Polypeptids ist, und wenn es über den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt auf ein ausgewähltes Gen abzielt, lokal das mit dem ausgewählten Gen assoziierte Chromatin inaktiviert, sodass die Expression des Gens inaktiviert oder unterdrückt wird. Eine Histondeacetylierung ist mit einer Chromatininaktivierung assoziiert, und so wird es besonders bevorzugt, dass der Chromatin-inaktivierende Abschnitt die Histondeacetylierung erleichtert. Die gezielte Deacetylierung der mit einem bestimmten Gen assoziierten Histone führt zu einer im Wesentlichen irreversiblen Geninaktivierung. Unter „Unterdrückung" oder „Inaktivierung" der Genexpression verstehen wir, dass in Gegenwart des erfindungsgemäßen Polypeptids die Expression des ausgewählten, gezielt angesteuerten Gens 1,2-fach, 1,4-fach, 1,6-fach, zweifach, dreifach, fünffach, zehnfach, zwanzigfach, 50-fach, 100-fach oder 1000-fach niedriger ist als, unter entsprechenden Bedingungen, in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids. Die Genexpression kann mittels beliebiger geeigneter Verfahren gemessen werden, zu denen die Reverse-Transcriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), eine RNA-Hybridisierung, RNAse-Protection-Assays, Nuclear-Run-off-Assays und eine Chromatinveränderung, wie sie aus einer Überempfindlichkeit gegenüber der DNAse 1 hervorgeht, gehören.
In tierischen Zellen und Pflanzenzellen wird die Histondeacetylierung durch den so genannten Histondeacetylasekomplex (HDAC) bewirkt, der zusätzlich zu einem oder mehreren Histondeacetylase-Enzym(en) weitere Proteine enthält, die an der Bildung und der Funktion des Komplexes beteiligt sind. Außerdem gibt es andere Proteinkomponenten, die, auch wenn sie möglicherweise kein Teil des HDAC sind, an HDAC binden oder auf andere Weise mit ihm interagieren und die Histondeacetylierung erleichtern.
Die Deacetylierung und die Acetylierung von Histonen sind gut bekannte Phänomene, die in den folgenden Übersichtsarbeiten diskutiert werden: Chen & Li (1998) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression 8, 169-190, Workman & Kingston (1998) Ann. Rev. Biochem. 67, 545-579, Perlmann & Vennstrom (1995) Nature 377, 387-388, Wolfe (1997) Nature 387, 16-17, Grunstein (1997) Nature 389, 349-352, Pazin & Kadonaga (1997) Cell 89, 325-328, DePinho (1998) Nature 391, 533-536, Bestor (1998) Nature 393, 311-312 und Grunstein (1998) Cell 93, 325-328.
Die Polypeptidzusammensetzung des HDAC-Komplexes wird derzeit untersucht. Zu Polypeptiden, die einen Bestandteil bestimmter HDAC-Komplexe bilden könnten oder mit ihnen assoziiert sind, gehören die Histondeacetylase 1 (HDAC1) (Taunton et al. (1996) Nature 272, 408-441), die Histondeacetylase 2 (HDAC2) (Yang et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12845-12850), die Histondeacetylase 3 (HDAC3) (Dangond et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 242, 648-652), N-CoR (Horlein et al. (1995) Nature 377, 397-404), SMRT (Chen & Evans (1995) Nature 377, 454-457), SAP30 (Zhang et al. (1998) Molecular Cell 1, 1021-1031), Sin3 (Ayer et al. (1995) Cell 80, 767-776, Schreiber-Agus et al. (1995) Cell 80, 777-786), SAP18 (Zhang et al. (1997) Cell 89, 357-364) und RbAp48 (Qian et al. (1993) Nature 364, 648-652). Alle diese Paper werden hier mit der entsprechenden Quellenangabe mit aufgenommen. Man geht davon aus, dass es weitere Komponenten des HDAC-Komplexes oder solche, die mit dem HDAC-Komplex interagieren, gibt, die noch nicht entdeckt worden sind. Wir stellen uns vor, dass diese ebenfalls für die Durchführung der Erfindung nützlich sein werden.
Für PLZF wurde gezeigt, dass es mit N-CoR und SMRT interagiert, die wiederum einen HDAC-Komplex rekrutieren. PLZF interagiert auch direkt mit HDAC (Lin et al. (1998) Nature 391, 811-814, Grignani et al. (1998) Nature 391, 815-818, David et al. (1998) Oncogene 16, 2549-2556).
Mad1 ist ein Mitglied der Mad-Familie und besitzt die Fähigkeit, als Repressor der Transkription zu wirken. Es wurde gezeigt, dass Mad1 in der Lage ist, mit Sin3 zu interagieren, das wiederum mit Histondeacetylasen der Klasse I (HDAC1 und HDAC2) interagiert. Mad/Sin3 fungiert als ein großes Proteingerüst, das in der Lage ist, multiple Protein-Protein-Wechselwirkungen einzugehen (Rassig et al. (1997) Cell 89, 341-347, Laherty et al. (1997) Cell 89, 349-356, Zhang et al. (1997) Cell 89, 357-364).
Die gebildeten Komplexe, die eine beliebige der Komponenten N-CoR, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30 und Histondeacetylase enthalten, werden beschrieben bei Heinzel et al. (1997) Nature 387, 43-48, Alland et al. (1997) Nature 387, 49-55, Rassig et al. (1997) Cell 89, 341-347, Laherty et al. (1997) Cell 89, 349-356, Zhang et al. (1997) Cell 89, 357-364, Kadosh & Struhl (1997) Cell 89, 365-371, Nagy et al. (1997) Cell 89, 373-380 und Laherty et al. (1998) Molecular Cell 2, 33-42. Alle diese Paper werden hier mit der entsprechenden Quellenangabe mit aufgenommen.
Somit wird besonders bevorzugt, dass die Komponente eines HDAC-Komplexes oder das Polypeptid, das an einen HDAC-Komplex bindet oder seine Rekrutierung erleichtert, eine beliebige bzw. ein beliebiges von MAD1, E7, PLZF, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30 oder N-CoR oder von HDACs, einschließlich der HDAC1, HDAC2 oder HDAC3, oder von NuRD, MAD2, MAD3, MAD4 oder Rb ist. Es dürfte klar sein, dass es nicht erforderlich sein muss, dass alle der Polypeptide vorhanden sind, so lange ein funktioneller Abschnitt von ihnen vorhanden ist. Zum Beispiel kann bezüglich der Histondeacetylase-Enzyme (zum Beispiel HDAC1, HDAC2 oder HDAC3) der funktionelle Abschnitt ein Abschnitt sein, der noch die Histondeacetylase-Aktivität aufweist, oder er kann ein Abschnitt sein, der eine Bindungsstelle für andere Komponenten eines HDAC-Komplexes enthält, oder ein Abschnitt, der auf sonstige Weise den HDAC-Komplex rekrutiert und die Histondeacetylierung fördert. Ähnlich kann bezüglich der anderen Komponenten des HDAC-Komplexes oder der Polypeptide, die an den HDAC-Komplex binden, der funktionelle Abschnitt ein Abschnitt sein, der eine Bindungsstelle für andere Komponenten des HDAC-Komplexes enthält. Bis jetzt sind für Säugetiere sechs HDAC-Gene beschrieben worden (Grozinger et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873), und man geht davon aus, dass irgendeins oder mehrere von ihnen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
VP16 oder KRAB sind, im Missverständnissen vorzubeugen, in den Begriffen „modifizierender Abschnitt" oder „Chromatin-inaktivierender Abschnitt" nicht mit eingeschlossen. VP16 ist ein Aktivator der Transkription, bezüglich dessen Wirkungsmechanismus man nicht davon ausgeht, dass eine kovalente Modifizierung der DNA oder des Chromatins beteiligt ist. KRAB ist ein Repressor der Transkription, bezüglich dessen Wirkungsmechanismus man davon ausgeht, dass andere Mechanismen als eine Chromatin-Inaktivierung beteiligt sind. Auch wenn es nicht bevorzugt wird, kann jedes beliebige Fragment von KRAB, das, wenn es Teil des oben definierten Moleküls/Polypeptids ist, und wenn es über den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt auf ein ausgewähltes Gen abzielt, das mit dem ausgewählten Gen assoziierte Chromatin lokal inaktiviert, sodass die Expression des Gens inaktiviert oder unterdrückt ist, in dem Begriff „Chromatin-inaktivierender Abschnitt" eingeschlossen sein. Zum Beispiel ist jedes beliebige Fragment von KRAB, das in der Lage ist, an einen HDAC-Komplex zu binden oder seine Rekrutierung zu erleichtern, in dem Begriff „Chromatin-inaktivierender Abschnitt" eingeschlossen. Derartige Fragmente werden jedoch nicht bevorzugt.
Man geht davon aus, dass Bindungsmotive in den Komponenten des HDAC-Komplexes oder in den Polypeptiden, die an den HDAC-Komplex binden, vorliegen, und diese Motive könnten ausreichen, als Chromatin-inaktivierende Abschnitte des erfindungsgemäßen Polypeptids zu fungieren, da sie die Histondeacetylierung über das Rekrutieren eines HDAC-Komplexes erleichtern könnten.
Weiterhin dürfte klar sein, dass Varianten einer Komponente des HDAC-Komplexes oder Varianten eines Polypeptids, das an den HDAC-Komplex bindet, verwendet werden können. Zu geeigneten Varianten gehören nicht nur funktionelle Abschnitte, wie sie oben beschrieben wurden, sondern auch Varianten, bei denen Aminosäurereste deletiert oder ersetzt oder insertiert wurden, vorausgesetzt, dass die Variante immer noch in der Lage ist, die Histondeacetylierung zu erleichtern. So gehören zu geeigneten Varianten Varianten der Histondeacetylase, bei denen die Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp modifiziert wurde, die aber ihre Fähigkeit zur Deacetylierung von Histonen behalten haben. Ähnlich gehören zu geeigneten Varianten Varianten von, zum Beispiel, Sin3 oder PLZF, bei denen die Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp modifiziert wurde, die aber ihre Fähigkeit, mit oder im HDAC-Komplex zu interagieren, behalten haben. Ähnlich können Varianten anderer Proteine, die mit Komponenten des HDAC-Komplexes und anderen Transkriptionsfaktoren interagieren, die über die HDAC-Aktivität eine Geninaktivierung bewirken, verwendet werden.
Es können die gesamten Rb-, MAD- und MeCpG2-Proteine oder Teile von ihnen mit dem HDAC-Komplex interagieren.
Zwar wurden die meisten Arbeiten mit HDAC-Komplexen und Polypeptiden, die an der Rekrutierung des HDAC-Komplexes in Säugersystemen beteiligt sind, durchgeführt, aber das grundlegende System ist von der Art, dass erwartet wird, dass funktionell äquivalente Polypeptide auch in anderen eukaryotischen Zellen, insbesondere in anderen tierischen Zellen und in Pflanzenzellen, vorkommen. Zum Beispiel zeigt die 5, dass Polypeptide, die sehr eng mit der humanen HDAC1 verwandt sind, in Arabidopsis und in der Hefe vorkommen. Ein pflanzlicher HDAC-Komplex wurde aus dem Mais isoliert (Lussen et al. (1997) Science 277, 88-91), und eine vergleichende Untersuchung von Histondeacetylasen aus Zellen von Pflanzen, Pilzen und Wirbeltieren ist durchgeführt worden (Lechner et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1296, 181-188). Für Histondeacetylase-Inhibitoren wurde gezeigt, dass sie inaktive rRNA-Gene in Brassica dereprimieren (Chen & Pickard (1997) Genes Dev. 11, 2124-2136), und ein natürlich vorkommendes wirtsspezifisches Toxin (HC-Toxin) aus Cochliobolus carbonum hemmt Histondeacetylasen von Pflanzen, Pilzen und Säugetieren (Brosch et al. (1995) Plant Cell 7, 1941-1950).
Es ist nicht erforderlich, dass der Chromatin-inaktivierende Abschnitt aus dem gleichen Zelltyp oder der gleichen Spezies stammt wie die Zelle, in die das Polypeptid (oder das für das Polypeptid codierende Polynucleotid) eingeführt wird, aber es ist erwünscht, dass das so ist, da ein derartiger Chromatin-inaktivierender Abschnitt in der Lage sein könnte, das Chromatin in dieser Zeller wirksamer zu inaktivieren.
Es wird besonders bevorzugt, dass der Chromatin-inaktivierende Abschnitt des Polypeptids PLZF, E7, MAD1, Rb oder SAP18 ist oder ein Teil von PLZF oder E7 oder MAD1 oder Rb oder SAP18, der die Histondeacetylierung erleichtern kann, oder ein Polypeptid oder ein Abschnitt eines Polypeptids, von dem bekannt ist, dass es eine Genaktivierung über eine Histondeacetylierung bewirkt. Zum Beispiel wird für den Teil von PLZF in PLZF-RARα, der an der APL beteiligt ist, angenommen, dass er mit N-CoR und SMRT interagiert.
Bevorzugte Chromatin-inaktivierende Abschnitte werden in den Beispielen beschrieben, und zu ihnen gehören ein Polypeptid/Polypeptidomimetikum oder ein Analoges, das aus SAP18 gewonnen werden kann, mit der Aminosäuresequenz XXXMAVESRVTQEEIKKEPEKPIDREKTCPLLLRVF (wobei XXX zum Beispiel ein AAA- oder DDD-Linker ist), und ein Polypeptid, das aus MAD1 gewonnen werden kann, mit der Aminosäuresequenz XXXMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP (wobei XXX zum Beispiel ein AAA- oder DDD-Linker ist).
Es wird auch besonders bevorzugt, dass der Chromatin-inaktivierende Abschnitt ein Polypeptid mit einer Histondeacetylase-Enzymaktivität ist, wie sie von der HDAC1, der HDAC2 oder der HDAC3 bereitgestellt wird.
Alternativ kann der modifizierende Abschnitt ein Abschnitt sein, der in der Lage ist, die kovalente Modifizierung, zum Beispiel Methylierung, einer Nucleinsäure, vorzugsweise DNA, zu modulieren. So kann der modifizierende Abschnitt ein DNA-modifizierendes Enzym sein oder umfassen, oder er kann in der Lage sein, ein derartiges Enzym zu rekrutieren. Die Modulation bewirkt vorzugsweise die Unterdrückung des ausgewählten Gens.
Es wird bevorzugt, dass der modifizierende Abschnitt die Sequenz der Nucleinsäure nicht verändert. Es wird bevorzugt, dass der modifizierende Abschnitt nicht das Nucleinsäurerückgrat spaltet. Der modifizierende Abschnitt ist vorzugsweise keine Rekombinase oder Restriktionsendonuclease.
Zum Beispiel kann der modifizierende Abschnitt eine vollständige Methyltransferase oder einen Teil von ihr oder eine Komponente eines Methyltransferase-Komplexes umfassen (oder in der Lage sein, sie bzw. ihn zu rekrutieren), wie es zum Beispiel diskutiert wird bei Okano M., Xie S., Li E. (1998) Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases, Nat. Genet. 19, 219-220, Adrian P. Bird und Alan P. Wolffe (1999) Methylation-Induced Repression: Belts, Braces, and Chromatin, Cell 99, 451-454.
Es wird bevorzugt, dass der Repressor oder modifizierende Abschnitt keine Endonuclease oder ein sonstiges Molekül ist, das einen persistierenden Bruch im DNA-Strang erzeugt.
Es wird bevorzugt, dass ein Polypeptid/Polypeptidmimetikum oder ein analoger Teil des Moleküls (zum Beispiel der modifizierende Abschnitt) eine Molekülmasse von unter 11 kDa, vorzugsweise unter 8 kDa, noch bevorzugter unter 6 kDa hat. Zum Beispiel wird es bevorzugt, dass das Polypeptid/Polypeptidmimetikum oder der analoge Abschnitt weniger als 100, noch bevorzugter weniger als 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 oder 20 Aminosäuren (oder Mimetika oder Analoge von diesen) enthält, am bevorzugtesten zwischen ungefähr 60 und 25 Aminosäuren (oder Mimetika oder Analoge von diesen).
Es wird besonders bevorzugt, dass der modifizierende Abschnitt aus Peptiden, die aus SAP18 oder MAD1 oder Rb gewonnen werden können, und geeigneten Linkern besteht, zum Beispiel den Peptiden, die aus SAP18 oder MAD1 gewonnen werden können, und Linkern, wie sie oben und im Beispiel 1 beschrieben werden.
Das Molekül kann ferner einen Abschnitt umfassen, der den Eintritt in die Zelle und/oder die Lokalisation im Zellkern erleichtert (lokalisierender Abschnitt). Dieser Abschnitt kann ebenfalls ein Polypeptid oder Polypeptidmimetikum/Analoges sein. Zum Beispiel kann der Lokalisierungsabschnitt aus einem Peptid mit membranotropher Aktivität bestehen oder dieses umfassen, wie es zum Beispiel bei Soukchareun et al. (1998) Bioconjugate Chem. 9, 466-475 und dort zitierten Literaturstellen diskutiert wird, zum Beispiel bei Soukchareun et al. (1995) Bioconjugate Chem. 6, 43-53 (virale Fusionspeptide) oder bei Eritja et al. (1991) Tetrahedron 47, 4113-4120 (Signalsequenzen für den Transport in den Kern). Es kann ein Signalpeptid für die nukleäre Lokalisation oder ein endosomales lytisches Peptid sein (das die Freisetzung des Moleküls aus dem endosomalen Kompartiment erleichtern kann), wie es in WO 99/13719 erwähnt wird. Es wird bevorzugt, dass dieser Abschnitt kleiner als 3 kDa ist, vorzugsweise kleiner als 2,5 kDa. Es wird bevorzugt, dass das Molekül insgesamt weniger als 11 kDa an Polypeptid/Mimetikum/Analogem enthält. Typischerweise kann ein Lokalisierungsabschnitt zwischen ungefähr 7 und 16 Aminosäuren enthalten.
Weitere Beispiele für Lokalisierungsabschnitte sind auf modifizierten Antennapedia-Homöodomänen basierende Penetratine (zum Beispiel RQIKIWFQNRRMKWKK) oder TAT (zum Beispiel C(Acm)GRKKRRQRRRPPQC, wobei C(Acm) ein Cys-Acetamidomethylrest ist) oder auf VP22 basierende Moleküle (Prochiantz (2000) Curr. Opin. Cell Biol. 9, 420-429) oder das basische HTV-TAT-Intemalisierungspeptid.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können für Verfahren und Anwendungen nützlich sein, die von Aspekten der Erfindung bereitgestellt werden, wie sie zum Beispiel unten detaillierter diskutiert werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Polypeptide in einem Verfahren des ersten oder zweiten Aspekts der Erfindung nützlich sein.
Es wird bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Moleküle hybride Moleküle sind, die in der Natur nicht vorkommen. Zum Beispiel wird es bevorzugt, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der modifizierende Abschnitt nicht aus einem natürlich vorkommenden Komplex oder Molekül gewonnen werden können. Die Moleküle (wenn es solche gibt), aus denen der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der Chromatin-inaktivierende Abschnitt gewonnen werden, können von der gleichen Spezies stammen (zum Beispiel kann der Nucleinsäure-bindende Abschnitt, wie es detaillierter unten beschrieben wird, ein Oligonucleotid mit einer Sequenz sein, die in einer humanen Nucleinsäure vorkommt, und der Chromatin-inaktivierende Abschnitt kann ein Teil des humanen PLZF sein), oder sie können von unterschiedlichen Spezies stammen (zum Beispiel kann ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die nicht in einer humanen Nucleinsäure vorkommt, die zum Beispiel in der Lage ist, an eine bakterielle DNA-Sequenz zu binden, mit einem Teil des humanen PLZF fusioniert sein).
Somit ist bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemäße Molekül eines, das durch Verfahren einer chemischen Synthese erzeugt wird, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitt so ausgewählt sind, wie es unten detaillierter beschrieben wird.
Techniken zur Synthese und zur Verknüpfung werden in WO 01/14737 und dort zitierten Literaturstellen diskutiert (wird hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen). Die Verfahren aus WO 01/147373 werden bevorzugt. Alternativ können auch Techniken eingesetzt werden, die bei Kusnetsova et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 3995-4000 beschrieben werden.
Die in einem eukaryotischen Genom vorliegende Stelle ist eine Stelle, die sich an einem ausgewählten Gen oder an ausgewählten Genen, dessen bzw. deren Expression moduliert, vorzugsweise unterdrückt oder inaktiviert, werden soll, befindet oder mit ihnen assoziiert ist. Es wird bevorzugt, dass die Stelle eine Stelle ist, die in einem eukaryotischen Genom natürlicherweise nicht vorkommt. Jedoch kann die Stelle, wie unten detaillierter diskutiert wird, eine sein, die gentechnologisch in das Genom eingeführt wurde, oder sie kann eine Stelle sein, die mit einer eingefügten viralen Sequenz assoziiert ist. Die Stelle, die gentechnologisch so in das Genom eingeführt wird, dass sie in der Nachbarschaft des Gens liegt, dessen Expression unterdrückt werden soll, kann ein Stelle aus der gleichen Spezies sein (die aber woanders im Genom vorliegt), oder sie kann eine Stelle sein, die in einer anderen Spezies vorhanden ist. Unter „Genom" verstehen wir nicht nur chromosomale DNA, sondern auch andere in der eukaryotischen Zelle vorhandene DNA, wie DNA, die in die Zelle eingeführt wurde, zum Beispiel Plasmid-DNA oder virale DNA. Es wird bevorzugt, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt an chromosomale DNA binden kann oder, wie detaillierter unten beschrieben wird, an von chromosomaler DNA transkribierte RNA.
Bei einer Ausführungsform wird es bevorzugt, dass das Gen ein endogenes Gen ist. Der Begriff „endogenes Gen" bezieht sich auf ein Gen, das zu der Zelle gehört, d.h. das bezüglich der Zelle nicht heterolog ist und sich in seinem natürlichen genomischen Kontext befindet. In diesem Kontext ist die in einem eukaryotischen Genom vorliegende Stelle eine Stelle, die sich an dem ausgewählten endogenen Gen oder an den ausgewählten endogenen Genen befindet oder mit ihm bzw. ihnen assoziiert ist, dessen bzw. deren Expression unterdrückt oder inaktiviert werden soll. Die Stelle ist eine Stelle, die natürlicherweise in einem eukaryotischen Genom vorkommt, und sie liegt in ihrem natürlichen genomischen Kontext vor.
Es kann erwünscht sein, dass die Stelle bestimmte Sequenzeigenschaften hat, die die Bindung an ein Oligonucleotid unter Bildung einer Dreifachhelix fördern, wie Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist. Es wird jedoch bezüglich der vorliegenden Erfindung angenommen, dass derartige Sequenzeigenschaften weniger wichtig als für Oligonucleotide in Abwesenheit eines Polypeptidabschnitts sein könnten, da die unterdrückende oder modulierende Wirkung des erfindungsgemäßen Moleküls sogar andauern kann, wenn das Molekül nicht mehr an die Zielstelle gebunden ist. Somit könnte die Bindungsaffinität weniger kritisch sein. Die Sequenz des Oligonucleotids ist immer noch wichtig, damit eine spezifische Erkennung erhalten wird. Die Bindungen, die zwischen dem Oligonucleotid und der Zielsequenz ausgebildet werden, müssen jedoch nicht so fest sein, wenn der Abschnitt aus dem Polypeptid/Peptidomimetikum vorhanden ist.
Die Positionierung der Bindungsstelle des Oligonucleotids bezüglich des Gens, dessen Transkription unterdrückt oder moduliert werden soll, kann auch weniger kritisch als bei Oligonucleotiden, zum Beispiel TFOs, ohne einen modifizierenden Abschnitt sein, da sich die modulierende oder unterdrückende Wirkung des erfindungsgemäßen Moleküls (zum Beispiel wenn die modifizierende Domäne eine Methyltransferase oder Histondeacetylase rekrutiert oder dazu in der Lage ist) sich über beide Seiten der Bindungsstelle des Oligonucleotids erstrecken kann. Der Nucleinsäure-bindende Abschnitt kann an den Promotor des Gens binden, aber alternativ kann er an eine andere Sequenz innerhalb oder in Nachbarschaft des interessierenden Gens binden.
WO 90/06934 / BP 0 375 408 und WO 91/06626 diskutieren Sequenzanforderungen an TFOs. Zwei Motive für die Bildung einer Dreifachhelix werden als „CT"-Motiv und „GT"-Motiv bezeichnet. Das erstere von diesen beinhaltet den Einsatz eines Polypyrimidinoligonucleotids als TFO. Für jedes GC-Basenpaar liegt ein C im TFO vor, und für jedes AT-Basenpaar liegt ein T (oder ein Xanthin oder ein Inosin oder ein halogeniertes Derivat) im TFO vor. Man geht davon aus, dass das TFO parallel zum purinreichen Strang des Duplex orientiert ist. Alternativ liegt bei Einsatz des „GT"-Motivs ein G (oder ein halogeniertes Derivat) für jedes GC-Basenpaar und ein T (oder Xanthin oder Inosin oder ein halogeniertes Derivat) für jedes AT-Basenpaar vor, und man geht davon aus, dass das TFO antiparallel zum purinreichen Strang des Duplex orientiert ist. Die Zielsequenz sollte wenigstens ungefähr 65% Purinbasen oder wenigstens ungefähr 65% Pyrimidinbasen enthalten. EP 0 266 099 diskutiert auch, wie geeignete Zielsequenzen ausgewählt werden können.
WO94/17086 diskutiert Oligonucleotide, die für eine Bindung an DNA-Sequenzen, für die angenommen wird, dass sie in der Lage sind, eine einsträngige Konformation anzunehmen, vorgesehen sind. Derartige Sequenzen können purinreich sein und eine beträchtliche Spiegelsymmetrie aufweisen. Die Oligonucleotide können im Wesentlichen komplementär zum Purinstrang sein, oder sie können eine Struktur aus einer ringförmigen Schleife oder einer Schleife mit Stamm aufweisen, die sowohl Watson-Crick- als auch Hoogsteen-Bindungen mit der einsträngigen Ziel-DNA ausbilden kann.
WO96/35706 beschreibt Oligonucleotide mit Strukturen und Sequenzeigenschaften, für die angenommen wird, dass sie die Bildung eines spezifischen und stabilen Komplexes mit einer Zielnucleinsäure fördern (einsträngige Pyrimidin-Nucleinsäuren), und die aufgrund der Bildung einer Haarnadelstruktur mit parallelen Strängen in Abwesenheit einer Zielnucleinsäure eine größere Stabilität aufweisen könnten.
Debin et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27(13), 2699-2707 kommentieren Faktoren, die die Stabilität von G, A-Dreifachhelices beeinflussen, sowie die Konsequenzen für das TFO-Design. Xodo et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268, 656-664 untersuchen auch Faktoren, die die Bindung eines TFO an Zielstellen beeinflussen, zum Beispiel die Bindung kurzer Oligonucleotide an benachbarte Stellen.
Blume et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27, 695-702 untersuchen die Rolle eines divalenten Kations bei der Bildung einer Dreifachhelix und wie die Bildung positiv oder negativ moduliert werden kann. Faria et al. (2001) J. Mol. Biol. 306, 15-24 beschreiben einen Assay zur Beurteilung von TFOs in Zellen sowie Ergebnisse mit verschiedenen Oligonucleotiden. Cheng et al. (2000) Biotech. and Bioeng. 70, 467-472 präsentieren die Ergebnisse einer mathematischen Modellierung der Bindung von TFOs und die Konsequenzen bezüglich der Wahl der Bindungsstellen und der TFO-Sequenzen.
Demidov & Frank-Kamenetskii legen eine Übersichtsarbeit über die Bindung von Peptidnucleinsäuren (PNAs), insbesondere kationischer Pyrimidin-PNAs (cpyPNAs), an Duplex-DNA vor.
Regeln für das Design potenzieller TFOs werden in einer Übersichtsarbeit von Vasquez & Wilson (1998) Trends Biochem. Sci. 1, 4-9, dargestellt. Für drei Typen von TFOs wird angegeben, dass sie wirksam sind: pyrimidinreiche (CT), purinreiche (GA) und gemischte (GT oder GAT). CT-TFOs binden in einem parallelen Motiv, wobei der dritte Strang die gleiche 5'-nach-3'-Orientierung hat wie der Purinstrang des Duplex. GA-TFOs binden in einem antiparallelen Motiv. Gemischte TFOs können, in Abhängigkeit von der Zielsequenz, auf beide Arten binden. Andere Eigenschaften unterscheiden sich ebenfalls zwischen den TFO-Typen. Zum Beispiel sind CT-TFOs pH-abhängig. Jeder TFO-Typ kann für die vorliegende Erfindung geeignet sein.
Es wird bevorzugt, dass der Abschnitt des Oligonucleotids oder des Mimetikums ungefähr 10 bis 80, vorzugsweise 15 bis 40 Basen, noch bevorzugter ungefähr 20 bis 40 Basen lang ist. Oligonucleotide mit weniger als 20 Basen können eine schwächere und/oder weniger spezifische Bindung zeigen, aber sie können trotzdem für die Durchführung der Erfindung nützlich sein, zum Beispiel weil nur eine transiente Bindung erforderlich ist, wie oben angemerkt wurde.
Unter „DNA" oder „Oligo(desoxy)nucleotid" verstehen wir ein Molekül mit einem Zucker-verknüpfung-Zucker-Rückgrat, wobei der Zuckerrest eine 2'-Desoxyribose umfasst (und deshalb schließt es eine DNA-Kette ein, die von einem Nucleosid mit einer 2',3'-Didesoxyriboseeinheit terminiert ist), und wobei am Zuckerrest in der Position 1 eine Base wie Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T), Inosin (I), Uracil (U) und dergleichen befestigt ist. In normaler DNA ist die Verknüpfung zwischen den Zuckerresten (die „Zucker-Zucker-Verknüpfung") eine Phosphatgruppe, die mit den besagten Zuckerresten einen Diester bildet. Wir schließen in dem Begriff „Nucleinsäure" (und insbesondere im Begriff DNA) Moleküle mit Verknüpfungen, die nicht aus Phosphatgruppen bestehen, mit ein.
Somit sind bei uns eine Phosphorthioatverknüpfung und eine Phosphorselenoatverknüpfung mit eingeschlossen. Es kann bevorzugt sein, dass die Verknüpfungen resistenter als normale DNA gegenüber einem Angriff zellulärer Nucleasen sind. Zu derartigen Verknüpfungen können auch Methylphosphat, Phosphotriester und das α-Enantiomer natürlich vorkommender Phosphodiester gehören.
In den Begriffen „Nucleinsäure" oder „Oligonucleotid" sollen auch eingeschlossen sein: Moleküle mit unnatürlichen Basenanalogen, Moleküle, bei denen die 2'- und 3'-Positionen des Pentosezuckers unabhängig voneinander irgendeine der Gruppen -H, -OH oder -NH₂ sind, und Moleküle, bei denen ein am Phosphoratom befestigter Sauerstoff, aber keiner der Phosphodiesterverknüpfung, durch -SH, -SeH, -BH₂, -NH₂, -PH₃, -F, -Cl, -CH₃, -OCH₃, -CN oder -H ersetzt ist.
Das Oligonucleotid kann ein Oligoribonucleotid oder ein Oligodesoxyribonucleotid sein. Oligodesoxyribonucleotide werden bevorzugt, da Oligoribonucleotide empfindlicher als Oligodesoxyribonucleotide gegenüber einem enzymatischen Angriff sein können.
Das Oligonucleotid oder Analoge oder Mimetikum kann eine Peptidnucleinsäure sein, wie sie Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist und zum Beispiel in WO 99/13719 und dort aufgeführten Literaturstellen und bei Demidov & Frank-Kamenetskii (2001) oben beschrieben wird. PNAs sind Nucleinsäureanaloge mit einem Polyamid (Peptid)-Rückgrat, das 2-Aminoethylglycineinheiten anstelle des Desoxyribosephosphat-Rückgrats der DNA enthält. Das PNA-Rückgrat ist neutral (im Gegensatz zum DNA-Rückgrat, das negativ geladen ist) und kann deshalb stabiler an ein geladenes Nucleinsäuremolekül binden, als es das entsprechende DNA-Molekül könnte.
Es wird bevorzugt, dass das Oligonucleotid oder Analoge oder Mimetikum ein DNA-Oligonucleotid ist.
Die Bezugnahme auf ein Oligonucleotid schließt (wenn es passt) die Bezugnahme auf ein Oligonucleotid-Mimetikum oder -Analoges, zum Beispiel eine PNA, ein.
Das Oligonucleotid kann einen Linker umfassen, der am 5'- oder 3'-Terminus des Oligonucleotids befestigt sein kann. Beispiele für geeignete Linker werden zum Beispiel in WO 90/06934 beschrieben.
Es kann bevorzugt sein, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt eine Peptidnucleinsäure (PNA) ist oder eine solche umfasst.
Der Nucleinsäure-bindende Abschnitt kann ein beliebiger geeigneter bindender Teil, wie er definiert wurde, sein, der an eine in einem eukaryotischen Genom, wie demjenigen einer Pflanze oder eines Tieres, vorliegende Stelle bindet. Es wird besonders bevorzugt, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt in der Lage ist, an eine Stelle zu binden, die an einem ausgewählten Gen, dessen Expression durch die Gegenwart des Chromatin-inaktivierenden Abschnitts des erfindungsgemäßen Polypeptids unterdrückt werden soll, liegt oder mit ihm assoziiert ist. Es wird bevorzugt, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt selektiv an die gewünschte Stelle bindet. Es kann eine oder es können mehrere gewünschte Stelle(n) vorhanden sein, an die der Nucleinsäure-bindende Abschnitt binden kann. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Polypeptid dazu eingesetzt werden, die Expression einer Gruppe von Genen zu unterdrücken, die alle eine Bindungsstelle für einen gemeinsamen DNA-bindenden Abschnitt aufweisen (sich zum Beispiel unter der Kontrolle eines Steroidhormonrezeptors, wie des Estrogenrezeptors (ER), befinden). Die im Eukaryoten vorliegende Stelle kann, um Unklarheiten vorzubeugen, eine natürlich vorkommende Steile sein, oder sie kann eine Stelle sein, die gentechnologisch eingeführt wurde. Die Stelle muss nicht ursprünglich im gleichen oder einem beliebigen anderen Eukaryoten vorhanden gewesen sein. Zum Beispiel kann sie eine bakterielle oder virale Sequenz oder eine künstliche Sequenz sein, für die bereits TFOs charakterisiert wurden und die gentechnologisch in die DNA der eukaryotischen Zelle, zum Beispiel einer Pflanzezelle, eingeführt wurde. Beispiele können Response-Elemente wie ERE und IRE sein, wie sie hier in Beispielen beschrieben werden, oder andere charakterisierte Bindungsstellen. Es kann erwünscht sein, eine derartige Stelle in einer Zelle einzusetzen, die keinen endogenen Regulator der Stelle enthält. Alternativ kann die Stelle eine modifizierte Version eines natürlich vorkommenden Response-Elements sein, wobei diese modifizierte Version als Bindungsstelle für TFOs dienen kann, aber nicht durch einen natürlich vorkommenden Regulator des natürlich vorkommenden Response-Elements reguliert werden kann. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Stelle, an die der Nucleinsäure-bindende Abschnitt bindet, natürlicherweise in der eukaryotischen Zelle vorkommt und in ihrer natürlichen Position im Genom vorliegt.
Der Nucleinsäure-bindende Abschnitt kann ein DNA-bindender Abschnitt oder ein RNA-bindender Abschnitt sein. Somit kann der Nucleinsäure-bindende Abschnitt an eine doppelsträngige Nucleinsäure (zum Beispiel DNA) oder an eine einsträngige Nucleinsäure (zum Beispiel RNA oder einsträngige DNA) binden. Im Falle des RNA-bindenden Abschnitts ist die im eukaryotischen Genom vorliegende Stelle, die den RNA-bindenden Abschnitt bindet, typischerweise naszierende RNA, die an der für die Inaktivierung ausgewählten Stelle von der DNA transkribiert wird. Die RNA kann diejenige sein, die von dem Gen transkribiert wird, dessen Expression unterdrückt werden soll, oder sie kann diejenige sein, die von einem Gen transkribiert wird, das an das Gen, dessen Expression unterdrückt werden soll, angrenzt oder sich wenigstens in dessen Nähe befindet. Es wird bevorzugt, dass der RNA-bindende Abschnitt an eine RNA-Sequenz bindet, die sich am 5'-Ende des Transkripts oder in dessen Nähe befindet. Es dürfte klar sein, dass die naszierende RNA während der Transkription an der Stelle ihrer Transkription oder in deren Nähe bleibt, und dass, wenn sich der Ort der Transkription an dem Gen oder in der Nähe des Gens, dessen Expression unterdrückt werden soll, befindet, die Verwendung eines RNA-bindenden Abschnitts im erfindungsgemäßen Molekül die Verbringung des Chromatin-inaktivierenden Abschnitts an die gewünschte Stelle erleichtert.
Es kann nützlich sein, dass der DNA-bindende Abschnitt an die Bindungsstelle eines Transkriptionfaktors bindet, zum Beispiel so, dass die Expression von mehr als einem Gen, an das der Transkriptionsfaktor bindet, moduliert werden kann. Datenbanken, die Transkriptionsfaktoren und ihre Bindungsstellen auflisten, sind unten aufgeführt:
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFFACTOR
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFSITE
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFCELL
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFCLASS
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFMATRIX
http://www.embl-heidelberg.de/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-fun+pagelibinfo+-info+TFGENE
Es kann nützlich sein, dass der DNA-bindende Abschnitt an einen Promotorbereich oder andere regulatorische Bereiche oder Sequenzen direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle bindet. Bei einigen Anwendungen kann es bevorzugt sein, auf Sequenzen innerhalb des Gens abzuzielen, um zwischen Spleißvarianten zu differenzieren.
Wie festgestellt wurde können Oligonucleotide so entworfen/konstruiert werden, dass sie an eine bestimmte, ausgewählte Ziel-DNA-Sequenz binden, die sich an einem ausgewählten Gen befindet oder mit diesem assoziiert ist. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Oligonucleotid eines, dass so konstruiert wurde, dass es an eine Stelle bindet, die in einer mutierten Gensequenz in der Pflanzenzelle oder der tierischen Zelle vorhanden ist, aber nicht in der äquivalenten Wildtypsequenz. Zum Beispiel, und wie es detaillierter unten diskutiert wird, kann das Oligonucleotid selektiv an ein dominant negatives, mutiertes Gen, wie ein mutiertes Onkogen, binden, und es nach der Bindung zur DNA-Methylierung oder Chromatin-Inaktivierung und zur Unterdrückung der Expression des mutierten Onkogens kommen. Beispiele für Onkogene, die beim Krebs des Menschen mutiert sind, sind RAS (H-ras) und Bcl-10.
Im typischen Fall sind der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitt fusioniert. Der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitt können als ein einziges Molekül synthetisiert werden (Totalsynthese-Ansatz), zum Beispiel durch den aufeinanderfolgenden Zusammenbau des Peptids und dann des Oligonucleotids auf einem festen Träger, wie es zum Beispiel bei Soukchareun et al. (1998), oben, und darin zitierten Literaturstellen oder bei Basu et al. (1995) Tetrahedron Lett 36, 4943 beschrieben wird. Vorzugsweise wird ein automatisches Verfahren eingesetzt.
Alternativ werden der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitt mittels Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, getrennt synthetisiert und dann verbunden. Zu Techniken, die für die Kopplung von Peptidnucleinsäuren an Peptide geeignet sind, gehört die Verwendung heterobifunktioneller Konjugationsreagenzien wie SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) und SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexencarboxylat), und sie werden zum Beispiel in WO 99/13719 beschrieben, insbesondere in den Beispielen 12 bis 15. Zu Techniken, die für die Kopplung von Oligodesoxynucleotiden an Peptide geeignet sind, gehört die Verwendung von mit N^α-Fmoc-Cystein(S-thiobutyl) derivatisierten Oligodesoxynucleotiden, wie es bei Soukchareun et al. (1998), oben, beschrieben wird. Zu weiteren Techniken gehört der Einsatz einer Aktivierung der 3'- oder 5'-Enden von Oligonucleotidphosphaten mit N-Hydroxybenzotriazol (HOBT)-Ester vor der Kopplung eines ungeschützten Peptids über eine nucleophile Gruppe (wie eine α-NH₂-Gruppe) des Peptids (siehe Ivanovskaya et al. (1995) Nucl. Nucl. 6, 931-934, Ivanovskaya et al. (1987) Dokl. Acad. Nauk. SSSR 293, 477-481, Kuznetsova et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27, 3995-4000). Techniken zur Konjugation von Peptiden und Oligonucleotiden werden zum Beispiel in einer Übersichtsarbeit von Tung & Stein (2000) Bioconjugate Chem. 11(5), 605-618, dargestellt.
Vorzugsweise wird eine Technik einer „nativen Ligation" eingesetzt, wie sie in WO 01/15737 und bei Stetsenko & Gait (2000) Organic Chem. 65(16), 4900-4908, beschrieben wird. Ein N-terminal Thioester-funktionalisiertes Peptid wird mit einem 5'-Cysteinyl-Oligonucleotidderivat ligiert.
Zweckmäßigerweise werden der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der Repressorabschnitt, der modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitt so verbunden, dass beide Abschnitte ihre jeweiligen Aktivitäten beibehalten, sodass zum Beispiel der Nucleinsäure-bindende Abschnitt an eine Stelle, die in einem Pflanzengenom oder einem tierischen Genom vorliegt, binden kann und nach der Bindung der modifizierende Abschnitt immer noch in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren; d.h. zum Beispiel ist ein Chromatin-inaktivierender Abschnitt noch in der Lage, das Chromatin zu inaktivieren. Die beiden Abschnitte können direkt miteinander verbunden werden, aber sie können auch über ein Linkerpeptid oder -oligonucleotid verbunden werden. Geeignete Linkerpeptide sind diejenigen, die typischerweise eine Random-Coil-Konformation annehmen. Zum Beispiel kann das Polypeptid Alanin oder Prolin oder eine Mischung von Alanin- und Prolinresten enthalten. Vorzugsweise begünstigen die Aminosäuren die Löslichkeit. So kann der Linker zum Beispiel geladene oder hydrophile Aminosäuren, wie Asparaginsäurereste, enthalten. Vorzugsweise kann der Linker Asparaginsäurereste enthalten oder aus ihnen bestehen. Es wird bevorzugt, dass die Aminosäuren keine hydrophoben Aminosäuren, wie Phenylalanin oder Tryptophan, sind. Vorzugsweise enthält der Linker zwischen 10 und 100, bevorzugter zwischen 10 und 50 und noch bevorzugter zwischen 10 und 20 Aminosäurereste. Ein kürzerer Linker, zum Beispiel aus 3 bis 9 Aminosäuren, kann ebenfalls nützlich sein. Auf jeden Fall ist das Molekül unabhängig davon, ob sich ein Linker zwischen den Molekülabschnitten befindet oder nicht, in der Lage, seine Zielnucleinsäure zu binden, und es ist in der Lage, die Expression zu reprimieren oder die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren, zum Beispiel das Chromatin zu inaktivieren und dadurch die Genexpression selektiv zu unterdrücken oder zu inaktivieren.
Polynucleotide, die für geeignete Repressorabschnitte, modifizierende oder Chromatin-inaktivierende Abschnitte codieren, sind in diesem Gebiet bekannt oder können ohne weiteres aus bekannten Sequenzen konstruiert und erzeugt werden. Polynucleotidsequenzen, die für verschiedene geeignete Chromatin-inaktivierende Abschnitte codieren, werden in den Literaturstellen oben angegeben, die auf die Polypeptide Bezug nehmen, oder sind von GenBank oder EMBL oder dbEST verfügbar. Eine Literaturstelle für PLZF ist Chen et al. (1993) EMBO J. 12, 1161-1167. Eine Literaturstelle für E7 ist Tommasino et al. (1995) Bioessays 17, 509-518. Literaturstellen für SAP18, MAD1 und Rb sind Zhang et al. (1997) Cell 89, 357-364, Ayer et al. (1993) Cell 72, 211-222 bzw. Weinberg (1995) Cell 81, 323-330.
Polynucleotide, die für geeignete Linkerpeptide codieren, können ohne weiteres aus Linkerpeptidsequenzen konstruiert und hergestellt werden.
Somit können Polynucleotide, die für den Repressorabschnitt oder den modifizierenden Abschnitt der erfindungsgemäßen Moleküle codieren, ohne weiteres mittels gut bekannter gentechnologischer Techniken konstruiert werden. Die Repressorabschnitte oder modifizierenden Abschnitte können deshalb über eine Expression mit molekularbiologischen Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden. Es kann jedoch bevorzugt sein, den bzw. die Polypeptid/Analog/Mimetikum-Abschnitt(e) der erfindungsgemäßen Moleküle mit Techniken der organischen Chemie, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten und hier diskutierten, zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine mit einem erfindungsgemäßen Molekül transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen, und typischerweise handelt es sich um einen E.-coli-Stamm, wie die E.-coli-Stämme DH5, die von Bethesda Research Laborstories Inc., Bethesda, Maryland, USA, bezogen werden können, und RR1, der von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA (ATCC Nr. 31343) bezogen werden kann. Zu bevorzugten eukaryotischen Wirtszellen gehören Pflanzen-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie diejenigen einer Fibroblasten-Zelllinie der Maus, der Ratte, des Affen oder des Menschen und Nierenzelllinien. Zu Hefe-Wirtszellen gehören YPH499, YPH500 und YPH501, die alle von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, bezogen werden können. Zu bevorzugten Säugetier-Wirtszellen gehören Chinese hamster ovary (CHO)-Zellen, die von der ATCC als CCL61 bezogen werden können, die NIH Swiss mouse embryo-Zellen NIH/3T3, die von der ATCC als CRL1658 bezogen werden können, die von Affennierenzellen abstammenden COS-1-Zellen, die von der ATCC als CRL 1650 bezogen werden können, 293-Zellen, bei denen es sich um humane embryonale Nierenzellen handelt, und humane HT1080-Fibrosarkomzellen.
Protoplasten für die Transformation werden typischerweise bei Bedarf mittels auf diesem Gebiet bekannter Verfahren erzeugt. Planzenzelllinien sind nicht allgemein verfügbar. Eine häufig verwendete Zelllinie ist jedoch die Tabakzelllinie Bright Yellow 2 (BY2, Mu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 357-362).
Die Transformation geeigneter Zellwirte mit einem erfindungsgemäßen Molekül wird mittels gut bekannter Verfahren durchgeführt, die typischerweise vom verwendeten Molekültyp abhängig sind. Bezüglich der Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe zum Beispiel Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York. Die Transformation von Hefezellen wird bei Sherman et al. (1986) Methods in Yeast Genetics, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben. Das Verfahren von Beggs (1978) Nature 275, 104-109 ist ebenfalls nützlich. Bezüglich Wirbeltierzellen können Reagenzien, die für die Transfektion derartiger Zellen nützlich sind, zum Beispiel Calciumphosphat und DEAE-Dextran oder Liposomenformulierungen, von Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA, bezogen werden. Bezüglich Pflanzenzellen und ganzen Pflanzen können die folgenden Ansätze (J. Draper und R. Scott in D. Grierson (Hrsg.), „Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow und London, 1991, Band 1, S. 38-81) zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden:

i) DNA-vermittelter Gentransfer über die Polyethylenglycol-stimulierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, eine Elektroporation oder eine Mikroinjektion in Protoplasten oder Pflanzenzellen (J. Draper, R. Scott, A. Kumar und G. Dury, ebenda, S. 161-198). Der direkte Gentransfer in Protoplasten wird auch bei Neuhaus & Spangenberg (1990) Physiol. Plant 79, 213-217, Gad et al. (1990) Physiol. Plant 79, 177-183 und Mathur & Koncz (1998) Method. Mol. Biol. 82, 267-276 beschrieben.
ii) Transformation durch Teilchenbeschuss (D. McCabe und P. Christou, Plant Cell Tiss. Org. Cult. 3, 227-236 (1993), P. Christou, Plant J. 3, 275-281 (1992)).

Zu bevorzugten Techniken gehören eine Elektroporation, eine Mikroinjektion und Liposomenformulierungen.
Einige Spezies sind einer direkten Transformation zugänglich, was eine Gewebe- oder Zellkultur überflüssig macht (Bechtold et al. (1993) Life Sciences, C. R. Acad. Sci. Paris 316, 1194-1199).
Bei allen Ansätzen wird ein geeigneter Selektionsmarker, wie eine Kanamycin- oder Herbizidresistenz, oder alternativ ein Markergen („Reporter"), auf das gescreent werden kann, wie das der β-Glucuronidase oder der Luciferase, bevorzugt (siehe J. Draper und R. Scott in D. Grierson (Hrsg.), „Plant Genetic Engineering", Blackie, Glasgow und London, 1991, Band 1, S. 38-81).
Die Elektroporation ist ebenfalls für die Transformation und/oder Transfektion von Zellen nützlich, und sie ist auf diesem Gebiet für das Transformieren von Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen, Wirbeltierzellen und bestimmten Pflanzenzellen (z. B. Zellen der Gerste, siehe Lazzeri (1995) Methods Mol. Biol. 49, 95-106) gut bekannt.
Beispielsweise können viele Bakterienspezies mittels der bei Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 beschriebenen Verfahren transformiert werden, wobei diese Literaturstelle hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird. Die größte Zahl an Transformanten wird regelmäßig nach der Elektroporation der in 2,5 × PEB suspendierten Mischung aus DNA und Zellen unter Einsatz von 6250 V pro cm bei 25 μFD erhalten.
Verfahren zur Transformation von Hefe durch eine Elektroporation werden bei Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182 offenbart.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes Molekül enthalten, können mittels gut bekannter Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel können markierte Oligos und/oder GFP-Marker eingesetzt werden.
Somit zieht die vorliegende Erfindung, zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen als solchen, auch eine Kultur dieser Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur abstammt, in einem Nährmedium in Betracht.
Bezüglich Pflanzen stellt man sich vor, dass die Erfindung einzelne, aus Suspensionskulturen stammende Zellen, isolierte Protoplasten oder stabil transformierte Pflanzen einschließt.
Zwar können die erfindungsgemäßen Moleküle in jede beliebige geeignete Wirtszelle eingeführt werden, aber es sollte klar sein, dass sie in erster Linie so entwickelt wurden, dass sie in geeigneten tierischen Zellen oder Pflanzenzellen wirksam sind, insbesondere denjenigen, die eine oder mehrere Stelle(n) in ihrer DNA aufweisen, an die das erfindungsgemäße Molekül binden kann.
Somit kann für die tierischen Zellen oder die Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Molekül enthalten, dessen Gegenwart die Expression eines bestimmten Gens unterdrückt, oder für die Tiere oder Pflanzen, die diese Zellen enthalten, davon ausgegangen werden, dass bei ihnen das Gen in dem Sinne „ausgeknockt" ist, dass es nicht mehr exprimiert werden kann. Es kann sein, dass die Chromatin-Inaktivierung über eine Histondeacetylierung ohne eine weitere Intervention im Wesentlichen irreversibel sein kann. Die Repression über eine Histondeacetylierung kann über die Verwendung eines Histondeacetylase-Hemmers, zum Beispiel Trichostatin A (TSA), Trapoxin oder Natriumbutyrat (NaB), rückgängig gemacht werden, wie Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist. Ähnlich kann die Methylierung ohne eine weitere Intervention, zum Beispiel durch die Verabreichung von Verbindungen, die die Methylierung hemmen/rückgängig machen, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind und zu denen die Verbindung Azacytidin gehört, im Wesentlichen irreversibel sein. Zu weiteren Methylierungshemmern gehören 5-Desoxyazacytidin oder zum Beispiel Antisense-Oligos (oder Unterdrücker der Genexpression, wie sie hier beschrieben werden), die gegen eine DNA-Methyltransferase gerichtet sind.
Es dürfte ohne weiteres klar sein, dass es die Einführung eines erfindungsgemäßen Moleküls in eine tierische Zelle oder eine Pflanzenzelle ermöglicht, das Molekül gezielt einer geeigneten Bindungsstelle in der Nucleinsäure, zum Beispiel DNA (die vom DNA-bindenden Abschnitt des Polypeptids gebunden wird), zuzuführen und die Unterdrückung oder Inaktivierung oder sonstige Modulierung der Genexpression zu ermöglichen, indem sie zum Beispiel die Inaktivierung des Chromatins an der Bindungsstelle oder in Assoziation mit der angesteuerten Bindungsstelle ermöglicht. Typischerweise wird das erfindungsgemäße Molekül so ausgewählt, dass es auf ein ausgewähltes Gen abzielt. Somit enthält das Zielgen zweckmäßigerweise eine Stelle, die vom DNA-bindenden Abschnitt des mit ihm assoziierten Moleküls gebunden wird. Die so gebundene Stelle kann innerhalb des Gens selbst liegen, zum Beispiel in einem Intron oder in einem Exon des Gens, oder sie kann in einem Bereich 5' zum transkribierten Teil des Gens liegen, zum Beispiel innerhalb oder in der unmittelbaren Nähe eines Promotor- oder Enhancerbereichs, oder sie kann in einem Bereich 3' zum transkribierten Teil des Gens liegen.
Zu Genen, die vom Estrogenrezeptor (ER) reguliert werden, gehören das Gen des Progesteronrezeptors (PR) und das Gen des PS2 (des „trefoil related protein"). Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu eingesetzt werden, das PR-Gen oder das PS2-Gen zu inaktivieren, wenn der DNA-bindende Abschnitt der erfindungsgemäßen Verbindung in der Lage ist, an die ER-Bindungsstelle zu binden. Eine Antiestrogentherapie wird zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt. Das komplette Repertoire der am Brustkrebs beteiligten estrogenregulierten Gene ist derzeit unbekannt. Es wird generell angenommen, dass die Antiestrogentherapie zu einer veränderten Expression von estrogenregulierten Schlüsselgenen führt, die am Wachstum und der Transformation von Brustkrebszellen beteiligt sind. Die unten beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren könnten einen alternativen, potenziell effektiveren Weg zur Regulierung (insbesondere der Hemmung) der Expression estrogenresponsiver Gene bereitstellen. Es könnte sein, dass es für bestimmte DNA-bindende Abschnitte in einer gegebenen Pflanzenzelle oder tierischen Zelle nur eine Zielstelle gibt und die Expression nur eines Gens vom Repressorabschnitt, vom modifizierenden oder vom Chromatin-inaktivierenden Abschnitt unterdrückt oder moduliert wird. Es kann jedoch mehr als eine Zielstelle geben, und die Einführung eines erfindungsgemäßen Moleküls könnte zur Unterdrückung der Expression mehrerer Gene führen.
Die Fähigkeit zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens ist für viele Gebiete der Biologie nützlich.
Typischerweise ist, wenn das Gen, dessen Expression unterdrückt ist, eine tierische Zelle ist, die tierische Zelle eine Zelle in einem Tier, und das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einem Tier (das ein Mensch oder ein Tier, das kein Mensch ist, sein kann) eingesetzt. Beispiele für bestimmte Verwendungen in tierischen Zellen sind die allelspezifische Inaktivierung onkogener Proteine, wie des mutierten Ras und des mutierten Bcl-10, die Hemmung der vom Estrogenrezeptor regulierten Genexpression beim Brustkrebs, die Hemmung des Androgenrezeptors, die Hemmung interessierender Gene für Entwicklungsstudien, die Hemmung von Genen zur Entwicklung transgener Modelle humaner Erkrankungen, zum Beispiel von Krebs, die Aufklärung biochemischer Wege, zum Beispiel von Signalwegen, Studien zur Validierung von Targets von Arzneimitteln/Zellmodellen für Krankheiten und die Hemmung von Genen, die an der Gewebemodellierung, wie sie beim Krebs und bei der Wundheilung auftritt, beteiligt sind.
Typischerweise ist auch die pflanzliche Zelle eine Zelle in einer Pflanze, und das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Pflanze eingesetzt.
Bei einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterdrückung der Expression von Genen eingesetzt, die bezüglich ihrer sozialen oder umweltbezogenen Eigenschaften in kommerziellen genmanipulierten transgenen Pflanzen inakzeptabel oder unerwünscht sind. Zu derartigen Genen können zum Beispiel Markergene, die mit Antibiotika oder Herbiziden selektiert werden können, gehören. Bei dieser Ausführungsform wird das Gen in der transgenen Pflanze für eine Stilllegung angesteuert.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine neuartige Pflanzenarchitektur oder Pflanzenmorphologie durch das Zielen auf bestimmte bekannte homöotische Gene, die an diesen Entwicklungswegen beteiligt sind, erzielt werden.
Zweckmäßigerweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterdrücken oder Inaktivierung der Expression eines Gens eingesetzt, dessen Expression unterdrückt oder inaktiviert werden soll. Zu derartigen Genen gehören Onkogene und virale Gene, einschließlich von Genen, die in proviralen Genomen vorhanden sind, und somit könnte das Verfahren in Bezug auf Tiere ein medizinisches Behandlungsverfahren darstellen. Onkogene können bei bestimmten Krebsformen überexprimiert sein, und es kann erwünscht sein, ihre Expression zu unterdrücken. Einige Onkogene sind aufgrund einer aktivierenden Mutation onkogen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren kann die selektive Unterdrückung der Expression eines mutierten Onkogens mittels eines DNA-bindenden Abschnitts erzielt werden, der selektiv an die Sequenz des mutierten Onkogens bindet, wobei der Repressorabschnitt oder modifizierende Abschnitt, zum Beispiel ein Chromatin-inaktivierender Abschnitt, die Expression des mutierten Onkogens unterdrückt, zum Beispiel durch das Inaktivieren des Chromatins, in dem das Onkogen gelegen ist oder mit dem es assoziiert ist. Die Unterdrückung der Überexpression eines Onkogens oder der Expression eines mutierten (insbesondere aktivierten) Onkogens ist im Allgemeinen bei der Behandlung von Krebsformen erwünscht, bei denen die Onkogene eine Rolle spielen. Zu mutierten Onkogenen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren abzielen kann, gehören Ras und Bcl-10. Diese können gezielt von DNA-bindenden Abschnitten angesteuert werden, die in der Lage sind, die mutierten Gene auf sequenzspezifische Weise zu erkennen.
Die Expression viraler Gene in einer tierischen Zelle oder in einer Pflanzenzelle ist im Allgemeinen unerwünscht, da diese Expression häufig mit einer Pathogenese assoziiert ist. Die Nucleinsäure bestimmter Viren kann in das Chromatin inkorporiert werden, und die Expression derartiger viraler Gene kann durch die Modifizierung dieses Chromatins gesteuert werden. Zum Beispiel werden retrovirale Proviren (d. h. DNA-Kopien retroviraler RNAs) häufig in tierische und pflanzliche Genome inkorporiert, wo sie ein Teil des Chromatins werden, zum Beispiel das integrierte HTV-Provirus und das integrierte humane Papillomvirus. Gypsy- und Copia-artige Retrotransposons sind offenbar im Pflanzenreich weit verbreitet. Copia-artige Retrotransposons, oder wenigstens ihre Domänen der reversen Transkriptase, sind offenbar in höheren Pflanzen weit verbreitet, während die Gypsy-artigen Elemente (die ihre Organisation mit den Retroviren teilen, denen aber die retroviralen Hülldomänen fehlen) weniger häufig sind (Suoniemi et al. (1998) Plant J. 13, 699-705). Die Integration viraler DNA in das Pflanzengenom wurde für die Integration geminiviraler DNA in das nukleäre Genom des Tabaks demonstriert (Bejarano et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 759-764). Potenzielle Retroviren sind kürzlich auch für Pflanzen beschrieben worden (Wright & Voytus (1998) Genetics 149, 703-715). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die selektive Unterdrückung der Expression eines viralen Gens erreicht werden. Die Nucleinsäure-bindende Domäne des Oligonucleotids/Mimetikums/Analogen kann zur gezielten Zuführung eines Repressorabschnitts oder eines modifizierenden, zum Beispiel Chromatin-inaktivierenden, Abschnitts eingesetzt werden und zur Inaktivierung des proviralen Genoms führen, indem sie an naszierende genomische RNA-Transkripte bindet, wodurch sie über ihre räumliche Nähe (zum Beispiel) eine Histondeacetylierung bewirkt.
Bestimmte genetische Erkrankungen, wie die Achondroplasie, werden durch dominante Mutationen verursacht. Die Unterdrückung der Expression des mutierten Allels kann für die Behandlung dieser Krankheiten nützlich sein. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahren kann die selektive Unterdrückung der Expression des mutierten Allels mittels eines DNA-bindenden Abschnitts erreicht werden, der selektiv an die Sequenz des mutierten Allels bindet, wobei (zum Beispiel) der Chromatin-inaktivierende Abschnitt das Chromatin inaktiviert, in dem das mutierte Allel gelegen ist oder mit dem es assoziiert ist, sodass die Expression des mutierten Allels unterdrückt wird.
Diese erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten typischerweise den Transfer des erfindungsgemäßen Moleküls in eine tierische Zelle oder eine Pflanzenzelle.
Transfersysteme, die für Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Peptid-Fusionen nützlich sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und können für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein, bei denen das erfindungsgemäße Molekül in eine Zelle entweder innerhalb oder außerhalb des Körpers eines Tiers eingeführt wird. Zum Beispiel können Verfahren auf der Basis von Liposomen oder Viren eingesetzt werden. Es können eine Elektroporation (siehe zum Beispiel Kuznetsova et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27(20), 3995-4000), ballistische Verfahren, kationische Lipide (wie sie zum Beispiel bei Felgner et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 511-512 oder in WO 99/13719 beschrieben werden) oder spezifische, an dem Oligonucleotid- oder Polypeptid-Abschnitt des Moleküls oder am Träger befestigte Liganden eingesetzt werden, wie es zum Beispiel in WO 99/13719 beschrieben wird.
Es können virale oder nicht-virale Transferverfahren eingesetzt werden. Verschiedene Viren sind als Gentransfervektoren verwendet worden, einschließlich von Papovaviren wie SV40 (Madzak et al. (1992) J. Gen. Virol. 73, 1533-1536), des Adenovirus (Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 39-61, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6, 616-629, Gorziglia und Kapikian (1992) J. Virol. 66, 4407-4412, Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2581-2584, Rosenfeld et al. (1992) Cell 68, 143-155, Wilkinson et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 2233-2239, Stratford-Perricaudet et al. (1990) Hum. Gene Ther. 1, 241-256), des Vacciniavirus (Moss (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 25-38), des adenoassoziierten Virus (Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-123, Ohi et al. (1990) Gene 89, 279-282), von Herpesviren einschließlich des HSV und des EBV (Margolskee (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 67-90, Johnson et al. (1992) J. Virol. 66, 2952-2965, Fink et al. (1992) Hum. Gene Ther. 3, 11-19, Breakfield und Geller (1987) Mol. Neurobiol. 1, 337-371, Freese et al. (1990) Biochem. Pharmacol. 40, 2189-2199) und von Retroviren von Vögeln (Brandyopadhyay und Temin (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 749-754, Petropoulos et al. (1992) J. Virol. 66, 3391-3397), der Maus (Miller (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1-24, Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 431-437, Sorge et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1730-1737, Mann und Baltimore (1985) J. Virol. 54, 401-407, Miller et al. (1988) J. Virol. 62, 4337-4345) und des Menschen (Shimada et al. (1991) J. Clin. Invest. 88, 1043-1047, Helseth et al. (1990) J. Virol. 64, 2416-2420, Page et al. (1990) J. Virol. 64, 5370-5276, Buchschacher und Panganiban (1992) J. Virol. 66, 2731-2739). Bis jetzt basierten die meisten Protokolle der humanen Gentherapie auf inaktivierten Retroviren der Maus.
Zu nicht-viralen Verfahren eines Gentransfers, die auf diesem Gebiet bekannt sind, gehören chemische Techniken wie die Calciumphosphat-Kopräzipitation (Graham und van der Eb (1973) Virology 52, 456-467, Pellicer et al. (1980) Science 209, 1414-1422), mechanische Techniken, zum Beispiel die Mikroinjektion (Anderson et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5399-5403, Gordon et al., 1980, Brinster et al. (1981) Cell 27, 223-231, Constantini und Lacy (1981) Nature 294, 92-94), ein durch eine Membranfusion vermittelter Transfer über Liposomen (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417, Wang und Huang (1989) Biochemistry 28, 9508-9514, Kaneda et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 12126-12129, Stewart et al. (1992) Hum. Gene Ther. 3, 267-275, Nabel et al., 1990, Lim et al. (1992) Circulation 83, 2007-2011) und eine direkte DNA-Aufnahme und ein rezeptorvermittelter DNA-Transfer (Wolff et al. (1990) Science 247, 1465-1468, Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14338-14342, Zenke et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659, Wu et al., 1989b, Wolff et al. (1991) BioTechniques 11, 474-485, Wagner et al., 1990, Wagner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259, Cotten et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037, Curiel et al. (1991a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850-8854, Curiel et al. (1991b) Hum. Gene Ther. 3, 147-154). Ein virusvermittelter Gentransfer kann mit einem direkten In-vivo-Gentransfer über eine Zufuhr mit Liposomen kombiniert werden, was es einem ermöglicht, die viralen Vektoren zu den Tumorzellen und nicht in die umgebenden, sich nicht teilenden Zellen zu lenken.
Zu anderen geeigneten Systemen gehören das von Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15, 866-870 beschriebene retroviral-adenovirale Hybridsystem oder virale Systeme mit Targeting-Liganden wie z.B. geeigneten einkettigen Fv-Fragmenten.
In einem Ansatz, der biologische und physikalische Verfahren des Gentransfers kombiniert, wird Plasmid-DNA (oder, zum Beispiel, eine Oligonucleotid/Peptid-Fusion) beliebiger Größe mit einem Polylysin-konjugierten Antikörper, der für das Hexonprotein des Adenovirus spezifisch ist, kombiniert, und der resultierende Komplex wird an einen Adenovirusvektor gebunden. Der trimolekulare Komplex wird dann zur Infektion der Zellen eingesetzt.
Der Adenovirusvektor ermöglicht eine effiziente Bindung und Internalisierung und einen effizienten Abbau des Endosoms, ehe die angekoppelte DNA geschädigt wird.
Ebbinghaus et al. (1996) Gene Ther. 3(4), 287-297 beschreiben Verfahren, über die TFOs mit Hilfe von Adenovirus-Polylysin-Komplexen Zellen zugeführt werden können. Pichon et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(2) beschreiben Verfahren, durch die die Aufnahme, die Abgabe ins Zytosol und die Akkumulation von Oligonucleotiden im Kern durch die Verwendung histidylierter Oligolysine verbessert werden kann.
Für Liposomen/DNA-Komplexe wurde gezeigt, dass sie in der Lage sind, einen direkten Gentransfer in vivo zu vermitteln. Während bei Standardpräparationen von Liposomen der Prozess des Gentransfers unspezifisch ist, wurde eine lokal begrenzte In-vivo-Aufnahme und -Expression für Tumoren berichtet, zum Beispiel nach einer direkten In-situ-Verabreichung (Nabel (1992) Hum. Gene Ther. 3, 399-410).
Techniken des Gentransfers, die das Molekül gezielt direkt einer Zielzelle oder einem Zielgewebe zuführen, werden bevorzugt. Ein rezeptorvermittelter Gentransfer wird zum Beispiel über die Konjugation von DNA mit einem Proteinliganden über Polylysin erreicht. Die Liganden werden auf der Basis des Vorkommens des entsprechenden Rezeptors für den Liganden auf der Zelloberfläche der Zielzelle/des Gewebetyps ausgewählt. Diese Ligand-DNA-Konjugate können, wenn es gewünscht ist, direkt in das Blut injiziert werden, und sie werden in das Zielgewebe gelenkt, wo es zur Bindung an den Rezeptor und zur Internalisierung des DNA-Protein-Komplexes kommt. Zur Überwindung des Problems der intrazellulären Zerstörung der DNA kann eine Koinfektion mit einem Adenovirus zur Aufhebung der Endosomenfunktion durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird das Verfahren zur Unterdrückung oder Modulation der Expression eines ausgewählten Gens zur Unterdrückung (oder Modulation) der Expression eines Gens in einer humanen Zelle eingesetzt. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich die humane Zelle im Körper eines Menschen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch die Modifizierung tierischer Zellen (einschließlich humaner Zellen) außerhalb des Körpers eines Tieres (d. h. eine Ex-vivo-Behandlung der Zellen) beinhalten, und die so modifizierten Zellen können wieder in den Körper des Tieres eingeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch die Untersuchung oder Charakterisierung modifizierter Zellen in vitro beinhalten, zum Beispiel zur Identifizierung potenzieller Arzneimitteltargets oder für das Screening von Kandidatenverbindungen auf potenziell pharmazeutisch nützliche Aktivitäten oder Eigenschaften.
Durch das Obengesagte dürfte klar geworden sein, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterdrückung der Aktivität einer Vielzahl ausgewählter Gene nützlich sein kann. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterdrückung der Aktivität einer Gruppe von Genen eingesetzt werden, deren Expression, wenigstens größtenteils, von einem einzigen Transkriptionsfaktor gesteuert wird. Zum Beispiel kann das Verfahren zur Unterdrückung estrogenregulierter Gene eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Moleküle und die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Analyse der Rolle von Genen bei, unter anderem, der Blütenentwicklung, der Kälteregulation/adaptation und von Reaktionen von Pflanzen auf Ethylen oder Pathogene bezüglich dieser Entwicklungsprozesse und anderer Prozesses eingesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Moleküls bei der Herstellung eines Mittels zur Unterdrückung (oder Modulation) der Expression des ausgewählten Gens in einer (vorzugsweise eukaryotischen) Zelle bereit. Es wird bevorzugt, dass das ausgewählte Gen ein endogenes Gen ist. Es gelten auch andere, oben bezüglich früherer Aspekte der Erfindung angegebene Präferenzen.
Es dürfte klar sein, dass es besonders bevorzugt wird, dass das Molekül bei der Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung (oder Modulation) der Expression eines ausgewählten Gens in einem Tier verwendet wird. In dem Begriff „Tier" soll, um Unklarheiten vorzubeugen, auch der Mensch mit eingeschlossen sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit, bei dem die Expression eines ausgewählten Gens unterdrückt (oder moduliert) werden soll, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Moleküls an den Patienten umfasst.
Es dürfte klar sein, dass die Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens nützlich ist, wenn die Expression oder Überexpression des ausgewählten Gens unerwünscht ist und zu einer Krankheit des Patienten beiträgt. Ein Beispiel für die unerwünschte Expression eines Gens ist die Expression bestimmter aktivierter Onkogene beim Krebs. Eine gesteigerte Expression des ausgewählten Gens kann nützlich sein, wenn eine fehlende oder unzureichende Expression des ausgewählten Gens unerwünscht ist und zu einer Krankheit des Patienten beiträgt. Zum Beispiel kann die unzureichende Expression eines Tumorsuppressorgens zum Krebs beitragen. Dementsprechend kann es nützlich sein, die Expression des Tumorsuppressorgens zu erhöhen.
Die Unterdrückung der Expression der durch den ER hochregulierten Gene ist bei der Behandlung des Brustkrebses erwünscht. Ähnlich ist die Unterdrückung der Expression der durch den Androgenrezeptor (AR) regulierten Gene bei der Behandlung des Prostatakrebses erwünscht.
Weitere Aspekte der Erfindung stellen die Verwendung eines erfindungsgemäßen Moleküls bei der Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung (oder Modulation) der Expression eines ausgewählten Gens bei einem Patienten bereit, der einer solchen Unterdrückung (oder Modulation) bedarf.
Noch weitere Aspekte der Erfindung stellen ein erfindungsgemäßes Molekül für die Verwendung in der Medizin bereit. Dabei wird das erfindungsgemäße Molekül verpackt und für die Verwendung in der Medizin präsentiert.
Und noch weitere Aspekte der Erfindung stellen eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Molekül und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
In dem Begriff „pharmazeutisch annehmbar" soll enthalten sein, dass die Formulierung steril und pyrogenfrei ist. Geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannt.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele detaillierter beschrieben:
1: Schematische Darstellung von Fusionsmolekülen und der Bindung an eine Zielstelle
In A steht „1" für das Oligonucleotidmodul 1 von Beispiel 1; „2" steht für das Polypeptidmodul 2. „L" bezeichnet einen Linkerbereich. In B steht „D" für ein zusätzliches Zuführungspeptid. Die Peptide können mit einem oder mit beiden Ende(n) des Oligonucleotids verknüpft sein; zum Beispiel kann das Repressorpolypeptid/modifizierende Polypeptid mit dem einen Ende verknüpft sein und das Zuführungspeptid mit dem anderen. C repräsentiert die Situation, in der der Oligonucleotidabschnitt eine Dreifachhelix mit doppelsträngiger DNA gebildet hat und das Repressorpeptid den Sin3-HDAC-Komplex zu der Stelle rekrutiert hat.
2: Quantifizierung der mRNA des Androgenrezeptors
Die Säulen repräsentieren die Expression der mRNA in Prozent des Kontrollwertes. Jede Säule stellt die mittlere Extinktion und den Standardfehler des Mittelwertes von vier unabhängigen Polymerasekettenreaktionen dar. Es wurden die Mittelwerte der Extinktionen bestimmt.
3: Wirkung von ARP-L218 und R1881 auf die Menge der mRNA des Androgenrezeptors
RT-PCR-Analyse der mRNA des Androgenrezeptors. Nach der Färbung mit Ethidiumbromid wurde die Menge der elektrophoretisch aufgetrennten Amplicons mittels eines Bildauswertungsgeräts von Labworks in relativen Einheiten bestimmt. Die Säulen stehen für ein Experiment mit n = 1.
4: Wirkung von ARP-L218 und Cyproteronacetat auf die Menge der mRNA des Androgenrezeptors
RT-PCR-Analyse der mRNA des Androgenrezeptors. Nach der Färbung mit Ethidiumbromid wurde die Menge der elektrophoretisch aufgetrennten Amplicons mittels eines Bildauswertungsgeräts von Labworks in relativen Einheiten bestimmt. Die Säulen stehen für ein repräsentatives Experiment mit n = 1.
5: Herunterregulation eines interferonstimulierten, in das Genom inkorporierten Gens
Zellen, die EGFP unter der Kontrolle des interferonstimulierten Response-Elements (ISRE) des humanen 6-16-Gens trugen, wurden transient mit unterschiedlichen Verbindungen transfiziert. Die Zellen wurden dann einen Tag mit 300 Einheiten/ml IFN behandelt und mittels FACS bezüglich der GFP-Expression analysiert.

a) Parentale Zelllinie, keine Behandlung
b) Zellen, die das stabil transfizierte Konstrukt (C8) exprimieren, keine Behandlung
c) C8 behandelt mit Interferon (+INF)
d) C8 transfiziert mit 500 pM TFO, +INF
e) C8-spezifisches TFO 1000 pM, +INF
f) C8, GeneICE1 500 pM, +INF
g) C8, GeneICE2 500 pM, +INF
h) C8, unspezifisches Kontroll-TFO 500 pM, +INF
i) C8, unspezifisches Kontroll-TFO 1000 pM, +INF

6: Chromatin-Immunpräzipitation der DNA des Androgenrezeptors
Ein Beispiel für den Typ von Daten, die durch das Beispiel 10 generiert werden können. Die Daten zeigen die Chromatin-Immunpräzipitation parentaler MCF-7-Tet-OFF-Zellen und stabil mit PLZF-ER transfizierter Zelllinien. Man ließ die Zelllinen MCF7-TO oder MCF7 JP13 (mit PLZF-ER, einem Tetracyclin-induzierbaren Chromatin-Remodellierungsgen, das mit einem an die DNA des Progesteronrezeptors bindenden Peptid verknüpft ist) bis zu 80% Konfluenz in Phenolrot-freiem DMEM mit 5% DSS, P/S/G plus Selektionsreagenzien und Dox, in Abhängigkeit vom Bedarf, wachsen. Die Zellen wurden vor der Vernetzung mit Formaldehyd und der Sonifizierung mit E2 (10^–8 M) oder einer Ethanolkontrolle 30 Minuten bei 37 °C behandelt. Die obere Abbildung zeigt das PR-PCR-Produkt bei Verwendung mit immunpräzipitiertem Chromatin assoziierter DNA (P) oder der aus den Zellen extrahierten Gesamt-DNA (S) bei Verwendung eines Antikörpers gegen das acetylierte Histon H4. Die Zellen ohne das (MCF7-TO) oder mit dem (MCF7 JP13) PLZF-ER-Konstrukt ließ man in Gegenwart (+) oder In Abwesenheit (–) von TET wachsen. Die untere Abbildung stellt das PR-PCR-Produkt im relativen Vergleich zur Menge des PR-PCR-Produkts bei Verwendung einer mit dem Antikörper gegen das acetylierte Histon H4 immunpräzipitierten DNA dar.
7: Herunterregulierung der Sekretion des PSA-Proteins in LNCap-Zellen durch ARP-L218
Die Zellen wurden 3 Tage mit R1881 inkubiert. Die PSA-Spiegel in den Überständen wurden mittels eines ELISA gemessen. Jede Säule repräsentiert das gesamte prostataspezifische Antigen (PSA).
Beispiel 1: Konstruktion und Verwendung von Oligo-Regulatorpeptid-Fusionsmolekülen
Es wurde eine Reihe von Oligo-Peptid-Konjugaten, die als genregulatorische Moleküle nützlich sind, erzeugt. Diese bestehen aus wenigstens zwei spezifischen Abschnitten oder Modulen, nämlich einem Oligonucleotid, das in der Lage sind, eine DNA-Dreifachhelix mit einer ausgewählten doppelsträngigen Zielsequenz zu bilden (triplex forming oligonucleotide oder TFO, Modul 1), und einer separaten Peptidsequenz, die sich entweder von einem Repressor oder einem Aktivator eines Gens in der ableitet (Modul 2). Das TFO ist mit dem Repressor- oder Aktivatorpeptid fusioniert.
Als ein Beispiel wird das TFO so konstruiert, dass es einen Triplex mit dem Interferon-stimulierbaren Response-Element (ISRE) des humanen interferonstimulierten Gens (ISG) 6-16 (Porter A., et al., EMBO J. 7, 85-92, 1988) bildet. Ein Strang des ISRE ist sehr reich an Purinen, und deshalb stellt es eine Kandidatensequenz für die Bildung eines DNA-Triplex über eine Hoogsteen-Basenpaarung dar. Die Regeln für das Design potenzieller TFO sind bei Vasquez KM und Wilson JH, Trends Biochem Sci. 1, 4-9, 1998, zusammengefasst. Die Sequenz 5'-AAAGTAAAAGGGGAGAGAGGG-3' wurde als ein Oligonucleotid (Modul 1) mit einem aktivierten 5'-Ende für die chemische Kopplung an Modul-2-Peptide erzeugt. Zu den in dieser Studie untersuchten Modul-2-Peptiden gehören wenigstens eine Kopie der minimalen Transkriptionsaktivatordomäne des Transcriptional Activator Proteins des Herpes Simplex Virus VP16, zum Beispiel die Aminosäuresequenz GGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDML oder GGGPADALDDFDLDMLPADALDDPDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDML-CONH₂ (einschließlich eines GGG-Linkers) und die humane Transkriptionsrepressordomäne MAD1 (zum Beispiel die Aminosäuren XXXMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP (wobei XXX zum Beispiel ein AAA- oder DDD-Linker ist)). Die letztere ist ein Bereich, für den bekannt ist, dass er mit dem Protein Sin3a des Histondeacetylase-Komplexes interagiert. Außerdem haben wir die Verwendung der Aminosäuren XXXMAVESRVTQEEIKKEPEKPIDREKTCPLLLRVF (wobei XXX zum Beispiel ein AAA- oder DDD-Linker ist) des humanen Sap18-Proteins, für das auch bekannt ist, dass es mit dem Sin3a-Protein assoziiert ist, untersucht. Dieser Bereich entspricht einer evolutionär hoch konservierten Sequenz und überlappt mit einem Bereich, der eine Genrepression vermitteln kann. Die Modul-2-Peptide wurden in aktivierter Form synthetisiert, um die nachfolgende Kopplung an das aktivierte Modul-1-Oligonucleotid über die Chemie einer „nativen Ligation" (siehe WO 01/15737 und Stetsenko & Gait (2000) Organic Chem. 65(16), 4900-4908), bei der ein mit einem N-terminalen Thioester funktionalisiertes Peptid an ein 5'-Cysteinyl-Oligonucleotid gekoppelt wird, zu ermöglichen.
Zu den Zelllinien für die Transfektionsarbeiten gehörten COS-Zellen und die humanen Fibrosarkomzellen HT1080. Die Zellen wurden mittels eines Standard-Transfektionsverfahrens auf Liposomenbasis (oder alternativ eines anderen Zuführungsverfahren, zum Beispiel eine Elektroporation oder Mikroinjektion) mit einem ISRE-regulierten Luciferase-Reportergen zusammen mit unterschiedlichen Mengen des Oligo-Peptid-Konjugats transient transfiziert. Das ermöglicht einen Vergleich der Interferon-abhängigen Luciferaseexpression mit den vom Oligo-Peptid vermittelten genregulatorischen Wirkungen. Als Kontrollen für die Spezifität wurden Zellen auch mit entweder dem Oligonucleotid, dem Peptid oder beiden (d. h. als separate, unverknüpfte Moleküle) behandelt. Nach geeigneten Zeiten, zum Beispiel 0,5, 1, 2, 4, 8 und/oder 12 Stunden, wurden die Zellen mit IFN stimuliert, und die Aktivität des Reportergens wurde mittels eines Luminometer-basierten Assays des Luciferaseenzyms gemessen. Die Korrektur bezüglich der Transfektionseffizienz erfolgte über den Einsatz eines nicht interferonabhängigen GFP-Kontrollgens.
Es wurde die Fähigkeit der verschiedenen Oligo-Peptid-Konjugate zur Aktivierung oder Repression der Transkription auf IFN ansprechender Gene untersucht. Die Zufuhr steigender Konzentrationen des Fusionsmoleküls Oligo-MAD1 reprimiert die Reportergen-Aktivität auf konzentrationsabhängige Weise. Ähnlich reprimiert die Zufuhr des Sap18-Oligo-Fusionsmoleküls die Genaktivität. Außerdem führt die Einführung des OligoVP16 in die das Reportergen enthaltenden Zellen zu einer Aktivität des Reportergens in Abwesenheit von IFN. Nachdem das TFO (d. h. ohne eine Peptiddomäne) den Zellen zusätzlich zu einem Oligopeptid-Fusionsmolekül zugeführt worden war, war die Repression der Genaktivität geringer als die, die mit dem Fusionsmolekül allein beobachtet wurde, d. h. die Repression war derjenigen äquivalent, die mit einer niedrigeren Konzentration des Fusionsmoleküls gesehen wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Moleküle mit dem Repressorpeptid wirksamere Regulatoren der Genaktivität als das TFO ohne eine Peptiddomäne sind und das TFO mit dem Oligo-Peptid-Fusionsmolekül um die Bindung an die Zielsequenz konkurrieren kann. Das Oligo und das Peptid allein oder zusammen zugesetzt hatten keine Repressorwirkung, was die Spezifität des Oligo-Peptid-Konjugats bezüglich der Genregulation zeigt.
Dieses Beispiel demonstriert das Design und die Konstruktion aus DNA-bindenden Oligonucleotiden und funktionellen Peptiden bestehender Fusionsmoleküle und ihre Zuführung in die Zellen. Die Oligo-Peptid-Konjugate sind in der Lage, spezifische Gene anzusteuern, und die GeneICE-vermittelten Repressor-Peptidsequenzen können Gene auf spezifische, gezielte Weise reprimieren. Somit können Oligo-Peptid-Konjugate so entworfen werden, dass sie potente Regulatoren der Genaktivität sind.
Beispiel 2: Repression chromosomaler Gene durch Oligo-Regulator-Fusionsmoleküle
Fusionsmoleküle sind zur Regulation der Aktivität von Genen in der Lage, wenn diese Gene im Genom integriert sind. Fusionsmoleküle, die ein mit einem MAD1-, Sap18- oder VP16-Peptid fusioniertes DNA-bindendes Oligonucleotid (TFO) enthalten, wurden wie im Beispiel 1 beschrieben entworfen und konstruiert.
Die Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben mit ISRE-enthaltenden Reportergenen transfiziert, und Zelllinien, die diese Gene stabil exprimierten, wurden selektiert. In diesen stabilen Zelllinien ist das Gen in das Genom integriert und kann deshalb als ein endogenes Gen fungieren.
Die Fusionsmoleküle wurden den Zellen zugeführt, und es wurden Experimente wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Weiterhin wurde die Repression zu unterschiedlichen Zeiten gemessen, um den Zeitverlauf der Repressorwirkungen zu bestimmen. Die Fusionsmoleküle waren wirksamere Repressoren als die TFOs allein. Die Wirkung war auch spezifisch (zum Beispiel hatten das unfusionierte Peptid und das unfusionierte Oligonucleotid nicht die gleiche Wirkung wie die Oligo-Peptid-Fusion). Außerdem wurde die durch Fusionsmoleküle bewirkte Repression zu späteren Zeitpunkten gesehen als irgendeine Repression, die mit den TFOs allein gesehen wurde, was eine anhaltendere Wirkung nahe legte. Wieder war das Fusionsmolekül mit dem VP16-Peptid in der Lage, die Genexpression zu aktivieren.
Somit sind die im Beispiel 1 beschriebenen Fusionsmoleküle in der Lage, die Aktivität chromosomaler Gene zu regulieren. Fusionsmoleküle mit einem DNA-bindenden Oligonucleotid als Targeting-Abschnitt sind in der Lage, gezielt spezifische chromosomale Gene anzusteuern. Ein mit dem DNA-bindenden Oligonucleotid fusioniertes GeneICE-Repressorpeptid ist in der Lage, die Aktivität eines vorher festgelegten chromosomalen Gens zu reprimieren. Somit sind die beschriebenen Fusionsmoleküle potente Regulatoren der Aktivität chromosomaler Gene.
Die Regulation endogener Gene wird zum Beispiel über die Messung der Transkription des Gens (zum Beispiel mittels PCR) oder durch das Bestimmen der Menge oder der Aktivität des von ihm codierten Polypeptids gemessen. In einem Beispiel ist das Oligonucleotid auf die regulatorische Stelle des Androgenrezeptor-Gens gerichtet. Im Einzelnen hat das Oligonucleotid die Sequenz 5' gggaaaggaaaagaggggaggg 3' oder 5' gggaggggaaaggaaaagagg 3'.
In einem Beispiel wird die Prostatakrebszelllinie LnCap mit der Oligonucleotid-Peptid-Fusion, die ein MAD1- oder Sap18-Peptid umfasst, wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die transfizierten Zellen werden gegebenenfalls identifiziert und/oder isoliert (zum Beispiel unter Einsatz eines GFP-Markers und von FACS-Techniken) und bezüglich der Expression des Androgenrezeptor-Gens sowie des klassischen Prostatakrebs-Markers PSA untersucht. Zum Beispiel wurden GFP-positive, FACS-sortierte Zellen in Gegenwart oder in Abwesenheit des AR-Agonisten R1881 kultiviert. Nach 72 Stunden wurden die Kulturmedien abgenommen, und die Menge des androgenregulierten Proteins PSA wurde mit einem Immunoassay bestimmt. Die Zugabe von R1881 führte zu einer ungefähr 25-fachen Erhöhung der Spiegel an sekretiertem PSA in Kontrollzellen (ohne eine Oligonucleotid-Peptid-Fusion oder mit einer irrelevanten Oligonucleotid-Peptid-Fusion). Im Gegensatz dazu waren die PSA-Spiegel in Zellen, die mit einem Test-Oligonucleotid-Peptid transfiziert worden waren, nur ungefähr 5-fach erhöht, was eine ungefähr 5-fache Erniedrigung des PSA-Spiegels gegenüber den Kontrollzellen anzeigte. Das demonstriert die Repression eines endogenen Gens.
Alternativ wird die PCR zum Nachweis und zur Quantifizierung der Expression und um zu zeigen, dass die Oligonucleotid-Peptid-Fusionen die Expression des endogenen Androgenrezeptor-Gens sowie die androgenregulierte Genexpression reprimieren, eingesetzt. Die Androgenrezeptor (AR)-positive humane Zelllinie T47D wird mit der Test-Oligonucleotid-Peptid-Fusion (zum Beispiel mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) markiert) oder einer irrelevanten Oligonucleotid-Peptid-Fusion (die ebenfalls GFP-markiert sein kann) infiziert. Die infizierten Zellen können mittels FACS gereinigt werden, und GFP-positive Zellen können vor der Ernte und der Präparation der RNA in Gegenwart des AR-Liganden R1881 kultiviert werden. Die Expression des Androgenrezeptor-Gens sowie der androgenregulierten Gene PSA und DRG-1 und eines nicht androgenregulierten Gens, GAPDH, wurde mittels PCR bestimmt. Das demonstriert die Repression eines endogenen Gens.
Beispiel 3: Fusionsmolekül, das an eine Zielsequenz und den Histondeacetylase-Komplex bindet
Dieses Beispiel demonstriert, dass das Fusionsmolekül an eine spezifische Zielsequenz sowie an eine Komponente des Histondeacetylase-Komplexes bindet. Die ein Oligonucleotid (TFO) und ein Repressorpeptid enthaltenden Fusionsmoleküle wurden wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
Die verschiedenen Fusionsmoleküle wurden mit einem markierten Oligonucleotid inkubiert, das komplementär zu dem Oligo-Teil einer Fusion hergestellt worden war. Die gleichen Fusionsmoleküle wurden auch mit Sin3 inkubiert, das eine Komponente eines Histondeacetylierungskomplexes ist. Weiterhin wurden die Fusionen auch sowohl mit dem komplementären Oligonucleotid als auch dem Sin3-Protein inkubiert.
Die Komplexe wurden dann mittels Standardverfahren einer Band-Shift-Analyse analysiert. Die Fusionsmoleküle waren in der Lage, sowohl das markierte komplementäre Oligonucleotid als auch das Sin3-Protein zu binden, und zwar sowohl einzeln und als auch gleichzeitig. Die unspezifischen Fusionen waren nicht in der Lage, das markierte Oligo oder Sin3 zu binden, was die Spezifität der Wirkung der Repressorfusionen demonstriert.
Mann kann schlussfolgern, dass die Repressorfusionen spezifisch ihre Zielsequenzen binden können. Die Repressorfusionen sind in der Lage, Histondeacetylase-Komplexe zu rekrutieren, indem sie Proteine binden, die Teil dieses Komplexes sind, und indem sie gleichzeitig ihre Zielsequenzen binden und die Histondeacetylase-Komplexe rekrutieren, sind die beschriebenen Fusionsmoleküle sehr potente und spezifische Repressoren der Genaktivität.
Beispiel 4: Protokoll zur Targetvalidierung
Es wird die verfügbare DNA-Sequenz des interessierenden Gens (einschließlich der flankierenden Sequenz) zur Auswahl einer geeigneten Stelle für das Targeting eines Oligo/Peptids analysiert. Das Oligo/Peptid wird synthetisiert und kann vor der Verwendung in den vorgesehenen Zellen oder Tieren oder Menschen getestet werden, zum Beispiel mittels eines Reportergensystems. Das Oligo/Peptid kann eingesetzt werden oder weiter in Zellen in vitro oder in Tieren oder Menschen getestet werden.
Nachdem eine Gensequenz erhalten worden ist, beinhaltet der Prozess die folgenden Schritte:

• Das interessierende Gen (einschließlich flankierender Sequenzen, falls erforderlich) wird mittels Bioinformatik-Werkzeugen zur Datengewinnung (zum Beispiel dem Programm der Genetics Computer Group (GCG), wie es bei Perkins et al. (1998) Biochemistry 37, 11315-11322 eingesetzt wird), auf einzigartige Sequenzelemente gescannt, die sonst nirgendwo im humanen Genom vorkommen. Es wird ein auf einer Nucleinsäure basierendes DNA-bindendes Molekül, für das vorhergesagt wird, das es an die identifizierte einzigartige Sequenz bindet (zum Beispiel als ein TFO), entworfen und synthetisiert.

Das DNA-bindende Molekül ist wahrscheinlich ein Oligonucleotid, vorzugsweise mit den folgenden Merkmalen:

(a) wenigstens 16 Nucleotide lang
(b) zielt auf einen Genpromotor an oder in der Nähe der Stelle der Initiation der Transkription des Gens ab.

Es wird bevorzugt, dass die Zielstelle für die Bindung an ein TFO in einem Strang reich an Purinen ist.
Das TFO kann reich an Pyrimidinen (vorwiegend C oder T), reich an Purinen (vorwiegend G oder A) oder gemischt (vorwiegend G oder T, oder G, A oder T) sein. Für CT-TFOs wird angenommen, dass sie in einem parallelen Motiv binden, bei dem der dritte Strang (TFO) die gleiche 5'-nach-3'-Orientierung hat wie der Purinstrang des Duplex. Für GA-TFOs wird angenommen, dass sie in einem antiparallelen Motiv binden, bei dem das TFO entgegengesetzt zum Purinstrang orientiert ist. Gemischte TFOs können in einem parallelen oder einem antiparallelen Motiv binden, in Abhängigkeit von der Zielsequenz. Die Basenpaarung entsteht aus der Bildung von Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen in parallelen Triplexen (T:AT, C⁺:GC und G:GC) und von reversen Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen in antiparallelen Triplexen (G:GC, A:AT und T:AT).
Es ist vorgesehen, dass das Oligonucleotid ein DNA-Oligonucleotid ist, möglicherweise mit stabilisierenden chemischen Modifikationen. Es können alternative Basen, zum Beispiel N⁶-Methyl-8-oxo-2-desoxyadenin anstelle von Cytosin, 2-Desoxy-6-thioguanin anstelle von Guanin oder 7-Deaza-2-desoxyxanthin anstelle von Thymin, verwendet werden.

• Das Repressorpeptid oder die Repressorpeptide kann bzw. können in größerer Menge mittels eines Gerätes zur Peptidsynthese erzeugt und bis zur Verwendung eingefroren werden.
• Das Konstrukt aus dem Repressorpeptid und dem DNA-bindenden Molekül wird präpariert und gereinigt. Es kann die in WO 01/15737 beschriebene Chemie eingesetzt werden. Kits können von Link Technologies bezogen werden.
• Das Konstrukt kann mit Hilfe der Massenspektrometrie und/oder über den Einsatz markierter komplementärer Oligonucleotid- oder markierter Antikörpereinheiten (z. B. unter Verwendung fluoreszierender oder chemilumineszierender Markierungen oder von Enzymmarkierungen) einer Qualitätskontrolle unterzogen werden. Typischerweise wird bei einem derartigen Verfahren das Konstrukt auf einen festen Träger gegeben, auf dem ein Antikörper, der den Peptidabschnitt des Konstrukts bindet, immobilisiert ist, und ein markiertes Oligonucleotid, das den Oligonucleotidabschnitt des Konstrukts bindet, wird zugegeben. Bei diesem Verfahren zeigt der Nachweis der an den festen Träger gebundenen Markierung, dass das Konstrukt intakt ist. Bei einem anderen typischen Format kann das Oligonucleotid an einem festen Träger befestigt sein und der Antikörper markiert sein.
• Es kann ein Reportergenkonstrukt für das interessierende Gen präpariert werden (auch wenn das nicht generell erforderlich ist).
• Das DNA-bindende Kandidaten-Oligonucleotid oder -Oligo/Peptid kann bezüglich der folgenden Eigenschaften getestet werden:
– Bindungsaffinität für die Zielsequenz
– Spezifität der Bindung durch Untersuchung mittels eines das ganze Genom abdeckenden DNA-Chips.
• Das Oligo/Peptid kann mittels des Reportergensystems auf seine Effektivität getestet werden.

Das Oligo/Peptid kann dann zur Modulation oder Unterdrückung der Expression des interessierenden Gens in der interessierenden Zelle oder dem interessierenden Tier eingesetzt werden.
Beispiel 5: Targetvalidierung
Die Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle werden zur Validierung von Arzneimitteltargets eingesetzt werden. Das wird beinhalten:

• Durchführen des im Beispiel 1 dargelegten Protokolls.
• Einführen des Konstrukts in Zellen oder Gewebe. Diese können normale oder erkrankte Gewebe, Zelllinien oder primäre Zellen sein, die für die Untersuchung des interessierenden Moleküls geeignet sind.
• Analyse des Phänotyps mittels eines beliebigen Verfahrens zur Expressionsanalyse; oder eine beliebige funktionelle Analyse, wie die Untersuchung der Zellbeweglichkeit, des Zellwachstums oder eine Apoptoseanalyse.
• Vergleich mit eventuell verfügbaren Daten bezüglich einer bestimmten Krankheit und Analyse der gewünschten Wirkungen, wie des Zelltodes oder der Zellbeweglichkeit.

Die erhaltenen Daten werden zur Validierung vorher festgelegter Arzneimitteltargets für Programme zur Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden.
Beispiel 6: Beispiel für die Behandlung eines Patienten
Es wird eine Oligo/Peptid-Fusion wie beschrieben erzeugt, die auf androgen- oder estrogenregulierte Gene abzielt. Die Fusionsmoleküle werden in einer sterilen Umgebung hergestellt und zu Liposomen formuliert. Die die Fusion enthaltenden Liposomen werden gezielt in der Nachbarschaft der Brust oder der Prostata eingesetzt. Die Liposomen werden von Krebszellen aufgenommen, und die vom Androgen- oder Estrogenrezeptor vermittelte Transkription wird selektiv in den betreffenden Zellen unterdrückt.
Beispiel 7: Screen zur Targetidentifizierung
Die Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle werden zur Identifizierung von Arzneimitteltargets eingesetzt werden. Das wird beinhalten:

• Präparation eines Fusionsmoleküls, wie es im Beispiel 1 dargelegt wurde.
• Einführen des Fusionsmoleküls in die Zellen oder Gewebe. Diese können normale oder erkrankte Gewebe, Zelllinien oder primäre Zellen sein.
• Analyse des aus dem Abschalten der Gene resultierenden Profils der Genexpression mit Hilfe von DNA-Arrays. Sie zeigt die Wirkung des Konstrukts auf die gesamte Genexpression in dem Modell.
• Analyse des Phänotyps mittels beliebiger Verfahren zur Expressionsanalyse oder eine beliebige funktionelle Analyse, wie die Untersuchung der Zellbeweglichkeit, des Zellwachstums oder eine Apoptoseanalyse.

Die erhaltenen Daten werden zur Identifizierung potentieller Arzneimitteltargets für Krankheiten wie Brust- oder Prostatakrebs verwendet werden. Diese Targets können ferner mittels geeigneter Verfahren, einschließlich weiterer ähnlicher Screens, In-vitro-Verfahren und Zell- und Tiermodelle, validiert werden.
Beispiel 8: Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle, die auf den Androgenrezeptor abzielen
Wie im Beispiel 2 diskutiert wurde, sind Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle zur Regulation der Genaktivität in der Lage, wenn die Gene in das Genom integriert sind. In diesem Beispiel präsentieren wir weitere experimentelle Daten, die das unterstützen.
Wir konstruierten Fusionen zwischen einem DNA-bindenden Oligonucleotid (TFO), das auf die Promotorsequenz des Gens des Androgenrezeptors (ARP) abzielt, und einem Peptid, das eine Sequenz des MAD1-Repressors von 14 oder 29 Aminosäuren, die mit einer Penetratinsequenz von 16 Aminosäuren verknüpft ist, enthält.
Die in diesem Beispiel eingesetzte Sequenz des ARP-TFO war die folgende:
ARP TFO: (5') GFGUGGTGFGGTTGTGTT (3')

U: = 5-Fluordesoxyuracil
F: = 2'-Desoxy-6-thioguanin

TFOs werden für die Konjugation am 5'-Ende modifiziert, wie es von Gait et al. (2000) J. Org. Chem. 65, 4900-4908 beschrieben wurde, und am 3'-Ende mit einer Standard Amino-Verknüpfung, um sie vor einem Abbau zu schützen.
Die Oligonucleotidsequenz wird so gewählt, dass sie einen Triplex mit der Promotorsequenz des Androgenrezeptors bildet.
Das TFO wurde mit zwei verschiedenen Peptidfragmenten fusioniert. Die in diesem Beispiel eingesetzten Peptidfragmente waren die folgenden:
L217: HHHHHH-Penetratin-DDD-14aaMAD
(Link)HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKDDDMNIAMLLEAADYLE(Amid)
L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratin
(Link)HHHHHHMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDRQIKIWFQNRRMKWKK(Amid)
Die Peptidsequenzen von 14 und 29 Aminosäuren stammen aus der Transkriptionsrepressordomäne des MAD1-Proteins, einem Bereich, von dem bekannt ist, dass er mit dem Protein Sin3 eines Histondeacetylase-Komplexes interagiert.
Die drei Asparaginsäurereste (DDD) sind eine Linkersequenz, während die Sequenz des Penetratin-Peptids eine effiziente Translokation des Oligo/Peptid-Fusionsmoleküls zur Plasmamembran vermittelt.
Die HIS-Reste wurden zur Bereitstellung weiterer Optionen für die Aufreinigung angefügt.
Die Experimente wurden mit der humanen Prostatatumorzelllinie LNCap (Lymph Node Prostate Carcinoma) durchgeführt. Die LNCap-Zellen wurden von der European Collection of Cell Cultures, Zugangsnummer B9110211, bezogen. Die Kulturen wurden im Hause gezüchtet und vermehrt und als Monolayer in Einmalartikeln für die Gewebekultur eingesetzt. Am Tage der Testung wurde für die Zellen gefunden, dass sie eine einwandfreie Zellintegrität aufwiesen und deshalb für den Einsatz in dieser Untersuchung annehmbar waren.
Die Einführung der Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle in die LnCAP-Zellen und in die Kerne wurde mittels eines fluoreszenzmarkierten (Cy3) Oligopeptids demonstriert. Das markierte Konstrukt (5 pmol in 1 ml) und Lipofectamin 2000 (eingesetzt nach der Anleitung des Herstellers) wurden zu den LnCAP-Zellen gegeben, und dann inkubierte man den Ansatz 24 Stunden. Die Zellen wurden dann fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die intranukleäre Lokalisation des Konstrukts wurde über die Kolokalisation mit einem Kernfarbstoff (DAPI) demonstriert.
Die Wirkung der Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle ARP-L217 und ARP-L218 auf die Expression des Androgenrezeptor-Gens wurde in den folgenden Experimenten gemessen.
1) Behandlung von LNCap-Zellen mit ARP-L217
Zur Messung der Wirkung von ARP-L217 auf die Expression des Androgenrezeptor-Gens wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
ARP-L217 wurde am Tag der Versuchsanordnung in phosphatgepufferter Saline (PBS) präpariert, mit einer Spritze durch einen Filter von 0,2 μm filtriert und eingesetzt.
Die LNCap-Zellen wurden mit ARP-L217 unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (kationisches aktiviertes Dendrimer, InVitrogen Life Technologies) transfiziert. Unterschiedliche Mengen an ARP-L217 wurden mit einer festen Menge an Lipofectamin 2000 (3 μl) in einem Gesamtvolumen von 100 μl Medium ohne Antibiotika, das mit Serum (10% FBS) supplementiert war, gemischt. Nach 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Transfektionsmischung zu den zu 70% konfluenten Zellen gegeben, und die Zellen wurden 3 Tage inkubiert.
Die Bedingungen für die RT-PCR wurden so eingestellt, dass eine optimale Empfindlichkeit innerhalb der exponentiellen Phase des Amplifizierungsprozesses erhalten wurde. Die zelluläre Gesamt-RNA wurde aus den behandelten LNCap-Zellen mit Hilfe des RNeasy-Kits (Qiagen) isoliert. Die RNA (1 μg einer jeden Probe) wurde mit Hilfe des Omniscript-RT-Kits (Qiagen) revers in cDNA transkribiert. Die synthetisierte cDNA (2 μl einer jeden Probe) wurde einer PCR-Amplifizierung (Taq-Kit, Qiagen) mit Primern des humanen Androgenrezeptors, Sense = 5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3' und Antisense = 5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3', unterzogen, wodurch ein Produkt von 281 bp erhalten wurde. Zur Verifizierung der Qualität der RNA/cDNA-Präparation wurde eine PCR-Amplifizierung mit humanen β-Actin-Primern (Promega, GB) durchgeführt. Zur Verifizierung, dass das PCR-Produkt nicht von restlicher, in den RNA-Proben übrig gebliebener DNA amplifiziert worden war, wurde eine RT-negative Kontrolle einer PCR-Amplifizierung von β-Actin unterzogen.
Die in dieser Untersuchung eingesetzten AR-Primersequenzen wurden mittels Qiagen-Operon synthetisiert und so entworfen, dass eine 5'-3'-Komplementarität vermieden wurde und wenigstens ein Intron in dem Produkt enthalten war, um eine Kontamination mit genomischer DNA zu erkennen.
Die Elektrophorese der PCR-Produkte wurde auf 2%igen Agarosegelen durchgeführt, und die Gele wurden zuvor mit Ethidiumbromid gegossen (Verdünnung 1:10). Die Gele wurden mit Hilfe des GelDoc-Systems fotografiert.
Der Vergleich und die Analyse der mRNA-Expression erfolgten über eine Quantifizierung der Gelbanden mit Hilfe des Softwaresystems von Labworks. Das Extinktionsverhältnis von Probe zu β-Actin wurde für jede Probe berechnet und für den Vergleich herangezogen. Somit wird eine erhöhte Expression der mRNA als Prozent bezogen auf die Kontrolle (unbehandelte Zellen) angegeben.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind als Tabelle 1 unten und auch als Säulendiagramm in der 2 gezeigt. Tabelle 1a Daten, die die Quantifizierung der Banden nach der 3-tägigen Exposition von LNCap-Zellen gegen ARP-L217 zeigen

	Quantifizierung der PCR-Bande des AR (Tag 3)
Probe	IODa	IODa	IODb	IODb	Mittelwert
unbehandelt	2280	2406	2105	2162	2238,25
PBS (25 μl)	2283	1908	2106	2544	2210,25
PBS (50 μl)	1799	1799	2677	2268	2135,75
0,25 μM ARP-L217 + Lipofectamin	1428	1749	1419	1325	1480,25
0,5 μM ARP-L217 + Lipofectamin	783	971	1037	1191	995,5
	Quantifizierung der PCR-Bande des β-Actins (Tag 3)
	IODa	IODa	IODb	IODb	Mittelwert
unbehandelt	8957	9589	8996	9663	9301,25
PBS (25 μl)	8228	7980	9098	8544	8462,5
PBS (50 μl)	7413	8762	8920	9005	8525
0,25 μM ARP-L217 + Lipofectamin	6632	6322	6605	7924	6870,75
0,5 μM ARP-L217 + Lipofectamin	6323	6180	5834	6695	6258

Tabelle 1b Bestimmung des auf Beta-Actin bezogenen Verhältnisses und prozentuale Hemmung gegenüber der Kontrolle

Probe	Verhältnis bezogen auf β-Actin	Prozent im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle
unbehandelt	0,2406	100
PBS (25 μl)	0,2611	108,5364073
PBS (50 μl)	0,2505	104,1091143
0,25 μM ARP-L217 + Lipofectamin	0,2154	89,52898226
0,5 μM ARP-L217 + Lipofectamin	0,1590	66,10562717

Aus diesen Daten geht hervor, dass die mit ARP-L217 inkubierten Zellproben im Vergleich zu den nur mit PBS-Lösungen behandelten stark reduzierte Spiegel der Expression des Androgenrezeptor-Gens zeigen.
2) Behandlung von LNCap-Zellen mit ARP-L218 und R1881
Die Wirkung von ARP-L218 mit einem synthetischen Androgen (R1881) und ohne dieses auf die Expression des Androgenrezeptor-Gens wurde mittels des im obigen Abschnitt umrissenen Protokolls gemessen.
ARP-L218 wurde am Tag der Versuchsanordnung in phosphatgepufferter Saline (PBS) präpariert, mit einer Spritze durch einen Filter von 0,2 μm filtriert und eingesetzt. R1881 (synthetisches Androgen) wurde von Perkin Elmer, Katalognummer NLP005005MG, gekauft.
Die LNCap-Zellen wurden mit ARP-L218 unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (kationisches aktiviertes Dendrimer, InVitrogen Life Technologies) mit/ohne Agonist transfiziert. Unterschiedliche Mengen an ARP-L218 wurden mit einer festen Menge an Lipofectamin 2000 (3 μl) in einem Gesamtvolumen von 100 μl serumfreiem Medium ohne Antibiotika (OptiMEM) gemischt. Nach 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Transfektionsmischung zu den zu 70% konfluenten Zellen gegeben, und die Zellen wurden 3 Tage inkubiert.
Die Zuführung der Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle in die LnCAP-Zellen und in die Kerne wurde mittels eines fluoreszenzmarkierten (Cy3) Oligopeptids demonstriert. Das markierte Konstrukt (5 pmol in 1 ml) und Lipofectamin 2000 (eingesetzt nach der Anleitung des Herstellers) wurden zu den LnCAP-Zellen gegeben, und dann inkubierte man den Ansatz 24 Stunden. Die Zellen wurden dann fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die intranukleäre Lokalisation des Konstrukts wurde über die Kolokalisation mit einem Kernfarbstoff (DAPI) demonstriert.
Es wurde die RNA extrahiert und die RT-PCR-Analyse der mRNA-Spiegel des AR wie oben beschrieben durchgeführt.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind als Tabelle 2 unten und auch als Säulendiagramm in der 3 gezeigt. Tabelle 2: Daten, die die Quantifizierung der Banden nach der 3-tägigen Exposition gegen ARP-L218 in Gegenwart/Abwesenheit eines synthetischen Androgens (R1881) zeigen. Bestimmung des auf Beta-Actin bezogenen Verhältnisses und prozentuale Hemmung gegenüber der Kontrolle.

Probe	AR	AR	Mittelwert	Beta-Actin	Beta-Actin	Mittelwert	Verhältnis zu Beta-Actin	Prozent der Kontrolle
PBS-behandelte Kontrolle	3142	-	3142	9521	-	9521	0,330	100
ARP-L218 (0,125 μM)	2327	2647	2487	10592	14178	12385	0,201	60,84
ARP-L218 (0,25 μM)	2728	2212	2470	17103	15691	16397	0,151	45,64
R1881 (1 μM) + ARP-L218	1291	-	1291	14949	-	14949	0,086	26,16
R1881 (100 nM) + ARP-L218	1068	-	1068	16258	-	16258	0,066	19,90
R1881 (1 nM) + ARP-L218	1393	-	1393	16950	-	16950	0,082	24,90
R1881 (0,01 nM) + ARP-L218	2532	-	2532	16807	-	16607	0,152	46,20
R1881 (1 μM)	1388	-	1388	8424	-	8424	0,165	49,92
R1881 (100 nM)	1455	-	1455	12536	-	12536	0,116	35,17
R1881 (1 nM)	1471	-	1471	14242	-	14242	0,103	31,29
R1881 (0,01 nM)	2083	-	2083	8799	-	8799	0,237	71,73

Aus diesen Daten geht hervor, dass die mit ARP-L218 und R1881 inkubierten Zellproben im Vergleich zu den nur mit R1881-haltigen Lösungen behandelten stark reduzierte Spiegel der Expression des Androgenrezeptor-Gens zeigen. Beide Probentypen hatten im Vergleich zu den Proben der mit PBS behandelten Kontrollzellen verringerte Spiegel der AR-mRNA.
Somit kann die durch R1881 bewirkte Verringerung der Expression des AR-Gens durch die Koinkubation der Zellen mit dem Oligo/Peptid-Fusionsmolekül ARP-L218 verstärkt werden.
3) Behandlung von LNCap-Zellen mit ARP-L218 und Cyproteronacetat
Die Wirkung von ARP-L218 mit dem und ohne den rezeptorbindenden Androgenrezeptor-Antagonisten Cyproteronacetat auf die Expression des Androgenrezeptor-Gens wurde mittels des im obigen Abschnitt umrissenen Protokolls gemessen.
ARP-L218 wurde am Tag der Versuchsanordnung in phosphatgepufferter Saline (PBS) präpariert, mit einer Spritze durch einen Filter von 0,2 μm filtriert und eingesetzt. Cyproteronacetat wurde bei Sigma, Lot-Nummer 41K1195, gekauft.
Die LNCap-Zellen wurden mit ARP-L218 unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (kationisches aktiviertes Dendrimer, InVitrogen Life Technologies) mit/ohne Agonist transfiziert. Unterschiedliche Mengen an ARP-L218 wurden mit einer festen Menge an Lipofectamin 2000 (3 μl) in einem Gesamtvolumen von 100 μl serumfreiem Medium ohne Antibiotika (OptiMEM) gemischt. Nach 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Transfektionsmischung zu den zu 70% konfluenten Zellen gegeben, und die Zellen wurden 3 Tage inkubiert.
Die Zuführung der Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle in die LnCAP-Zellen und in die Kerne wurde mittels eines fluoreszenzmarkierten (Cy3) Oligopeptids demonstriert. Das markierte Konstrukt (5 pmol in 1 ml) und Lipofectamin 2000 (eingesetzt nach der Anleitung des Herstellers) wurden zu den LnCAP-Zellen gegeben, und dann inkubierte man den Ansatz 24 Stunden. Die Zellen wurden dann fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die intranukleäre Lokalisation des Konstrukts wurde über die Kolokalisation mit einem Kernfarbstoff (DAPI) demonstriert.
Es wurde die RNA extrahiert und die RT-PCR-Analyse der mRNA-Spiegel des AR wie oben beschrieben durchgeführt.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind als Tabelle 3 unten und auch als Säulendiagramm in der 4 gezeigt. Tabelle 3: Daten, die die Quantifizierung der Banden nach der 3-tägigen Exposition von LnCAP-Zellen gegen ARP-L218 in Gegenwart/Abwesenheit eines Androgenrezeptor-Antagonisten (Cyproteronacetat) zeigen. Bestimmung des auf Beta-Actin bezogenen Verhältnisses und prozentuale Hemmung gegenüber der Kontrolle.

Probe	AR	Beta-Actin	Verhältnis	% der Kontrolle
PBS-behandelte Kontrolle	3142	9521	0,330	100
Cyproteronacetat (10 μM)	1568	14691	0,107	32,4
Cyproteronacetat (1 μM)	1868	11856	0,158	47,8
Cyproteronacetat (1 μM) + ARP-L218 (0,0625 μM)	1583	14861	0,107	32,4
Cyproteronacetat (10 nM)	2401	14112	0,170	51,5
Cyproteronacetat (10 nM) + ARP-L218 (0,03125 μM)	1241	16885	0,074	22,4
Cyproteronacetat (0,1 nM)	2357	13278	0,178	54,0

Aus diesen Daten geht hervor, dass die mit ARP-L218 und Cyproteronacetat inkubierten Zellproben im Vergleich zu den nur mit Cyproteronacetat behandelten reduzierte Spiegel der Expression des Androgenrezeptor-Gens zeigen. Beide Probentypen hatten im Vergleich zu den Proben der mit PBS behandelten Kontrollzellen verringerte Spiegel der AR-mRNA.
Somit kann die durch Cyproteronacetat bewirkte Verringerung der Expression des AR-Gens durch die Koinkubation der Zellen mit dem Oligo/Peptid-Fusionsmolekül ARP-L218 verstärkt werden.
Beispiel 9: Herunterregulation eines interferonstimulierten, in das Genom inkorporierten Gens
Wie im Beispiel 2 diskutiert wurde, sind Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle zur Regulation der Genaktivität in der Lage, wenn die Gene in das Genom integriert sind. In diesem Beispiel präsentieren wir weitere experimentelle Daten, die das unterstützen.
Wir konstruierten Fusionen zwischen einem DNA-bindenden Oligonucleotid (TFO), das auf ein interferonstimuliertes Response-Element (IRE) abzielt, und einem Peptid, das eine Sequenz des MAD1-Repressors von 29 Aminosäuren, die mit einer Penetratinsequenz von 16 Aminosäuren verknüpft ist, enthält.
Die in diesem Beispiel eingesetzte Sequenz des IRE-TFO war die folgende:
IRE TFO: (5') GGGUGGTGGGGTTGTGTT (3')

U: = 5-Fluordesoxyuracil
F: = 2'-Desoxy-6-thioguanin

TFOs werden für die Konjugation am 5'-Ende modifiziert, wie es von Gait et al. (2000) J. Org. Chem. 65, 4900-4908 beschrieben wurde, und am 3'-Ende mit einer Standard Amino-Verknüpfung, um sie vor einem Abbau zu schützen.
Die Oligonucleotidsequenz wird so gewählt, dass sie einen Triplex mit dem Interferon Stimulatable Response Element (ISRE) des humanen Interferon Stimulated Gene (ISG) 6-16 (Porter et al. (1988) EMBO J. 7, 85-92) bildet.
Das TFO wurde mit zwei verschiedenen Peptidfragmenten fusioniert. Die in diesem Beispiel eingesetzten Peptidfragmente waren die folgenden:
L218: HHHHHH-29aaMAD-DDD-Penetratin
(Link)HHHHHHMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDRQIKIWFQNRRMKWKK(carboxamid)
L219: DDD-29aaMAD-HHHHHH-Penetratin
(Link)DDDMNIAMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK(carboxamid)
Die Peptidsequenz von 29 Aminosäuren stammt aus der Transkriptionsrepressordomäne des MAD1-Proteins, einem Bereich, von dem bekannt ist, dass er mit dem Protein Sin3 eines Histondeacetylase-Komplexes interagiert.
Die drei Asparaginsäurereste (DDD) sind eine Linkersequenz, während die Sequenz des Penetratin-Peptids eine effiziente Translokation des Oligo/Peptid-Fusionsmoleküls zur Plasmamembran vermittelt.
Die HIS-Reste wurden zur Bereitstellung weiterer Optionen für die Aufreinigung angefügt.
Die modifizierten humanen Fibrosarkomzellen HT1080 wurden zur Demonstration der Fähigkeit der Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle zur Herunterregulation einer interferonstimulierten Reportergenexpression eingesetzt. Diese Zellen enthalten ein stabil inkorporiertes Gen, das EGFP unter der Kontrolle des interferonstimulierten Response-Elements (IRE) des humanen 6-16-Gens exprimiert.
Für die folgenden Daten wurden die Zellen transient mit verschiedenen Verbindungen unter Einsatz von Standard-Lipofectamin-Protokollen transfiziert. Die Zellen wurden dann einen Tag mit 300 Einheiten/ml Interferon (INF) behandelt und mittels FACS bezüglich der GFP-Expression analysiert.
Die 5 zeigt die FACS-Analyse mehrerer unterschiedlicher Zellpopulationen, bei der die folgenden experimentellen Bedingungen zum Einsatz kamen:

a) Parentale Zelllinie, keine Behandlung
b) Zellen, die das stabil transfizierte Konstrukt (C8) exprimieren, keine Behandlung
c) C8 behandelt mit Interferon (+INF)
d) C8 transfiziert mit 500 pM TFO, +INF
e) C8-spezifisches TFO 1000 pM, +INF
f) C8, IRE-L218 500 pM, +INF
g) C8, IRE-L219 500 pM, +INF
h) C8, unspezifisches Kontroll-TFO 500 pM, +INF
i) C8, unspezifisches Kontroll-TFO 1000 pM, +INF

Die Tabelle 4 zeigt die interferoninduzierte GFP-Expression aus 5 als Prozent ausgedrückt. Tabelle 4: Interferoninduzierte GFP-Expression

Angewandte Bedingungen GFP-Expression

(a) 0%

(b) < 1%

(c) 90%

(d) 53%

(e) 63%

(f) 40%

(g) 42%

(h) 87%

(i) 85%
Das IRE-TFO-System, das als Modellsystem eingesetzt wurde, ist beschrieben worden (Roy, 1994, Eur. J. Biochem. 220, 493-503). Die Ergebnisse der FACS-Analyse zeigen, dass IRE-L218 und IRE-L219 in der Lage waren, die Expression um durchschnittlich 59% zu reprimieren, während das spezifische TFO mit der gleichen Sequenz eine Repression von durchschnittlich 42% bewirkte. Die Kontroll-TFOs hatten nur eine marginale Wirkung auf die Positivkontrolle.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle bezüglich der Repression der INF-induzierten Genexpression des GFP äußerst wirksam sind.
Beispiel 10: Die Herunterregulierung der Genexpression durch Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle ist mit einer Histondeacetylierung des Chromatins assoziiert.
Wie aus den Beispielen 8 und 9 hervorgeht, sind die Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle bezüglich der Reprimierung der Genexpression wirksam. Wir schlagen vor, dass das auf einer MAD1-vermittelten Änderung der Histonacetylierung der DNA an der Stelle oder in der Nähe der Stelle, wo das ARP- oder IRE-Oligo bindet, beruht.
Für den Nachweis, dass die verringerte Genexpression mit einer Histondeacetylierung des Chromatins assoziiert ist, kann das Verfahren der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) eingesetzt werden. Die Chromatin-Immunpräzipitation wird mit Hilfe eines ChIP-Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Upstate BioTechnology, Bucks, GB) durchgeführt.
Es werden humane LNCap-Prostatatumorzellen gezüchtet und vermehrt und mit Oligo/Peptid-Fusionsmolekülen inkubiert, die bezüglich der Repression der Expression des Androgenrezeptor-Gens wirksam sind. Unbehandelte LNCap-Zellen dienen als Kontrolle.
Man lässt die Zellen in 35-cm-Gewebekulturplatten in DMEM ohne Phenolrot, supplementiert mit 5% DSS, P/S/G und G418 (100 μg/ml), bis zu 95%iger Konfluenz wachsen. Hygromycin B (80 μg/ml) und Doxycyclin (1 μg/ml) werden nach Bedarf zugegeben. 30 Minuten vor der Fixierung wird E2 (10^–8 M) oder Ethanol (als Kontrolle) zu den Zellen gegeben. 37%iger Formaldehyd wird tropfenweise bis zu einer Endkonzentration von 1% direkt in das Medium gegeben. Die Zellen werden 10 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Auf Eis wird das Medium von den Platten abgesaugt, und die Zellen werden zweimal mit eiskaltem PBS, das 1 × Proteaseinhibitoren (PI) (Sigma, Dorset, GB) enthält, gewaschen. Für die Ernte wird 1 ml eiskaltes PBS, das 1 × PI enthält, zu der Platte gegeben, und die Zellen werden mit einem Gummischaber in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen abgeschabt. Die Zellen werden 4 Minuten bei 2000 Upm und 4 °C abzentrifugiert. Die Pellets werden in 400 μl vorgewärmtem ChIP-SDS-Lysierpuffer (1% SDS, 10 mM Na-EDTA, pH 8,0, 50 mM Tris-HCl, pH 8,1), der PI enthält, resuspendiert und 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Die Lysate werden zur Scherung der DNA in Stücke mit einer Länge von 200-1000 bp sonifiziert. Während der Sonifizierung befinden sich die Proben in einem Becher mit Eis/Wasser, um sie kalt zu halten und einen Abbau der Probe zu verhindern. Die Sonifizierung wird mittels eines Soniprep-150-Sonikators mit einer angebrachten exponentiellen Soniprep-150-Titansonde (Sanyo-Gallenkamp, Leics, GB) in Zyklen von 10 Sekunden, die durch Pausen von 30 Sekunden getrennt sind, durchgeführt.
Die Proben werden 10 Minuten bei 4 °C und 13 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird in sterilen 15-ml-Falconröhrchen gesammelt und 10-fach mit 3600 μl ChIP-Verdünnungspuffer (0,01% SDS, 1,1% Triton-X-100, 1,2 mM Na-EDTA, pH 8,0, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl) verdünnt. Die Proben werden dann in zwei Aliquots von 2 ml in Röhrchen von 2,5 ml aufgeteilt, das eine für die Inkubation mit einem Antikörper gegen acetyliertes Histon H4, ChIPs-Grade (Upstate BioTechnology, Bucks, GB), und das andere für die Verwendung als Kontrolle ohne Antikörper.
Zur Reduzierung des unspezifischen Hintergrunds wird jedes 2-ml-Aliquot durch die Zugabe von 80 μl einer Aufschlämmung aus Lachsspermien-DNA/50%iger Protein-A-Agarose (suspendiert in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Na-EDTA, pH 8,0) 30 Minuten bei 4 °C auf einer senkrechten rotierenden Plattform (Stuart Scientific, Staffs, GB) vorgeklärt. Die Agarosebeads werden dann durch eine 30-sekündige Zentrifugation bei 1000 Upm abzentrifugiert, und die Überstände werden in frischen 2,5-ml-Röhrchen gesammelt. Der Antikörper für die Immunpräzipitation wird in einer Verdünnung von 1:500 zur ersten Probe gegeben, aber nicht zu der Kontrollprobe ohne Antikörper. Beide Röhrchen werden über Nacht bei 4 °C auf einer vertikalen rotierenden Plattform (Stuart Scientific, Staffs, GB) inkubiert.
60 μl der Aufschlämmung aus Lachsspermien-DNA/50%iger Protein-A-Agarose werden rotierend 1 Stunde bei 4 °C mit jedem Röhrchen inkubiert, um die Antikörper/Histon-Komplexe oder, im Falle der Kontrolle ohne Antikörper, die unspezifisch gebundenen Proteine zu sammeln. Die Agarosebeads werden durch eine kurze, 1-minütige Zentrifugation bei 800 Upm abzentrifugiert. Die Überstände werden sorgfältig in frische 2,5-ml-Röhrchen transferiert und bei –20 °C gelagert.

Der Protein-A-Agarosebeads/Antikörper/Histon-Komplex wird 5 Minuten auf einer vertikalen rotierenden Plattform bei 4 °C mit 1 ml eines jeden der folgenden Puffer in der unten aufgeführten Reihenfolge gewaschen:

(a) Immunkomplex-Waschpuffer mit niedriger Salzkonzentration	– eine Waschung
(0,1% SDS, 1% Triton-X-100, 2 mM Na-EDTA, pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl)
(b) Immunkomplex-Waschpuffer mit hoher Salzkonzentration	– eine Waschung
(0,1% SDS, 1% Triton-X-100, 2 mM Na-EDTA, pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl)
(c) LiCl-Immunkomplex-Waschpuffer	– eine Waschung
(0,25 M LiCl, 1% NP40 (Nonidet), 1% Desoxycholat, 1 mM Na-EDTA, pH 8,0, 10 mM Tris-HCl, pH 8,1)
(d) 1 × TE	– zwei Waschungen
(10 mM Tris-HCl, 1 mM Na-EDTA, pH 8,0)

Der Histon/Immunkomplex wird durch die Zugabe von 250 μl frisch hergestelltem Elutionspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO₃) von den Agarosebeads eluiert. Die Proben werden kurz gemischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten auf einer vertikalen rotierenden Plattform inkubiert. Die Beads werden 2 Minuten mit 1000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert, und das Eluat wird in frische Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. Der Elutionsschritt wird mit weiteren 250 μl Elutionspuffer wiederholt, und die Eluate werden vereinigt.
20 μl 5 M NaCl werden zu den Eluaten gegeben, und die Histon-DNA-Vernetzungen werden durch wenigstens 4-stündiges Erhitzen auf 65 °C rückgängig gemacht. Es werden 10 μl 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0, 20 μl 1 M Tris-HCl, pH 6,5, und 2 μl Proteinase K (10 mg/ml) zu den eluierten Proben gegeben. Die Vernetzungen werden auch in den Überstandsfraktionen der IP rückgängig gemacht. Es werden 40 μl 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0, 80 μl 1 M Tris-HCl, pH 6,5, und 8 μl Proteinase K (10 mg/ml) zu den Überstandsproben gegeben. Die Proben werden 1 Stunde bei 45 °C inkubiert, um das Protein in den Proben abzubauen.
Es werden 20 μg Glykogen als inerter Träger zu den Proben gegeben, und dann wird die DNA durch eine Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und eine Ethanolfällung aus den Proben gewonnen. Die DNA-Pellets werden für die PCR-Reaktionen in 50 μl sterilem Wasser resuspendiert. 1 μl Probe und 35-40 Zyklen werden in allen PCR-Amplifizierungen eingesetzt. Eine computerbasierte Bildanalyse (NIH-Bildanalyseprogramm) wird zur Ermittlung der relativen Spiegel der PCR-Produkte des Gens des estrogenregulierten Androgenrezeptors im Vergleich mit den β-Actin-Kontrollen und den Kontrollen ohne Antikörper eingesetzt. Das ermöglichte eine Berechnung der in einer Probe, die mit den anderen Proben verglichen werden sollte, enthaltenen relativen Menge des Gentranskripts.
Oligonucleotide, die für die ChIP-Analyse eingesetzt wurden:
Progesteronrezeptor, Vorwärtsprimer:
5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG-3'
Progesteronrezeptor, Rückwärtsprimer:
5'-TTCGGATACTGCTTCCTGC-3'
β-Actin, Vorwärtsprimer: 5'-TTTTCGCAAAAGGAGGGGAG-3'
β-Actin, Rückwärtsprimer: 5'-AAAGGCAACTTTCGGAACGG-3'
Ein Beispiel für den Typ von Ergebnissen, die erhalten werden können, ist in der 6 gezeigt.
Die Menge der präzipitierten Androgenrezeptor-DNA, und somit das Ausmaß der Acetylierung der mit dem Androgenrezeptor assoziierten Histonproteine des Chromatins, kann in den Zellen, in denen die Expression des Androgenrezeptors mittels des beschriebenen Verfahrens gehemmt wird, im Vergleich zu den unbehandelten Zellen um ungefähr 75% erniedrigt werden.
Beispiel 11: Gelshift-Assay
Die vorangehenden Beispiele haben gezeigt, dass die ARP-L217- und ARP-L218-Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle in der Lage sind, gezielt die Genaktivität zu regulieren. Es wird davon ausgegangen, dass das auf einer MAD1-vermittelten Änderung der Histonacetylierung der DNA an der Stelle oder in der Nähe der Stelle, an der das ARP- oder IRE-Oligo bindet, beruht.
Es wird ein Gelshift-Assay zur Demonstration, dass die Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle an ein DNA-Fragment binden können, das den Zielpromotor enthält, eingesetzt.
Ein DNA-Fragment des Androgenrezeptors von 281 bp, das die Zielpromotorsequenz enthält, wird mit ARP-L217 inkubiert. Die Proben werden zur Charakterisierung des Triplex-vermittelten Photoaddukts einer nicht-denaturierenden Gelelektrophorese unterzogen. Addukte werden in Proben gefunden, die das ARP-L217-Produkt enthalten, dessen Position mit zunehmenden Dosen verschoben wird.
Auf diese Weise ist es möglich zu zeigen, dass Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle an das DNA-Fragment, das den Zielpromotor enthält, binden können.
Beispiel 12: Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle mit einem nuklearen Lokalisierungssignal
Der Peptidabschnitt des Moleküls kann ein nukleäres Lokalisierungssignal (NLS) enthalten, damit das Molekül gezielt dem Kern zugeführt wird. Die in diesem Beispiel eingesetzten Peptide sind die folgenden:

a) DDD-MAD1-DDD-NLS, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist: (Link)DDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPDDDPKKKRKV(carboxamid) und
b) DDD-NLS-DDD-MAD1, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist: (Link)DDDPKKKRKVDDDMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP(carboxamid)

Die NLS ist ein vom SV40-T-Antigen stammendes funktionelles nukleäres Lokalisierungssignal aus 7 Aminosäuren (Sequenz PKKKRKV).
Die Linkersequenz DDD und die MAD1-Aminosäuresequenz von 29 Aminosäuren sind die gleichen wie die in den früheren Beispielen diskutierten.
Zur Demonstration, dass die Peptidsequenzen DDD-MAD1-DDD-NLS und DDD-NLS-DDD-MAD1 auf den Kern abzielen, wurden humane A549-Lungenkarzinomzellen mit GeneICE-Oligopeptiden, die aus der DDD-MAD1-DDD-NLS- und der DDD-NLS-DDD-MAD1-Peptidsequenz bestehen und mit einem Cy3-markierten Oligonucleotid verknüpft sind, mittels Standard-Lipofectamin-2000-Protokollen transfiziert. Die Zellen wurden dann in Formaldehyd fixiert und mittels des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens mit dem Kernfarbstoff DAPI gefärbt. Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Zellen zeigte, dass das Cy3-markierte GeneICE-Oligopeptidmolekül mit dem Kernfarbstoff DAPI kolokalisiert war. Aus den resultierenden experimentellen Daten wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die NLS bezüglich der gezielten Lenkung des Peptids in den Kern sehr wirksam ist.
Die Peptidsequenzen DDD-MAD1-DDD-NLS und DDD-NLS-DDD-MAD1 können die Expression des Zielgens vermitteln, wenn sie in erfindungsgemäße Oligo/Peptid-Moleküle inkorporiert sind. Das kann mittels des in den Beispielen 8 und 9 umrissenen experimentellen Ansatzes demonstriert werden.
Zum Beispiel können die Peptidsequenzen DDD-MAD1-DDD-NLS und DDD-NLS-DDD-MAD1 in die folgenden Oligo/Peptid-Moleküle inkorporiert werden.
ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS und
ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1.
ARP ist die im Beispiel 8 gezeigte TFO-Oligo-Sequenz.
Die Moleküle ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS und ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1 werden dann, wie im Beispiel 8, in LNCap-Zellen transfiziert oder, wie im Beispiel 9, in modifizierte HT1080-Zellen. Mittels der in diesen Abschnitten umrissenen experimentellen Verfahren ist es möglich, die Wirkung der Moleküle ARP:-DDD-MAD1-DDD-NLS und ARP:-DDD-NLS-DDD-MAD1 auf die Expression des Zielgens zu zeigen.
Beispiel 13: Regulation der Spiegel des prostataspezifischen Antigens mit Hilfe von Oligo/Peptid-Fusionsmolekülen
Wie in den Beispielen 2, 8 und 9 diskutiert wurde, sind Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle in der Lage, die Genaktivität zu regulieren, wenn die Gene in das Genom integriert sind. In diesem Beispiel präsentieren wir weitere experimentelle Daten, die das unterstützen.
Die Proteinspiegel des prostataspezifischen Antigens (PSA) werden vom Protein des Androgenrezeptors (AR) reguliert. Da wir im Beispiel 8 gezeigt haben, dass die Spiegel der AR-mRNA in Zellen, die mit den ARP-L218-Oligo/Peptid-Fusionsmolekülen transfiziert wurden, verringert sind, zogen wir die Schlussfolgerung, dass in mit ARP-L218 transfizierten Zellen die Spiegel des PSA-Proteins erniedrigt sein sollten.
Deshalb wurde ARP-L218 mittels der im Beispiel 8 beschrieben Protokolle mit Lipofectamin 2000 (InVitrogen) mit oder ohne R1881 (Perkin Elmer), einem synthetischen Androgen, für 3 Tage in LNCap-Zellen (GET/LNC/W39/P6) transfiziert, und danach wurde der Überstand für die Quantifizierung des gesamten PSA-Proteins am Pathology Centre, Hammersmith Hospital, London, GB, gewonnen.
Die PSA-Messungen wurden mit Hilfe eines immunometrischen Assays unter Einsatz einer Chemilumineszenzmarkierung mit einem automatischen Immunoassay-Analyser (Abbott Architect Immunoassay Analyser) durchgeführt.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der Tabelle 5 unten gezeigt und auch als Säulendiagramm in der 7. Tabelle 5: Quantifizierung des Gesamt-PSA in Zellüberständen

Probe	Gesamt-PSA (ng/ml)
PBS-behandelte Kontrolle	279
ARP-L218 (0,125 μM)	279
ARP-L218 (0,125 μM)	270
ARP-L218 (0,25 μM)	287
ARP-L218 (0,25 μM)	282
R1881 (100 nM) + ARP-L218 (0,25 μM)	757
R1881 (100 nM)	1980
R1881 (0,01 nM) + ARP-L218 (0,25 μM)	330
R1881 (0,01 nM)	372

Aus diesen Daten geht hervor, dass die Zellen, die mit dem synthetischen Androgen R1881 inkubiert wurden, eine Zunahme der PSA-Spiegel zeigen, wie man auch erwarten würde. Wenn die Zellen jedoch mit R1881 und ARP-L218 transfiziert wurden, ist die Zunahme der PSA-Spiegel stark verringert. Wie aus den mit ARP-L218, aber nicht mit R1881 transfizierten Proben hervorgeht, hat ARP-L218 keine direkte Wirkung auf den PSA-Spiegel.
Deshalb schlagen wir vor, dass R1881 eine Erhöhung der AR-Aktivität bewirkt, die wiederum zu einer Erhöhung der PSA-Spiegel führt. ARP-L218 bewirkt jedoch eine Blockierung der Expression des AR-Gens (wie im Beispiel 8 gezeigt ist), und so werden die PSA-Spiegel in der Folge verringert. Die Daten legen nahe, dass die erfindungsgemäßen Oligo/Peptid-Fusionsmoleküle dazu eingesetzt werden können, direkt oder indirekt ein Zielgen zu regulieren.

Claims

Molekül zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Molekül umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen Abschnitt aus einem Expressionsrepressor, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der Repressorabschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst.
Molekül zur Modulation der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Molekül umfasst (1) einen Nucleinsäure-bindenden Abschnitt, der an den Ort des ausgewählten Gens oder an eine mit diesem assoziierte Stelle, wobei diese Stelle in einem Genom vorliegt, bindet, und (2) einen modifizierenden Abschnitt, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der modifizierende Abschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst, das in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren, und keine Endonuclease oder KRAB ist.
Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Repressorabschnitt oder der modifizierende Abschnitt ein das Chromatin modifizierender Abschnitt und nicht KRAB ist.
Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Repressorabschnitt oder der modifizierende Abschnitt aus einer vollständigen Komponente eines DNA-Methylase-Komplexes oder aus einem Teil von ihr besteht oder aus einem vollständigen Polypeptid, das an einen DNA-Methylase-Komplexes bindet oder dessen Rekrutierung fördert und das nicht KRAB ist, oder einem Teil von ihm besteht.
Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Repressorabschnitt oder der modifizierende Abschnitt aus einer vollständigen Komponente einer Histonacetyltransferase oder aus einem Teil von ihr besteht oder aus einem vollständigen Polypeptid, das an einen Histonacetyltransferase-Komplex bindet oder dessen Rekrutierung fördert und das nicht KRAB ist, oder einem Teil von ihm besteht.
Molekül gemäß einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Polypeptid- oder Peptidomimetikumabschnitt des Moleküls eine Molekülmasse von unter 11 kDa hat.
Molekül gemäß einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein DNA-bindender Abschnitt ist.
Molekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein RNA-bindender Abschnitt ist und die in einem Genom vorliegende Stelle eine naszierende RNA ist, die von der DNA transkribiert wird.
Molekül nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligonucleotid oder Oligonucleotidanaloge oder die ein Oligonucleotid nachahmende Struktur ein ein Tripel bildendes Oligonucleotid (triele forming oligonucleotide, TFO) ist.
Molekül nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligonucleotidanaloge oder die ein Oligonucleotid nachahmende Struktur eine Peptidnucleinsäure (peptide nucleic acid, PNA) ist.
Molekül gemäß Anspruch 3 oder von diesem abhängigen Ansprüchen, wobei der Chromatin-inaktivierende Abschnitt die Histondeacetylierung fördert.
Molekül gemäß Anspruch 3 oder von diesem abhängigen Ansprüchen oder 11, wobei der Chromatin-inaktivierende Abschnitt aus einer vollständigen Komponente eines Histondeacetylierung (HDAC)-Komplexes oder aus einem Teil von ihr besteht oder aus einem vollständigen Polypeptid, das an einen HDAC-Komplex bindet oder dessen Rekrutierung fördert, oder aus einem Teil von ihm besteht.
Molekül gemäß Anspruch 12, wobei die Komponente des HDAC-Komplexes oder das Polypeptid, das an einen HDAC-Komplex bindet oder dessen Rekrutierung fördert, eine beliebige bzw. ein beliebiges von PLZF, N-CoR, SMRT, Sin3, SAP18, SAP30, HDAC, NuRD, MAD1, MAD2, MAD3, MAD4, Rb oder E7 ist.
Molekül gemäß Anspruch 13, wobei der Chromatin-inaktivierende Abschnitt aus dem vollständigen PLZF oder aus einem N-CoR- oder SMRT-bindenden Abschnitt von ihm besteht.
Molekül gemäß Anspruch 13, wobei der Chromatin-inaktivierende Abschnitt aus einer vollständigen HDAC oder aus einem enzymatisch aktiven Teil von ihr besteht.
Molekül gemäß Anspruch 13, wobei der Chromatin-inaktivierende Abschnitt aus dem vollständigen E7 oder aus einem Histondeacetylase-Komplex-bindenden Teil von ihm besteht.
Molekül gemäß einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Molekül ferner einen Abschnitt umfasst, der den Eintritt in die Zelle und/oder die Lokalisation im Zellkern fördert.
Molekül gemäß Anspruch 17, wobei der Abschnitt, der den Eintritt in die Zelle und/oder die Lokalisation im Zellkern fördert, ein kleines Peptid aus 7-16 Aminosäuren ist, zum Beispiel die modifizierte Antennapedia-Homöodomäne gemäß der Sequenz RQIKIWFQNRRMKWKK oder das basische HIV-TAT-Internalisierungspeptid gemäß der Sequenz C(Acm)GRKKRRQRRRPQC, wobei C(Acm) Cys-Acetamidomethyl ist.
Molekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der Repressorabschnitt oder modifizierende Abschnitt fusioniert sind.
Verwendung eines Moleküls gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 bei der Herstellung eines Mittels zur Modulation der Expression des ausgewählten Gens in einer Zelle.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Mittel zur Unterdrückung der Expression des ausgewählten Gens dient.
Verwendung gemäß Anspruch 20 oder 21, wobei das Mittel ein Medikament zur Modulierung oder Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einem Tier ist, wobei das Tier Krebs hat.
Verwendung eines Moleküls gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 bei der Herstellung eines Medikament zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einem Patienten, der Krebs hat.
Molekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 für die Verwendung in der Medizin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Molekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, die Mittel zur Förderung der Aufnahme des Moleküls in die Zelle umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Mittel zur Förderung der Aufnahme des Moleküls in die Zelle aus Liposomen oder einem viralen Träger besteht.
Wirtszelle, die ein Molekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 aufweist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 28, die eine Bakterienzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 28, die eine Tierzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 28, die eine Pflanzenzelle ist.
Tier, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, das eine Wirtszelle gemäß Anspruch 30 aufweist.
Pflanze, die eine Wirtszelle gemäß Anspruch 31 aufweist.
Verfahren zur Konstruktion eines Moleküls zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst (1) Identifizieren einer am Ort des ausgewählten Gens lokalisierten oder mit diesem assoziierten Stelle, (2) Identifizieren oder Konstruieren eines Nucleinsäure-bindenden Abschnitts, der an die Stelle bindet, oder für den vorhergesagt wird, dass er an die Stelle bindet, (3) Herstellen eines Moleküls, das den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt und einen Abschnitt aus einem Expressionsrepressor umfasst, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der Repressorabschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst.
Verfahren zur Konstruktion eines Moleküls zur Modulation der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst (1) Identifizieren einer am Ort des ausgewählten Gens lokalisierten oder mit diesem assoziierten Stelle, (2) Identifizieren oder Konstruieren eines Nucleinsäure-bindenden Abschnitts, der an die Stelle bindet, oder für den vorhergesagt wird, dass er an die Stelle bindet, (3) Herstellen eines Moleküls, das den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt und einen modifizierenden Abschnitt umfasst, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der modifizierende Abschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst, das in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren.
Verfahren zur Konstruktion eines Moleküls zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst (1) Identifizieren einer am Ort des ausgewählten Gens lokalisierten oder mit diesem assoziierten Stelle, (2) Identifizieren oder Konstruieren eines Nucleinsäure-bindenden Abschnitts, der an ein Polynucleotid bindet, oder für den vorhergesagt wird, dass er an ein Polynucleotid bindet, das die Nucleotidsequenz der Stelle hat oder umfasst, (3) Herstellen eines Moleküls, das den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt und einen Abschnitt aus einem Expressionsrepressor umfasst, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der Repressorabschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst.
Verfahren zur Konstruktion eines Moleküls zur Modulation der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst (1) Identifizieren einer am Ort des ausgewählten Gens lokalisierten oder mit diesem assoziierten Stelle, (2) Identifizieren oder Konstruieren eines Nucleinsäure-bindenden Abschnitts, der an ein Polynucleotid bindet, oder für den vorhergesagt wird, dass er an ein Polynucleotid bindet, das die Nucleotidsequenz der Stelle hat oder umfasst, (3) Herstellen eines Moleküls, das den Nucleinsäure-bindenden Abschnitt und einen modifizierenden Abschnitt umfasst, wobei der Nucleinsäure-bindende Abschnitt ein Oligonucleotid oder eine ein Oligonucleotid nachahmende Struktur oder ein Oligonucleotidanaloges umfasst, und wobei der modifizierende Abschnitt ein Polypeptid oder Peptidomimetikum umfasst, das in der Lage ist, die kovalente Modifizierung der Nucleinsäure oder des Chromatins zu modulieren.
Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, das ferner die folgenden Schritte umfasst: (4) Durchführen einer Kontrolle der Qualität der Molekülpräparation um festzustellen, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der Repressorabschnitt oder modifizierende Abschnitt aneinander befestigt sind; und/oder (5) Testen der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Nucleinsäure-bindenden Abschnitts an die Stelle; und/oder (6) Testen der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Moleküls an die Steile; und/oder (7) Testen der Wirksamkeit des Moleküls oder Polynucleotids bezüglich der Modulierung oder Unterdrückung der Expression des Gens und/oder eines Reportergens, das die Nucleotidsequenz der Stelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, das ferner die folgenden Schritte umfasst: (4) Durchführen einer Kontrolle der Qualität der Molekülpräparation um zu bestimmen, dass der Nucleinsäure-bindende Abschnitt und der Repressorabschnitt oder der modifizierende Abschnitt aneinander befestigt sind; und/oder (5) Testen der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Nucleinsäure-bindenden Abschnitts an ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz der Stelle hat oder umfasst; und/oder (6) Testen der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Moleküls an ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz der Stelle hat oder umfasst; und/oder (7) Testen der Wirksamkeit des Moleküls oder Polynucleotids bezüglich der Modulierung oder Unterdrückung der Expression des Gens und/oder eines Reportergens, das die Nucleotidsequenz der Stelle umfasst.
In-vitro-Verfahren zur Unterdrückung der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren das Einbringen eines Moleküls gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 3 bis 19 in die Zelle umfasst.
In-vitro-Verfahren zur Modulation der Expression eines ausgewählten Gens in einer Zelle, wobei das Verfahren das Einbringen eines Moleküls gemäß einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 19 in die Zelle umfasst.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 34 bis 41, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 34 bis 41, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist und in einer Pflanze enthalten ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 34, 36, 38, 39, 40, 42 oder 43, wobei die Expression einer Vielzahl ausgewählter Gene unterdrückt wird.