WO2004058290A1 - Inhibierung der hiv replikation durch expression von ‘late domain‘ peptiden in zielzellen - Google Patents

Inhibierung der hiv replikation durch expression von ‘late domain‘ peptiden in zielzellen Download PDF

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WO2004058290A1
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Hans-Georg KRÄUSSLICH
Barbara MÜLLER
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Ruprecht-Karls-Universi Tät Heidelberg
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    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to protein fragments (peptides) of the human brain deficiency virus (HIN) with antiviral function.
  • the invention relates to nucleic acids which code for membrane-bound viral, late domain 'proteins or peptides, the peptides encoded by these nucleic acids, and the use of these peptides and nucleic acids for the targeted inhibition of viral infections.
  • the human immunodeficiency virus type 1 (HIN-1) is the causative agent of the acquired immune deficiency AIDS.
  • HIN-1 human immunodeficiency virus type 1
  • antiviral drugs reverse translptase inhibitors and protease inhibitors
  • the treatment of AIDS patients also poses great problems in developed countries. Due to the very rapid adaptation of the virus by mutation, resistant virus variants appear after only a few weeks in therapy with individual active substances (monotherapy). The combination of several drugs can only circumvent this problem to a very limited extent.
  • HIV infection is currently being treated in developed countries through intensive drug therapy (highly active antiretroviral therapy, HAART), which requires the use of at least three different antiviral drugs.
  • HAART highly active antiretroviral therapy
  • exact adherence to complicated therapy procedures and a close and complex monitoring of the therapy success is necessary.
  • HIN protein fragments or peptides were searched which intervene in certain mechanisms of virus replication in order to specifically switch off different stages of an HIV infection.
  • the expression of antivirally active proteins or peptides in HIV-permissive cells through gene therapy strategies offers the possibility of inhibiting virus replication in the long term and is therefore superior to treatment by taking several medications daily.
  • One step in HIV replication that has so far been inaccessible to targeted inhibition is the release of the virus from the plasma membrane.
  • the Gag protein (group-specific antigen), the main structural protein of HIV, carries all the functional domains that are required for particle formation and release.
  • the Gag-Pol polyprotein also contains functional domains for the viral enzymes protease, reverse transcriptase and integrase.
  • Gag and Gag-Pol form spherical particles after transport to the inside of the plasma membrane. These particles protrude from the membrane in a process known as 'budding' until only a narrow membrane tube connects the particle and the cell. As the last step in budding, a membrane fusion takes place at this point, which separates the particle from the cell.
  • the viral protease cleaves Gag and Gag-Pol into their functional subunits. This triggers a morphological rearrangement ('maturation'), which is essential for the hifectiosity of the virion and which can be blocked with the protease inhibitors currently used in HIV therapy.
  • HIV budding is an active process involving a little-known cellular machinery.
  • retroviruses including HIV
  • Filoviruses e.g. Filoviruses (Ebola) and rhabdoviruses (rabies, vesicular stomatitis virus) were identified as so-called late domain proteins. These contain small, highly conserved peptide motifs that are necessary for virus release. All known late domains in retroviruses are within the Gag structural protein, in the case of HIV in the C-terminal domain p6.
  • the central functional element of the 'late domain' in HIV is the peptide sequence P (T / S) AP.
  • Late domain elements of other retroviruses contain the peptide sequence PPXY as most important element, often in combination with a P (T / S) AP sequence.
  • the PPXY motif is missing from HTV.
  • Some of the P (T / S) AP or PPXY elements can replace each other and act independently of their location within the overall molecule.
  • late domain peptides bind intracellular factors and recruit to the location of the virus release (Freed 2002, Perez and ⁇ olan 2002).
  • Possible direct interaction partners of 'late domain' motifs are the cellular proteins TsglOl (for PTAP) and the ubiquitin ligase ⁇ edd4 (for PPXY) (VerPlank 2001, Garrus 2001, Kokonyogo 2001).
  • TsglOl for PTAP
  • ubiquitin ligase ⁇ edd4 for PPXY
  • the interaction of these factors with the virus protein could be important for particle release (Garras 2001, Kokonyogo 2001), so that a targeted inhibition of this interaction would interrupt the virus production in a late step in the replication cycle and possibly in combination with protease inhibitors would prevent virus replication.
  • (Marker) denotes an optionally available DNA region which codes for a peptide for the detection of the construct
  • MTS denotes the DNA region coding for a “membrane targeting signal”, fragments or derivatives thereof, and
  • Late domain denotes a DNA region which codes for the expressed region of the "late domain", a fragment or derivative thereof, of a virus
  • the invention also relates to nucleic acids of the general formula: 5'- MTS -, Iate domain '- (marker) - 3' and 5'- (marker) -MTS -, late domain'- 3 'as well as fragments and derivatives thereof.
  • virus denotes all viruses whose genome is equipped with a "late domain” area.
  • viruses included in the present invention include retroviruses including leukemia viruses, sarcoma viruses such as HTLV-I, and especially lentiviruses such as HIV-1 and HTV-2.
  • the invention includes also filoviruses (eg Ebola virus), rhabdoviruses (eg rabies virus), as well as other enveloped viruses such as herpes viruses, Bunyaviruses, arena viruses, flaviviruses and togaviruses.
  • the region coding for “late domain” comes from the genome of retroviruses, filoviruses and rhabdoviruses. In a particularly preferred embodiment, the region coding for “late domain” comes from the genome of retroviruses, in particular lentiviruses. In a very particularly preferred embodiment, the region coding for “late domain” comes from a genome section of HIV-1, which is referred to as p6.
  • fragment and derivative refers to DNA sequences which code for a "late domain", in which at least one nucleotide of the disclosed sequence is substituted by at least one nucleotide which is different from the original one, can be replaced, or to "late domain” DNA sequences in which the original nucleotide sequence either at the 5 ', at the 3' or at both ends and / or within the sequence either extended, shortened or shortened at one end and is extended at the other end, provided that the function and biological effect of the coded "late domain" area is retained.
  • late domain includes the sequencing of several “late domains", it being irrelevant whether the “late domains” are the same or different, or whether they originate from the same or two different viruses.
  • fragment and derivatives refers to DNA sequences coding for an MTS, in which at least one nucleotide of the original sequence can be replaced by at least one nucleotide which is different from the original one, or to MTS-DNA- Sequences in which the original nucleotide sequence either at the 5 ', at the 3' or at both ends and / or within the Sequence is either lengthened, shortened or shortened at one end and extended at the other end, provided that the function and biological effect of the coded MTS area is retained.
  • the invention includes various possibilities for transporting and anchoring the peptide encoded by the nucleic acid according to the invention to the membrane. All peptides that can act as an intracellular membrane targeting signal are suitable for this.
  • "MTS" can therefore code for a peptide which contains a motif for intracellular attachment of a membrane anchor, for example palmitoyl, myristoyl, or prenyl or CaaX motif.
  • MTS Transmembrane anchor of a type I transmembrane protein encoded.
  • the person skilled in the art understands a type I transmembrane protein to be a transmembrane protein with extracellular amino and intracellular carboxy terminus.
  • MTS of all type I transmembrane proteins accessible to the person skilled in the art are suitable for the invention.
  • MTS of type I transmembrane proteins which are selected from the non-exhaustive list of examples such as ribophorin I and II, MHC class I, HIV-1 Vpu. Synaptotagmin II, mouse CMV-gp48, human CMV-USII, calnexin, PERK, UDP-glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR) or CD34.
  • peptides or DNA sequences coding therefor can be considered as “markers” for detecting the peptides encoded by the nucleic acid according to the invention.
  • the invention includes all peptides or proteins which are suitable for detection, for example for immunological detection So-called reporter genes or other genes which code for proteins or peptides, the presence of which is easy to determine, are particularly suitable for the present invention.
  • Markers which are suitable for carrying out the present invention can be selected from the group comprising so-called " epitope-tags "(c-Myc, hemagglutinin, FLAG), biotin, digoxygenin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, green fluorescent protein (GFP) and derivatives thereof with altered fluorescence (EGFP, EYFP, EFCP), ß-galactosidase, luciferases, ß-glucuronidase and ß-lactamase.
  • epitope-tags “(c-Myc, hemagglutinin, FLAG), biotin, digoxygenin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, green fluorescent protein (GFP) and derivatives thereof with altered fluorescence (EGFP, EYFP, EFCP), ß-galactosidase, luciferases, ß-glucuronidase and ß-lactamase.
  • the marker can also code for any peptide which is detected using methods known to those skilled in the art using specific antibodies, e.g. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western blot, immunoprecipitation, enzyme-linked 1-immunoadsorbent assay (ELISA) or Radioactive 1-mm immunoadsorbent assay (RIA). It is advantageous if the antibody used for the detection is coupled to a molecule which enables the detection or contributes to it.
  • FACS Fluorescent Activated Cell Sorting
  • ELISA enzyme-linked 1-immunoadsorbent assay
  • RIA Radioactive 1-mm immunoadsorbent assay
  • Suitable for this are, for example, biotin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, fluorescein isothiocynate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), diamidinophenylindole (DAPI) and phycoerythrin.
  • biotin horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, fluorescein isothiocynate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), diamidinophenylindole (DAPI) and phycoerythrin.
  • the nucleic acid according to the invention does not contain a region coding for a marker. This is particularly advantageous if the nucleic acid is used for (gene) therapeutic purposes. Then it is important if the nucleic acid codes for the smallest possible peptide and the said peptide is as free as possible from additional foreign components that are essential for the effect and which may have an unfavorable effect on the physiological state of the target cell.
  • the nucleic acid according to the invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 1, as well as fragments and derivatives as defined above.
  • the nucleic acid according to the invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, as well as fragments and derivatives as defined above.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably used to express the peptide it encodes in cells, in particular HIV-infected cells.
  • nucleic acid according to the invention into the host or target cell (transfection or transformation), depending on the host cell selected.
  • the simplest method for gene transfer is the injection of "naked" nucleic acids into a target tissue / target cells.
  • a more efficient method is the manipulation of a single cell by the so-called microinjection of the nucleic acid into the cell nucleus.
  • the use of reagents and methods is particularly favorable Calcium chloride, rubidium chloride, lithium chloride, calcium phosphate, DEAE dextran, cationic lipids, liposomes, biolistic particle bombardment ("gene gun” method), heat shock transformation and electroporation, as well as any combination thereof.
  • nucleic acid according to the invention is inserted in a so-called expression vector.
  • the present invention therefore also relates to a recombinant DNA and an expression vector which contain the nucleic acid according to the invention.
  • the expression vector is a eukaryotic, in particular human, bacterial or a retroviral vector, plasmid, bacteriophage or other vectors customary in genetic engineering which are suitable for the expression of proteins or peptides.
  • the nucleic acid sequence in the vector according to the invention can be operatively linked to regulatory elements which ensure transcription and synthesis of a translatable mRNA in pro- and / or eukaryotic cells.
  • regulatory elements are promoters, enhancers or transcription termination signals, but can also be introns or similar elements, such as elements which enable or contribute to the stability and multiplication of the vector, the selection and / or the integration into the host genome.
  • the nucleic acid according to the invention is inserted into a retroviral vector.
  • Retroviruses are so-called RNA viruses, whose
  • the genome After infection of a cell, the genome is reverse transcribed into DNA and integrated into the host cell genome. The uptake into the cell takes place via receptor-controlled
  • Virus uptake switched off so that the cell is infected only once.
  • the integration of the viral DNA into the genome is effected by a virally encoded protein, integrase, the location of integration being non-specific.
  • retroviral-based vectors are particularly suitable for gene therapy, because they are absorbed more efficiently by receptor-controlled endocytosis and integrated more efficiently since the process takes place enzymatically. The person skilled in the art knows this process also under the name "retroviral transduction”.
  • the person skilled in the art knows how such vectors are introduced into the target cell by means of so-called “packaging cells”, which carry so-called helper viruses in the genome.
  • the invention includes all retroviral vectors which are derived, for example, from Onko, Lenti or Spuma viruses the retroviral vector according to the invention is M159.
  • the invention also includes a method for producing a recombinant protein, a fragment or derivative thereof, which is encoded by the nucleic acid according to the invention.
  • the method comprises the following steps: (a) introducing a vector according to the invention, which contains the nucleic acid according to the invention, into a suitable host cell by means of suitable methods, where the host cell can be pro- or eukaryotic, (b) culturing the transfected host cell and (c) Isolation of the recombinant protein from the host cell or from the culture medium. If desired or necessary, the proteins isolated according to step (c) can be further purified for other purposes.
  • the person skilled in the art is also familiar with numerous methods, for example salt fractionation, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the present invention furthermore relates to a fusion peptide of the general formula encoded by the nucleic acid according to the invention
  • COOH denotes the carboxy terminal end of the fusion peptide
  • (Marker) denotes an optionally present peptide for the detection of the construct
  • MTS membrane targeting signal
  • Late domain denotes the “late domain” region, a fragment or derivative thereof, of a virus.
  • the invention also relates to a fusion peptide of the general formulas NH 2 - MTS -, late domain '- (marker) - COOH and NH 2 - (marker) -MTS -, late domain' - COOH as well as fragments and derivatives thereof. It may also be desirable for the present invention if the fusion peptide according to the invention does not contain a marker. This is particularly advantageous when the fusion peptide is used for therapeutic purposes. Then it is important if the fusion peptide is as small as possible and as free as possible from additional foreign components that are essential for the effect, which may have an unfavorable effect on the physiological state of the target cell.
  • fragment and derivative refers to amino acid sequences of “late domain”, in which at least one amino acid can be replaced by at least one amino acid that is different from the original one, or to “late domain” "- Amino acid sequences in which the original amino acid sequence is either elongated, truncated or truncated at one end and / or truncated at one end and extended at the other either at the amino, carboxy terminal or both ends and within the sequence, provided that the function and biological action of the "Late domain” area is preserved.
  • the fusion peptide according to the invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In a further preferred embodiment, the fusion peptide according to the invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the insertion of the nucleic acid sequence into vectors according to the invention to be used for gene therapy and the introduction of the vectors according to the invention into HIN-infected cells leads to the expression of a fusion peptide, which causes a strong inhibition of HIV replication.
  • the invention therefore also relates to the use of the vector according to the invention for the treatment of HIV-infected patients.
  • the invention relates to a method for inhibiting the release of HIV from infected cells, this comprising contacting and transfecting the HIV-infectable cell with the vector according to the invention.
  • a method for inhibiting the release of HIV from infected cells this comprising contacting and transfecting the HIV-infectable cell with the vector according to the invention.
  • T lymphocytes and / or hematopoietic stem cells are particularly preferred for the above-mentioned method. T lymphocytes are very particularly preferred.
  • the invention further relates to a method for inhibiting the release of HIV, which comprises bringing the HIV-infectable cell into contact with the fusion peptide according to the invention or a fragment or derivative thereof.
  • the method can be carried out in vitro in an aqueous solution, in vivo in a suitable cell culture assay, or in a living being by means of suitable administration forms.
  • nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention can be used in the context of the present invention as a medicament, optionally in combination with a suitable carrier. It is immaterial whether the nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention are administered alone or in combination with other active substances.
  • the active substances can be administered simultaneously or in succession.
  • the dose and / or the exposure time of the drug is variable and depends on the physiological condition of the person to be treated. The patient's age, weight and gender can play a role here. It can also be important whether the disease needs to be treated acutely, chronically or prophylactically.
  • nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention are used for the production of a medicament, optionally in combination with a pharmaceutically suitable carrier, for the treatment of HIV-infected patients.
  • the present invention accordingly also relates to a medicament which, optionally in combination with other pharmaceutically acceptable substances and carriers, contains a nucleic acid according to the invention and / or a vector and / or a fusion peptide according to the invention, and for the treatment of HIV-infected patients suitable is.
  • the drug can be administered orally, for example in the form of coated or uncoated tablets, granules, hard and soft gelatin capsules, or they can be done rectally in the form of suppositories.
  • the drug can also be administered parenterally - bypassing the digestive system - for example subcutaneously, intramuscularly or intravenously in the form of solutions for infusions or injections.
  • Other suitable administration forms relate to direct applications (for example to the skin) in the form of ointments, tinctures, sprays or transdermal therapeutic agents, or agents to be inhaled in the form of nasal sprays, aerosols, or in the form of microcapsules, implants or rods.
  • the appropriate dosage form depends on the type and severity of the disease.
  • the present invention relates to a kit which can be used for the treatment of HIV-infected patients, the kit comprising at least one nucleic acid according to the invention and / or a vector and / or a fusion peptide according to the invention.
  • the starting vector for the construction of the plasmid bhd-la was the vector pEFplink (LIT), which expresses the open reading frame used in eukaryotic cells under the control of the cellular EFl-alpha promoter.
  • LIT vector pEFplink
  • srcNLS PCR-amplified from pHHR-srcNLS-GFP; R. Welker, unpublished
  • complete p6 protein of H1N-1 PCR-amplified from p ⁇ L4-3
  • the lentiviral vector bhd-1 was created by cloning the entire expression cassette from bhd-la into plasmid Ml 59 (provided by Dr. M. von Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt). This plasmid expresses the therapeutic gene under the control of the long terminal repeat of the myeloproliferative sarcoma virus. The expression efficiency is increased by the leader sequence 71 of the murine embryonic stem cell virus, which is also present in the vector, and the beta-post-transcriptional regulatory element of the woodchuck hepatitis B virus (Schambach 2000).
  • 293T, COS-7 and Phoenix ampho cells were cultured in Dulbecco's medium (Invitrogen) complemented with 10% fetal calf serum (FCS; Sigma).
  • FCS fetal calf serum
  • PM-1 and Jurkat cells were cultured in RPMI medium with 10% FCS.
  • Replication-competent viruses were obtained after transfection of 293T cells with the proviral clone pNL4-3 and subsequent passage on PM-1 cells.
  • a retroviral vector coding for the prototypical fusion protein (bhd-1) was packaged using the Phoenix ampho packaging cell line (Grigani et al., 1998).
  • Example 3 Expression of the prototypical fusion protein in transfected cells
  • the corresponding expression construct was first transfected alone into different cell lines (HeLa, 293T, COS-7).
  • a protein with the expected apparent molecular weight (approx. 35 kDa) could be detected in cell extracts, which reacts with antisera against EGFP and against p6 (drawing 1B).
  • the fusion protein is therefore stable in cells, the amount expressed corresponds approximately to that of the well-expressed marker protein EGFP alone (blot with anti-GFP, see lanes 1 and 3).
  • the synthetic membrane localization signal is therefore functional in the context used here and the fusion protein is transported to the intended site of action within the cell.
  • pKHIN LIT
  • HIN-1 the proviral clone p ⁇ L4-3
  • Main structural proteins Gag and Gag-Pol are expressed and form virus-like particles that are normally released into the cell culture supernatant (since the "long terminal repeats" and the primer binding site are missing in pKHIV, the resulting particles are not infectious).
  • an inhibitory fusion protein in the same
  • the plasmid was transfected together with the vector bhd-la (or for negative control with the empty vector pEFplink or the EGFP expression plasmid pEGFP-cl) in 293T cells. In the co-transfections, equimolar amounts of the two were used
  • Example 5 Infection of stably transduced PM-1 and Jurkat cells to demonstrate the inhibitory effect on virus replication.
  • SrcNLS synthetic membrane localization signal developed by the inventors (R. Welker, unpublished); EGFP: green fluorescent protein; p6: complete coding sequence of the p6 protein of H-V-1 NL4-3.
  • FIG. 1 A eukaryotic expression vector coding for the fusion protein outlined in (A) was transiently transfected into 293T cells. 48 hours after transfection, the cells were lysed and the total extract was examined for the presence of the fusion protein by means of an ammunoblot (lane 3). Cells transfected in parallel with empty vector (lane 2) and cells transfected with the plasmid pEGFP-cl (Clontech) (lane 1) were used as controls. The picture shows hnmunoblots developed with the specified antisera; the positions of the molecular weight standards (MW in kilodaltons) are plotted on the left.
  • a protein of the expected size (approx. 35 kDa) is detected, which reacts both with antiserum against p6 and with antiserum against GFP.
  • COS-7 cells were transfected with the inhibitor contract bhd-la and examined 48 h after transfection using fluorescence microscopy to determine the intracellular localization of the srcNLS-EGFP-p6 fusion protein. A strong fluorescence signal can be seen on the plasma membrane.
  • 293T cells were co-transfected with an equal amount of a non-infectious HIV-1 derivative (pKHIV) and the inhibitor construct.
  • pKHIV non-infectious HIV-1 derivative
  • a negative control was instead of the expression vector without coding sequence or the EGFP-expressing plasmid pEGFP-cl (Clontech) is used in the bit construct.
  • 48 hours after transfection the cells were lysed and equal amounts of the cell extract were tested for expression of the inhibitory protein (top) and the main HIV structural protein Gag (middle) encoded by pKHIV by means of immunoblot.
  • the released subviral particles from the cell supernatant were cleaned by ultracentrifugation through a sucrose cushion, completely applied to an SDS gel and detected by immunoblot (bottom).
  • T cell lines Two different T cell lines (Jurkat and PM-1) were stably transduced with the inhibitor construct and then infected with the HIV-1 isolates NL4-3 and D117II.
  • capsid protein (p24) in the cell culture supernatant was quantified by ELISA at several times after infection. The mean values from two approaches are shown. In cells transduced with the inhibitor construct bhd-1, virus replication is reduced by approximately 90% compared to the control.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Membran-verankerbare Konstrukte des „late Domain'-Bereichs von Retroviren, insbesondere HIV, kodieren. Die Konstrukte hemmen die Freisetzung von HIV aus infizierten Zellen und können somit für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden.

Description

Inhibierung der HIV Replikation durch Expression von 'late domain' Peptiden in
Zielzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinfragmente (Peptide) des humanen hniriundefizienzvirus (HIN) mit antiviraler Funktion. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für membranständige virale ,late domain' -Proteine oder -Peptide kodieren, die durch diese Nukleinsäuren kodierten Peptide, sowie die Verwendung dieser Peptide und Nukleinsäuren zur gezielten Hemmung viraler Infektionen.
Das menschliche Irnmundefizienz- Virus Typ 1 (HIN-1) ist der Erreger der erworbenen Immunschwäche AIDS. Weltweit sind heute ca. 40 Millionen Menschen mit HIV infiziert und drei Millionen Menschen sind 2001 an AIDS verstorben. Obwohl bereits seit einiger Zeit mehrere antivirale Medikamente (Reverse Translmptase-Inhibitoren und Protease- Inhibitoren) gegen HIV verfügbar sind, wirft die Behandlung von AIDS Patienten auch in entwickelten Ländern sehr große Probleme auf. Aufgrund der sehr raschen Anpassung des Virus durch Mutation treten bei einer Therapie mit einzelnen Wirkstoffen (Monotherapie) schon nach wenigen Wochen resistente Virusvarianten auf. Dieses Problem lässt sich nur sehr begrenzt durch die Kombination mehrerer Medikamente umgehen. Gegenwärtig wird die HIV-Infektion in entwickelten Ländern durch eine intensive medikamentöse Therapie behandelt (highly active antiretroviral therapy, HAART), welche die Einnahme von mindestens drei verschiedenen antiviralen Medikamenten erfordert. Um eine Resistenzentwicklung bei einer HAART zu minimieren, ist die genaue Einhaltung komplizierter Therapieverfahren und eine engmaschige und aufwändige Überwachung des Therapieerfolges erforderlich. Um die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden, wurde im Zuge der Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine nach HIN-Proteinfragmenten oder -Peptiden gesucht, die in bestimmte Mechanismen der Virusreplikation eingreifen, um gezielt verschiedene Stufen einer HIV-Infektion auszuschalten. Darüber hinaus bietet die Expression antiviral wirksamer Proteine bzw. Peptide in HIV-permissiven Zellen durch gentherapeutische Strategien die Möglichkeit, die Virusreplikation längerfristig zu hemmen und ist damit der Behandlung durch tägliche Einnahme mehrerer Medikamente überlegen. Ein Schritt in der HIV-Replikation, der bisher einer gezielten Hemmung nicht zugänglich war, ist die Freisetzung des Virus von der Plasmamembran.
Das Gag-Protein (Gruppenspezifisches Antigen), das Hauptstrukturprotein von HIV, trägt alle funktionellen Domänen, die zur Partikelbildung und -freisetzung benötigt werden. Das Gag-Pol-Polyprotein birgt zusätzlich funktionelle Domänen für die viralen Enzyme Protease, Reverse Transkriptase und Integrase. Gag und Gag-Pol bilden nach Transport zur Innenseite der Plasmamembran sphärische Partikel. Diese Partikel stülpen sich in einem als ,Knospung' bezeichneten Prozess aus der Membran heraus, bis nur noch ein schmaler Membranschlauch Partikel und Zelle verbindet. Als letzter Schritt der Knospung findet an dieser Stelle eine Membranfusion statt, die das Partikel von der Zelle trennt. Gleichzeitig damit oder kurz darauf werden Gag und Gag-Pol durch die virale Protease in ihre funktionellen Untereinheiten gespalten. Dadurch wird eine morphologische Umlagerung (,Reifung') ausgelöst, die essentiell für die hifektiösität des Virions ist, und die mit den derzeit in der HIV-Therapie verwendeten Protease-Hemmern blockiert werden kann.
Die HIV-Knospung ist ein aktiver Prozess, der eine bisher wenig bekannte zelluläre Maschinerie involviert. Bei Retroviren (einschließlich HIV), sowie einigen anderen Virusgruppen, zB. Filoviren (Ebola) und Rhabdoviren (Tollwut, Vesicular stomatitis Virus) wurden sogenannte ,late domain'-Proteine identifiziert. Diese enthalten kleine, hochkonservierte Peptidmotive, die für die Virusfreisetzung notwendig sind. Alle bekannten ,late domains' bei Retroviren liegen innerhalb des Gag-Striikturproteins, im Fall von HIV in der C-terminalen Domäne p6. Das zentrale funktioneile Element der ,late domain' bildet bei HIV die Peptidsequenz P(T/S)AP. ,late domain' -Elemente anderer Retroviren, sowie die anderer Virusfamilien, enthalten die Peptidsequenz PPXY als wichtigstes Element, häufig in Kombination mit einer P(T/S)AP-Sequenz. Das PPXY Motiv fehlt bei HTV. Die P(T/S)AP- bzw. PPXY-Elemente können sich zum Teil gegenseitig ersetzen und unabhängig von ihrer Lokalisation innerhalb des Gesamtmoleküls wirken.
Es gibt Hinweise darauf, dass ,late domain'-Peptide intrazelluläre Faktoren binden und zum Ort der Nirusfreisetzung rekrutieren (Freed 2002, Perez und Νolan 2002). Mögliche direkte teraktionspartner von ,late domain' Motiven sind die zellulären Proteine TsglOl (für PTAP) und die Ubiquitin-Ligase Νedd4 (für PPXY) (VerPlank 2001, Garrus 2001, Kokonyogo 2001). Die Interaktion dieser Faktoren mit dem Nirusprotein könnte für die Partikelfreisetzung wichtig sein (Garras 2001, Kokonyogo 2001), so dass eine gezielte Hemmung dieser Interaktion die Nirusproduktion in einem späten Schritt im Replikationszyklus unterbrechen und eventuell in Kombination mit Proteaseinhibitoren die Virusreplikation verhindern würde.
Es wurde nun gefunden, dass die Expression eines Fusionsproteins, welches eine membranständige Version der ,late domain' -Region von HIV-1, p6, enthält, die HIN- Partikelfreisetzung aus der transfizierten Zelle hemmt und nach Transduktion die HIV- Virusreplikation um etwa 90% reduziert. Wahrscheinlich liegt dies daran, dass das erfindungsgemäße Fusionsprotein zur Bindung und Rekrutierung der wirtseigenen Faktoren befähigt sein könnte. Die wirtseigenen Faktoren sollten somit für eine Bindung an , echte' virale ,late domain'-Peptide nicht mehr zur Verfügung stehen, so dass es nicht zur Partikelbildung bzw. -freisetzung kommt. Die gentherapeutische Blockierung der Virusreplikation zu einem späten Zeitpunkt im Replikationszyklus kann in direkter Verbindung mit bereits zugelassenen antiviralen Medikamenten wirken. Vorteilhaft ist außerdem, dass funktioneile ,late domains' kompakte Peptidmotive sind und sich damit zum Einsatz in gentherapeutischen Vektoren hervorragend eignen. Bei intrazellulärer Expression dieser Peptide ist nur eine geringe l-mmunogenität zu erwarten. Der unerwartete Effekt wurde unter anderem dadurch erzielt, dass der ,late domain' Anteil des Fusionspeptids mit einem membranverankernden Anteil verknüpft wurde, so dass das Fusionspeptid direkt am Ort der Freisetzung, namentlich an der Plasmamembran, exprimiert wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nuklemsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein der allgemeinen Formel
5'- MTS - (Marker) - ,late domain'- 3' wobei
„5' " das 5 '-Ende der Nuklemsäuresequenz bezeichnet,
„3' " das 3 '-Ende der Nuklemsäuresequenz bezeichnet,
„(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet
„MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet, und
„late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnet
Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren der allgemeinen Formel: 5'- MTS - ,Iate domain' - (Marker) - 3' und 5'- (Marker)-MTS - ,late domain'- 3' sowie Fragmente und Derivate davon.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet "Virus" sämtliche Viren, deren Genom mit einem "late domain"-Bereich ausgestattet ist. Beispiele für Viren, die in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, umfassen Retroviren, darunter Leukoseviren, Sarkomviren, z.B. HTLV-I, und insbesondere Lentiviren wie HIV-1 und HTV-2. Die Erfindung umfasst außerdem Filoviren (z.B. Ebola- Virus), Rhabdoviren (z.B. Tollwut- Virus), sowie andere umhüllte Viren wie Herpesviren, Bunyaviren, Arenaviren, Flaviviren und Togaviren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, Filoviren und Rhabdoviren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, insbesondere Lentiviren. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus einem Genomabschnitt von HIV-1, der als p6 bezeichnet wird..
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf DNA-Sequenzen, die für eine „late domain" kodieren, bei denen mindestens ein Nukleotid der offenbarten Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten „late domain"-Bereichs erhalten bleibt.
Darüber hinaus schließt die erfindungsgemäße Definition von „late domain" das Nacheinanderschalten mehrerer „late domains" ein, wobei es unerheblich ist, ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus dem gleichen oder zwei verschiedenen Viren stammen.
Analog zu dem vorgenannten bezieht sich „Fragmente und Derivate" auf DNA-Sequenzen kodierend für eine MTS, bei denen mindestens ein Nukleotid der ursprünglichen Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf MTS-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten MTS-Bereichs erhalten bleibt.
Die Erfindung schließt verschiedene Möglichkeiten zum Transport und zur Verankerung des von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten Peptids an der Membran ein. Geeignet sind hierfür alle Peptide, die als intrazelluläres Membran-Targetingsignal fungieren können. „MTS" kann daher für ein Peptid kodieren, das ein Motiv zur intrazellulären Anhängung eines Membranankers birgt, z.B. Palmitoyl, Myristoyl-, bzw. Prenyl oder CaaX-Motiv. Für die vorliegende Erfindung kann es auch zweckmäßig sein, wenn „MTS" für einen Transmembrananker eines Typ I - Transmembranproteins kodiert. Unter einem Typ I - Transmembranprotein versteht der Fachmann ein Transmembranprotein mit extrazellulärem Amino- und intrazellulärem Carboxyterminus.
Geeignet für die Erfindung sind demnach MTS aller dem Fachmann zugänglichen Typ I- Transmembranproteine. Bevorzugt sind MTS von Typ I-Transmembranproteinen, die ausgewählt sind aus der nicht abschließenden Liste von Beispielen wie Ribophorin I und II, MHC-Klasse I, HIV-1-Vpu. Synaptotagmin II, Maus-CMV-gp48, Mensch-CMV-USll, Calnexin, PERK, UDP-Glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR) oder CD34.
Als „Marker" zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierten Peptide kommen verschiedene Peptide bzw. dafür kodierende DNA-Sequenzen in Betracht. Generell schließt die Erfindung alle Peptide bzw. Proteine ein, die sich für einen Nachweis, beispielsweise für einen immunologischen Nachweis, eignen. Für die vorliegende Erfindung eignen sich besonders sogenannte Reportergene oder andere Gene, die für Proteine bzw. Peptide kodieren, deren Anwesenheit leicht zu bestimmen ist. Marker, die sich zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen, können ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend sogenannte „epitope-tags" (c-Myc, Hämagglutinin, FLAG), Biotin, Digoxygenin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Green Fluorescent Protein (GFP) und Derivate davon mit veränderter Fluoreszenz (EGFP, EYFP, EFCP), ß-Galactosidase, Luciferasen, ß-Glucuronidase und ß-Lactamase. Verfahren zum Nachweis der vorstehenden Marker sind dem Fachmann bekannt.
Der Marker kann auch für ein beliebiges Peptid kodieren, dessen Nachweis mittels dem Fachmann bekannter Methoden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern erfolgt, z.B. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western Blot, hnmunpräzipitation, Enzyme-linked 1-rnmunoadsorbent Assay (ELISA) oder Radioactive 1-mmunoadsorbent Assay (RIA). Vorteilhaft ist es, wenn der zum Nachweis verwendete Antikörper mit einem Molekül gekoppelt ist, das den Nachweis ermöglicht oder dazu beiträgt. Geeignet hierfür sind beispielsweise Biotin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Fluoreszein- Isothiocynat (FITC), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC), Diamidinophenylindol (DAPI) und Phycoerythrin.
Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure keinen für einen Marker kodierenden Bereich enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Nukleinsäure für (gen-)therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn die Nukleinsäure für ein möglichst kleines Peptid kodiert und das besagte Peptid möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
In einer bevorzugten Auslxihrungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO:l dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf.
hi einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression des von ihr kodierten Peptids in Zellen, insbesondere HlV-infizierten Zellen, eingesetzt.
Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Wirts- bzw. Zielzelle (Transfektion bzw. Transformation) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren - abhängig von der gewählten Wirtszelle - zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe / Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen.
Für die Expression und für das Einbringen der Nukleinsäure in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem sogenannten Expressionsvektor inseriert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen, insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen Vektor, Plasmid, Bakteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls gewünscht oder erforderlich, kann die Nuklemsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber auch Introns oder ähnliche Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors, die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen oder dazu beitragen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen retroviralen Vektor inseriert. Retroviren sind sogenannte RNA- Viren, deren
Genom nach Infektion einer Zelle revers in DNA transkribiert und in das Wirtszell-Genom integriert wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt hierbei über rezeptorgesteuerte
Endozytose. Bei manchen retroviralen Vektoren wird die Expression des Vektors nach
Aufnahme des Virus ausgeschaltet, so dass die Zelle nur einmal infiziert wird. Die Integration der viralen DNA in das Genom wird durch ein viralkodiertes Protein, Integrase, bewirkt, wobei der Integrationsort unspezifisch ist. Vektoren auf retroviraler Basis sind aufgrund der vorstehend genannten Eigenschaften insbesondere für die Gentherapie geeignet, denn sie werden durch die rezeptorgesteuerte Endozytose effizienter aufgenommen, und effizienter integriert, da der Prozess enzymatisch erfolgt. Der Fachmann kennt diesen Vorgang auch unter der Bezeichnung „retrovirale Transduktion".
Dem Fachmann ist bekannt, wie solche Vektoren mittels sogenannter „Packaging Cells", die sogenannte Helferviren im Genom tragen, in die Zielzelle eingeschleust werden. Die Erfindung umfasst alle retroviralen Vektoren, die sich beispielsweise von Onko-, Lenti- oder Spumaviren ableiten. Beispielhaft handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor um M159.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, eines Fragments oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine geeignete Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium. Falls gewünscht oder erforderlich können die gemäß Schritt (c) isolierten Proteine für andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt merfür zahlreiche Methoden, z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie, lonenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affimtätschromatografie und ähnliches.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiertes Fusionspeptid der allgemeinen Formel
NH2- MTS - (Marker) - ,late domain'- COOH wobei
„NH2" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet,
„MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet, und
„late domain" die „late domain"-Region, ein Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Fusionspeptid der allgemeinen Formeln NH2- MTS - ,late domain' - (Marker) - COOH und NH2- (Marker)-MTS - ,late domain'- COOH sowie Fragmente und Derivate davon. Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn das erfindungsgemäße Fusionspeptid keinen Marker enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Fusionspeptid für therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn das Fusionspeptid möglichst klein und möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
i Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf Aminosäuresequenzen von „late domain", bei denen mindestens eine Aminosäure durch mindestens eine Aminosäure, die von der ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"- Aminosäuresequenzen, bei denen die ursprüngliche Aminosäuresequenz entweder am amino-, am carboxyterminalen oder an beiden Enden und oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des „late domain"-Bereiches erhalten bleibt.
Erfindungsgemäß können auch mehrere „late domains" nacheinander geschaltet sein, wobei es unerheblich ist ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus gleichen oder verschiedenen Viren stammen.
Hinsichtlich der Definitionen von „Marker", „Virus" und „MTS" gelten die vorstehend für die erfindungsgemäße Nukleinsäure gemachten Angaben, die hier auf Proteinebene bezogen sind.
i einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO:4 dargestellte Aniinosäuresequenz auf. In einem weiteren Aspekt führt die Insertion der Nuklemsäuresequenz in erfindungsgemäße, gentherapeutisch anzuwendende Vektoren und das Einbringen der erfindungsgemäßen Vektoren in HIN-infizierte Zellen zur Expression eines Fusionspeptides, wodurch eine starke Hemmung der HIV-Replikation verursacht wird. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors für die Behandlung von HlV-infizierten Patienten.
In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV- Freisetzung von infizierten Zellen, wobei dieses das Inkontaktbringen und die Transfektion der HlV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Günstig zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anwesenheit der vorgenannten Reagenzien bzw. der Einsatz der vorstehend genannten Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die eine Aufnahme der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Zelle ermöglichen bzw. dazu beitragen.
Als mögliche Zielzellen für eine Transfektion / retrovirale Transduktion mit einem erfindungsgemäßen Vektor sind alle Zellarten denkbar. Besonders bevorzugt für das vorstehend genannte Verfahren sind T-Lymphozyten und/oder hämatopoetische Stammzellen. Ganz besonders bevorzugt sind T-Lymphozyten.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Freisetzung, wobei dieses das inkontaktbringen der HlV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Fusionspeptid oder eines Fragments oder Derivats davon umfasst. Das Verfahren kann in vitro in einer wässrigen Lösung, in vivo in einem geeigneten Zellkultur-Assay, oder in einem Lebewesen mittels geeigneter Verabreichungsformen durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid können im Sinne der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel, optional in Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff, verwendet werden. Dabei ist es unerheblich, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen verabreicht werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder die Einwirkzeit des Arzneimittels ist variabel und hängt vom physiologischen Zustand der zu behandelnden Person ab. Dabei können Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten eine Rolle spielen. Außerdem kann es von Bedeutung sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder prophylaktisch behandelt werden muss.
In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid zur Herstellung eines Arzneimittels, optional in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff, für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten verwendet.
Die Herstellung solcher Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Für die Stabilität und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit von Stabilisatoren und Trägersubstanzen wie Stärke, Laktose, Stearinsäure, Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder anderer Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe erforderlich. Arzneimittel in flüssiger Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Arzneimittel, das, optional in Kombination mit weiteren, pharmazeutisch verträglichen Substanzen und Trägerstoffen, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid enthält, und das für die Behandlung von HIV- infizierten Patienten geeignet ist.
Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten Tabletten, Granulaten, harten und weichen Gelatinekapseln, oder sie kann rektal in Form von Zäpfchen erfolgen. Das Arzneimittel kann auch parenteral - unter Umgehung des Verdauungsapparates - z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form von Lösungen für Infusionen oder Injektionen verabreicht werden. Andere geeignete Darreichungsformen betreffen direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben, Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder zu inhalierende Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder in Form von Mikrokapseln, Implantaten oder Stäbchen. Die geeignete Darreichungsform hängt von der Art und der Schwere der Krankheit ab.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, das zur Behandlung von HIV- inftzierten Patienten eingesetzt werden kann, wobei das Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid umfasst.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 : Klonierung; der prototypischen Expressionsplasmide bhd-la und bhd-1 :
Ausgangsvektor für die Konstruktion des Plasmids bhd-la war der Vektor pEFplink (LIT), der eingesetzte offene Leseraster in eukaryontischen Zellen unter Kontrolle des zellulären EFl-alpha-Promoters exprimiert. In dieses Plasmid wurde eine ,in frame' Fusion aus den kodierenden Sequenzen für srcNLS (PCR-amplifiziert aus pHHR-srcNLS-GFP; R. Welker, unpubliziert) und dem vollständigen p6 Protein von H1N-1 (PCR-amplifiziert aus pΝL4-3) kloniert. Zwischen diese beiden Fusionsanteile wurde die ebenfalls mittels PCR amplifizierte kodierende Sequenz für EGFP (aus pEGFP-cl, Clontech) gesetzt. Daraus resultierte Plasmid bhd-la. Durch Klonierung der gesamten Expressionskassette aus bhd- la in das Plasmid Ml 59 (zur Verfügung gestellt von Dr. M. von Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt) entstand der lentivirale Vektor bhd-1. Dieses Plasmid exprimiert das therapeutische Gen unter der Kontrolle des ,long terminal repeat' des Myeloproliferative Sarkom Virus. Durch die ebenfalls im Vektor vorhandene leader-Sequenz 71 des Murinen embryonic stem cell Virus und das beta-Posttranskriptionelle Regulationselement des Waldmurmeltier-Hepatitis B-Virus wird die Expressionseffizienz gesteigert (Schambach 2000).
Beispiel 2: Kultivierung der Zellen und Viren
293T-, COS-7 und Phoenix-ampho-Zellen wurden in Dulbecco's Medium (Invitrogen), komplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS; Sigma), kultiviert. PM-1 und Jurkat- Zellen wurden in RPMI-Medium mit 10% FCS kultiviert.
Replikationskompetente Viren wurden nach Transfektion von 293T Zellen mit dem proviralen Klon pNL4-3 und anschliessender Passage auf PM-1 Zellen gewonnen.
Zur stabilen Transfektion von PM-1 Zellen wurde ein retroviraler Vektor, der für das prototypische Fusionsprotein kodiert (bhd-1) mittels der Verpackungszellinie Phoenix- ampho (Grigani et al., 1998) verpackt.
Beispiel 3: Expression des prototypischen Fusionsproteins in transfizierten Zellen Um die Expression und Stabilität des Fusionsproteins zu testen, wurde das entsprechende Expressionskonstrukt zunächst alleine in verschiedene Zellinien (HeLa, 293T, COS-7) transfiziert . In Zellextrakten konnte ein Protein mit dem erwarteten apparenten Molekulargewicht (ca. 35 kDa) nachgewiesen werden, das mit Antiseren gegen EGFP sowie gegen p6 reagiert (Zeichnung 1B). Das Fusionsprotein ist demnach in Zellen stabil, die exprimierte Menge entspricht in etwa der des gut exprimierten Markerproteins EGFP alleine (Blot mit anti-GFP, vgl. Spuren 1 und 3). Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von transfizierten COS-7 (Zeichnung IC) und HeLa-Zellen (nicht gezeigt) zeigte ein starkes GFP-Signal an der Plasmamembran. Das synthetische Membranlokalisationssignal ist demnach in dem hier verwendeten Kontext funktionell und das Fusionsprotein wird an den beabsichtigten Wirkungsort innerhalb der Zelle transportiert.
Beispiel 4: Ko-Transfektionsexperiment zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung des neuen Fusionsproteins
Durch Ko-Transfektion des prototypischen Vektors mit dem Plasmid pKHIV wurde auf einfache Weise die inhibitorische Wirkung des Fusionsproteins auf die Partikelfreisetzung untersucht (Zeichnung 2). pKHIN (LIT) ist ein nicht-infektiöses subvirales Derivat des proviralen Klons pΝL4-3, das die kodierenden Regionen von HIN-1 (mit Ausnahme von nef) unter Kontrolle des CMV major late-Promotors enthält. Die viralen
Hauptstrukturproteine Gag und Gag-Pol werden exprimiert und bilden virusähnliche Partikel, die normal in den Zellkulturüberstand freigesetzt werden (da in pKHIV die ,long terminal repeats' und die Primerbindungsstelle fehlen, sind die entstehenden Partikel nicht infektiös). Bei Anwesenheit eines inhibitorisch wirksamen Fusionsproteins in der gleichen
Zelle sollte entsprechend weniger Virusprotein ins Medium freigesetzt werden. Dieses
Plasmid wurde zusammen mit dem Vektor bhd-la (bzw. zur Νegativkontrolle mit dem Leervektor pEFplink oder dem EGFP-Expressionsplasmid pEGFP-cl) in 293T-Zellen transfiziert. Bei den Kotransfektionen wurden jeweils equimolare Mengen der beiden
Plasmide eingesetzt. Die j-rnmunoblot-Analyse des Zellextraktes mit anti-GFP-Antiserum zeigte, dass das Fusionsprotein in vergleichbarer Menge zum Kontrollprotein EGFP exprimiert wurde (Zeichnung 2, oben). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellkulturüberstände geerntet, durch 0,45 μm Filter filtriert und in Ultrazentrifugenröhrchen auf ein Saccharosekissen (20% w/w in phosphatgepufferter NaCl-Lösung) geschichtet. Durch Zentrifugation (90 min; 39000 rpm, SW-41 Rotor) wurden die Viraspartikel aus dem Überstand pelletiert und anschliessend vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen. Durch Immunoblot mit Antiserum gegen HIV-1 Capsid wurden die pelletierten Viraspartikel nachgewiesen. Wie Zeichnung 2 zeigt, werden bei gleicher Menge an intrazellulär exprimiertem Gag-Protein (Zeichnung2, Mitte) in Anwesenheit des Fusionsproteins deutlich weniger Viraspartikel freigesetzt (unten) als in den Kontrollansätzen.
Beispiel 5: Infektion von stabil transduzierten PM-1 und Jurkat-Zellen zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung auf die Virusreplikation.
Mit Hilfe von Verpackungszellinien wurden stabil mit bhd-1 transduzierte PM-1 und Jurkat-Zellen hergestellt. Durch hohe Transduktion oder durch FACS-Sortierung wurde ein Anteil von ca. 80% EGFP positiver Zellen erreicht, hn Vergleich zu untransduzierten, bzw. mit einem nur EGFP-exprimierenden Kontrollvektor (M56) transduzierten Zelhmen sollten diese Zellen eine verminderte Virusreplikation erlauben. Dies wurde durch Infektion mit den HIN-1 Isolaten ΝL4-3, bzw. dem besonders aggressiven Isolat D117II getestet. Die Virusreplikation über bis zu 3 Wochen wurde durch Bestimmung des Capsidproteins p24 im Medium verfolgt. Wie Zeichnung 3 zeigt, war in diesen Experimenten die Freisetzung von p24 in bhd-1 transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen um etwa 90% inhibiert. Durch Expression des Prototyp-Fusionsproteins kann also die HIV-1 Replikation effizient gehemmt werden. Beschreibung der Zeichnungen:
Zeichnung 1:
(A) Schematischer Aufbau des getesteten prototypischen Inhibitorproteins.
SrcNLS: von den Erfindern entwickeltes synthetisches Membranlokalisationssignal (R. Welker, unpubliziert); EGFP: grün fluoreszierendes Protein; p6: komplette kodierende Sequenz des p6 Proteins von H-V-1 NL4-3.
(B) Ein eukaryotischer Expressions vektor, der für das in (A) skizzierte Fusionsprotein kodiert, wurde transient in 293T-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und der Gesamtextrakt mittels frnmunoblot auf das Vorhandensein des Fusionsproteins untersucht (Spur 3). Als Kontrolle wurden parallel mit Leervektor transfizierte Zellen (Spur 2), sowie mit dem Plasmid pEGFP-cl (Clontech) transfizierte Zellen (Spur 1) verwendet. Das Bild zeigt hnmunoblots entwickelt mit den angegebenen Antiseren; auf der linken Seite sind die Positionen der Molekulargewichts-Standards (MW in Kilodalton) aufgetragen.
In den mit j-nhibitorkonstrukt transfizierten Zellen wird ein Protein der erwarteten Grosse (ca. 35 kDa) delektiert, das sowohl mit Antiserum gegen p6, als auch mit Antiserum gegen GFP reagiert.
(C) COS-7 Zellen wurden mit dem Inhibitorkonstrakt bhd-la transfiziert und 48 h nach Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die intrazelluläre Lokalisation des srcNLS-EGFP-p6-Fusionsproteins zu bestimmen. Man erkennt ein starkes Fluoreszenzsignal an der Plasmamembran.
Zeichung 2:
293T-Zellen wurden mit gleichem Mengen eines nicht-infektiösen HIV-1 Derivats (pKHIV) und dem hihibitorkonstrukt kotransfiziert. Als Negativkontrolle wurde anstelle des In bitorkonstruktes der Expressionsvektor ohne kodierende Sequenz bzw. das EGFP- exprimierende Plasmid pEGFP-cl (Clontech) eingesetzt. 48h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und gleiche Mengen des Zellextrakts mittels Immunoblot auf Expression des inhibitorischen Proteins (oben) und dem von pKHIV kodierten HIV Hauptstxukturprotein Gag (Mitte) getestet. Aus dem Zelll lturüberstand wurden die freigesetzten subviralen Partikel mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen gereinigt, vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen und durch hnmunoblot nachgewiesen (unten).
In allen Ansätzen werden vergleichbare Mengen an Gag-Protein exprimiert (Mitte), die Freisetzung von Gag-Partikeln ist jedoch in Anwesenheit des inhibitorischen Proteins im Vergleich zu den beiden Kontrollen deutlich reduziert (unten).
Zeichung 3:
Zwei verschiedene T-Zell-Linien (Jurkat und PM-1) wurden stabil mit dem Inhibitorkonslxukt transduziert und anschliessend mit den HIV-1 Isolaten NL4-3 und D117II infiziert. Als Mass für die Virasfreisetzung wurde zu mehreren Zeitpunkten nach Infektion HIN-1 Capsidprotein (p24) im Zellkulturüberstand mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus zwei Ansätzen. In Zellen, die mit dem Inhibitorkonstrukt bhd-1 transduziert wurden, ist die Virusreplikation im Vergleich zur Kontrolle um etwa 90% reduziert.
Diese Daten wurden von Frau PD Dr. D. v. Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt/M., zur Verfügung gestellt

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure der allgemeinen Formel
5'- MTS - (Marker) - ,late domain'- 3' wobei
„5' " das 5 '-Ende der Nuklemsäuresequenz bezeichnet,
„3' " das 3 '-Ende der Nuklemsäuresequenz bezeichnet,
„(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet. „MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region,
Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet, und
„late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnet, ein Fragment oder Derivat davon.
2. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Filoviren, Rhabdoviren und Retroviren.
3. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Retroviras ist.
4. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Retroviras ein Lentiviras ist.
5. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lentiviras HIV-1 ist.
6. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Nukleotide 1 bis 63 der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz umfasst.
7. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass sie keine für einen „Marker" kodierende DNA- Region enthält.
8. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
9. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
10. Rekombinante DNA, die eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
11. Expressionsvektor, der eine rekombinante DNA gemäß Anspruch 10 enthält.
12. Expressionsvektor gemäß Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein retroviraler Vektor ist.
13. Expressionsvektor gemäß Ansprach 12, dadurch gekennzeichnet, dass der retrovirale Vektor Ml 59, ein Fragment oder Derivat davon, ist.
14. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Peptids, das von der Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 kodiert wird, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Einbringen eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 in eine Wirtszelle, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle, und
(c) Isolierung des Peptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
15. Fusionspeptid der allgemeinen Formel NH2- MTS — ,late domain' - (Marker) - COOH wobei
„NH2" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet, „(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet,
„MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet, und „late domain" den „late domain", Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet,
ein Fragment oder Derivat davon.
16. Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Ansprach 15, dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Aminosäuren 1 bis 21 der in SEQ ID NO:2 dargestellten Sequenz umfasst.
17. Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass es keinen Marker enthält.
18. Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
19. Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO:4 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
20. Verwendung eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 zur Behandlung von HrV-Infektionen.
21. Verwendung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass HIN-infizierte Zellen mit dem Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 transfiziert werden.
22. Verwendung gemäß Ansprach 21, dadurch gekennzeichnet, dass die HIV- infizierten Zellen T-Lymphozyten sind.
23. Verfahren zur Hemmung einer HIV-Freisetzung, umfassend das Inkontaktbringen einer HIN-infizierten Zelle mit dem Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.
24. Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und oder eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Verwendung als Arzneimittel.
25. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9, eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HIV- infizierten Patienten.
26. Arzneimittel zur Behandlung von HIN-infizierten Patienten, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einen Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19, optional in Kombination mit weiteren pharmazeutisch verträglichen Substanzen und/oder Trägerstoffen.
27. Kit, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und oder ein Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.
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