NO306623B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl Download PDFInfo
- Publication number
- NO306623B1 NO306623B1 NO901213A NO901213A NO306623B1 NO 306623 B1 NO306623 B1 NO 306623B1 NO 901213 A NO901213 A NO 901213A NO 901213 A NO901213 A NO 901213A NO 306623 B1 NO306623 B1 NO 306623B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- trna
- rna
- ribozyme
- producing
- Prior art date
Links
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 109
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 67
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims abstract description 128
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 18
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 claims description 14
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 3
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 claims description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 claims 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 35
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 26
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 16
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 8
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 6
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 5
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 5
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 5
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 108091029536 tRNA precursor Proteins 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 108091026823 U7 small nuclear RNA Proteins 0.000 description 2
- 101800005128 V-erbA oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 2
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-yl propanedithioate Chemical group CCC(=S)SC1=CC=CC=N1 FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- -1 succinimidylpyridylthio propionate Chemical compound 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 108700008272 transferrin-polylysine conjugate Proteins 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MEXAGTSTSPYCEP-JEDNCBNOSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.NCCCC[C@H](N)C(O)=O MEXAGTSTSPYCEP-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- YEMQNMTZLKJRHT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-pyridin-2-ylpropanethioic S-acid Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C)(C(S)=O)N1C(=O)CCC1=O YEMQNMTZLKJRHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713840 Avian erythroblastosis virus Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100456896 Drosophila melanogaster metl gene Proteins 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000723677 Tobacco ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl.
Den spesifikke inhiberingen av gener ved oligonukleotider, f.eks. når det gjelder en terapeutisk virkende blokkering av deregulerte onkogener eller virale gener, beror på evnen hos slike komplementære RNA- eller DNA-sekvenser, såkalte "antisense-oligonukleotider", til å hybridisere med mRNA, prosesse-ringssignaler eller pre-mRNA, og på denne måten avbryte informasjons-overføringen fra gener til proteiner.
Anvendelsen av antisense-DNA bevirker en nedbrytning av komplementær mål-RNA ved RNAse H-spalting av det oppståtte hybridet, resultatet er den irreversible ødeleggelsen av det tilstedeværende komplementære RNA.
I tilfelle anvendelse av antisense-RNA følger en såkalt "hybrid arrest" av translasjon eller prosessering, hvorved RNA/RNA-hybridene representerer den strukturelle hindringen.
Det antas at slike hybrider akkumuleres i cellen; deres videre skjebne er ennu ikke undersøkt. Ifølge vår nåværende kunnskap turde det ved denne mekanismen i alt vesentlig dreie seg om et reversibelt forløp. Anvendelsen av antisense-RNA-molekyler har den fordelen at disse molekylene enten kan syntetiseres in vitro og bringes inn i cellene, eller at de genene som koder for disse, kan føres inn i cellene, slik at det inhiberende RNA kan produseres inne i cellen. Det har imidlertid hittil ikke lyktes å bringe slike gener i en form som muliggjør produksjon av en virksom mengde av antisense-RNA i cellen.
Ganske nylig ble det oppdaget et tredje prinsipp for RNA-inhibering, og gjort tilgjengelig for in vitro anvendelse.
Dette prinsippet beror på RNA-molekylenes, de såkalte "ribozymene", evne til å gjenkjenne bestemte RNA-sekvenser, binde seg til disse og spalte dem. Det ble utledet fra de in vivo betraktede autokatalytiske spaltereaksjonene for RNA-molekyler i planteviroider og satellitt-RNA.
Ved å bygge på bestemte strukturkrav for den ribozym-katalyserende RNA-spaltingen, kan man nå altså konstruere de novo ribozymer som har en in trans endonuklease-aktivitet som er innrettet på en bestemt målsekvens. Da slike ribozymer, hvorav de hittil mest inngående utforskede på grunn av sin struktur kalles "hammerhead"-ribozymer, kan virke på tallrike forskjellige sekvenser, kan det tilsvarende ribozymet "sys etter mål" for praktisk talt hvilket som helst RNA-substrat. Dette gjør ribozymene til interessante, ytterst fleksible instrumenter for inhibering av spesifikke gener, og til et løfterikt alternativ til antisense-konstruksjoner, som allerede har vist seg å ha en potensiell terapeutisk nytte.
En av de nå kjente og tidligere mest inngående utforskede ribozym-modellene omfatter tre strukturdomener; ved å bygge på denne modellen er det allerede med godt resultat bygget ribozymer mot CAT-mRNA. (Haseloff et al., 1988; Uhlenbeck et al., 1987) :
De tre domenene omfatter:
a) en høykonservert region av nukleotider som flankerer spaltestedet i 5'-retning. Derved dreier det seg vanligvis om sekvensen GUC, selvom også en modifikasjon viste en i alt vesentlig uforminsket spalteaktivitet i GUA eller GUU. Spalting viste seg også etter sekvensene CUC, i mindre grad også for AUC og UUC (de kravene som ble stillet til effektiv spalting er ennå ikke blitt fullstendig oppklart). b) de høykonserverte sekvensene som inneholdes i naturlig forekommende spaltedomener i ribozymer, og som danner en slags baseparret stengel; c) de regionene som flankerer spaltestedet på begge sidene, og som garanterer for den nøyaktige tilpasningen av ribozymet
i forhold til spaltestedet og for sammenbindingen mellom substrat og enzym (i de hittil gjennomførte forsøkene ble valgt 8 baser på hver av de to sidene).
RNA-enzymet kan konstrueres etter denne modellen, og har allerede vist seg egnet for effektiv og spesifikk spalting av RNA-sekvenser in vitro. (Haseloff et al., 1988).
I den senere tid har man oppdaget ytterligere typer av autokatalytisk RNA-spalteaktivitet som kommer i betraktning for den målrettede RNA-inhiberingen. En av disse modellene er det såkalte "hårnål"-ribozym, hvis aktive sete er avledet av minus-strengen i satellitt-RNA hos tobakk-ringspotvirus (Hampel og Tritz, 1989). Ytterligere selvspaltende RNA-aktiviteter blir assosiert med hepatitt deltavirus (Kuo et al., 1988; Sharmeen et al., 1988; Wu et al., 1989) og med RNAseP (Altmann et al., 1988) .
De forsøkene som gikk forut for arbeidene med den foreliggende oppfinnelse, tjente til sammenligning av virkningen av antisense-RNA, antisense-DNA og ribozymer. Disse forsøkene ble gjennomført ved hjelp av den snRNP U7-avhengige histon-pre-mRNA-prosesseringsreaksjonen, og sågar i et system in vitro som prosesserer U7-avhengig histon-pre-mRNA (Mowry et al., 1987 Soldati et al., 1988). Derved ble funnet at antisense-RNA representerer den sterkeste inhibitoren, hvorved inhiberingen er reversibel. Hemmevirkningen av antisense-DNA og av ribozymer av"hammerhode" typen, begge irreversible, lå innenfor den samme størrelsesorden, hvorved det for fullstendig hemming stundom var nødvendig med et ca. 1000-gangers overskudd i forhold til substrat RNA.
Selvom forsøkene hittil var blitt gjennomført med ribozymer med naken RNA i proteinfrie systemer, var for-forsøkene til den foreliggende oppfinnelse de første eksperimentene som hadde vist at syntetisk fremstilte ribozymer som var innrettet på en spesifikk sekvens, viser spaltevirkning også i proteinholdig miljø. Denne kjensgjerning ga den første hentydning om en potensiell in vivo anvendelse.
En av de begrensende faktorene ved anvendelse av ribozymer til inhibering av ekspresjonen av spesifikke gener turde ligge i oppbyggingen av en ribozymkonsentrasjon som er tilstrekkelig til å bevirke effektiv utkobling av en bestemt biologisk reaksjon; årsakene dertil ligger muligens som ved anvendelse av antisense-RNA blant annet i den altfor lave stabiliteten for RNA.
Til grunn for den foreliggende oppfinnelse lå den oppgaven å tilveiebringe et system for anvendelse av mRNA som in vivo inhibitor for mRNA som fjerner de hittil bestående begrensningene ved anvendelse av RNA, idet det stilles til disposisjon en virksom konsentrasjon av inhiberende RNA i cellen.
Denne oppgaven ble løst ifølge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl, eventuelt foreliggende i multikopi, inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl kjennetegnet ved at det inneholder de nødvendige transkripsjonsenheter til et tRNA-gen for transkripsjon av polymerase III inkludert sekvensene som bestemmer sekundærstrukturen til tRNA'et, og at DNA-sekvensen som koder for et inhiberende RNA-molekyl valgt fra gruppen ribozym eller antisense-RNA er slik anordnet innenfor DNA-molekylet, at det inhiberende RNA-molekyl er del av transkriptet.
Ved løsningen av denne oppgaven gikk man ut fra den overveielsen at ved innføring av et gen som frembringer den inhiberende RNA i motsetning til import av RNA som sådan, burde man ha garanti for en betydelig forsterkning av RNA og dermed et tilstrekkelig RNA-forråd til hemming av de biologiske reaksj onene.
Den inhiberende RNA kan være et hvilket som helst ribozym eller en annen antisense-RNA. Fig. 1 viser en skjematisk tRNA-ribozym-modell.
I prinsippet kunne man tenke seg å gjennomføre en effektiv transport av RNA hhv. den DNA-sekvensen som koder for denne, via virus eller virale vektorer, f.eks. retrovirus.
Dette systemet har imidlertid noen avgjørende ulemper, som mobilisering av endogene virus, rekombinasjon med endogene retrovirus, aktivering av endogene gener ved integrering, begrensning med hensyn til vertsorganisme og vevstype.
I motsetning dertil tilveiebringes derfor ifølge oppfinnelsen bæregener som ikke har disse ulempene.
De genene som foreslås som bæregener for RNA-genene innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, har følgende fordeler: De har en kompakt struktur, de kan pga. sin ringe størrelse lettere transporteres inn i cellen, de har en høy transkripsjonsrate og er i sin ekspresjon ikke begrenset til bestemte vev, men blir uttrykt ubikvitært, dvs. i nesten alle celletyper.
En ytterligere fordel ved polymerase III-genene ligger i tilstedeværelsen av et svært sterkt terminerings-signal for transkripsjon. Derved reduseres sansynligheten vesentlig for at et cellulært gen som ligger i nærheten blir aktivert på uønsket måte.
De genene som er transkribert av polymerase III, har følgende særtrekk: Det dreier seg derved om gener, hvis promotor ikke befinner seg oppstrøms foran genet, men innenfor genet (Geiduschek et al., 1988). Disse for bindingen av polymerase III vesentlig interne kontrollregionene har en diskontinuerlig struktur; de består av to såkalte "bokser" (A-boksen og B-boksen), som er vesentlige for identifikajsonen ved transkripsjonsfaktorene, samt et mellomliggende genavsnitt som er kritisk med hensyn til sin lengde (Hofstetter et al., 1981). Lengden av denne sekvensen utgjør hos tRNA-gener 31-74 basepar (Clarkson).
Representanter for disse genene transkribert av polymerase III er tRNA-genene, 5S-RNA og en rekke andre små kjerne- og cytoplasma-RNA-gener: 7SK, 7SL, M, U6 og 4, 5S RNA, samt adenovirus-genene VAI og VA2 (Geiduschek et al., 1988). Felles for disse genene er deres ringe størrelse, deres kompakte struktur, deres høye transkripsjonsrate og deres ubikvitære transkripsj on.
Det ble overraskende fastslått at det kan oppnås forhøyet stabilitet for den inhiberende RNA ved hjelp av de genetiske enhetene ifølge oppfinnelsen, uten at man behøver å ta hensyn til en skade av dens virksomhet når det gjelder aktivitet.
Det ble vist allerede av Jennings og Molloy, 1987, at en spesfikk promotor gjenkjent av polymerase III er egnet til å styre syntesen av antisense-RNA. Dertil ble Xbal/BamHl fragmentet i VAI-genet, som inneholdt promotoren, klonet i 5'-retningen foran antisense-DNA, hvilket tilsvarer det vanlige prinsippet ved anvendelse av polymerase II-promotorer. Det ble tilstrebet å oppnå et kort transkript sammenlignet med polymerase II-transkripter. Transkriptet har bare en ubetydelig modifikasjon som muliggjør baseparring av endene, for å beskytte endene for nedbrytning ved enkeltstreng-eksonukleaser.
I motsetning til dette forslaget, hvor bare promotor-sekvensen i et spesifikt polymerase III-gen blir anvendt, (området mellom Pos.-30 til 73, mens VAl-genet av villtypen strekker seg til terminator-sekvensen ved pos.+160 - +200), blir ifølge den foreliggende oppfinnelse dessuten de sekvensene i polymerase III-genet målrettet anvendt, som er utslagsgivende for transkriptets sekundærstruktur, for å utnytte disse til stabilisering av de inhiberende RNA-sekvensene. I motsetning til det tidligere beskrevne forslaget er den for den inhiberende RNA kodenden gensekvensen innenfor det av polymerase III transkriberte genet slik anordnet, at det ifølge oppfinnelsen foreligger en genkassett. Utover dette er de innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse anvendte bære-genene i motsetning til det virale VAl-genet ikke toksiske.
De genene som er transkribert av polymerase III, kan anvendes fleksibelt innenfor rammen av oppfinnelsen. Når det gjelder deres funksjon som bære-gener for RNA-inhiberende sekvenser, må man ved utvalg respektive modifikasjon av naturlige gener respektive ved konstruksjon av kunstige gener ta hensyn til følgende kriterier:
1) A- og B-boksen er høyt konservert.
2) Et avsnitt på 5 til 7 T-rester nedstrøms fra B-boksen er ansvarlig for termineringen av transkripsjonen. 3) Avstandet mellom A- og B-boksen kan ikke forstørres vilkårlig, hvorved maksimum for øyeblikket blir antatt ved
omlag 9 0 bp.
4) I noen systemer har den 5'-flankerende sekvensen innflytelse på transkripsjonen. 5) Det finnes henvisninger til at en intakt antikodon-stammeregion er vesentlig for transkriptets stabilitet.
Spesielt egnet som bæregener for fremstilling av DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, er tRNA-gener. Den RNA som er kodet av disse genene, er dessuten på grunn av sin kløverblad- struktur og anse som spesielt egnet til å gi stabilitet til den inhiberende RNA. Med dennes hjelp kan man fremstille kompakte RNA-produserende genenheter, idet den sekvensen som koder for
den inhiberende RNA blir innført mellom A- og B-blokken.
Forsøk innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble gjennomført med startmetionin-tRNA som har et Apa I-restriksjonssete i den antikodonstamme- og sløyferegionen som ligger mellom A-og B-blokken (startmetionin tRNA i alle høyere eukaryoter har dette restriksjonssete i antikodonsløyfen).
I tillegg til den regionen som ligger mellom A- og B-blokken, er også andre innskuddsseter mulig innenfor bære-DNA-sekvensene (tRNA-gener eller andre polymerase III-gener), sålenge som man sørger for at transkripsjonsaktiviteten for polymerase III og transkriptets stabilitet blir bevart.
DNA-molekylene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan allikevel i prinsippet fremstilles med samtlige tRNA; om nødvendig kan man konstruere et egnet restriksjonssete hvori man så skyter inn den sekvensen som koder for den inhiberende RNA. Ved innsettingen må man bare passe på at det ikke blir foretatt noen base-utbytting i antikodon-stammeregionen, som kan påvirke genets transkripsjons-rate eller stabiliteten for den resulterende tRNA (Folk et al., 1983). Dessuten må det tas hensyn til den omstendig-heten at innskudd større enn 6 0 bp kan skade transkripsjonen (Ciliberto et al., 1982).
Når det gjelder valg av egnede bæregener er det i prinsippet verdt å strebe etter'å anvende artsegne tRNA-gener eller andre gener som er transkribert av polymerase III, og som ikke er toksiske.
Forsøkene innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble gjennomført idet ribozymsekvenser ble innført i normale tRNA-gener. Når tRNA-ribozymet som blir transkribert fra dette genet, overveiende er lokalisert i cytoplasma, mens det allikevel er ønskelig for bestemte anvendelser, f.eks. for å inhibere kjerne-spesifikk RNA, f.eks. RNA fra snRNP-partikler, og lokalisere tRNA-ribozymet respektive tRNA-ribozymene, resp. tRNA-antisense-RNA i kjernen, kan det anvendes mutanter som overveiende er lokalisert i kjernen, f.eks met i tRNA-genet beskrevet av Zasloff et al., 1982, og Zasloff 1983, som har en eneste baseutveksling.
DNA-molekylene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan fremstilles f.eks. som følger: En kopi av genet transkribert fra polymerase III, f.eks. et tRNA-gen som inneholdes på et bakterielt plasmid, blir spaltet med et egnet restriksjonsenzym på det setet som er bestemt for innsettingen, f.eks. mellom A- og B-blokken, og den ifølge standardmetoder fremstilte dobbelt-trådede DNA som koder for den inhiberende RNA, innligert. Derved blir egnede vertsorganismer transformert, seleksjonert, formert og den amplifiserte plasmid-DNA utvunnet. Plasmidene blir undersøkt på tilstedeværelsen av den genetiske enheten ifølge oppfinnelsen; dette kan skje ved restriksjons-spalting, sekvensanalyse eller ved påvisning av et funksjonelt transkript av plasmid-DNA in vitro.
De således fremstilte genetiske enhetene kan komme til anvendelse såvel i form av det sirkulære plasmidet som også i form av den fra plasmidet utskårne genenheten som inneholder samtlige nødvendige informasjoner for transkripsjonen ved polymerase III.
Hvilken form som velges, retter seg vanligvis etter anvendelsesområdet og etter det transportsystemet som velges for innføring av gen-enheten i cellen.
DNA-molekylene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan også foreligge som mangfoldiggjorte kopier (derved dreier det seg om tandemstrukturer, hvori de genetiske enhetene er anordnet flere ganger etter hverandre, hvorved de inhiberende innskuddene kan være like eller forskjellige).
Transkripsjon av et slikt tandem gir på grunn av de i hver enkelt enhet inneholdte promotor- og terminerings-signaler, fra hverandre adskilte RNA-enheter. På grunn av denne egenskapen ved fragmentene til å foreligge avvekslende som komplette transkripsjonsenheter, er også orienteringen av de enkelte enhetene til hverandre irrelevant. Ved fremstilling av slike tandem går man ut ifra plasmider som inneholder multimere kopier av den regionen som koder for de inhiberende enhetene. Multimere vektorer som inneholder tRNA-ribozymgener kan fremstilles f.eks., idet man går ut ifra den i eks. 1. beskrevne erbBsnitt-serien, ligerer enkeltfragmentene under anvendelse av T4 DNA-ligase til polymerer, og de polymere genene blir klonet på nytt i et tilsvarende restriksjonssete i en egnet plasmidvektor. Fremstillingen av slike tandem blir muliggjort ved den ringe størrelse av enhetene fremstilt ifølge oppfinnelsen, som fortrinnsvis utgjør 200 til 350 bp. Ved hjelp av slik "tandem-inhibitor" kan man etter fremstilling av et heteromert kompleks av antisense-RNA eller ribozymer teste effektiviteten av en sats av inhibitorer i et enkelt forsøk. For eksempel kan på denne måten innføres en blanding av 5 til 10 ribozymer i et cellesystem. Etter at en inhibering er blitt oppnådd ved hjelp av blandingen, kan de enkelte ribozymene bli undersøkt med hensyn til sin effektivitet. Dette er en fordel spesielt på grunn av den kjennsgjerningen at kriteriene for utvalg av mål-RNA-sekvenser for inhibering, enda ikke alle er uforsket.
Som gode målsekvenser er å anse f.eks. slike regioner som ikke har noen sekundærstruktur, regioner nær spaltesignaler, regioner etter initiasjonskodonet, regioner uten bindingsseter for spesifikke proteiner (som f.eks. Sm-bindingsseter i snRNA-molekyler). Ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse, spesielt ved anvendelse i tandemform, blir det mulig å få opplysninger om slike målsekvenser, og deretter å inhibere dem effektivt.
Anvendelse av tandemenheter er også en fordel når det er nødvendig for inaktivering av biologiske prosesser å spalte RNA, f.eks. viral RNA, på flere steder. En flerfoldig spalting kan oppnås f.eks. ved at et større antall forskjellige ribozymer blir konstruert, og en vektor som inneholder de genetiske enhetene med de aktuelle DNA sekvensene som koder for disse, blir innført i cellene. Ved transkripsjon av disse sekvensene vil ribozym-enhetene lagre seg på de tilsvarende målsekvensene, hvorved mRNA blir spaltet i bruddstykker.
Multimere kopier kan anvendes når det for effektiviteten ved bestemte anvendelser, eksempelvis ved anvendelse av transferrin-polykation-transportsystemet er nødvendig med større mengder av et lavmolekylært ribozym. Plasmider som bærer multimere kopier av den genetiske enheten som inneholder den for dette ribozymet kodende DNA-sekvensen, forbedrer fremstillingen av fragmentet ved'flere gangers forhøyelse av utbyttet.
Tandemenheter kan også anvendes fordelaktig når inhiberende RNA skal tilveiebringes samtidig, og som er innrettet mot forskjellige RNA-typer.
Ved anvendelse av oppfinnelsen på antisense-RNA må man se til at ved tRNA-gener må størrelsen på innskuddet være begrenset. Når det gjelder effektiv transkripsjon ligger størrelses-ordenen ved ca. 60 bp; det må derfor ved anvendelse av større antisense-RNA-konstruksjoner tas i betraktning andre av polymerase III-transkriberte gener, som har større kapasitet når det gjelder transkripsjon av lengre sekvenser.
De bæregenene som kan anvendes innenfor rammen av oppfinnelsen, kan også fremstilles syntetisk, dersom de oppfyller den betingelsen at de har de for transkripsjonen, ved hjelp av polymerase III, nødvendige transkripsjonsenhetene. Anvendelsen av slike syntetiske gener kan bringe med seg følgende fordeler: a) Slike gener blir ikke anerkjent av aminoacylsyntetaser og av ribosomer, hvorved et inngrep i cellens translasjons-maskineri blir forhindret. b) Det består en mulighet for, ved dannelse av en syntetisk konstruksjon å fremstille inhiberende RNA med større
stabilitet og høyere transkripsjonsrate enn med et
naturlig gen.
c) Kloningsprosessen kan utformes mere fleksibelt ved dannelse av syntetiske sekvenser.
Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble det fastslått at stabiliteten av ribozym-tRNA-molekylene kan forhøyes, ved at antikodon-stammeregionen i bære-tDNA-molekylet bli forlenget. Det kunne vises at ved forlengelse av den 5-base-parrede antikodon-stammeregionen i villtype tRNA-genet til 9-basepar, er det mulig å oppnå en 6-dobbelt mengde av transkript sammenlignet med den forkortede villtypen av tRNA-genet, hvilket kan tilbakeføres på en forhøyelse av stabiliteten og den bearbeid-barheten som kan oppnås derved.
Det ble videre fastslått at en forhøyelse av stabiliteten til DNA-molekylene fremstilt ifølge oppfinnelsen i form av tRNA-ribozymgener, eller tRNA-antisensegener også kan oppnås når de for den inhiberende RNA-funksjonen kodende DNA-sekvensene foreligger som del av introns (i tilfelle ribozymer betegnet som"ribintrons"). Derved gikk man ut ifra den overveielse at naturlig forekommende introns ikke forandrer sekundærstrukturen for tRNA-forløpermolekyler og at tRNA-introns ikke viser noen sekvenskonservering, hvorved strukturforandringen i den resulterende tRNA-forløperen kan minimaliseres og dens stabilitet derved maksimeres ved kloning av ribozym- eller antisense-sekvenser som del av introns. Ved hjelp av det innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse anvendte tyr-tRNA-genet, hvorved spleisingen av tRNA-forløpermolekylene bare foregår langsomt, kunne man vise at aktiviteten av rib-tRNA kan forhøyes med god virkning ved anvendelse av tDNA molekyler som inneholder "ribintron"-sekvenser. Derved er det mulig å angripe RNA som er lokalisert forsterket i cytoplasma. Dette systemet muliggjør på enkel måte innbygging av egnede strukturelementer til forhøyelse av "ribintronenes" stabilitet sammenlignet med nedbrytning ved eksonnukleaser. Dette kan oppnås f.eks. ved ytterligere baseparringer eller ved større hårnål-områder som grenser til ribozymsekvensene. Ved modifikasjoner av denne typen må man passe på at de strukturene som er bestemmende for spleisingen av intronet, blir beholdt.
De naturlige intronsekvensene kan modifiseres, f.eks. ved innsetting av egnede restriksjons-snittseter for å muliggjøre kloning av oligonukleotider, eller, dersom de ikke finnes i det naturlig forekommende gen, ved innsetting av nukleotider som muliggjør baseparring med antikodontripletten for å disponere over et ytterligere stabiliserende strukturkjennetegn.
Det kunne vises innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse at ekspresjonen av ribozymer som bestanddel av introns i alt vesentlig ikke medfører noen skade på tRNA-sekundær-strukturen, hvorved det oppståtte transkriptet kan akkumuleres i høyere konsentrasjon og bearbeides korrekt. Dersom det i løpet av bearbeidingen frigjorte intron ikke viser seg tilstrekkelig stabilt, kan man tenke seg egnede struktur-kjennetegn som bevirker en forhøyelse av stabiliteten mot eksonuklease-nedbrytning.
For å bringe DNA-molekylene fremstilt ifølge oppfinnelsen inn i cellen, kan anvendes flere metoder: Standardmetoden til innføring av DNA i vevskulturceller benytter dannelsen av et kopresipitat mellom DNA og kalsiumfosfat (Graham et al., 1973). Presipitatet tilsettes celler som opptar en bestemt andel, muligvis ved en pinocytoseprosess. En lignende metode benytter et positivt ladet stoff, DEAE-dekstran som letter opptaket av DNA i cellen. Det er også blitt utviklet metoder til innføring av DNA i cellen ved elektroporasjon (derved oppstår ved hjelp av et pulserende elektrisk felt forbigående porer)
(Langridge et al., 1987, Fromm et al., 1987). Mikroinjeksjons-teknikker for innføring i store celler (Kressmann et al., 1980) og vevskulturceller (Pepperkok et al., 1988) er likeså anvendbare. Disse metodene er dog bare brukbare i laboratoriet, respektive for in vitro anvendelser. Det er nylig blitt utviklet et syntetisk kationisk peptid (DOTMA), som spontant danner liposomer med DNA, og således letter transporten inn i cellene (Felgner et al.,1987). I prinsippet er som allerede nevnt også retrovirale vektorer egnet til transport av genetisk materiale inn i cellene (Stewart et al., 1986, 1987); disse systemene har imidlertid de allerede anførte ulempene.
En ytterligere transportmekanisme beror på å benytte "avvæpnede" toksiner som transportmidler. De hittil anvendte transportmetodene er alle sammen beheftet med den mangelen at de ikke kan befordre tilstrekkelig inhiberende nukleinsyre inn i cellen. Ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse er det nå mulig pga. molekylenes ringe størrelse og kompakthet, når det gjelder transportkapasiteten å oppnå en økning av antallet aktive inhibitorenheter. Pga. av den ringe størrelse og kompakte struktur av de genetiske enhetene ifølge oppfinnelsen kan man også etter ubetydelige modifikasjoner, f.eks. konjugasjon med kolesterin, lipofile'motioner eller kjernelokaliseringspeptider også fullstendig gi avkall på et transportsystem.
Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, foretrekkes det å anvende et løselig system for transporten som foregår via reseptorformidlet endocytose. Spesielt foretrekkes derved et transferrin-polykationkonjugat som er kompleksert med DNA-molekylet fremstilt ifølge oppfinnelsen; komplekset blir opptatt via transferrin-reseptoren som er tilstede på praktisk talt alle voksende celler.
Anvendelsesområdene for DNA-molekylene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er tallrike: For eksempel kan det fremstilles transgene dyr som på grunn av tilstedeværelsen av DNA- molekylet fremstilt ifølge oppfinnelsen i sitt genetiske materiale har en intracellulær immunitet mot virus, f.eks. munn- og klov-sykevirus, Newcastle sykdomsvirus, storfepapillomavirus, pseudorabies eller infektiøs gastroenteritt. Tilsvarende kan også frembringes intracellulær immunitet i transgene planter, f.eks. mot potetvirus PVX.
Videre kan DNA-molekylene fremstilt ifølge oppfinnelsen innføres i somatiske celler for å sette inn mot patogene virus, som HIV eller beslektede retrovirus, rettede ribozymer hhv. antisense-RNA til bekjempelse av disses virale stimulanter.
Et ytterligere anvendelsesområde ligger i genterapien ved anvendelse av RNA konstruksjon med komplementaritet til onkogener og andre nøkkelgener, som kontrollerer veksten og/eller differensieringen av celler. Ved slike anvendelser er det viktig med den høye spesifisiteten for RNA inhiberingen som kan oppnås virksomt ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse, og med hvis hjelp det er mulig, f.eks. å skille mellom protoonkogen-og onkogentranskripter.
Videre kan de genetiske enhetene anvendes i planter eller dyr for å forhindre ekspresjon av spesifikke gener, for på denne måten å bringe frem ønskede egenskaper.
Den inhiberende virkningen av RNA kan også utnyttes ved bekjempelse av sykdommer på den måten at produksjonen av uønskede genprodukter blir forhindret, f.eks. produksjonen av hovedplakk-proteinet ("major plague protein") som opptrer ved Alzheimers sykdom eller av proteiner som forårsaker autoimmun-sykdommer.
Den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i de tilfellene hvor et regulatorprotein, som har en vekselvirkning med RNA, skal kobles ut ved tilleiring eller tilpassing av RNA.
Ved hjelp av de innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse gjennomførte forsøk kunne påvises transkripsjonsaktivitet hos tDNA-ribozymgenet. Dertil ble fremstilt en tDNA-ribozymgenkonstruksjon, idet en DNA-sekvens som koder for et 53 bp langt ribozym rettet mot snRNA U7-sekvensen ble innsatt i Apal restriksjonssetet mellom A-boksen og B-boksen i'startmetionin tDNA (A- og B-boksen er de to gjenkjennelsessekvensene for polymerase; transkripsjonen begynner 15 bp oppstrøms fra A-boksen og slutter i en oligo T-sekvens nedstrøms fra B-boksen). Etter mikroinjeksjon av dette genet, ble transkripsjon påvist; konsentrasjonen av tRNA-ribozymhybridet var 10-20 % av konsentrasjonen av tRNA, som ble produsert av et koinjisert villtype tRNA-gen.
RNA-molekyler, syntetisert in vitro fra tRNA-ribozymgen, spalter mål-RNA på det forutsette stedet. Tilføyelsen av tRNA-strukturen til ribozymsekvensen blokkerer ikke ribozymaktiviteten. tRNA-ribozymmolekyler, syntetisert av gener som er blitt injisert i oocytter, spalter mål-RNA likeså på de forutsette stedene og med den samme effektivitet som in vitro syntetiserte ribozymer uten den ytterligere tRNA-strukturen. Det beviser at in vivo syntese og prosessering av et tRNA-ribozym ikke inngår med modifikasjoner som forhindrer virkningen av ribozymet.
Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse ble først påvist in vivo aktiviteten av et ribozym. Dertil ble tDNA/ribozymgenet injisert sammen med radioaktivt merket GTP i kjernen av oocytter. Etter 8 timers inkubasjon som var forutsett for ribozym-syntesen, ble den radioaktivt merkede substrat RNA (U7 RNA) injisert i oocyttenes cytoplasma. Etter ytterligere 2 timer ble nukleinsyren fra oocyttene preparert: I de oocytter hvori ribozym-syntesen hadde funnet sted, ble ikke påvist noe blivende substrat RNA. I motsetning dertil var substrat RNA stabil i de oocyttene som ikke var blitt injisert med tDNA/-ribozymgen hhv. hvor genet ikke hadde truffet kjernen.
Det kunne også vises innenfor rammen av den foreliggendeoppfinnelse at tDNA-ribozymene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan inhibere den transformerende virkningen av et onkogen. Ved hjelp av erytroide hønseceller, transformert med erbB-onkogenet, ble aktiviteten av et tRNA-ribozym påvist i erytrocytter via den differensieringen som inntrådte ved inhibering av erbB-ekspresjonen.
Effektiviteten av de genetiske enhetene kan også kontrolleres ved betraktning av musecellers motstand mot infeksjoner, eksempelvis polyomainfeksjoner, etter anvendelse av genetiske enheter fremstilt ifølge oppfinnelsen, som er rettet mot viruset (eventuelt mot flere regioner), f.eks. mot papilloma-viruset.
Eksempel 1
Konstruksjon av tRNA-ribozymgener
a) Konstruksjon av pSPT18metl
Metionininitiatoren 1-tRNA-genet fra Xenopus. tilstede på et
284 bp EcoRI-fragment, som var klonet inn i pBR322 (Hinfl H-G-fragment (Hofstetter et al., 1981, Tellford et al., 1979), ble isolert ved EcoRI spaltning av pBR322 vektoren, renset ved gelelektroforese (2 % agarose/TBE) og ligert inn i EcoRl-setet i det bakterielle plasmidet pSPT18 (Boehringer Mannheim) slik at det ved transkripsjon av plasmidet med SP6-polymerase ble oppnådd et sense-tRNA-transkript. Til dette ble anvendt standard klonings-metoder beskrevet i (Maniatis). Hovedfordelen med omkloningen av tRNA-genet i pSPT18 ligger i tilstedeværelsen av SP6- og T7-RNA polymerasepromotorer som ligger tvers overfor hverandre på plasmidet. Derved kan ved in vitro transkripsjon oppnås spesifikke RNA transkripter som enten inneholder tRNA-ribozym-sekvensen eller den dermed komplementære sekvensen (Melton et al.,1984). Disse transkriptene er nyttige til å teste RNA-molekylets spalteaktivitet eller til å påvise ved en "RNase Protection Mapping" tilstedeværelsen av tRNA-ribozymer i celleekstrakter som uttrykker tRNA-ribozymet.
b) Konstruksjon av tRNA-ribozymgener
tRNA-genet på pSPT18metl ble spaltet på det eneste Apal setet
i antikodonstamme- og sløyferegionen (se fig. 2). Denne figuren viser plasmider som inneholder sekvenser som koder for tRNA ribozym. pSPT18 metl inneholder det 284 bp EcoRl-fragmentet, som bærer Xenopus laevis initiator tRNA-genet. Det dreier seg derved om G-H fragmentet (Hofstetter et al., 1981), klonet inn i EcoRl-setet til polylinkeren i pSPT18. De komplementære oligonukleo-tidene som koder for ribozymer, og som er rettet mot U7snRNA (CD33 og begge sekvensene i erbB-mRNA (ES13, ES53), er vist. Den her anvendte klonings-strategi førte til fjerning av de ovenstående endene i Apal-setet i tRNA-genet. Den andelen av innskuddene som koder for ribozymet og de regionene som er komplementære til mål-RNA (anti-U7, anti-erbB) blirkarakterisert, likesom A- og B-
boksen, avsnittet i 5 T-resten (terminasjonssignal) og transkrip-sjonsinitiasjonssetene. Plasmidet inneholder ColEI replikasjons-opprinnelsen, en ampicillin-resistensmarkør og promotorene for T7-og SP6-RNA-polymerase.
Til fremstilling av dobbelttrådede syntetiske DNA-oligonukleotider som koder for den viroide spaltesekvensen (Haseloff et al., 1988) flankert av de til mål-mRNA komplementære sekvensene, ble først fremstilt enkelttrådede oligonukleotider etter standardmetoder (Applied Biosystems DNA synthesizer). Komplementære oligonukleotider ble fosforylert, anilert og innligert i det Apal-spaltede pSPT18metl plasmidet under anvendelse av standardmetoder (Maniatis). Ligeringsblandingen ble anvendt til transformasjon av E.coli HP101, bakterikloner som inneholdt det nye plasmidet, ble isolert og tilstedeværelsen av aktive ribozymsekvenser på det bakterielle plasmidet bekreftet på to arter: 1) RNA-molekyler som stammet fra in vitro SP6-transkripsjonen av klonede DNA-plasmider, ble inkubert med en radioaktivt merket RNA som inneholdt målsekvensen for ribozymet, og testet på spesifikk spalting av mål-RNA (se fig. 4). 2) Tilstedeværelsen av korrekt innsatte DNA-sekvenser ble bekreftet ved dideoksy-DNA-sekvensering over innskudds-setet.
Fig. 4 viser in vitro ribozymaktiviteten for tRNA-ribozymer. Plasmid-DNA-molekyler, som var erBsnitt-tRNA-ribozymene ES13 og ES53, ble spaltet med PvuII og transkribert med SP6-RNA-polymerase. Denne transkripsjonen ga 23 0 nukleotid lange RNA-molekyler som inneholder tRNA-ribozymsekvensen og dessuten de5'- og3'-flankerende sekvensene, som stammer fra de flankerendeXenopus-sekvensene og de flankerende bakterielle plasmidsekven-sene. (Se fig. 2). Ribozymtranskriptene ble inkubert med 20.000 cpm (20 fM) av et RNA-molekyl med regionen til erbB-mRNA, omfattende initiasjonskodonet. RNA-molekylet inneholder målsekvensene både for ES13 og ES53 (se fig. 3). Etter 2 timers inkubasjon av ribozymet plus mål-RNA ved 37°C i nærvær av 10 mM MgCl2, 20 mM TRIS-HC1, pH 7,5 og 150 mM NaCl, ble tilsatt EDTA til en konsentrasjon på 15 mM, prøven ble tørket, løst i 80 % formamid/TBE, oppvarmet i 30 sek. ved 95°C og separert på en 9,5 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel. Etter elektroforesen ble de merkede RNA-molekylene påvist ved auto-radiografi.
Spor M: Molekylvektsmarkør: pBR322 DNA, spaltet med Hpall og radioaktivt merket med alfa-32p-CTP under anvendelse av Klenow-fragmentet i DNA-polymerase (Maniatis). Molekylvekts-markøren ble umiddelbart før påføringen på gelen løst i 80 % formamid/TBE og oppvarmet i 3 minutter ved 95°C. Molekylvektene for noen av fragmentene (i nukleotider) er angitt til venstre.
Spor 1: erbB-mål-mRNA (20.000 cpm, 20 fM) uten inkubering
Spor 3: erbB-mål-mRNA (20.000 cpm, 20 fM), inkubert med MgCl2ved 3 7°C uten ribozymer.
Spor 4: erbB-mål-mRNA (20.000 cpm, 20 fM), inkubert med ES13-RNA
(1 fM)
Spor 5: erbB-mål-mRNA (20.000 cpm, 20 fM), inkubert med ES53-RNA
Til venstre på figuren er angitt molekylvektene (i nukleotider) for erbB-mål-mRNA og 5'- og 3'-spalteproduktene fra begge ribozym-spaltereaksjonene. (se også fig. 3).
Fig. 3 viser komplementariteten mellom ribozymer og mål-RNA: CD33 (A) mot U7snRNA (Cotten et al., 1988), ES13 (C) og ES53 (B) mot sekvenser i erbBmRNA (Venustrom et al., 1980).
tRNA-andelen av tRNA-ribozymene er ikke vist på grunn av oversiktligheten. Spaltestedene for ribozymet er tilkjenne-gitt, likeså initieringskodonene i erbB-mRNA.
Eksempel 2
tRNA-ribozymtranskripsjon i Xenopus oocytter
Transkripsjonen av tRNA-ribozymgenene, mikroinjisert i Xenopus-oocytter, ble gjennomført ifølge den metoden som er beskrevet for tDNA i (Kressman et al., 1978, Hofstetter et al., 1981, Kressmann et al., 1980). Dessuten gikk man frem som følger: Stadium VI oocytter fikk man fra voksne hundyr av Xenopus laevis stimulert med HCG (Humant korion gonadotropin). Oocyttene ble kort sentrifugert for å bringe kjernen til randen av oocyttene. Hver kjerne ble injisert med ca. 50 ni av en løsning som inneholdt 0,3 ixg/ fil supertvunnet plasmid DNA (inneholdende tRNA-ribozymgenet ifølge eks. 1) og 2/iCi//xl 32p-GTP. Etter 5 til 8 timers inkubering ved 2 0°C ble de enkelte injiserte oocyttene spaltet i 1 % SDS, 1 mg/ml proteinase K, 300 mM NaCl, 20 mM tris, pH 8, 20 mM EDTA (400 ^il/oozyt) ved 37°C i 45 min, ekstrahert en gang med fenol og en gang med fenol/kloroform og utfelt med etanol. De samlede etanol-presipitatene ble løst i 80 % formamid/TBE, kort oppvarmet for denaturering ved 95°C og separert ved elektroforese på en10 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel og gjort synlig ved autoradiografi. Ved alle forsøkene med tRNA-ribozymgener inneholdt injeksjonsløsningene villtype metRNA-genet i en konsentrasjon på 1/6 av konsentrasjonen av tRNA-ribozymgenet. TBE-buffer (tris, borat, EDTA) ble fremstilt ifølge forskriftene, beskrevet i (Maniatis).
Resultatet av disse forsøkene viser fig. 5:
Spor m: Molekylvektmarkør: som i fig. 4. Molekylvektene av noen av fragmentene (i nukleotider) er angitt til venstre i figuren. Sporene 1, 2, 3: Nukleinsyrene fra enkelt-oocytter, injisert med met-tRNA-genet og met-tRNA-ribozymgenet metribo 33. Til høyre i figuren er angitt posisjonene for met-tRNA (met, 77 nukleotider lang) og for tRNA-ribozymet (met ribo), 128 nukleotider langt.
Eksempel 3
Bestemmelse av ribozymaktiviteten til tRNA-ribozym syntetisert av oocytter, sammenlignet med in vitro syntetisert ribozym som ikke har tRNA-sekvenser.
Et tRNA-ribozym syntetisert i mikroinjiserte oocytter og rettet mot U7, ble fremstilt ved separasjon ved hjelp av elektroforese, synliggjort ved autoradiografi, skåret ut av polyakrylamidgelen og eluert ved inkubering over natten i en Eppendorf vibrator i HEP ("Heidelberg Extrationspuffer": 0,75 M ammoniumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 1 % (vol/vol) fenol, 0,1 %
(vekt/vol) SDS, 0,1 mM EDTA). Den eluerte RNA ble ekstrahert en gang med fenol/kloroform og en gang med kloroform, og utfelt med etanol i nærvær av 10 fig E.coli tRNA som bærer. Bunnfallet ble opptatt og kvantitativt bestemt ved hjelp av Cerenkov-telling av
32p-merkingen under anvendelse av verdiene for den spesfikke aktiviteten (Kressmann et al., 1982). Prøver av tRNA-ribozymet ble inkubert med 32p-merket RNA som inneholdt U7-sekvensen (10.000 cpm/prøve, 10 fM pluss de angitte mengdene av umerket U7-RNA) i 2 timer ved 37°C i nærvær av 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2og 10 mM tris-HC1, pH 7,5. Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av EDTA inntil 15 mM, prøvene ble tørket, løst i 80 % formamid/TBE, oppvarmet ved 95°C i 3 0 sek. og separert på en forvarmet 9,5 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel. De radioaktivt merkede RNA-typene ble synliggjort ved autoradiografi ved -80°C med en Dr. Goos "special" forsterkerfolie.
Ribozymet CD32 ble fremstilt ved T7-polymerasetranskripsjon av et plasmid, inneholdende innskuddet fra CD33 (se fig. 2) og klonet i Hindlll/Sall-setene i pSPT19 (Boehringer Mannheim). Dette transkriptet inneholder bare ribozym-sekvensen pluss de sekvensene som er komplementære til U7, flankert av korte avsnitt av vektor-sekvensen. Dette ribozymets spalteaktivitet ble trukket frem som sammenligning med spalteaktiviteten for oocytt-syntetiserte tRNA-ribozymet CD33, for å bedømme innflytelsen av sekundær-strukturen til tRNA samt in vivo syntesen og -modifikasjonen på ribozym-aktiviteten. Det viste seg at begge ribozymene (CD32 og CD3 3) spalter den RNA som inneholder U7-sekvensen (94 nukleotider lang) i et 5'-spalteprodukt med 25 nukleotider og et 3 '-spalteprodukt med 69 nukleotider.
Resultatet av disse forsøkene er vist i fig. 6:
Spor m: Molekylvektsmarkør analog med fig. 5.
Spor 1: U7-RNA (10.000 cpm, 10 fM), inkubert uten ribozym
Spor 2: U7-RNA (10.000 cpm, 100 fM), inkubert med 10 fM av det
oocytt-syntetiserte tRNA-ribozymet CD33
Spor 3: U7-RNA (10.000 cpm, 1 pM), inkubert med 10 fM av oocytt-syntetisert tRNA-ribozym CD33
Spor 4: U7-RNA (10.000 cpm, 100 fM), inkubert med 10 fM av
ribozym CD32 syntetisert in vitro med T7-polymerase. Spor 5: U7-RNA (10.000 cpm, 100 fM), inkubert med 1 fM av ribozym CD32 syntetisert in vitro med T7-polymerase.
Eksempel 4:
Bestemmelse av spalting av ribozymsubstrat i oocytter
En blanding av<32>P-GTP, anti U7-tRNA-ribozymgen og met-tRNA-genet ble injisert i oocytt-kjerner. Som beskrevet i eks. 2 ble de injiserte oocyttene inkubert ved 20°C i 8 timer, for å la transkripsjonen finne sted. Deretter ble injisert radioaktivt merket U7-RNA (50 ni, 100.000 cpm//xl, 100 fM/pil) i oocyttenes cytoplasma. Deretter ble oocyttene inkubert i 2 timer.Fremstillingen av nukleinsyrene av enkelt-oocytter og deres adskillelse ved hjelp av gelelektroforese ble gjennomført som beskrevet ovenfor.
Resultatet av disse forsøkene er vist i fig. 7.
Spor m: Molekylvektsmarkør som fig. 5
Spor 1: Nukleinsyrer fra en oocytt injisert med met- og
metribo-genene
Spor 2 og 3: Oocytter injisert med met og metribo, etterfulgt av
U7-RNA-injeksjon
Spor 4 og 5: Oocytter injisert bare med U7-RNA
Spor 6: En alikvot av U7-RNA anvendt for injeksjon
Spor 7: U7-RNA (10 fM), inkubert med ribozymet CD32 (10 fM)
i løpet av 2 timer ved 37°C i nærvær av 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2og 20 mM tris-HCl, pH 7,5. På grunn av gelbetingelsene er vist bare 3'-spalte-produktet (69 nukleotider).
Eksempel 5
Transkripsjonsaktivitet av tRNA-ribozymer i hønseceller.
Plasmid-DNA-molekyler, inneholdende tRNA-ribozymgenene ble innført i hønseceller for å bestemme genenes transkripsjonsaktivitet. Det ble vist at tRNA-ribozymgenet (avledet av et Xenopus-tRNA-gen) blir effektivt transkribert i hønseceller.Herved gikk man frem som følger: IO<6>primære hønse-embryo-fibroblastceller (Zenke et al., 1988) ble utsådd pr. 10 cm skål ifølge standardmetode, og fikk vokse over natten. Om morgenen ble hver skål transfisert med 10 fig plasmid-DNA (inneholdende enten erbBsnitt 13 eller erbBsnitt 53) under anvendelse av kalsiumfosfat-kopresipiteringsmetoden (Graham et al., 1973). Cellene ble i løpet av natten utsatt for presipitatet, den følgende morgen vasket 2 ganger med friskt medium og inkubert ytterligere 48 timer i friskt medium. Mediet ble deretter fjernet, cellene opptatt i PK/SDS-buffer (se ovenfor), og nukleinsyren gjenvunnet. Deretter ble nukleinsyren underkastet en "RNAse Protection Mapping" under anvendelse av 32p-merket antisense erbBsnitt 13 eller erbBsnitt 53 RNA-sonder for å påvise tilstedeværelse av tRNA-ribozym transkripter. Merket RNA (10.000 cpm/10 fM antisense-RNA pr. prøve) ble tilsatt til det tørkede etanolbunnfallet, prøven ble tørket igjen og løst i 10 fil av 80 % avionisert formamid, 400 mM NaCl, 20 mM PIPES, pH 6,5, 10 mM EDTA. Prøvene ble oversjiktet med steril parafinolje, oppvarmet 3 minutter ved 95°C og raskt overføt i et 45°C vannbad, som fikk stå i ro over natten. Om morgenen ble tilsatt 0,3 ml iskald NaCl (300 mM), 3 0 mM tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,05 mg pr. ml RNase A og 8 0 enheter/ml RNase Tl, under rask, forsiktig bevegelse. Prøvene fikk stå ved romtemperatur i 45 min. Proteinase K og SDS ble tilsatt til 1 mg/ml og 0,5 %, inkubasjonen fortsatt ved romtemperatur og deretter ved 56°C i 20 min. Etter tilsetning av 10 fig tRNA ble prøven utfelt med etanol. Det opptatte bunnfallet ble tatt opp i 80 % formamid/TBE og separert på en forvarmet 9,5 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel.
Resulatet av disse forsøkene er vist i fig. 8:
Spor m: Molekylvektsmarkør som i eksemplene foran.
Spor 1: Antisense ES 13-probe, hybridisert med E. coli tRNA
(10 fig)
Spor 2: Antisense ES 53-probe, hybridisert med E. coli tRNA Spor 3 og 4: Kartlegging av nukleinsyrene fra 10.000 og 100.000
celler som ikke var blitt transfisert med plasmid
DNA, hybridisert med ES 13-proben
Sport 5 og 6: Kartlegging av nukleinsyrene fra 10.000 og 100.000
celler, transfisert med ES 13, hybridisert med ES
13-proben.
Sport 7 og 8: Kartlegging av nukleinsyrene fra 10.000 og 100.000
celler, transfisert med ES 53, som var blitt hybridisert med ES 53-proben.
Eksempel 6
Svekkelse av virkningen av v-erb B onkogenet ved tDNA ribozym-gener, som ble innført ved hjelp av polylysin-transferrin-konjugater i v-erb B transformerte erytroblaster.
Ved hjelp av dette eksempelet kunne det vises at tDNA ribozymer som er rettet mot erb B onkogenet, kan innføres ved hjelp av polylysin-transferrin-konjugater i erb B transformerte hønseerytroblaster og svekke den transformerende virkningen av onkogenet.
Forforsøk 1
Fremstilling av transferrin-polylysin-konjugater
Sammenkobling fulgte analogt med metoder kjent fra litteraturen (sml. G. Jung, W. Kohnlein og G. Liiders, Biochem. Biophys.Res. Commun. 101 (1981), 599) ved innføring av disulfidbroer etter modifisering med succinimidylpyridyltitio-propionat.
Pyridiylditiopropionat-modifisert transferrin 1:
6 ml av en over Sephadex G-25 gelfiltrert løsning av 120 mg (1,5fxmol) transf errin (fra hønseeggehvite, Sigma, Conalbumin type I, jernfri) i 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,8) ble tilsatt under god rysting 200 \ xl av en 15 mM etanolisk løsning av succinimidylpyridyltiopropionat (SPDP, Pharmacia) og fikk omsette seg i en time ved romtemperatur og leilighetsvis rysting. Over en gelkolonne (Sephadex G-25, 14 x 180 mm, 0,1 M natriumfosfatbuffer pH7,8) ble lavmolekylære reaksjonsprodukter og reagensrester fraskilt og derved oppnådd 7 ml av produkt-fraksjonen; inneholdet av pyridylditiopropionat-rester bundet til transferrin ble bestemt ved hjelp av en alikvot etter reduksjon med ditiotreitol ved fotometrisk bestemmelse av mengden av frigjort pyridin-2-tion, og var ca'. 2,6fimol.
Mercaptopropionat-modifisert polylysin 2:
En løsning av 18 mg (ca. 1,0/xMol) poly (L) lysin - hydrobromid (Sigma, fluoresceinisotiocyanat ( = FITC) - merket, molekylvekt ca. 18.0 00/tilsvarende en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad på ca. 90) i 3 ml 0,1 M natriumfosfat (pH 7,8) ble filtrert over Sephadex G-25. Polylysin-løsningen ble fortynnet med vann til
7 ml, under god risting tilsatt 270 fil av en 15 mMol etanolisk løsning av SPDP, og fikk omsette seg 1 time i mørke ved romtemperatur og under leilighetsvis omrysting. Etter tilsetning av 0,5 ml 1 M natriumacetat-buffer (pH 5,0) ble for fraskilling av lavmolekylære substanser filtrert over Sephadex G-25 (eluerings-middel: 20 mM natriumacetat-buffer, pH 5,0). Produktfraksjonen (ninhydrinfarging, fluorescens) ble inndampet i vakuum, bragt til pH ca. 7 med buffer, tilsatt en løsning av 23 mg (150//mol) i ditiotreitol i 200 fil vann, og fikk stå en time ved romtemperatur under argon i mørke. Ved ytterligere gelfiltrering (Sephadex G-25, 14 x 130 mm søyle, 10 mM natrium-acetat-buffer pH 5,0) ble fraskilt fra overskudd av reduksjons-middel og man oppnådde 3,5 ml produktløsning av fluorescens-merket polylysin med et innhold av 3,8 mol merkaptogrupper (fotometrisk bestemmelse av Ellman's reagens, 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre) ).
Transferrin-polylysin-konjugater 3:
Den som ovenfor beskrevet oppnådde løsningen av modifisert transferrin 1 (7 ml i 0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,8, ca. 1,5/imol transf errin med ca. 2,6/j,mol pyridylditiopropionatrester) ble spylt med argon; det ble tilsatt 2,0 ml av den ovenfor beskrevne løsningen av merkaptomodifisert polylysin 2 (i 10 mM natriumacetat-buf f er pH 5,0, det tilsvarer ca. 0,6/imol polylysin med ca. 2,2/xmol merkaptogrupper), spylt med argon, rystet, og fikk omsette seg i 18 timer ved romtemperatur i mørke og under argon. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann til 14 ml og separert ved ionebyttekromatografi (Pharmacia Mono S kolonne HR10/10, gradienteluering, buffer A: 50 mM HEPES pH 7,9, buffer B: A + 3 M natriumklorid, 0,5 ml/min). Ikke-konjugert transferrin ble eluert til å begynne med, produktfraksjonene ved ca. 0,66 - 1,5 M natriumklorid. De konjugerte produktene (ninhydrinfarging, i UV ved 280 nm proteinabsorpsjon, og fluorescens) ble samlet i 6 fraksjoner med et innhold i hver på ca. 10 mg transferrin. Fraksjonene ble deretter dialysert mot en 100 mM jern(III)citrat-løsning (bragt opp til pH 7,8 med natriumhydrogenkarbonat), og deretter ytterligere to ganger mot 1 mM HEPES-buffer (pH 7,5).
Natriumdodecylsulfat-gelelektroforese (10 % SDS, 8 % polyakrylamid) viste ved forbehandling med 2-merkaptoetanol i alle 6 fraksjonene et omtrent likt innhold av transferrin, mens det i ikke-reduserte prøver ikke var synlig noen bånd for fritt transferrin, men bare konjugater som vandret kortere.
Forforsøk 2
Transport av transferrin-polylysin-konjugater i levende celler.
For å påvise at de i forforsøk 1 beskrevne transferrin-polylysin-konjugatene blir opptatt effektivt i levende erytroblaster, ble disse konjugatene merket med FITC. Det er kjent (Schmidt et al., 1986), at FITC-merket transferrin etter noen timers inkubering med erytroblaster hvorifra transferrin var blitt fjernet på forhånd, kunne påvises i vesikler inne i cellen (undersøkelse i fluorescensmikroskop).
I forliggende eksempel ble erytroblaster (transformert ved enEGF-reseptor-retrovirus, Kahazaie et al., 1988) inkubert i 18 timer i transferrinfritt differensieringsmedium (sammensetning i Zenke et al., 1988) ved 37°C (cellekonsentrasjon 1,5 x10<6>/ml). Etter tilsetning av de forskjellige transferrin-polylysin-konjugatene (eller som kontroll av den tilsvarende mengde sterilt aq bidest) ble cellene inkubert ved 3 7°C i nærvær av10 ng/ml EGF (for å opprettholde den transformerte tilstanden). Etter 24 og 48timer ble uttatt ca. 5 x IO<5>celler, vasket en gang i fosfat-buffret fysiologisk koksalt-løsning (PBS; pH 7,2), fiksert med det50-dobbelte volumet av en blanding av 3,7 % formaldehyd og 0,02 % glutaraldehyd i PBS (10 min, 40°C), vasket 1 gang i PBS, innleiret i elvanol og undersøkt i fluorescens-mikroskop (Zeiss Axiophot,Smalbånd-FITC og TRITC-impuls). Samtidig ble cellenes vekst-hastighet bestemt i andre alikvoter av de forskjellige ansatsene. Hertil ble uttatt 100 fil cellesuspensjon og innbyggingen av<3>H-thymidin (8£tCi/ml, 2 timer) bestemt, som beskrevet i Leutz et al.,1984. Av fig. 10 går det frem at de med transferrin-polylysin inkuberte erytroblastene etter 24 timer fremviser 2 til 10 sterkt fluorescerende vesikler, som ikke lar seg påvise i kontrollene. Tabell A viser at med unntak av fraksjon 6, er alle konjugatene blitt opptatt av praktisk talt alle cellene.
Den kjennsgjerning at cellene i alle prøvene vokser like raskt (som målt ved innbygging av tritiert thymidin (<3>H TdR) ; tabell A) beviser at cellene ikke blir skadet av polylysin-konstruktene og at et uspesifikt opptak (f.eks. gjennom celle-membraner som er blitt gjennomtrengelige) derfor kan utelukkes.
Forforsøk 3
Polylysin-transferrinkonstruksjoner kan ved den in vitro-induserte modningen av hønseerytroblaster til erytrocytter funksjonelt erstatte det naturlige transferrin-jernkomplekset.
Det var hensikten med dette forsøket å vise at de her anvendte transferrin-polylysin-konjugatene blir anvendt av cellen som naturlig transferrin, dvs. at de gjennomløper den normale transferrin-syklus med lignende effektivitet. Som testsystem herfor er erytroblaster som ved "frakobling" av det transformerende onkogenet kan induseres til modning til normale erytrocytter, spesielt egnet (Beug et al., 1982). Fra litteraturen går det frem at slike celler for normal modning krever høye konsentrasjoner av transferrin-jernkompleks (100 - 200 ug/ ml), 3 ganger lavere konsentrasjoner forhindrer modningen av cellene og fører etter flere døgn til celledød (Kowenz et al., 1986). Det kunne også vises (Schmidt et al., 1986), at "resirkulering", altså gjenanvendelse av transferrinreseptorer og dermed en transferrin-syklus som foregår med optimal hastighet er nødvendig for normal in vitro differensiering.
Erytroblaster (transformert ved EGF-reseptorretroviruset) ble indusert til differensiering ved uttrekk av EGF og tilsetning av en optimal mengde av partielt renset hønseerytropoietin (Kowens et al., 1986, fri for transferrin). Inkuberingen foregikk ved en cellekonsentrasjon på 1 x 10<6>/ml i transferrinfritt differensieringsmedium ved 42°C og 5 % C02. Ved begynnelsen av inkuberingen ble tilsatt enten naturlig transferrin-jern-kompleks (Sigma, 100 /ig/ml) , eller transferrin-polylysin-konjugater mettet med jern (konsentrasjon likeså 100 //g/ml) . Cellenes vekst og modnings-tilstand ble analysert på følgende måte etter 24 og 48 timer: 1. Bestemmelse av celletallet (i Coulter Counter, Modell ZM, Beug et al., 1984) 2. Opptak av cellestørrelsesfordeling (i Coulter-Charmelyzer
Model 256) og
3. Fotometrisk måling av hemoglobininnholdet i cellen (Kowens et al., 1986)
Dessuten ble alikvoter av ansatsene etter 72 timer sentrifugert i en cytosentrifuge (Shandon) på objektglass og underkastet en histokjemisk påvisning for hemoglobin (farging med nøytralt benzidin pluss Diff-Quick hurtigfargning for blodceller, . Beug et al., 1982) .
Resultatene i tabell B viser tydelig at celler som i nærvær av polylysin-transferrinkonjugater, ble indusert fraksjon 1 til 5 for differensiering, vil modnes like så effektivt og med samme hastighet som slike som ble inkubert med naturlig transferrin-jern. Cellene i den transferrinfrie kontrollen viste derimot en sterkt redusert cellevekst, og akkumulerte bare små mengder hemoglobin. Undersøkelse av celle fenotypen på fargede cytospin-preparater viste at de cellene som var inkubert med polylysin-transferrinkonjugater var blitt modnet på samme måten til sene retikulocytter (late reticulocytes, Beug et al., 1982) som de som var behandlet med naturlig transferrin, mens de cellene som var inkubert uten transferrin, utgjorde en blanding av desintegrerte og umodne, erytroblast-lignende celler (Schmidt et al., 1986). Bare de cellene som var behandlet med transferrin-polylysin-fraksjon 6 hadde et lavere hemoglobin-innhold og en høyere prosentsats av umodne celler (tabell B). Dette viser at fraksjon6som var konjugert med spesielt mye polylysin, fungerer mindre godt i transferrin-cyklusen. Samtidig henviser dette resultatet til testmetodens følsomhet.
Forforsøk 4
Polylysin-transferrinkonjugater muliggjør opptak av DNA i hønseerytroblaster.
I det foreliggende forsøk skulle undersøkes om DNA kan transporteres effektivt av transferrin-polylysinkonjugater inn i cellens indre i en størrelse som tilsvarer størrelsen av tDNA-ribozymer (se eks. 1). I det foreliggende eksempelet ble anvendt tDNA med et innskudd med sekvensen.
Molekylvekt ca. 3 00.00, endemerket med gamma<32>P ATP (Maniatis) . Omlag 0,3/ig av denne DNA, løst i 20/il TE-buffer, ble enten blandet med 10/ig naturlig transferrin, med 10/ig transferrin-polylysinkonjugat fraksjon 3, hver gang løst i 50/il ag bidest pluss 400 /ig/ml storfeserumalbumin (Beug et al., 1982) eller med 50/xl av dette løsningsmiddelet uten transferrin. DNA-proteinblandingene ble tilsatt til 2 ml transferrinfritt differensieringsmedium, 4 x IO<6>hønseerytroblaster, som var tranformert med et EGF-reseptor retrovirus og ble forinkubert i 18 timer i transferrinfritt medium i nærvær av EGF, (Kahazaie et al., 1988) tilsatt, og ansatsene inkubert i 8 timer ved 3 7°C og 5 % C02. Deretter ble cellene frasentrifugert, supernatanten tatt av og cellene vasket 3 ganger i transferrinfritt medium. Cellesedimentet og kulturmediet ble tatt opp i 1 % SDS, 1 mg/ml proteinase K, 300 mM NaCl, 10 mM tris pH 8,0, 10 mM EDTA (PK/SDS-buffer), inkubert i 3 0 min ved 3 7°C, ekstrahert med fenol/ kloroform, og DNA isolert ved etanolfelling. Isolert DNA med en radioaktivitet på tilsammen 2.000 cpm ble separert på en ikke-denaturerende 3,5 % akrylamidgel (TBE, Maniatis) og DNA påvist ved autoradiografi. Figuren viser fluorescensopptak av hønseerytro-blaster som ble inkubert 24 timer uten (A) eller med FITC-merkede transferrin-polylysinkonjugater (B,C). Ved stimulering ved blått lys (B, for påvisning av FITC) kan tydelig observeres flere fluoriserende vesikler i hver celle. Spesifisiteten av denne fluorescensen vises ved at vesikel-fluorescensen ikke opptrer (C) ved stimulering ved grønt lys (hvorved kan sees en lignende uspesifikk fluorescens i cellene som i A). Denne figuren viser at i den celleprøven som er behandlet med transferrin-polylysin er blitt tatt opp omlag 5-10 ganger mer DNA fra cellene, enn i kontrollprøvene med naturlig transferrin eller uten transferrin.
To tRNA-ribozymgener, rettet mot translasjons-initiasjons-regionen i erbB ble konstruert (sammenlign fig. 2 og 3, eks. 1) . Ca. 10 0/ig av hvert plasmid som inneholdt genet ble EcoRI-spaltet for å frigjøre tRNA-ribozymgenet på et 225 bp fragment. Spalteprodukt ene ble endemerket ved hjelp av Klenow-fragment og renset ved hjelp av gelelektroforese gjennom en 2 % agarose/TBE-gel. Vektorfragmentet og tRNA-ribozymgenfragmentene ble lokalisert ved etidiumbromidfarging, skåret ut og gjenvunnet ved elektroeluering, fenol/kloroform- og kloroformekstraksjon og etanolfelling. De rensede, radioaktivt merkede DNA-fragmentene ble deretter anvendt under benyttelse av transferrin-polylysin-transportsystemet til å bestemme opptaket og hemmingen av erbB-RNA. Som kontroll DNA ble anvendt vektoren pSPT 18.
Som testcellesystem ble valgt en hønseerytroblastcellelinje som er transformert ved en temperatursensitiv mutant (ts 34, Graf et al., 1978) fra fuglerytroblastosevirus AEV (Beug et al., 1982
b). Det erb A onkogenet som likeså er uttrykt i disse cellen, kan inhiberes ved en spesifikk proteinkinasehemmer (H7). Det ble
fastslått at v-erbA-onkogenet blir fosforylert in vivo og in vitro (dvs. som bakterielt uttrykt protein) i 2 seter, nemlig Ser 28 og Ser 29, ved proteinkinase C resp. ved cAMP-avhengig proteinkinase. Mutasjon av disse serinene til alaniner forhindrer fosforyleringen og ødelegger v-erbA-onkogenaktiviteten. H7 er en spesifikk inhibitor for begge disse kinasene, og er i stand til, i v-erbA-v-erbB holdige erytroblaster selektivt å oppheve de forandringene som er forårsaket av v-erbA (f.eks. blokkering av differensieringen .
Det er kjent at erytroblaster hvis erbB-onkogen blir aktivert - f.eks. ved forhøyelse av temperaturen i tilfelle en temperatur-ømfintlig erbB-mutant - blir indusert til å modne seg til erytrocytter. Et av de første tegnene på denne utviklingen er induksjon av hemoglobinsyntesen, som kan påvises ved en ømfintlig påvisning (sur benzidinfarging, Orkin et al., 1975, Graf et al., 1978) på enkeltcellenivå. Som fenotypisk virkning av et ribozym rettet mot erbB i dette testsystemet, skulle man derfor vente en spesifikk forhøyelse av tallet på benzidin-positive celler.
Den forsøksrekken som ligger til grunn for dette eksemplet, ble gjennomført på følgende måte: De forskjellige DNA-preparatene (se ovenfor og tabell C) , løst i 30 pil TE-buffer, ble alle blandet med10 fig naturlig transf errin-jernkompleks eller transferrin- polylysin-konjugat (løst i 50 fig ag. bidest), og inkubert i 30 minutter ved 3 7°C.
I tilfelle vektor-DNA (10fig) ble anvendt tilsvarende mer (100 fig) av transf errin-preparatene . DNA-transferrin-DNA-blandingene ble alle tilsatt til 1 ml transferrinfritt differensieringsmedium (Zenke et al., 1988). Testcellene (pr. ansats 3 x 10<6>) ble før forsøket inkubert i 60 min. i transferrinfritt differensieringsmedium ved 42°C (herved forsterkes transferrin-opptaket) og tilsatt til de DNA-transferrinholdige ansatsene. Etter 6 timer, 18 timer og 68 timer (for behandling av cellene se nedenfor) ble uttatt prøver, som beskrevet, fra supernatanten og cellesedimentet separert, opptatt i PK-SDS-buffer og DNA ble analysert.
Etter avsluttet inkubasjon (6 timer) ble cellene sentrifugert fra og inkubert i ytterligere 72 timer i transferrinholdig differensieringsmedium med erytropoietin og insulin (Kowens et al., 1986, Zenke et al., 1988), 2 ml pr. ansats og ved 37°C, dvs. ved nærvær av et aktivt v-erb B-protein.
Følgende resultater ble oppnådd:
1. Som i forforsøk 4 kunne iakttas et forsterket opptak av
DNA i størrelsen av erbsnitt DNA'er i de celleprøvene som var behandlet med transferrinpolylysin (omlag 5-dobbelt).
2. Ved transfeksjon av hønsefibroblaster med erbsnitt DNA
kunne vises at erbsnitt ribozym-tDNA blir uttrykt i hønseceller (se eks. 5). 3. Tabell C viser at i alle tilfeller hvori erbsnitt-ribozym-tDNA ble innført i erb-B-transformerte erytroblaster ved hjelp av polylysin-transferrinkonstruksjon, var prosentsatsen av benzidinpositive celler blitt signifikant forhøyet (til ca. det dobbelte) (som referanse tjente de prøvene som ble behandlet med vektor-DNA og hvori anvendelsen av polylysin-transferrinkonjugater ifølge forventningene ikke førte til en forhøyelse av antallet benzidinpositive celler).
Eksempel 7
Forlengelse av antikodonstammeregionen forhøyer utbyttet av rib-tRNA.
Det humane met-tRNA-genet (klonet som BamHI/Rsal fragment, fullført ved EcoRI linker, i EcoRI kuttestedet i bluescript vektoren) ble spaltet i sine enkelte Apal-kuttesteder i antikodonstammeregionen. De enkelttrådede overhengene ble fjernet ved T4-DNA-polymerasebehandling, og oligonukleotider, inneholdende ribozymsekvensene innsatt. Det i de foregående eksemplene anvendte ribozyminnskuddet resulterte i et rib-tRNA-molekyl som inneholdt en 3-base-stamme (fig. 11 viser villtype tRNAmet og tRNArib med den forkortede antikodonstammen). Ved den andre konstruksjonen ble anvendt et oligonukleotid som adskilte seg fra det første ved den til villtypesekvensen komplementære sekvensen GGTTAT i 5'-enden. Derved ble villtype-stammen fremstilt igjen og forlenget med 4 ytterligere basepar (fig. 12 viser konstruksjonen av tRNArib med den forsterkede antikodonstammen. Ribozymsekvensen er fremstilt i fig. 13; i den venstre (5') enden erkarakterisertforskjellene i nukleotidsekvensen mellom den regionen som koder for den forkortede stammen og den forsterkede stammen. I fig.13 er dessuten gjengitt sekvensen for met-tRNA-genet). Begge ligerings-produktene ble transformert til E. coli HB 101 ifølge standardmetoden beskrevet i Maniatis, egnede kloner ble utvalgt, plasmid DNA isolert og sekvensert for bestemmelse av den riktige strukturen. Begge de resulterende rib-tRNA-genene ble undersøkt i nærvær av<32>P-GTP på rib-tRNA molekylenes transkripsjonsaktivitet og akkumulering ved mikroinjeksjon av den klonede DNA i Xenopus-oocytter, gjennomført som beskrevet i eks. 2 resp. 3. Vi 11type-tRNA-genet ble koinjisert ved 10-ganger lavere konsentrasjon.
De injiserte oocytttene ble inkubert i 7 timer ved 20°C, den resulterende RNA ble høstet (sml. eks. 2) og elektroforetisk separert (10 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel) og RNA-molekylene gjort synlige (fig. 14) ved autoradiografi (eksponert 2 døgn ved -70°C). Det forkortede rib-tRNA-genet leverer ca. 1/10 av den RNA-mengden som blir transkribert fra villtype genet; sammenlignet dermed leverer det genet som koder for rib-tRNA molekylet med den forlengede stammen, den 6-dobbelte mengden av RNA.
Eksempel 8
Ekpresjon av ribozymgener som bestanddel av introns.
Som utgangsgen ble valgt et Xenopus laevis tRNA<tyr>C-gen (oocyt-type), som inneholder et intron omfattende 13 nukleotider. Den naturlig intronsekvensen ble modifisert som følger: Først ble innsatt et egnet restriksjonskuttested (Apal; GGGCCC), for å muliggjøre en etterfølgende kloning av oligonukleotider, deretter komplementære nukleotider til antikodontripletten for å disponere over et ytterligere stabiliserende strukturkjennetegn ved forlengelse av intronsekvensen. Størrelsen av intronet i det modifiserte genet er forhøyet fra 13 nukleotider til 15 nukleotider (fig. 15).
Modifiseringen av intronsekvensen ble gjennomført ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR; Ho et al., 1989). Derfor ble syntetisert 4 primere, hvorav to inneholdt den forandrede intronsekvensen (komplementære til hverandre), og to var rettet mot genets 5'- resp. 3'-ende for å innføre et EcoRI resp. Sali restriksjonskuttestedet. Villtypegenet forelå som Hhal-fragment (258 bp), klonet i pBR327 (Stutz et al., 1989). Det resulterende PCR-produktet ble renset over agarosegel, kuttet med de nevnte restriksjons-enzymene og ligert med vektoren pAALM (=pSP64+ T7 promotor; Vieira og Messing, 1982) . Konstruktet ble transformert til E.coli HB 101, og kloner som inneholdt det ønskede innskuddet, identifisert ved sekvensanalyse.
Aktiviteten til det modifiserte genet (tRNA<tyr>M) ble sammenlignet med aktiviteten til villtypegenet med mikroinjisering i Xenopus oocytter, hvorved som intern standard ble koinjisert et 5S-RNA-gen (50 ganger lavere konsentrasjon) som forelå på plasmidet pUC-10-5S (Carroll og Brown, 1976) i nærvær av<32>P-GTP. De injiserte oocyttene ble inkubert 2 0 timer ved 2 0°C, RNA ble separert på en 8 % akrylamid/8,3 M urea/TBE-gel og autoradio-grafert (fig. 16) . Det primære tRNA<tyr->transkriptet ble synlig ved 100 (102) nt ved siden av 5S-RNA ved 120 nt, den 5'- og 3'-prosesserte prekursorformen ved 90 (92) nt, samt det ferdig prosesserte tyrosin tRNA ved 76 nt. Spleisingen av prekursorformen på 90 nt synes å være den begrensende faktor, slik at storparten av det dannede transkriptet (ca. 80 %) foreligger i denne form. Som ventet ble den biologiske aktiviteten ikke forminsket ved modifikasjonen sammenlignet med villtypegenet.
I et ytterligere eksperiment ble systemets ytelsesevne testet. Det ble syntetisert to ribozymsekvenser inneholdende oligodeoksyribonukleotider, som allerede inneholder Apal-ender og derved kunne klones direkte inn i intronsekvensen i det modifiserte tRNAtyr - genet. Ved et oligonukleotid ble innsatt 12 nt i begge endene for å danne stabile "hårnåler" i ribintrons og derved motvirke eksonuklease-nedbrytning. Den samlede størrelsen av det derav resulterende intron var 89 nt (ribozym HP) sammenlignet med 65 nt i tilfelle den ubeskyttede ribozymsekvensen (ribozym C). Ribozymenes sekvenser samt kloningsskjerna er fremstilt i fig. 17.
For de analogt med de ovenfor beskrevne mikroinjeksjonene i Xeno<p>us oocytter ble ved siden av begge de beskrevne konstruksjonene anvendt et tredje, som inneholder ribozymet HP i dimer form og således forhøyer intronstørrelsen til 163 nt (ribozym D). Konsentrasjonen av den koinjiserte 5S-standarden var 1 : 20 ved konstruksjon HP og D, 1 : 1 ved konstruksjon C (fig. 18). Eksperimentet viser at konstruksjonene HP og C til tross for vesentlig forstørrede introns transkriberer svært aktivt og blir prosessert med samme effektivitet som villtype tRNAtyr - genet.
I tilfelle konstruksjon D er bare en minimal mengde transkript påvisbar, fordi den nødvendige sekundærstrukturen for dannelse av et Pol-III-transkripsjonskompleks åpenbart ble ødelagt av den intronsekvensen.
Det kunne vises at ekspresjonen av ribozymer som introns av tRNA ikke fører til noen vesentlig skade på tRNA-sekundær-strukturen, hvorigjennom det oppstående transkriptet kan akkumuleres i høy konsentrasjon og prosesseres korrekt.
Litteratur:
Altmann et al. (1988), Structure and Function of Major
and Minor Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles,
Utgiver Birnstiel, Springer Verlag, Berlin, 183-195 Beug et al. (1982a), J. Cell Physiol. Suppl.l, 195-207
Beug et al. (1982b), Cell 28, 907-919
Beug et al. (1984), Cell 36, 963-972
Caroll and Brown, (1976), Cell 7, 477-486
Ciliberto et al. (1982), Proe.Nati.Acad.Sei. 79, 1921-1925 Clarkson, Eukaryotic Genes, Their Structure, Activity and Regulation, utgiver: McLean et al., Butterworth (1983),
239-261
Cotten et al. (1988), EMBO J., 7, 801-808
Felgner et al. (1987), Proe.Nati.Acad.Sei. 84, 7413-7417 Folk et al. (1983), Cell 33, 585-593
Fromm et al. (1987) Methods in Enzymol. 153, 351-366 Geiduschek et al. (1988), Ann.Rev.Biochem. 57, 873-914
Graf et al. (1978) Nature 275, 496-501
Graham et al (1973), Virology 52, 456-467
Hampel u.Tritz (1989), Biochemistry 28, 4929-4933
Haseloff et al. (1988), Nature 334, 585-591
Ho et al. (1989), Gene 77, 51-59
Hofstetter et al (1981), Cell 24, 573-585
Jennings et al. (1987), EMBO J. Vol.6, 10, 3043-3047
Jung et al. (1981), Biochem.Res.Commun.101, 599
Kahazaie et al. (1988) EMBO J. 10, 3061-3071
Kowenz et al (1986), Mod.Trends i Human Leukemia VII,
Springer Verlag, 199-209
Kressmann et al. (1978), Proe.Nati.Acad.Sei. 75, 1176-1180 Kuo et al. (1988), J. Virol. 62, 4439-4444
Langridge et al. (1987), Methods Enzymol. 153, 336-351
Leutz et al. (1984), EMBO J. 3, 3191-3197
Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Melton et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 7035-7056
Mowry et al (1987), Science 238, 1682-1687
Orkin et al. (1975), Proe.Nati.Acad.Sei. 72, 98-102
Pepperkok et al. (1988), Proe.Nati.Acad.Sei.85, 6748-6752 Schmidt et al (1986), Cell 46, 41-51
Sharmeen et al. (1988), J.Virol.62, 2674-2679
Soldati et al. (1988), Mol.Cell.Biol.8, 1518-1524
Stewart et al. (1987), EMBO J.6, 383-388
Stutz et al. (1989), Genes & Development Vol. 3, 8, 1190-1198 Tellford et al. (1979), Proe.Acad.Sei. 76, 2590-2594 Uhlenbeck et al. (1987), Nature 328, 596-600
Vennstrom et al. (1980), J.Virol. 36, 575-585
Vieira und Messing, (1982), Gene 19, 259-268
Wu et al. (1989), Proe.Nati.Acad.Sei. 86, 1831-1835
Zasloff et al. (1982), Nature 300, 81-84
Zasloff et al. (1983), Proe.Acad.Sei. 80, 6426-6440
Zenke et al. (1988), Cell 52, 107-119.
Claims (15)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl, eventuelt foreliggende i multikopi, inneholdende deler av et gen som j transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl,karakterisert vedat det inneholder de nødvendige transkripsjonsenheter til et tRNA-gen for transkripsjon av polymerase III inkludert sekvensene som bestemmer sekundærstrukturen til tRNA'et, og at DNA-sekvensen som koder for et inhiberende RNA-molekyl valgt fra gruppen ribozym eller antisense-RNA er slik anordnet innenfor DNA-molekylet, at det inhiberende RNA-molekyl er del av transkriptet.
2. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det nevte ribozymet er av "hammerhead" typen.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det inneholder transkripsjonsenhetene til et initierings-Met-tDNA.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det inneholder transkripsjonsenhetene til et tyr-tDNA.
5. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av kravene 1-4,karakterisert vedat det inneholder DNA-sekvensen som koder for det inhiberende RNA-molekyl som innskudd mellom A-blokken og B-blokken til tRNA-genet.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 3 eller 5,karakterisert vedat det inneholder DNA-sekvensen som koder for det inhiberende RNA-molekyl som innskudd i det naturlige Apal-restriksjonskuttingssetet mellom A-og B-blokken.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 4,karakterisertve'd at det inneholder DNA-sekvensen som koder for det inhiberende RNA-molekyl som innskudd av intronet.
8. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av de foregående krav,karakterisert vedat det inneholder en oligonukleotidsekvens slik at antikodon-stamregionen til tRNA-transkriptet er forlenget i forhold til villtype-tRNA-transkriptets.
9. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge krav 7 eller 8,karakterisert vedat det inneholder DNA-sekvensen som koder for det inhiberende RNA-molekyl som innskudd i et kunstig innført restriksjonskuttingssete.
10. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av kravene 7 til 9,karakterisert vedat intronet er slik modifisert at sekundærstrukturen til utgangs-tRNA'et stabiliseres, hvorunder de nødvendige strukturer for spleisingen er opprettholdt.
11. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av kravene 1-10,karakterisert vedat det inhiberende RNA-molekyl er rettet mot viral RNA.
12. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av kravene 1-10,karakterisert vedat det inhiberende RNA-molekyl er rettet mot onkogener eller andre nøkkelgener som kontrollerer veksten og/eller differensieringen til celler.
13. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl ifølge et av kravene 1-12,karakterisert vedat det foreligger som multikopi, hvorunder like eller forskjellige sub-enheter som inneholder DNA-sekvenser kodende for et inhiberende RNA-molekyl, foreligger som fullstendige transkripsjonsenheter.
14. Fremgangsmåte for innføring av DNA-molekyler ifølge et av kravene 1-13 i høyere eukaryotiske celler in vitro,karakterisert vedat DNA-molekylene modifiseres slik at deres opptak i cellen gjennom reseptor-formidlet endocytose finner sted, og at man bringer cellene i kontakt med DNA-molekylene.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14,
karakterisert vedat man komplekserer DNA-molekylene med et transferrin-polykation-konjugat og bringer cellene i kontakt med dette kompleks.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT60989 | 1989-03-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO901213D0 NO901213D0 (no) | 1990-03-15 |
NO901213L NO901213L (no) | 1990-09-17 |
NO306623B1 true NO306623B1 (no) | 1999-11-29 |
Family
ID=3495118
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO901213A NO306623B1 (no) | 1989-03-16 | 1990-03-15 | Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0387775B1 (no) |
JP (1) | JP3330930B2 (no) |
KR (1) | KR900014591A (no) |
AT (1) | ATE140961T1 (no) |
AU (1) | AU637354B2 (no) |
CA (1) | CA2012312C (no) |
DD (1) | DD297838A5 (no) |
DE (1) | DE59010432D1 (no) |
DK (1) | DK0387775T3 (no) |
ES (1) | ES2090049T3 (no) |
FI (1) | FI105103B (no) |
GR (1) | GR3020935T3 (no) |
HU (2) | HU215187B (no) |
IE (1) | IE74850B1 (no) |
IL (1) | IL93754A (no) |
NO (1) | NO306623B1 (no) |
NZ (1) | NZ232917A (no) |
PT (1) | PT93440B (no) |
RU (1) | RU2136751C1 (no) |
ZA (1) | ZA901973B (no) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0471796A4 (en) * | 1989-05-10 | 1993-05-05 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter |
DE4091533T (no) * | 1989-08-31 | 1992-01-30 | ||
JP2507895B2 (ja) * | 1989-12-19 | 1996-06-19 | 工業技術院長 | リボザイムの新規合成系 |
KR930701590A (ko) * | 1990-06-19 | 1993-06-12 | 알프레드 퍼나트 | 엔도누클레아제 |
US6008343A (en) * | 1990-06-19 | 1999-12-28 | Gene Shears Pty. Ltd. | Nucleotide based endonucleases |
CA2093664C (en) * | 1990-10-12 | 2003-07-29 | Fritz Eckstein | Modified ribozymes |
DE4104186A1 (de) * | 1991-02-12 | 1992-08-13 | Genentech Inc | Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe |
FR2687411A1 (fr) * | 1992-02-13 | 1993-08-20 | Nice Sophia Antipolis Universi | Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn. |
WO1993022433A2 (de) * | 1992-04-28 | 1993-11-11 | Frank Andreas Harald Meyer | Medikament zur gentherapeutischen behandlung von menschen, tieren und pflanzen, insbesondere zur blockierung der virenvermehrung und der tumorgene sowie verfahren zur herstellung des medikaments |
US5989906A (en) * | 1992-05-14 | 1999-11-23 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting P-glycoprotein (mdr-1-gene) |
WO1993023057A1 (en) * | 1992-05-14 | 1993-11-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting cancer development |
US5610052A (en) * | 1992-08-26 | 1997-03-11 | Ribozyme Pharmaceuticals Inc. | Enzymatic RNA with activity to ras |
US5827935A (en) * | 1992-05-27 | 1998-10-27 | City Of Hope | Chimeric tRNAlys -ribozyme molecules |
EP0596901B1 (en) * | 1992-05-27 | 2000-08-09 | City Of Hope | CHIMERIC tRNA LYS -RIBOZYME MOLECULES |
HUT71929A (en) * | 1992-06-29 | 1996-02-28 | Gene Shears Pty Ltd | Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens |
AU5968994A (en) * | 1992-12-16 | 1994-07-04 | Johanna E. Bergmann | Agents for the prevention and treatment of human alzheimer's disease |
ATE250670T1 (de) * | 1993-07-06 | 2003-10-15 | Univ Nice Sophia Antipolis | Vektor, enthält ein bei arn-polymerase-iii transcriptes virus-gen |
US5837503A (en) * | 1993-07-07 | 1998-11-17 | Universite De Nice-Sophia-Antipolis | Vector containing viral gene transcribed by RNA polymerase III and methods for use |
US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
CA2157015A1 (en) * | 1994-01-24 | 1995-07-27 | John J. Rossi | Inhibitors and target molecule co-localization |
DE4424761C1 (de) * | 1994-07-04 | 1995-06-08 | Max Planck Gesellschaft | Expressionskassette für die Antisense- und die Ribozym-Expression |
JPH11506914A (ja) | 1995-06-07 | 1999-06-22 | コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼーション | 最適化ミニザイムおよびミニリボザイムおよびその使用 |
FR2755976B1 (fr) * | 1996-11-15 | 1999-01-15 | Idm Immuno Designed Molecules | Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires |
US6057156A (en) | 1997-01-31 | 2000-05-02 | Robozyme Pharmaceuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of epidermal growth factor receptors |
WO1999020753A2 (en) * | 1997-10-21 | 1999-04-29 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Peptide bond formation using nucleic acid catalysts |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
ATE526406T1 (de) | 1998-03-20 | 2011-10-15 | Commw Scient Ind Res Org | Kontrolle der genexpression |
AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
EP1147204A1 (en) | 1999-01-28 | 2001-10-24 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
CA2369944A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-07-31 | Nucleonics Inc. | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
AUPR621501A0 (en) | 2001-07-06 | 2001-08-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery of ds rna |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
-
1990
- 1990-03-13 AT AT90104701T patent/ATE140961T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-13 DE DE59010432T patent/DE59010432D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-13 EP EP90104701A patent/EP0387775B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-13 DK DK90104701.9T patent/DK0387775T3/da active
- 1990-03-13 ES ES90104701T patent/ES2090049T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-14 HU HU901584A patent/HU215187B/hu unknown
- 1990-03-14 DD DD90338709A patent/DD297838A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-14 NZ NZ232917A patent/NZ232917A/en unknown
- 1990-03-15 NO NO901213A patent/NO306623B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-03-15 CA CA002012312A patent/CA2012312C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 IL IL9375490A patent/IL93754A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-15 AU AU51301/90A patent/AU637354B2/en not_active Expired
- 1990-03-15 FI FI901296A patent/FI105103B/fi active IP Right Grant
- 1990-03-15 PT PT93440A patent/PT93440B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-03-15 ZA ZA901973A patent/ZA901973B/xx unknown
- 1990-03-15 IE IE93190A patent/IE74850B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-15 KR KR1019900003438A patent/KR900014591A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-03-15 JP JP06549390A patent/JP3330930B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-16 RU SU5010032A patent/RU2136751C1/ru active
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00692P patent/HU211868A9/hu unknown
-
1996
- 1996-09-03 GR GR960402292T patent/GR3020935T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA901973B (en) | 1991-11-27 |
PT93440A (pt) | 1990-11-07 |
AU637354B2 (en) | 1993-05-27 |
DE59010432D1 (de) | 1996-09-05 |
ES2090049T3 (es) | 1996-10-16 |
NZ232917A (en) | 1997-07-27 |
EP0387775B1 (de) | 1996-07-31 |
NO901213D0 (no) | 1990-03-15 |
CA2012312A1 (en) | 1990-09-16 |
KR900014591A (ko) | 1990-10-24 |
JPH03130080A (ja) | 1991-06-03 |
IL93754A0 (en) | 1990-12-23 |
FI105103B (fi) | 2000-06-15 |
IE900931L (en) | 1990-09-16 |
HUT54206A (en) | 1991-01-28 |
PT93440B (pt) | 2001-07-31 |
GR3020935T3 (en) | 1996-12-31 |
DD297838A5 (de) | 1992-01-23 |
IE74850B1 (en) | 1997-08-13 |
CA2012312C (en) | 2001-08-14 |
JP3330930B2 (ja) | 2002-10-07 |
IL93754A (en) | 1995-12-31 |
EP0387775A1 (de) | 1990-09-19 |
DK0387775T3 (da) | 1996-11-04 |
AU5130190A (en) | 1990-11-01 |
HU901584D0 (en) | 1990-06-28 |
ATE140961T1 (de) | 1996-08-15 |
NO901213L (no) | 1990-09-17 |
RU2136751C1 (ru) | 1999-09-10 |
HU215187B (hu) | 1998-10-28 |
HU211868A9 (en) | 1995-12-28 |
FI901296A0 (fi) | 1990-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO306623B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-molekyl inneholdende deler av et gen som transkriberes av polymerase III og en DNA-sekvens som koder for et inhiberende RNA-molekyl | |
CA2125974C (en) | Senescent cell derived inhibitors of dna synthesis | |
US6458559B1 (en) | Multivalent RNA aptamers and their expression in multicellular organisms | |
US6083744A (en) | DNA-armed ribozymes and minizymes | |
KR100234840B1 (ko) | 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용한 세포절제 | |
US5874414A (en) | Trans-splicing ribozymes | |
JP4321877B2 (ja) | トランス―スプライスにより生成される治療用分子 | |
US6852535B1 (en) | Polymerase III-based expression of therapeutic RNAS | |
AU687001B2 (en) | Method and reagent for inhibiting cancer development | |
Köhler et al. | Trans-splicing ribozymes for targeted gene delivery | |
US20050142578A1 (en) | RNA interference mediated target discovery and target validation using short interfering nucleic acid (siNA) | |
JPH10500309A (ja) | リボザイムを用いて再狭窄および癌を治療するための方法および組成物 | |
Liu et al. | Suppression of ischemia‐induced fos expression and AP‐1 activity by an antisense oligodeoxynucleotide to c‐fos mRNA | |
US6183959B1 (en) | Method for target site selection and discovery | |
JPH10507067A (ja) | テロメラーゼのrna成分 | |
Ho et al. | Antisense oligonucleotides selectively regulate aspartyl β-hydroxylase and its truncated protein isoform in vitro but distribute poorly into A549 tumors in vivo | |
US6830923B1 (en) | Genetics units for inhibiting the function of RNA | |
AU2004205192B2 (en) | Production of ssDNA in vivo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |